MX2011003762A

MX2011003762A - Celulas manipuladas por ingenieria que expresan multiples inmunomoduladores, y uso de las mismas.

Info

Publication number: MX2011003762A
Application number: MX2011003762A
Authority: MX
Inventors: Thomas D Reed; Robert Patterson Beech
Original assignee: Intrexon Corp
Priority date: 2008-10-08
Filing date: 2009-10-08
Publication date: 2011-04-27
Also published as: CN102575227A; IL253985A0; KR20110065565A; AU2009302804B2; IL212184A0; US20110268766A1; WO2010042189A3; US9492482B2; US20160089398A1; JP2016025858A; EP2356219A2; JP2019000118A; KR101629071B1; US20170128569A1; IL253985B; US20180333486A1; RU2573912C2; EP2356219A4; JP2012504959A; IL212184A

Abstract

La presente invención se refiere al campo de los agentes terapéuticos. Más específicamente, la invención proporciona los métodos para generar células inmunitarias manipuladas in vitro, que expresan condicionalmente interleucina 12 (IL-12) y uno o más inmunomoduladores bajo el control de un sistema de modulación de expresión en gen, en presencia del ligando de activación, y los usos para propósitos terapéuticos en animales.

Description

CELULAS MANIPULADAS POR INGENIERIA QUE EXPRESAN MULTIPLES INMUNOMODULADORES, Y USO DE LAS MISMAS Campo de la Invención Esta invención se refiere al campo de la terapia génica para el tratamiento de trastornos y enfermedades, tales como el cáncer. En una modalidad, la invención proporciona la manipulación por ingeniería de las células inmunitarias o células de apoyo terapéutico (TSC, por sus siglas en inglés) , para expresar uno o más inmunomoduladores y el uso de las células como agentes terapéuticos.

Antecedentes de la Invención La Interleucina-12 (IL-12) es un miembro de la familia de citocinas tipo I, involucrada en la contribución a un número de procesos biológicos que incluyen, pero no están limitadas a, respuesta inmunitaria protectora y supresión, de la tumorigénesis (Abdi et al, 2006; Adorini, 1999; Adorini, 2001; Adorini et al, 2002; Adorini et al, 1996; Akhtar et al , 2004; Akiyama et al, 2000; Al-Mohanna et al, 2002; Aliberti et al, 1996; Allavena et al , 1994; Allí y Khar, 2004; Alzona et al , 1996; Amemiya et al, 2006; Araujo et al, 2001; Arulanandam et al , 1999; Athie et al , 2000; Athie-Morales et al, 2004; Bertagnolli et al, 1992; Bhardwaj et al, 1996; Biedermann et al , 2006; Brunda y Gately, 1994; Buchanan et al, 1995; Romani et al, 1997; Rothe et al , 1996; Satoskar et REF.:219228 al, 2000; Schopf et al, 1999; Thomas et al, 2000; Tsung et al, 1997; Wolf et al, 1994; Yuminamochi et al, 2007) . Un cuerpo creciente de evidencia sugiere que la IL-12 puede ser un objetivo promisorio para controlar enfermedades humanas (por ejemplo, cáncer) .

A pesar del hecho de que IL-12 sigue siendo promisoria como un agente terapéutico contra el cáncer, basado en su potente actividad de apoyo sobre las células NK anti-tumorales Tipo 1, células T CD4+ y células T CD8+ (Trinchieri, 2003), la toxicidad reportada de la IL-12 recombinante (rhIL-12) en pacientes (Atkins et al, 1997) , junto con las fuentes limitadas de rhIL-12 de grado GMP para la aplicación clínica, han prevenido los procedimientos terapéuticos exitosos basados en IL-12. De este modo, parece razonable que los procedimientos de terapia génica pueden representar opciones de tratamiento más seguras, más adecuadas. Por supuesto, las pruebas clínicas de fase I que implementan la distribución intra- o peri-tumoral del ADNc de la IL-12 basado en virus recombinante (Sangro et al, 2004; Triozzi et al, 2005) o en plásmidos (Heinzerling et al, 2005) , o los fibroblastos autólogos modificados con el gen de la IL-12 (Kang et al, 2001) han sido encontrados como seguros y bien tolerados .

Sin embargo, las respuestas clínicas objetivo en pacientes con melanoma o una gama diversa de carcinomas que reciben estas terapias génicas, han sido raras, variables, transitorias, y en gran medida enfocadas al sitio de tratamiento (Heinzerling et al, 2005; Kang et al, 2001; Sangro et al, 2004; Triozzi et al, 2005) . En casos donde la resolución de la enfermedad fue parcial o completa, han sido notadas frecuencias incrementadas de linfocitos de infiltración tumoral (Heinzerling et al, 2005; Sangro et al, 2004) y niveles elevados de células T CD8+ específicas del tumor circulantes (Heinzerling et al, 2005), consistentes con el aprestamiento cruzado mejorado de las células T específicas del antígeno, en esos pacientes.

Ya que el aprestamiento cruzado de las células T específicas es mejor logrado por las células dendríticas (DC) que sirven como una fuente natural pero regulada de la IL-12 (Berard et al, 2000), reporta recientes de la eficacia pre-clínica superior de la terapia con el gen de la IL-12 basada en DC, han sido de gran interés (Satoh et al, 2002; Tatsumi et al, 2003; Yamanaka et al, 2002). Por ejemplo, se ha mostrado que la inyección intratumoral (i.t.) de las DC manipuladas por ingeniería genética para producir IL-12p70 (vía la infección con adenovirus recombinante) , da como resultado el aprestamiento cruzado dramáticamente mejorado de un repertorio de células T CD8+' , específicas del tumor, ampliamente reactivas, en concierto con el rechazo del tumor en modelos murinos (Tatsumi et al, 2003). Dado el uso previo de un adenovirus recombinante que codifica para mIL-12 bajo un promotor basado en CMV (rAd.cIL12, (Tatsumi et al, 2003)), la producción de DC manipuladas por ingeniería genética de la IL-12, fue constitutiva, ya que el impacto inmunológico de esta citocina tempranamente dentro de la lesión tumoral y posteriormente dentro de los nodulos linfáticos que drenan los tumores, no pudo ser resuelto con respecto al resultado terapéutico. De este modo, existe una necesidad para DC manipuladas por ingeniería genética para la expresión condicional del IL-12 para el propósito de regular el nivel de la expresión del transgen y para la sincronización de la activación del transgen. La invención proporciona un resultado terapéutico promisorio para el uso de tales células .

Breve Descripción de la Invención La invención proporciona un vector recombinante que codifica para una o varias proteínas que tienen la o las funciones de uno o más inmunomoduladores, bajo el control de uno o más promotores. En una modalidad, uno o más promotores son condicionales. En otra modalidad más, uno o más promotores son constitutivos. En otra modalidad más, el vector es un vector adenoviral que codifica para la o las proteínas impulsadas fuera de un promotor que puede ser condicionalmente activado por la provisión de un ligando soluble de molécula pequeña tales como las diacilhidrazinas (por ejemplo, RG-115819, RG-115830 o RG-115932) . Este vector permite el control de la expresión de la o las proteínas a partir de células inmunitarias y TSC.

En una modalidad, la invención proporciona un vector para expresar condicionalmente una o varias proteínas que tienen la o las funciones de uno o más inmunomoduladores , que comprenden un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido que codifica para un cambio de gen comprende (1) al menos un secuencia del factor de transcripción operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, y (2) un polinucleótido que codifica para una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador enlazado a un promotor que es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando. En una modalidad, el inmunomodulador se selecciona de IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R DN o una subunidad de los mismos, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-alfa, IFN-gamma, CCL3 (MIP-la) , CCL5 (RANTES) , CCL7 (MCP3), XCL1 (linfotactina) , CXCL1 (MGSA-alfa) , CCR7 , CCL 19 (MIP-3b) , CXCL9 (MIG) , CXCL10 (IP-10), CXCL 12 (SDF-I), CCL21 (6Ckine) , OX40L, 4-IBBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-Defensina, HMGB1, Flt3L, IFN-beta, TNF-alfa, dnFADD, TGF-alfa, PD-LlAR i, un oligonucleótido antisentido PD-L1, TGFbRII DN, ICOS-L y S100.

En otra modalidad más, la invención proporciona un vector para expresar una o varias proteínas que tienen la o las funciones de uno o más inmunomoduladores , y una proteína que tiene la función de IL-12, que comprende un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, (2) un polinucleótido que codifica para la o las proteínas que tienen la o las funciones de uno o más inmunomoduladores , y (3) un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de la IL-12; en donde al menos un polinucleótido de (2) y (3) están enlazados al promotor que es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando.

La invención proporciona además un método para producir una población de células por ejemplo, células inmunitarias o TSC, que expresan una o varias proteínas que tienen la función de uno o más inmunomoduladores, por la modificación (por ejemplo, transíección, electroporación, etc.) de las células con un vector recombinante que expresa condicionalmente la o las proteínas que tienen la o las funciones de uno o más inmunomoduladores, en donde el vector comprende un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, y (2) un polinucleótido que codifica una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador enlazado a un promotor el cual es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando.

En otra modalidad más, la invención proporciona un método para producir una población de células, por ejemplo, células inmunitarias o TSC, que expresan proteínas que tienen la o las funciones de uno o más inmunomoduladores, y una proteína que tiene la función de IL-12, al modificar las células con un vector recombinante que comprende un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, (2) un polinucleótido que codifica para la o las proteínas que tienen la o las funciones de uno o más inmunomoduladores , y (3) un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de la IL-12; en donde al menos un polinucleótido de (2) y (3) están enlazados al promotor que es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando.

La invención proporciona además un población de células, por ejemplo, células inmunitarias o TSC, que expresan una o varias proteínas que tienen la función de uno o más inmunomoduladores , que han sido modificados (por ejemplo, transíectados , sometidos a electroporesis , etc.) con un vector recombinante que expresa condicionalmente la o las proteínas que tienen la o las funciones de uno o más inmunomoduladores, en donde el vector comprende un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, y (2) un polinucleótido que codifica una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador enlazado al promotor que es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando.

En otra modalidad más, la invención proporciona una población de células, por ejemplo, células inmunitarias o TSC, que expresan proteínas que tienen la o las funciones de uno o más inmunomoduladores y una proteína que tiene la función de la IL-12, que ha sido modificada con un vector recombinante que comprende un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, (2) un polinucleótido que codifica para la o las proteínas que tiene la o las funciones de uno o más inmunomoduladores y (3) un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de la IL-12; en donde al menos un polinucleótido de (2) y (3) están enlazado a un promotor que están activados por el factor de transcripción dependiente del ligando.

En otra modalidad más, la invención proporciona una composición que comprende dos o más poblaciones de células de la presente invención, por ejemplo, células inmunitarias o TSC, en donde cada población de células en la composición expresa uno o más inmunomoduladores que son diferentes de uno o más inmunomoduladores expresados en las o las otras poblaciones de células en la composición. En una modalidad, la composición contiene dos poblaciones de células. En otra modalidad más, la composición contiene más de dos poblaciones de células. En otra modalidad más, la composición contiene tres poblaciones de células. En otra modalidad más, la composición contiene cuatro poblaciones de células.

En otra modalidad más, la invención proporciona otra célula manipulada por ingeniería genética in vitro, por ejemplo, un célula inmunitaria o TSC, que comprende un vector que incluye un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, y (2) un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de un inmunomodulador enlazado a un promotor que es activado por un factor de transcripción dependiente del ligando. En otra modalidad más, la invención proporciona una célula manipulada por ingeniería genética in vifcro, por ejemplo, célula inmunitaria o TSC, que comprende un vector que incluye un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, (2) un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de un inmunomodulador, y (3) un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de la IL-12; en donde al menos un polinucleótido de (2) y (3) están enlazados a un promotor que es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando.

En otra modalidad más, la invención proporciona una composición que comprende dos o más poblaciones de células manipuladas por ingeniería in vitro, por ejemplo, células inmunitarias o TSCs, de la presente invención, en donde cada una de las poblaciones de las células manipuladas por ingeniería in vitro en la composición, comprende un vector que incluye un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, y (2) un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de un inmunomodulador enlazado a un promotor que es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando, y en donde cada población de células manipuladas por ingeniería in vitro en la composición, expresa uno o más inmunomoduladores que son diferentes de uno o más inmunomoduladores expresados en la o las otras poblaciones de la célula manipulada por ingeniería genética in vitro en la composición. En una modalidad, la invención proporciona una composición que comprende dos o más poblaciones de células manipuladas por ingeniería in vitro, por ejemplo, células inmunitarias o TSC, cada una de dichas poblaciones de células que comprende un vector que incluye un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, (2) un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de un inmunomodulador, y (3) un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de la IL-12; en donde al menos un polinucleótido de (2) y (3) están enlazados a un promotor que es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando. En una modalidad, la composición contiene dos poblaciones de células manipuladas por ingeniería in vi tro. En otra modalidad más, la composición contiene más de dos poblaciones de células manipuladas por ingeniería in vi tro. En otra modalidad más, la composición contiene tres poblaciones de células manipuladas por ingeniería in vitro. En otra modalidad más, la composición contiene cuatro poblaciones de células manipuladas por ingeniería in vitro.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una población de células, por ejemplo, células inmunitarias o TSC, como se describen en la presente.

En una modalidad, el polinucleótido que codifica para una o más proteínas que tienen las funciones del inmunomodulador, está bajo el control del promotor del cambio de gen y el polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de la IL-12 está bajo el control de un promotor constitutivo. En otra modalidad más, el polinucleótido que codifica para la o las proteínas que tienen las funciones del o los inmunomoduladores y el polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de la IL-12, están ambos bajo el control de un promotor multicistrónico del cambio del gen. En otra modalidad más, el polinucleótido que codifica para una o varias proteínas que tienen la función del o de los inmunomoduladores está bajo el control del promotor del cambio del gen y el polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de la IL-12, está bajo el control de un promotor condicional que es diferente del promotor de cambio de gen. En una modalidad adicional, el sistema de regulación de genes para el polinucleótido que codifica para la o las proteínas que tienen la función del o de los inmunomoduladores y sistema de regulación de genes para el polinucleótido que tiene la función de la IL-12, son ortogonales. En una modalidad adicional, el sistema de regulación de genes para cada polinucleótido que codifica para cada proteína, es ortogonal.

En una modalidad, la invención también proporciona un tratamiento del cáncer, tal como, pero no limitado a, tumores de melanoma, tumores gliomas, cáncer renal y cánceres de próstata, así como los cánceres listados en la presente en la Tabla 1. La terapia génica con IL-12 ha demostrado eficacia antitumoral en estudios de modelos animales cuando se aplica como un vector de ADNc recombinante (Faure et al, 1998; Sangro et al, 2005), pero incluso más, cuando se aplica en el contexto del DC modificado con gen (Satoh et al, 2002; Svane et al, 1999; Tatsumi et al, 2003; Yamanaka et al, 2002) . Hasta la fecha, no obstante, las pruebas de fase I en humanos de terapia génica con IL-12, que implementan plásmidos o vectores virales, han fallado en lograr respuestas clínicas objetivas y durables en el panorama del cáncer (Heinzerling et al, 2005; Kang et al, 2001; Sangro et al, 2004; Triozzi et al, 2005) . La terapia génica como se describe en la presente, proporciona una modalidad terapéutica promisoria.

En una modalidad, la invención proporciona un método para tratar un tumor en un mamífero, que comprende los pasos de : (a) administrar intratumoralmente a los microambientes tumorales, un población de células inmunitarias o TSC, que son manipuladas in vitro para expresar incondicionalmente , una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador; y (b) administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un ligando de activación; Con la cual se induce la expresión de una proteína que tiene la función del inmunomodulador y se trata el tumor.

En otra modalidad más, la invención proporciona un método para tratar un tumor en un mamífero, que comprende los pasos de : (a) administrar intratumoralmente a los microambientes tumorales, dos o más poblaciones de células inmunitarias o TSCs, que son manipuladas in vitro para expresar condicionalmente una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador, en donde cada población de células inmunitarias o TSCs expresan un grupo diferente de uno o más inmunomoduladores ; y (b) administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más ligandos de activación; Con lo cual se induce la expresión de una proteína que tiene la función del inmunomodulador y se trata el tumor.

En otra modalidad más, la invención proporciona un método para tratar un tumor en un mamífero, que comprende los pasos de : (a) administrar intratumoralmente a los microambientes tumorales una población de un célula inmunitaria o TSC, que son manipuladas in vitro para expresar condicionalmente una o más proteínas' que tienen la función de un inmunomodulador y una proteína que tiene la función de la IL-12, en donde al menos una de las proteínas que tiene la función del inmunomodulador o la IL-12 está bajo el control de un promotor condicional que es activado por un ligando; y (b) administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva del ligando de activación; con lo cual se induce la expresión de una proteína que tiene la función del inmunomodulador y/o la proteína que tiene la función de la IL-12 y el tratamiento del tumor.

En otra modalidad más, la invención proporciona un método para tratar un tumor en un mamífero, que comprende los pasos de : (a) administrar intratumoralmente a microambientes tumorales dos o más poblaciones de células inmunitarias o TSCs, que son manipuladas in vitro para expresar condicionalmente una o más " proteínas que tiene la función de un inmunomodulador y una proteína que tiene la función de la IL-12, en donde cada población de células inmunitarias o TSCs expresan un grupo diferente de una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador, en donde al menos una de las proteínas que tiene la función del inmunomodulador o la IL-12 está bajo el control de un promotor condicional que es activado por un ligando; y (b) administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más ligandos de activación; Con lo cual se induce expresión de una proteína que tiene la función de los inmunomoduladores y/o la proteína que tiene la función de la IL-12 y el tratamiento del tumor.

En otra modalidad más, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno de un mamífero, que comprende los pasos de : (a) administrar al mamífero una población de células modificadas, que son modificadas para expresar condicionalmente una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador; y (b) administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un ligando de activación; con lo cual se induce expresión de una proteína que tiene la función del inmunomodulador y se trata la enfermedad o trastorno.

En otra modalidad más, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero, que comprende los pasos de : (a) administrar al mamífero dos o más poblaciones de células modificadas, que son modificadas para expresar condicionalmente una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador, en donde cada población de células modificadas expresa un grupo diferente de uno o más inmunomoduladores; y (b) administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más ligandos de activación; Con lo cual se induce expresión de las proteínas que tienen la función de los inmunomoduladores y se trata la enfermedad o el trastorno.

En otra modalidad más, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero, que comprende los pasos de : (a) administrar al mamífero una población de células modificadas, que son modificadas para expresar condicionalmente una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador, y una proteína que tiene la función de la IL-12, en donde al menos una de las proteínas que tienen la función del inmunomodulador o IL-12 está bajo el control de un promotor condicional que es activado por un ligando; y (b) administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva del ligando de activación; con lo cual se induce expresión de una proteína que tiene la función del inmunomodulador y/o la proteína que tiene la función de la IL-12 y tratar la enfermedad o el trastorno .

En otra modalidad más, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero, que comprende los pasos de : (a) administrar al mamífero dos o más poblaciones de células modificadas, que son modificadas para expresar condicionalmente una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador y una proteína que tienen la función de la IL-12, en donde cada población de células modificadas expresa un grupo diferente de una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador, en donde al menos una de las proteínas que tienen la función del inmunomodulador o la IL-12 está bajo el control de un promotor condicional que es activado por un ligando; y (b) administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más ligandos de activación; Con lo cual se induce expresión de una proteína que tiene la función de los inmunomoduladores y/o la proteína que tiene la función de la IL-12 y se trata la enfermedad o el trastorno .

La invención también proporciona un método para determinar la eficacia de la terapia basada en células manipuladas por ingeniería, por ejemplo, células inmunitarias o TSC- , mediante la medición del nivel de expresión o actividad de IFN- gamma en un paciente, antes del inicio de la terapia, con lo cual se genera un nivel de control, seguido por la administración de las células manipuladas por ingeniería, para expresar una o más proteínas que tienen las funciones de un inmunomodulador y opcionalmente una proteína que tiene la función de la IL-12, administrando una cantidad efectiva de un ligando de activación, y luego midiendo el nivel de expresión de IFN-gamma para generar un nivel de prueba, y comparando el nivel control al nivel de prueba, para determinar si el régimen terapéutico es o no efectivo.

En una modalidad, la invención proporciona un método para determinar la eficacia de un régimen terapéutico basado en células manipuladas por ingeniería in vitro, por ejemplo, células inmunitarias- o TSC, en un paciente, que comprende : ' (a) medir el nivel de expresión o el nivel de actividad o ambos del interferón-gamma (IFN- gamma) en una primera muestra biológica obtenida del paciente en necesidad del mismo, antes de las células manipuladas por ingeniería in vitro, con lo cual se genera un nivel de control; (b) administrarle a un paciente en necesidad de las mismas, las células manipuladas por ingeniería in vitro, para expresar condicionalmente una o más proteínas que tienen las funciones de un inmunomodulador y opcionalmente una proteína que tiene la función de la IL-12; (c) administrar al paciente en necesidad del mismo, una cantidad efectiva de un ligando de activación; (d) medir el nivel de expresión o el nivel de actividad o ambos, de la IFN- gamma en una segunda muestra biológica, obtenida del paciente en necesidad del mismo, después de la administración de células inmunitarias manipuladas por ingeniería in vitro, y el ligando de activación, con lo cual se genera el nivel de prueba; y (e) comparar el nivel de control al nivel de prueba de IFN-gamma, en donde un incremento en el nivel de prueba de expresión, la actividad o ambos de IFN-gamma con relación al nivel control indica que el régimen terapéutico es efectivo en el paciente, en necesidad del mismo .

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra un mapa de plásmido para un sistema de expresión de promotor regulado, para un transcripto bicistrónico que codifica para hIL-12.

[0032] La Figura 2 muestra un mapa de plásmido para un sistema de expresión de promotor regulado para un transcripto bicistrónico que codifica para hIL-21 e hIL-15.

La Figura 3 muestra un mapa de plásmido para un sistema de expresión de promotor regulado para un transcripto bicistrónico que codifica para mIL-12.

La Figura 4 muestra un mapa de plásmido para un sistema de expresión de promotor regulado para un transcripto bicistrónico que codifica para mIL-21 e mIL-15.

La Figura 5 muestra un mapa de plásmido para un sistema de expresión de promotor regulado para hlL-21.

La Figura 6 muestra un mapa de plásmido para un sistema de expresión de promotor regulado para mIL-21.

La Figura 7 muestra un mapa de plásmido para un sistema de expresión de promotor regulado para un transcripto tricistrónico que codifica para hIL-12 e hlL-21.

La Figura 8 muestra un mapa de plásmido para un sistema de expresión de promotor regulado para un transcripto tricistrónico que codifica para mIL-12 e mIL-21.

La Figura 9 muestra la estructura del vector rAd.RheoIL12 en el cual las regiones El y E3 han sido suprimidas y los componentes (RTS) -IL-12 del Sistema ® Terapéutico RheoSwitch , reemplazan la región El. El recuadro marcado "IL 12" representa las secuencias de codificación de IL-12p40 e IL-12p35, separadas por IRES .

Descripción de las Secuencias Inmunomoduladores Citocinas Las secuencias polinucleotídicas de la interleucina 1 (IL-1), que son citocinas importantes para la respuesta inflamatoria contra la infección, están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso M28983 (IL-la humana) ; M15330 ( IL1 ß humana) ; AF201830 (IL-?d humana) ; AF201831 (IL-?e humana); AF201832 (IL-?? humana); AF201833 (IL-?? humana) ; NM_010554 (IL-?a de ratón) ; NM 008361 (IL-?ß de ratón) ; NM_019451 (L-165 de ratón) ; M_019450 (IL- lf6 de ratón); NM_027163 (IL-lf8 de ratón); NMJ53511 (IL- lf9 de ratón) ; NM_204524 (IL-?ß de pollo) ; NM_017019 (IL-?a de rata) ; y NM 031512 (ILlp de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de la interleucina 1 (IL-1) están disponibles de bases de datos públicas como números de acceso AAA59134 (IL-? humana) ; AAA59135 (IL-?ß humana) ; AAF25210 (IL-?d humana) ; AAF25211 (IL-?e humana) ; AAF25212 (IL-?? humana) ; AAF25213 (IL-?? humana) ; NP_034684 (IL-? de ratón); NP_032387 (IL-?ß de ratón); NP_062324 (L-?d de ratón) ; NP_062323 (IL-lf6 de ratón) ; NP_081439 (IL-lf8 de ratón) ; NP 705731 (IL-lfP de ratón) ; NP_989855 (IL-?ß de pollo) ; NP 058715 (IL-?a de rata) ; y NP_ 113700 (IL- 1ß de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente. Laurent et al, Psychiatr. Genet. 7: 103 (1997) identificaron mutaciones polimorficas en el gen de la interleucina- 1 beta humana.

Las secuencias polinucleotídicas de la interleucina 2 (IL-2), que pertenece a una familia incluye IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, e IL-21, están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso U25676 (humana) ; NM_008366 (de ratón) ; NM_204153 (de pollo) ; y NM_053836 (rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de la interleucina 2 (IL-2) están disponibles de bases de datos públicas como números de acceso AAA70092 (humana) ; NP_032392 (de ratón) ; NP_989484 (de pollo) ; y NP_446288 (rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Liu et al, Ap l . Biochem. Biotechnol. 133: 11 (2006) generaron IL-2 humana mutante, y Lorberboum et al, J. Biol. Chem. 265: 16311 (1990) describen la generación de IL-2 quimérica.

Las secuencias polinucleotídicas de la interleucina 4 (IL-4) , que es una citocina que induce diferenciación de células T cooperadoras intactas a células T a Th2 , están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso M23442 (humana) ; NM_021283 (de ratón) ; NM_001007079 (de pollo) ; y NM_201270 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de la interleucina 4 (IL-4) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AAA59150 (humana) ; NP 067258 (de ratón) ; NP_001007080 (de pollo) ; y NP_958427 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Kawashima et al., J. Med. Genet . 35: 502 (1998) describen los polimorfismos en el gen de IL-4, que están asociados con la dermatitis atópica.

La interleucina 7 (IL-7) es una citocina importante para el desarrollo de células B y T. Las secuencias polinucleotídicas de IL-7 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso J04156 (humana) ; NM_008371 (de ratón) ; NM_001037833 (de pollo) ; y NM_013110 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de la interleucina 7 (IL-7) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AAA59156 (humana) ; NP_032397 (de ratón) ; NP_001032922 (de pollo) ; y NP_037242 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Feng et al, Genetics 775:545 (2007) han identificado mutaciones puntuales en IL-7 que dan como resultado deficiencia funcional.

La interleucina 9 (IL-9) es una citocina producida por células T y es un regulador de las células hematopoyéticas . Las secuencias polinucleotídicas de IL-9 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM_000590 (humana) ; NM_008373 (de ratón) ; NM_001037825 (de pollo); y NMJ)Ol 105747 (de rata), secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de la interleucina 9 (IL-9) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP_000581 (humana) ; NP 032399 (de ratón) ; NP 00 1032914 (de pollo); y NPJ) 01099217 (de rata), secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente .

La IL-12 es una citocina que puede actuar como un factor de crecimiento para las células T y NK activadas, para aumentar la actividad lítica de las células asesinas NK/activadas por linfocina, y estimular la producción de IFN-gamma por el resto de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) . Las secuencias polinucleotídicas de IL-12 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM_000882 (humana IL12A) ; NM_002187 (humana IL12B) ; NM_008351. (de ratón IL12a) ; NM_008352 (de ratón IL 12b) ; NM_213588 (de pollo IL 12A) ; NM_213571 (de pollo IL12B) ; NM_053390 (de rata IL12a) ; y M_022611 (de rata ILl 2b) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de la interleucina 12 (IL-12) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP_000873 (humana IL 12A) ; NP_002178 (humana IL12B) ; NP_032377 (de ratón ILl 2a) ; NP_032378 (de ratón IL12b) ; NP_998753 (de pollo IL12A) ; NP_998736 (de pollo IL12B) ; NP_445842 (de rata ILl 2a) ; y NP_072133 (de rata IL 12b) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

La interleucina 15 (IL- 15) es una citocina que regula la activación y proliferación de células T y células asesinas naturales. Las secuencias polinucleotídicas de IL-15 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso U14407 (humana) ; NM 008357 (de ratón) ; EU334509 (de pollo) ; y AFO 15719 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de la interleucina 15 (IL-15) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AAA21551 (humana) ; NP_032383 (de ratón) ; ABY55312 (de pollo) ; y AAB94536 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

La interleucina 18 (IL- 18) , una citocina producida por macrófagos que junto con la interleucina 12 inducen la inmunidad mediada por células después de la infección con productos microbianos. Las secuencias polinucleotídicas de IL-18 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso U90434 (humana) ; NM_008360 (de ratón) ; EU747333 (de pollo) ; y AY258448 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de la interleucina 18 (IL-18) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AAB50010 (humana) ; NP_032386 (de ratón) ; ACE79188 (de pollo) ; y AAP 14669 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias polinucleotídicas de la interleucina 21 (IL-21) , que es una citocina que tiene efectos regulatorios potentes sobre las células del sistema inmunitario, incluyen las células asesinas naturales y las células T citotóxicas, por inducción de la proliferación celular, están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AF254069 (humana) ; NM_021782 (de ratón) ; NM_001024835 (de pollo) ; y NM_001108943 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de la interleucina 21 (IL-21) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso, AAG29348 (humana) ; NP_068554 (de ratón) ; NP_001020006 (de pollo); y NPJ) 01 102413 (de rata), secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente .

La interleucina 27 (IL-27) es una citocina que juega una función importante en la regulación de la actividad de linfocitos B y T. Las secuencias polinucleotídicas de IL-27 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AY099296 (humana) ; NM 145636 (de ratón) ; y XM_344962 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de la interleucina 27 (IL-27) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AAM34498 (humana) ; NP 663611 (de ratón) ; y XP 344963 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias polinucleotídicas de interferón beta 1 (IFNBl) , que es un miembro del grupo de proteínas interferones que se enlazan a receptores específicos de la superficie celular (IFNAR) , y estimula macrófagos y células asesinas naturales (NK) para promover una respuesta anti-viral, están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM_002176 (humana) ; NM_010510 (de ratón) ; NM_001024836 (de pollo) ; y NM_019127 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos del interferón beta 1 (IFNBl) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP_002167 (humana) ; NP_034640 (de ratón) ; NPJ) 01020007 (de pollo); y NP_062000 (de rata), secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

El interferón gamma (IFN- gamma) es una citocina soluble que es el único interferón Tipo II y tiene actividad anti-viral, inmunorreguladora y anti-tumoral . Las secuencias polinucleotídicas de IFN- gamma están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM_000619 (humana) ; NM_008337 (de ratón) ; y NM_138880 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de interferón gamma (IFN- gamma) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP_000610 (humana) ; NP_032363 (de ratón) ; y NP_620235 (de rata) secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias polinucleotídicas del factor de necrosis tumoral (TNF-alfa) , que es una citocina pro-inflamatoria multifuncional secretada predominantemente por monocitos/macrófagos que tiene efectos sobre el metabolismo de los lípidos, la coagulación, la resistencia a la insulina, y la función endotelial, están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso X02910 (humana) NM_013693 (de ratón) ; y BCl 07671 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de TNF-alfa están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso CAA26669 (humana) ; NP_038721 (de ratón) ; y AAI07672 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Quimiocinas El ligando 1 de quimiocina (porción C) (XCLl, también conocida como linfotatina) es quimiotáctica para las células T CD4+ y CD8+, pero no para los monocitos, e induce una elevación en el calcio intracelular en linfocitos de sangre periférica. Las secuencias polinucleotídicas de XCLl están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM_002995 (humana) ; NM_008510 (de ratón) ; y NM_134361 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de XCL1 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP 002986 (humana) ; NP_032536 (de ratón) ; y NP_599188 (de rata) , las secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente. La Patente de los Estados Unidos No. 6,022,534 describe la linfotactina y el uso ya sea para atraer células T citotóxicas, y/o células NK, y/o para inducir la proliferación de las células residentes. Los métodos para el aislamiento y uso de un anticuerpo anti-linfotactina, y la proteína de fusión XCL1 se describen también .

Las secuencias polinucleotídicas del ligando 3 de la quimiocina CC (CCL3), también conocida como proteína 1 inflamatoria de macrófagos (MIP-1) , que es una denominada monocina (un tipo de citocina producida principalmente por monocitos y macrófagos) , que está involucrada en el estado inflamatorio agudo en el reclutamiento y activación de los leucocitos polimorfonucleares , están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM_002983 (humana) ; NM_011337 (de ratón) ; y NM_013025 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de CCL3 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP_002974 (humana) ; NP_035467 (de ratón) ; y NP_037157 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente..

Las secuencias polinucleotídicas de CCL5 (RANTES) , que es una citocina pro- inflamatoria involucrada en la inflamación y en el asma, están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AF043341 (humana) ; NM_013653 (de ratón) ; y NM_031116 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de CCL5 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AAC03541 (humana) NP_038681 (de ratón) ; y NP_112378 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias polinucleotídicas del ligando 7 de la quimiocina CC (CCL7) , que es una quimiocina involucrada en el reclutamiento de macrófagos durante la inflamación y la invasión del cáncer, están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM_006273 (humana) ; NM_013654 (de ratón) ; y NM_001007612 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de CCL7 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP_006264 (humana) ; NP_038682 (de ratón) ; y NP_001007613 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

El ligando 9 de quimiocina (porción CXC) (CXCL9, también conocida como MIG) es un quimioatrayente de células T inducible por interferón gamma. Las secuencias polinucleotídicas de CXCL9 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM_002416 (humana) ; NM 0 108599 (de ratón) ; y NM_145672 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de CXCL9 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP_002407 (humana) ; NP_032625 (de ratón) ; y NP_663705 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

El ligando 10 de la quimiocina (porción C-X-C) (CXCL10) es una citocina pequeña con funciones en la quimioatracción para las células en el sistema inmunitario, la adhesión de las células T a las células endoteliales , actividad anti-tumoral y angiogénesis . Las secuencias polinucleotídicas de CXCL10 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso X02530 (humana) ; NM_021274 (de ratón) ; y BC058444 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos del ligando 10 de quimiocina (porción C-X-C) (CXCL10) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso CAA26370 (humana) ; NP 067249 (de ratón) ; y AAH58444 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

El ligando 12 de quimiocina (porción C-X-C) (CXCL12) , también conocido como factor 1 derivado de células estromales (SDF-1) , es una citocina pequeña que pertenece a la familia de intercrinas, miembros de los cuales activan los leucocitos y son a menudo inducidos por estímulos pro-inflamatorios tales como LPS, TNF ó ILL. Las secuencias polinucleotídicas de CXCL12 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso N _000609 (humana) ; NM_001012477 (de ratón) ; NM_204510 (de pollo) ; y NM_001033883 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de CXCL 12 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NPJ300600 (humana) ; NP_001012495 (de ratón) ; NP_989841 (de pollo) ; y NP_001029055 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Hansson et al, Microbes and Infection 5:841 (2006) discuten que la interacción entre el receptor 7 de quimiocina (porción C-C) (CCR7) y el ligando 19 de quimiocina (porción C-C) (CCL19, también conocido como ???-3ß) es crucial para la generación de las respuestas inmunitarias primarias. Las secuencias polinucleotídicas de CCR7 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM_001838 (humana) ; y NM_007719 (de ratón) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de CCR7 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP_001829 (humana) ; y NP_031745 (de ratón) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias polinucleotídicas de CCL 19 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM_006274 (humana) ; y NM_011888 (de ratón) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de CCL 19 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP 006265 (humana) ; y NP_036018 (de ratón) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias polinucleotídicas del ligando 21 de la quimiocina CC (CCL21) , un ligando bien establecido para CCR7, que es necesario para las células T CD4+ pero no para las células T CD8+ para que lleguen a su "punto de establecimiento" de estado de reposo y las perturbaciones en la expresión de CCL21, pueden alterar la susceptibilidad a la autoinmunidad, están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AB002409 (humana) ; NM_011335 (de ratón CCL21a) ; M_0111124 (de ratón CCL21b) ; y NM_023052 (de ratón CCL21c) ; secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de CCL21 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso BAA21817 (humana) ; NP_035465 (de ratón CCL21a) ; NP_035254 (de ratón CCL21b) ; y NP_075539 (de ratón CCL21c) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente .

La interleucina-8 (IL-8) , es una quimiocina, también llamada péptido 1 de activación de neutrófilos o SCYB8, es un péptido derivado de tejidos secretado por varios tipos de células en respuesta a estímulos inflamatorios. Las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,133,426 y 6,177,980 describen las secuencias de aminoácidos y de polinucleótidos de los anticuerpos humanizados anti-IL-8. La secuencia polinucleotídica de IL-8 humana está disponible de las bases de datos públicas como número de acceso NM_000584, secuencia de la cual se incorporada por referencia en la presente.

La secuencia de aminoácidos de IL-8 humana está disponible de las bases de datos públicas como número de acceso NP_000575, secuencia de la cual es incorporada por referencia en la presente.

Factores de crecimiento El factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) es una citocina que funciona como un factor de crecimiento de células sanguíneas blancas, estimula las células madre para producir granulocitos (neutrófilos , eosinófilos y basófilos) y monocitos. Las secuencias polinucleotídicas de GM-CSF están disponibles de las bases de datos públicas como los números de acceso M111734 (humana) ; NM_009969 (de ratón) ; EU520303 (de pollo) ; NM_001037660 (de rata Csf2ra) ; y NM_133555 (de rata Csf2rb) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos del factor de estimulación de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AAA52122 (humana) ; NP_034099 (de ratón) ; ACBl 1534 (de pollo) ; NP_001032749 (de rata Csf2ra) ; y NP_598239 (Csf2rb) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias polinucleotídicas del ligando de tirosina-cinasa relacionado a FMS (ligando FLT3/FLK2, Flt3L) , que puede funcionar como un receptor del factor de crecimiento sobre las células madre hematopoyéticas o las células progenitoras o ambas, están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso U04806 (humana) ; y NM_013520 (de ratón) , secuencias de l s^ cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos del ligando FLT3/FLK2 (Flt3L) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AAAl 7999 (humana) ; y NP_038548 (de ratón) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

La secuencia polinucleotídica del factor de crecimiento transformante, alfa (TGF-alfa) , que está supra-regulado en algunos cánceres humanos, puede conferir reversiblemente el fenotipo transformado sobre as células cultivadas, está disponible de las bases de datos públicas como números de acceso NM_001099691 (humana) ; NM_031199 (de ratón) ; NM_001001614 (de pollo) ; y NM_012671 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente .

Las secuencias de aminoácidos de TGF-alfa están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP_001093161 (humana) ; NP_112476 (de ratón) ; NP_001001614 (de pollo) ; y NP_036803 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Adyuvantes Las beta-defensinas son péptidos antimicrobianos implicados en la respuesta inmunitaria innata contra muchas bacterias Gram-negativas y Gram-positivas , hongos y virus. Las secuencias polinucleotídicas de beta-defensinas están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso X92744 (hBD-1 humana) ; AJ000152 (hBD-2 humana) ; AF217245 (beta defensina-3 humana) ; AJ314835 (beta defensina- 4 humana) ; AB089180 (hBD-5 humana) ; AY122466 (defensina beta 106 humana, DEFB106) ; AF540979 (beta defensina 107 humana, DEFB 107) ; AF529416 (beta defensina humana, DEFB 108) ; DQ012014 (beta defensina 110 humana, DEFB110) ; DQ012015 (beta defensina 111 humana, DEFB111) ; DQ012016 (beta defensina 112 humana, DEFB112) ; DQ012017 (beta defensina 113 humana, DEFB113); DQ012018 (beta defensina 114 humana, DEFB1 14); DQ012019 (beta defensina 115 humana, DEFB 115) ; DQO 12020 (beta defensina 116 humana, DEFBl 16) ; DQ012021 (beta defensina 117 humana, DEFBl 17) ; NM_007843 (defensina beta 1 de ratón) ; NM_010030 (defensina beta 2 de ratón, Defb2) ; NM_013756 (defensina beta 3 de ratón, Defb3) ,- NM_019728 (defensina beta 4 de ratón, Defb4) ; NM_030734 (defensina beta 5 de ratón, Defb5) ; NM_054074 (defensina beta 6 de ratón, Defb6) ; NM_139220 (defensina beta 7 de ratón) ; NM_153108 (defensina beta 8 de ratón, Defb8) ; NM_139219 (defensina beta 9 de ratón, Defb9) ; y NM_139225 (defensina beta 10 de ratón, DefblO) ; secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de las beta-defensinas están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso CAA63405 (hBD-1 humana) ; CAB65126 (hBD-2 humana) ; AAF73853 (beta defensina-3 humana) ; CAC85520 (beta defensina-4 humana) ; BAC10630 (hBD- 5 humana) ; AAM93908 (defensina beta 106 humana, DEFB106) ; AAN33115 (beta defensina 107 humana, DEFB 107) ; AAQ09525 (beta defensina humana, DEFB 108) AAY59750 (beta defensina 110 humana, DEFBl 10) ; AAY59751 (beta defensina 111 humana, DEFBl 11) ; AAY59752 (beta defensina 112 humana, DEFBl 12) ; AAY59753 (beta defensina 113 humana, DEFBl 13) ; AAY59754 (beta defensina 114 humana, DEFBl 14) ; AAY59755 (beta defensina 115 humana, DEFB115) ; AA.Y59756 (beta defensina 116 humana, DEFB116) ; AAY59757 (beta defensina 117 humana, DEFB117) ; NP 031869 (defensina beta 1 de ratón) ; NP_034160 (defensina beta 2 de ratón, Defb2) ; NP_038784 (defensina beta 3 de ratón, Defb3); NP 062702 (defensina beta 4 de ratón, Defb4) ; NP_109659 (defensina beta 5 de ratón, Defb5) ; NP_473415 (defensina beta 6 de ratón, Defb6) ; NP_631966 (defensina beta 7 de ratón de ratón, Defb7) ; NP_694748 (defensina beta 8 de ratón, Defb8) ; NP_631965 (defensina beta 9 de ratón, Defb9) ; y NP_631971 (defensina beta 10 de ratón, DefblO) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente. Ver también Patente de los Estados Unidos No. 5,242,902 para secuencias peptídicas humanas y de rata adicionales.

Las proteínas de caja 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1) son proteínas cromosómicas no histonas que funcionan como citocinas, mediando las respuestas locales y sistémicas a la muerte celular necrótica y el cáncer, la invasión por patógenos, trauma y sepsis. Las secuencias polinucleotídicas de las proteínas HMGB1 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM_002128 (humana) ; NM_010439 (de ratón) ; NM_204902 (de pollo) ; y NM_012963 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de caja 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP 002119 (humana) ; NP_034569 (de ratón) ; NP_990233 (de pollo) ; y NP_037095 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las proteínas fagocíticas S100 son mediadoras de respuestas inflamatorias y reclutan células inflamatorias hacia los sitios de daño tisular, y son miembros de las moléculas del patrón molecular asociado al daño (DAMP) que son importantes para la inmunidad innata. Ver Foell et al, J. Leukocyte Biol . 81:1 (2006). Las secuencias polinucleotídicas de las proteínas S100 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso BCO 14392 (S100 Al humana) ; BC002829 (S100 A2 humana) ; BC012893 (S100 A3 humana) ; BC016300 (S100 A4 humana) ; Z 18954 (S100D humana) ; BC001431 (S100 A6 humana) ; BC 034687 (S100 A7 humana) ; BC005928 (S100 A8 humana) ; BC047681 (S100 A9 humana) ; BC015973 (S100 A10 humana) ; D38583 (clagizzarina humana) ; NM_011309 (SlOOal de ratón) ; NM_009115 (SlOOb de ratón) ; NM_013650 (S100a8 de ratón) ; NM_009114 (S100a9 de ratón) ; NM_011310 (S100a3 de ratón) ; NM_011311 (S100a4 de ratón) ; y NM_011312 (S100a5 de ratón) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de proteínas S100 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AAH14392 (S100 Al humana) ; AAH02829 (S100 A2 humana) ; AAH12893 (S100 A3 humana) ; AAH16300 (S100 A4 humana) ; CAA79479 (S100D humana) ; AAHO 1431 (S100 A6 humana) ; AAH34687 (S100 A7 humana) ; AAH05928 (S100 A8 humana) ; AAH47681 (S100 A9 humana) ; AAH15973 (S100 A10 humana) ; BAA07597 (clagizzarina humana) ; NP_035439 (SlOOal de ratón) ; NP_033141 (SlOOb de ratón) ; NP_038678 (S100a8 de ratón) ; NP_033140 (S100a9 de ratón) ; NP_035440 (S100a3 de ratón) ; NP_035441 (S100a4 de ratón) ; y NP_035442 (S100a5 de ratón) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

El mañano, un polisacárido vegetal, que es un polímero de la azúcar mañosa, es útil para la generación de una respuesta inmunitaria. La Patente de los Estados Unidos No. 5,807,559, describe los conjugados inmunogénicos del mañano que pueden ser útiles para generar la inmunidad de células T contra cultivos de carbohidrato asociados al tumor, o contra estructuras de carbohidratos expresadas sobre agentes infecciosos y/o células hospederas infectadas La Patente de los Estados Unidos No. 5,773,425 describe el uso del mañano para aliviar síntomas y/o curar enfermedades virales y para mejorar la respuesta inmunitaria.

Los bacilos de Calmette-Guerin (BCG) , especies de Mycobacterium atenuadas vivas, se utilizan como vacunas para prevenir tuberculosis severa y fatal. La Patente de los Estados Unidos No. 7,393,541 describe la generación de una vacuna con adyuvante para producir una respuesta inmunitaria mediada por células T in vivo, hacia una micobacteria en un sujeto mamífero. Ver también Hubbard y Collins, Infect . Immun. 59(2): 570. La Patente de los Estados Unidos No. 5,292,513 describe un método para aprestar macrofagos in vivo en pacientes en necesidad de actividad bactericida y anti-viral aumentada, con BCG muerto por calor. La secuencia del genoma completo del BCG está disponible de las bases de datos públicas como número de acceso NC_008769 (M bovis BCG str. Pasteur 1173P2, genoma completo).

Los lipopolisacáridos bacterianos (LPS) son endotoxinas que inducen una respuesta inmunitaria fuerte después de la infección con las bacterias Gram-negativas . La Patente de los Estados Unidos No. 4,148,877 describe el fraccionamiento de LPS a partir de cultivo bacteriano y el uso de la fracción como un fármaco para inducir resistencia a la infección bacteriana. La Patente de los Estados Unidos No. 5,292,513 describe un método para aprestar macrófagos¦ in vivo, en pacientes en necesidad de actividad bactericida y anti-viral aumentadas, con LPS .

Moléculas co-estimuladoras (Positivas) El ligando OX40 (OX40L) pertenece al miembro 4 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (ligando) (Tnfsf4) , es expresado sobre células dendríticas y promueve la diferenciación de células Th2. Las secuencias polinucleotídicas del ligando 0X40 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso X79929 (humana) ; U12763 (de ratón) ; y AF037067 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos del ligando 0X40 (OX40L) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso CAA56284 (humana) ; AAA21871 (de ratón) ; y AAC67236 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

El ligando 4-1BB (4-1BBL) pertenece al miembro 9 de la superfamilia de factor de necrosis tumoral (ligando) (Tnfsf9) , que es una proteína transmembranal tipo 2 y es expresada sobre linfocitos T activados. Las secuencias polinucleotídicas de 4-IBBL están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM 003811 (humana) ; NM_009404 (de ratón) ; y AY332409 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos del ligando 4-IBB (4-IBBL) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP_003802 (humana) ; NP_033430 (de ratón) ; y AAQ01228 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

La proteína CD40 pertenece al miembro 5 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral, es esencial en la mediación de una amplia variedad de respuestas inmunitarias e inflamatorias, incluyendo el cambio de clase de inmunoglobulina dependiente de células T, el desarrollo de células B de memoria, y la formación del centro germinal. Las secuencias polinucleotidicas de proteínas de CD40 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso X60592 (humana) ; NM_170701 (de ratón) ; NM_204665 (de pollo) ; y NM_134360 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas CD40 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso CAA43045 (humana) ; NP_733802 (de ratón) ; NP_989996 (de pollo) ; y NP_599187 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

La proteína relacionada al receptor del factor de necrosis tumoral inducida por glucocorticoide (GITR) puede evocar inmunidad tumoral efectiva vía la estimulación de células T. La administración del anticuerpo monoclonal anti-GITR (mAb) puede provocar una potente inmunidad específica del tumor, y erradicar tumores establecidos sin promover una enfermedad auto-inmunitaria patente. Ver Ko et al, J. Exp. Med 7: 885 (2005) . La Patente de los Estados Unidos No. 6,503,184 Bl describe un anticuerpo anti-GITR.

Las secuencias polinucleotídicas del ligando GITR (GITRL) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AY358868 (humana) ; y AY359852 (de ratón) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos del ligando GITR (GITRL) están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso AAQ89227 (humana) ; y AAQ55265 (de ratón) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

El ligando de enlace del mediador de entrada del virus del herpes (HVEM) (HSVgD) , también denominado como p30, o LIGHT es un miembro de la familia TNF involucrado en la coestimulación de células T. LIGHT tiene dos receptores, el mediador de la entrada del virus del herpes (HVEM) y el receptor de linfotoxina- ß (LT^R) . Siendo un ligando para HVEM, HSVgD activa las células T al actuar como un factor co-estimulador para las células T que da como resultado la proliferación de células T y la secreción de citocina. Ver la Patente de los Estados Unidos No. 7,118,742 para las secuencias de polinucleótidos y de aminoácidos de LIGHT. La Patente de los Estados Unidos 5,654,174 describe una proteína gD variante con supresión de los residuos carboxilo-terminales .

CD70 es una citocina que se enlaza a CD27. Ésta juega un papel en la activación de células T. Induce la proliferación de células T co-estimuladas y aumenta la generación de células T citolíticas. Las secuencias polinucleotídicas de CD70 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM_001252 (humana) ; NM_011617 (de ratón) ; y NM_001106878 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de CD70 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP_001243 (humana) ; NP 035747 (de ratón) ; y NP_001100348 (de rata) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

ICOS-L es un ligando para el receptor ICOS de la superficie celular específico de células T y actúa como una señal co-estimuladora para la proliferación de células T y la secreción de citocina. ICOS-L también induce la proliferación de células B y la diferenciación en células plasmáticas. ICOS-L podría jugar un papel importante en la mediación de respuestas tisulares locales a condiciones inflamatorias, así en la modulación de la respuesta inmunitaria secundaria al co-estimular la función de las células T de memoria. Las secuencias polinucleotídicas de ICOS-L están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM_015259 (humana) ; y NM_015790 (de ratón) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de ICOS-L están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP_056074 (humana) ; y NP_056605 (de ratón) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

La proteína PD-L1 (también conocida como CD274) es expresada en monocitos activados, las células T y B. PD-L1 es supra-regulado en monocitos después del tratamiento con IFN-gamma, y en células dendríticas y queratinocitos después del tratamiento con IFN-gamma, junto con otros activadores. Las secuencias polinucleotídicas de las proteínas PD-L1 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NM_014143 (humana) ; y NM_021893 (de ratón) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente.

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas PD-L1 están disponibles de las bases de datos públicas como números de acceso NP_054862 (humana) ; y NP_068693 (de ratón) , secuencias de las cuales son incorporadas por referencia en la presente .

Molécula co-estimuladora (negativa) El compuesto 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA4) es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas y es una molécula co-estimuladora expresada en células T activadas. Las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,034,121 y 6,984,720 describen métodos de preparación y uso de los anticuerpos contra CTLA4. La Patente de los Estados Unidos 6,984,720 también describe las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera del anticuerpo anti-CTLA4.

Las moléculas PD-1 son miembros de la superfamilia de genes de inmunoglobulina, que se enlaza al ligando PD-1 (PD-L1) . El enlace de un receptor PD-1 sobre una célula T por PD-L1 transmite una señal co-estimuladora a la célula, lo cual previene que las células progresen a través del ciclo celular, e incrementa la proliferación de células T. La inhibición de una interacción entre PD-L1 y el receptor sobre la célula T con un anticuerpo anti-PD-Ll, da como resultado la sub-regulación de la respuesta inmunitaria, denominada como energía de células inmunitarias . La Patente de los Estados Unidos No. 7,029,674 describe los métodos para la preparación y las secuencia del anticuerpo anti-PD-Ll.

PD-L2 es principalmente conocido como un ligando para PD-1 (o el homólogo humano PDCD1) . No obstante, se ha reportado que PD-12 está involucrado en la señal co-estimuladora, esencial para la proliferación de linfocitos T y la producción de IFN-gamma de una manera independiente de PDCD1. La interacción con PDCD1 inhibe la proliferación de células T al bloquear la progresión del sitio celular y la producción de citocina. Yamazaki et al, J. of Immunol . 169: 5538 (2002) y Ansari et al, J. Exp. Med. 198: 63 (2003) describen la preparación de anticuerpos monoclonales anti-PD-L2.

Supresores Inmunitarios Contrarios (Inhibidores de Tolerancia) El factor beta de crecimiento transformante (TGF-ß) es una proteína multifuncional que regula la proliferación y diferenciación celular, al interactuar con uno de los dos receptores de serina/treonina-cinasa transmembranales , tipo I y tipo II. Ver Chen et al, Science 28: 1335 (1993). El receptor de TGF tipo II (TGFR2) fosforila y activa los receptores tipo I los cuales se autofosforilan, luego se enlazan a y activan los reguladores transcripcionales SMAD. Lynch MA et al, Cáncer Res. 58: 4227 (1998) describe las mutaciones en el gen del receptor tipo II del factor ß de crecimiento transformante (TGFBR2) que están asociados con los carcinomas de ovario humano. Brand et al, J. Biol . Chem. 255:11500-11503 (1993) describe que la supresión del dominio citoplásmico predicho de serina/teronina-cinasa (nucleótidos 1172-2036 de TGF R2 ADNc H2-3FF, disponible de las bases de datos públicas como número de acceso M85079 y las secuencias de aminoácidos disponibles como número de acceso AAA61164) deteriora las expresiones de los genes dependientes de los tres TGF-ß (1, 2 y 3) . TGF-ß es producido en la mayoría de los tumores humanos e inhibe la inmunidad celular específica del antígeno tumoral . Foster et al, J. Immunother. 31:500 (2008) describe que la expresión del TGFPR2 negativo dominante, en los linfocitos T citotóxicos, puede conducir a resistencia a los efectos inhibitorios de TGF-ß.

TGF actúa sinérgicamente con TGFa en la inducción de transformación. Éste también actúa como un factor de crecimiento autócrino negativo. La desregulación de la activación de TGFfi y la señalización puede dar como resultado la apoptosis. Ziyadeh et al, Proc . Nati. Acad. Sci . 97: 8015 (2000) describe que la administración del anticuerpo anti-TGFfi puede prevenir la insuficiencia renal y la glomeruloesclerosis y los ratones db/db, un modelo de diabetes tipo II que desarrolla nefropatía evidente. Los métodos de generación y uso de los anticuerpos monoclonales para TGF se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 6,419,928. Barcellos-Hoff et al., Am J. Pathol . 147:5 (1995) también describe un método para la generación del anticuerpo para ??ß. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos para las construcciones de la proteína de fusión de TGF$ se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 6, 756, 215.

La IL-10 es una citocina producida por las células Th2 activadas, las células B, queratinocitos , monocitos, y macrófagos. IL-10 inhibe la síntesis de un número de citocinas, incluyendo IFN-gamma, IL-2, IL-3, TNF y GM-CSF producidas por macrófagos activados y por las células T cooperadoras. IL-10 es útil en la promoción de desarrollo y diferenciación de las células B humanas, activadas, inhibiendo las respuestas de Thl para prevenir el rechazo al trasplante y los trastornos autoinmunitarios mediados por células T. O'Farrell efc al., EMBO J. 17:1006 (1998); Kanbayashi et al, Cell I munol . 171 :153 (1996); Fukushima et al, Br. J. Ophthal ol . 90:1535 (2006); y van Lent et al, Ann. Rheum. Dis . 66:334 (2007) describen la preparación de anticuerpos anti-IL10. La Patente de los Estados Unidos No. 7,326,567 describe la secuencia polinucleotídica del anticuerpo para IL-10. La Patente de los Estados Unidos No. 5,837,232 describe un método para tratar un trastorno autoinmunitario mediado por células B, con anticuerpos anti-IL-10.

El supresor de las familias de señalización de citocinas (SOCS) forma parte de un sistema de retroalimentación negativa clásico, que regula la transducción de señales de citocina. Alexander et al. Cell 98: 597 (1999) describe que el supresor de la señalización 1 de citocina (S0CS1) es un inhibidor crítico de la señalización del interferón-gamma , y previene las acciones neonatales potencialmente fatales de esta citocina. Hilton et al, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 95:114 (1999) discute que SOCSl está involucrada en la regulación negativa de las citocinas que señalan a través de la vía JAK/STAT3. Ohya et al J. Blol . Chem. 272: 27178 (1997) describe que las proteínas SOCS parecen ser un regulador mayor de la señalización por la interleucina 6 (IL-6) y el factor inhibitorio de leucemia (LIF) . La Patente de los Estados Unidos No. 6,534,277 describe un método para la preparación y uso del anticuerpo anti-SOCSl, donde una secuencia de ácido nucleico que codifica para el anticuerpo SOCSl es introducida dentro de las células, tal que el anticuerpo es expresado por las células o su progenie, y las células recombinantes son luego administradas in vivo para efecto terapéutico. Las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,323,317 y 7,049,418 también describen los anticuerpos anti-SOCSl.

TGF- es un polipéptido mitogénico que es capaz de enlazarse al receptor de EGF, y de actuar sinérgicamente con TGF-ß para promover la proliferación celular independiente del anclaje, en agar suave. Ellis et al, N. Engl . J. Med. 317:15% (1987) describe que TGF-OÍ juega un papel en ciertas manifestaciones paraneoplásicas del melanoma. La Patente de los Estados Unidos No. 4,742,003 y Xian et al, The J. of Histoche . & Cytochem. 47:949 (1999) describen los métodos de preparación de los anticuerpos anti-GF-a.

El receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR1) y Fas contienen la proteína citoplásmica asociada a Fas, con dominio de muerte (FADD) , que es esencial para la señalización inducida por Fas y TNF, para la muerte celular programada (apoptosis) y la oligomerización del receptor. Una proteína de mamífero designada FADD que tiene la habilidad para enlazarse a la región citoplásmica o el dominio del receptor Fas que inhibe la apoptosis mediada por FAS, ha sido identificada. La secuencia polinucleotídica de FADD está disponible de las bases de datos públicas como número de acceso U24231, y la secuencia de aminoácidos como número de acceso AAA86517, que son incorporadas por referencia en la presente. El fragmento FADD o el ácido nucleico que lo codifica es un inhibidor negativo dominante de FADD nativo funcionalmente intacto, que se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6,562,797 Bl .

La SEQ ID No. : 1 es una secuencia polinucleotídica de una construcción que codifica para mIL-12 y m-IL21.

La SEQ ID No. : 2 es una secuencia polinucleotídica de una construcción que codifica para hIL-12 y hIL-21.

La SEQ ID No. : 3 es una secuencia polinucleotídica de una construcción que codifica para mIL-21 y mIL-15.

La SEQ ID No . : 4 es una secuencia polinucleotídica de una construcción que codifica para mIL-12.

La SEQ ID No. : 5 es una secuencia polinucleotídica de una construcción que codifica para hIL-21 y hIL-15.

La SEQ ID No. : 6 es una secuencia polinucleotídica de una construcción que codifica para hIL-21.

La SEQ ID No.: 7 es una secuencia polinucleotídica de una construcción que codifica para mIL-21.

La SEQ ID No. : 8 es una secuencia polinucleotídica de una construcción que codifica para hIL-21.

La SEQ ID No.: 9 es una secuencia polinucleotídica que codifica para mIL-21.

La SEQ ID No.: 10 es una secuencia de aminoácidos de mIL-21.

La SEQ ID No.: 11 es una secuencia polinucleotídica que codifica para mIL-15.

La SEQ ID No. : 12 es una secuencia de aminoácidos de mIL-15.

La SEQ ID No.: 13 es una secuencia polinucleotídica que codifica para mp40 de mIL-12.

La SEQ ID No.: 14 es la secuencia de aminoácidos de mp40 de mIL-12.

La SEQ ID No. : 15 es una secuencia polinucleotídica que codifica para mp35 de mIL-12.

La SEQ ID No.: 16 es la secuencia de aminoácidos de mp35 de mIL-12.

La SEQ ID No.: 17 es una secuencia polinucleotídica que codifica para hIL-21.

La SEQ ID No.: 18 es la secuencia de aminoácidos de hIL-21.

La SEQ ID No. : 19 es una secuencia polinucleotídica que codifica para hIL-15.

La SEQ ID No. : 20 es la secuencia de aminoácidos de hIL-15.

La SEQ ID No.: 21 es una secuencia polinucleotídica que codifica para p40 de hIL-12.

La SEQ ID No. : 22 es la secuencia de aminoácidos de p40 de hIL-12.

La SEQ ID No.: 23 es una secuencia polinucleotídica que codifica para p35 de hIL-12.

La SEQ ID No. : 24 es la secuencia de aminoácidos de p35 de hIL-12.

La SEQ ID No.: 25 es una secuencia de ácido nucleótido de un elemento de respuesta a la ecdisona, encontrada en Drosophila .

La SEQ ID No. : 26 es una secuencia de ácido nucleótido de un elemento de la respuesta de ecdisona encontrada en Drosophila m lanogaste .

La SEQ ID No. : 27 es una secuencia de ácido nucleótido de un elemento de la respuesta de ecdisona encontrada en Drosophila melanogaster.

La SEQ ID No . : 28 es un sitio de restricción de una enzima endonucleasa doméstica (HE) (I-Scel) La SEQ ID No.: 29 es una secuencia de ADN del vector adenoviral que comprende la secuencia de codificación de la IL-12 humana: Ad-RTS-hIL-12 (SPl-RheoIL-12) .

Descripción Detallada de la Invención DEFINICIONES A no ser que se definan de otro modo, todos los términos de la técnica, las notaciones, y otros términos científicos o terminología científica utilizada en la presente, están destinados a tener los significados comúnmente entendidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos son definidos en la presente para claridad y/o para fácil referencia y entendimiento, y la inclusión de tales definiciones en la presente no debe ser necesariamente considerada como una diferencia sustancial sobre lo que es en general entendido en la técnica. Las definiciones comúnmente entendidas de los términos de biología molecular y/o los métodos y/o los protocolos de la misma, pueden ser encontrados en Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5a edición, Springer-Verlag : New York, 1991; Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994; Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001) y Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (1994). Como sea apropiado, los procedimientos que involucran el uso de kits y/o reactivos comercialmente disponibles, son en general llevados a cabo de acuerdo con la guía y/o los protocolos y/o los parámetros del fabricante, ha no ser que se indique de otro modo.

El término "aislado" para los propósitos de la invención, designa un material biológico (célula, ácido nucleico o proteína) que ha sido eliminado de su ambiente original (el ambiente en el cual éste está naturalmente presente) . Por ejemplo, un polinucleótido presente en el estado natural en una planta o en un animal no está aislado, sin embargo, el mismo polinucleótido separado de los ácidos nucleicos adyacentes en los cuales éste está naturalmente presente, es considerado "aislado".

El término "purificado", como se aplica a los materiales biológicos, no requiere que el material esté presente en una forma que muestre pureza absoluta, excluyendo la presencia de otros compuestos. Ésta es más bien una definición relativa. "Ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "oligonucleótido" , "nucleótido" y "polinucleótido" son utilizados intercambiablemente y se refieren a la forma polimérica del éster de fosfato de los ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o¾- citidina; "moléculas de ARN" ) o desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina , o desoxicitidina ; "moléculas de ADN"), o cualesquiera análogos de fosfoéster de los mismos, tales como los fosoforotioatos y tioésteres, ya sea en la forma de una sola hebra, o en una hélice de doble hebra. Son posibles las hélices de doble hebra de AD -ADN, ADN-ARN y ARN-ARN. El término molécula de ácido nucleico y en particular molécula de ADN o ARN, se refiere únicamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula; y no la limitan a cualesquiera formas terciarias particulares. De este modo, este término incluye el ADN de doble hebra encontrado, entre otras cosas, en las moléculas de ADN lineales o circulares (por ejemplo, fragmentos de restricción), plásmidos, ADN superenrollado y cromosomas. En la discusión de la estructura de las moléculas de ADN de doble hebra, particulares, pueden ser descritas las secuencias en la presente, de acuerdo a la convención normal de dar únicamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra no transcrita del ADN (por ejemplo, la hebra que tiene una secuencia homologa al ARNm) . Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que ha sufrido una manipulación biológica molecular. El ADN incluye, pero no está limitado a, ADNc, ADN genómico, ADN plásmido, ADN sintético, y ADN semi-sintético .

El término "fragmento, " como es aplicado a las secuencias polinucleotídicas , se refiere a una secuencia de nucleótidos de longitud reducida, con relación al ácido nucleico de referencia y que comprende, sobre la porción común, una secuencia nucleotídica idéntica al ácido nucleico de referencia. Tal fragmento de ácido nucleico de acuerdo a la invención puede ser, donde sea apropiado, incluido en un polinucleótido más grande del cual éste es un constituyente. Tales fragmentos comprenden, o consisten alternativamente de, oligonucleótidos en el intervalo de longitud de al menos 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, o más nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico de acuerdo a la invención.

Como se utiliza en la presente, un "fragmento de ácido nucleico aislado" se refiere a un polímero de ARN o ADN que es de una sola hebra o de doble hebra, que contiene opcionalmente bases nucleotídicas sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en la forma de un polímero de ADN, puede estar comprendido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

Un "gen" se refiere a un polinucleótido que comprende nucleótidos que codifican para una molécula funcional, incluyendo las moléculas funcionales producidas mediante transcripción únicamente (por ejemplo, una especie de ARN bioactiva) o mediante transcripción y traducción (por ejemplo, un polipéptido) . El término "gen" abarca el ADNc y los ácidos nucleicos de ADN genómico. "Gen" también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa un AR específico, proteína o polipéptido, incluyendo las secuencias reguladoras que preceden (secuencias de no codificación 5') y que siguen (secuencias de no codificación 3') la secuencia de codificación. "Gen nativo" se refiere a un gen como es encontrado en la naturaleza, con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no sea un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y/o de codificación que no sean encontradas juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias de codificación que son derivadas de fuentes diferentes, o secuencias reguladoras y secuencias de codificación derivadas de la misma fuente, pero acomodadas de una manera diferente a la que es encontrada en la naturaleza. Un gen quimérico puede comprender las secuencias de codificación derivadas de diferentes fuentes y/o secuencias regulatorias derivadas de diferentes fuentes. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su posición natural en el genoma de un organismo. Un gen "extraño" o "heterólogo" se refiere a un gen no normalmente encontrado en el organismo hospedero, sino que es introducido dentro del organismo hospedero mediante transferencia génica. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados dentro de un organismo no nativo, o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que ha sido introducido dentro del genoma mediante un procedimiento de transformación. Por ejemplo, el gen de la interleucina- 12 (IL-12) codifica para la proteína IL-12. IL-12 es un heterodímero de una subunidad de 35-kD (p35) y una subunidad de 40-kD (p40) enlazadas a través de un enlace disulfuro para hacer IL-12p70 completamente funcional. El gen de IL-12 codifica para las subunidades p35 y p40.

"ADN heterólogo" se refiere al ADN no naturalmente localizado en la célula, o en un sitio cromosómico de la célula. El ADN heterólogo puede incluir un gen extraño a la célula .

El término "genoma" incluye el ADN o ARN cromosómico, así como mitocondrial, de cloroplastos y viral.

Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico, o ARN, cuando una forma de una sola hebra de la molécula de ácido nucleico puede recocerse a la otra molécula de ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica en solución. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y ejemplificadas en Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989) , particularmente Capítulo 11 y Tabla 11.1 en ésta) . Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "exigencia" de la hibridación.

Las condiciones exigentes pueden ser ajustadas para seleccionar los fragmentos moderadamente similares, tales como las secuencias homologas provenientes de organismos distantemente relacionados, a fragmentos altamente similares, tales como los genes que duplican las enzimas funcionales provenientes de organismos estrechamente relacionados. Para la selección preliminar para los ácidos nucleicos homólogos, pueden ser utilizadas las condiciones de hibridación de baja existencia, correspondientes a una Tm de 55°C, por ejemplo, 5X SSC, 0.1% de SDS, 0.25% de leche, y sin formamida, o 30% de formamida, 5X SSC, 0.5% de SDS. Las condiciones de hibridación de exigencia moderada corresponden a una Tm, más alta, por ejemplo, 40% de formamida, con 5X ó 6X SSC. Las condiciones de hibridación de alta exigencia corresponden a la Tm, más alta, por ejemplo, 50% de formamida, 5X ó 6X SSC.

La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la exigencia de la hibridación, son posibles disparidades entre bases. El término "complementario" es utilizado para describir la relación entre las bases nucleotídicas que son capaces de hibridarse una con la otra. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. En consecuencia, la invención también incluye los fragmentos aislados de ácido nucleico que son complementarios a las secuencias completas, como se describen o se utilizan en la presente, así como aquellas secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente similares.

En una modalidad de la invención, los polinucleótidos son detectados mediante el empleo de condiciones de hibridación que comprenden un paso de hibridación a Tn, de 55 °C, y utilizando condiciones como se describen anteriormente. En otras modalidades, la Tm es 60°C, 63°C, ó 65°C.

Los lavados pos-hibridación también determinan las condiciones de exigencia. Un grupo de condiciones utiliza una serie de lavados comenzando con 6X SSC, 0.5% de SDS a temperatura ambiente por 15 minutos (min) , luego repetidas con 2X SSC, 0.5% de SDS a 45°C por 30 min, y luego repetidas con 0.2X SSC, 0.5% de SDS a 50 °C por 30 min. Un grupo preferido de condiciones exigentes utiliza temperaturas más altas en las cuales los lavados son idénticos a aquellos anteriormente mencionados, excepto por la temperatura de los dos lavados finales de 30 min en 0.2X SSC, 0.5% de SDS que se incrementa a 60 °C. Otro grupo preferido de condiciones altamente exigentes utiliza dos lavados finales en 0. IX SSC, 0.1% de SDS a 65°C.

La exigencia apropiada para la hibridación de los ácidos nucleicos, depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Entre mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias nucleotídicas , mayor es el valor de Tra para los híbridos de los ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a la Tm más alta) de las hibridaciones de ácidos nucleicos, disminuye en el siguiente orden: ARN :ARN, AD :AR , ADN:ADN . Para los híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, las ecuaciones para calcular Tm han sido derivadas (ver Sambrook et al, supra, 9.50-0.51) . Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, por ejemplo, oligonucleótidos , la posición de las disparidades se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (ver Sambrook et al., supra, 11.7-11.8) .

En una modalidad de la invención, los polinucleótidos son detectados mediante el empleo de condiciones de hibridación que comprenden un paso de hibridación en al menos de 500 mM y al menos 37°C, y un paso de lavado en 2X SSPE a una temperatura de al menos 63 °C. En otra modalidad más, las condiciones de hibridación comprenden menos de 200 mM de sal y menos 37°C para el paso de hibridación. En una modalidad adicional, las condiciones de hibridación comprenden 2X SSPE y 63 °C para los pasos de hibridación y de lavado.

En otra modalidad más, la longitud para un ácido nucleico hibridable es al menos de aproximadamente 10 nucleótidos. Preferentemente, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es al menos de 15 nucleótidos; por ejemplo, al menos aproximadamente 20 nucleótidos; por ejemplo, al menos 30 nucleótidos. Además, el experto en la técnica reconocerá que la temperatura y la concentración de la sal de la solución de lavado pueden ser ajustadas como sea necesario de acuerdo a factores tales como la longitud de la sonda .

El término "sonda" se refiere a una molécula de ácido nucleico de una sola hebra que puede tener apareamiento de bases con un ácido nucleico objetivo de una sola hebra, complementario, para formar una molécula de doble hebra.

Como se utiliza en la presente, el término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico corto que es hibridable a una molécula de ADN genómico, una molécula de ADNc, un ADN plásmido o una molécula de ARNm. Los oligonucleótidos pueden ser marcados, por ejemplo, con 32p-nucleótidos o nucleótidos a los cuales ha sido covalentemente conjugado un marcador, tal como la biotina. Un oligonucleótido marcado puede ser utilizado como una sonda para detectar la presencia de un ácido nucleico. Los oligonucleótidos (uno o ambos de los cuales pueden estar marcados) pueden ser utilizados como cebadores de PCR, ya sea para la clonación de longitud completa o un fragmento de un ácido nucleico, para el secuenciamiento del ADN o para detectar la presencia de un ácido nucleico. Un oligonucleótido puede ser también utilizado para formar una triple hélice con una molécula de ADN. En general, los oligonucleótidos son preparados sintéticamente, preferentemente sobre un sintetizador de ácido nucleico. En consecuencia, los oligonucleótidos pueden ser preparados con enlaces análogos fosfoéster de origen no natural, tales como los enlaces tioéster, etc.

Un "cebador" se refiere a un oligonucleótido que se híbrida a una secuencia objetivo de ácido nucleico para crear una región de ácido nucleico de doble hebra que puede servir como un punto de inicio para la síntesis del ADN bajo condiciones adecuadas. Tales cebadores pueden ser utilizados en una reacción en cadena de polimerasa o para el secuenciamiento de ADN.

La "reacción en cadena de polimerasa" es abreviada PCR y se refiere a un método in vitro para amplificar enzimáticamente secuencias específicas de ácido nucleicos. PCR involucra una serie repetitiva de ciclos de temperatura con cada ciclo que comprende tres etapas: la desnaturalización del ácido nucleico plantilla para separar las hebras de la molécula objetivo, recociendo un cebador oligonucleotídico de PCR de una sola hebra al ácido nucleico plantilla, y la extensión del o de los cebadores recocidos mediante ADN-polimerasa . La PCR proporciona un medio para detectar la presencia de la molécula objetivo y, bajo condiciones cuantitativas o semi-cuantitativas, para determinar la cantidad relativa de esa molécula objetivo dentro del combinado inicial de ácidos nucleicos.

"Reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa" es abreviada RT-PCR y se refiere a un método in vitro para producir enzimáticamente una molécula de ADNc objetivo o moléculas provenientes de una molécula o varias moléculas de ARN, seguido por la amplificación enzimática de una secuencia o secuencias específicas de ácido nucleico o secuencias dentro de la molécula o moléculas de ADNc objetivo, como se describe anteriormente. La RT-PCR también proporciona un medio para detectar la presencia de la molécula objetivo y, bajo condiciones cuantitativas o semi-cuantitativas , para determinar la cantidad relativa de esa molécula objetivo dentro del combinado inicial de ácidos nucleicos .

Una "secuencia de codificación" de ADN se refiere a una secuencia de ADN de doble hebra que codifica para un polipéptido y puede ser transcrita y traducida en un polipéptido en una célula in vitro o in vivo, cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas. Las "secuencias reguladoras adecuadas" se refieren a las secuencias nucleotídicas localizadas corriente arriba (secuencias de no codificación 5'), dentro de, o corriente abajo (secuencias de no codificación 3') de una secuencia de codificación, y que influye en la transcripción, el procesamiento y la estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia de codificación asociadas. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores secuencias guía de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitios de procesamiento de ARN, sitios de enlace efectores y estructuras de tronco-bucle. Los límites de las secuencias de codificación son determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un cod n de detención de la traducción en el extremo 3' (carboxilo) . Una secuencia de codificación puede incluir, pero no está limitada a, secuencias procarióticas ADNc proveniente del ARNm, secuencias de ADN genómico, e incluso secuencias de ADN sintético. Si la secuencia de codificación está destinada para la expresión en una célula eucariótica, una señal de poliadenilación y la secuencia de terminación de la transcripción usualmente estarán localizadas 3 'a la secuencia de codificación.

"Estructura de lectura abierta" es abreviada ORF y se refiere a una longitud de frecuencia de ácido nucleico, ya sea ADN, ADNc o ARN, que comprende una señal de inicio de la traducción o codón de inicio, tal como un ATG o AUG, y un codón de terminación, y puede ser potencialmente traducido en una secuencia polipeptídica .

El término "cabeza a cabeza" es utilizado en la presente para describir la orientación de dos secuencias polinucleotídicas una con relación a la otra. Dos polinucleótidos son colocados en una orientación cabeza a cabeza cuando el extremo 5 ' de la hebra de codificación de un polinucleótido está adyacente al extremo 5' de la hebra de codificación del otro polinucleótido, con lo cual la dirección de transcripción de cada polinucleótido procede lejos del extremo 5' de los otros polinucleótidos . El término "cabeza a cabeza" puede ser abreviado (5')-a-(5') y puede también ser indicado por los símbolos («- ?) o (3'«-5 ' 51 ?3 · ) .

El término "cola-a-cola" es utilizado en la presente para describir la orientación de dos secuencias de polinucleótido una con relación a la otra. Dos polinucleótidos son colocados en la orientación cola-acola cuando el extremo 3 ' de la hebra de codificación de un polinucleótido está adyacente al extremo 3 ' de la hebra de codificación del otro polinucleótido, con lo cual la dirección de transcripción de cada polinucleótido procede hacia el otro polinucleótido. El término "cola-a-cola" puede ser abreviado (3')-a-(3!) y puede ser también indicado por los símbolos («- ?) o (51 ? 3'3'? El término "cabeza-a-cola" es utilizado en la presente para describir la orientación de dos secuencias polinucleotídicas una con relación a la otra. Dos polinucleótidos son colocados en una orientación cabeza-acola cuando el extremo 5' de la hebra de codificación de un polinucleótido está adyacente al extremo 31 de la hebra de codificación del otro polinucleótido, con lo cual la dirección de transcripción de cada polinucleótido procede en la misma dirección que aquella del otro polinucleótido. El término "cabeza-a-cola" puede ser abreviado (5')-a-(3') y puede ser también indicado por los símbolos (? ? ) o (5'? 3 ' 5 ' ? 3 ' ) .

El término "conexión hacia abajo o corriente abajo" se refiere a una secuencia nucleotídica que está localizada 3' a una secuencia nucleotídica de referencia. En particular, las secuencias nucleotídicas con dirección 31 en general se refieren que siguen el punto inicial de transcripción. Por ejemplo, el codón de inicio de la traducción de un gen está localizado con dirección 3 ' del sitio de inicio de transcripción.

El término "con dirección hacia arriba o corriente arriba" se refiere a una secuencia nucleotídica que está localizada 5' a una secuencia nucleotídica de referencia. En particular, las secuencias nucleotídicas con dirección 5' en general se refieren a las secuencias que están localizadas sobre el lado 5' de una secuencia de codificación o el punto inicial de la transcripción. Por ejemplo, la mayoría de los promotores están localizados con dirección 5' del sitio de inicio de la transcripción.

Los términos "endonucleasa de restricción" y "enzima de restricción" son utilizados intercambiablemente y se refieren a una enzima que se enlaza a y corta dentro de una secuencia nucleotídica específica dentro del ADN de doble hebra .

"Recombinación homologa" se refiere a la inserción de una secuencia de ADN extraño, dentro de otra molécula de ADN, por ejemplo, la inserción de un vector en un cromosoma. Preferentemente, el vector se dirige a un sitio cromosómico específico para la recombinación homológica. Para la recombinación homologa específica, el vector contendrá suficientes regiones largas de homología a las secuencias del cromosoma, para permitir el enlace complementario y la incorporación del vector dentro del cromosoma. Regiones más largas de homología, y más altos grados de similitud secuencial, pueden incrementar la eficiencia de la recombinación homologa.

Varios métodos conocidos en la técnica pueden ser utilizados para propagar un polinucleótido de acuerdo a la invención. Una vez que un sistema hospedero adecuado y las condiciones de crecimiento son establecidas, los vectores de expresión recombinantes pueden ser propagados y preparados en cantidad. Como se describe en la presente, los vectores de expresión que pueden ser utilizados incluyen, pero no están limitados a, los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales tales como el virus de la vaccinia o adenovirus; virus de insecto tales como baculovirus ; virus de levadura; vectores bacteriófagos (por ejemplo, lambda) , y vectores de ADN plásmidos y cósmidos, por nombrar solo unos pocos .

Un "vector" se refiere a cualquier vehículo para la clonación de y/o transferencia de un ácido nucleico dentro de una célula hospedera. Un vector puede ser un replicón al cual puede ser enlazado otro segmento de ADN para dar origen así a la replicación del segmento enlazado. Un replicón se refiere a cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, fago, cósmido, cromosoma, virus) que funcione como una unidad autóloga de la replicación del ADN in vivo, por ejemplo, capaz de realizar la replicación bajo su propio control. El término "vector" incluye los vehículos virales y no virales para introducir el ácido nucleico dentro de una célula in vitro, ex vivo o in vivo. Un número grande de vectores conocidos en la técnica pueden ser utilizados para manipular los ácidos nucleicos, para incorporar elementos de respuesta y promotores dentro de genes, etc. Los posibles vectores incluyen, por ejemplo, plásmidos o virus modificados que incluyen, por ejemplo bacteriófagos, tales como los derivados lambda o plásmidos tales como pBR322 o derivados de plásmido pUC, o el vector Bluescript . Otro ejemplo más de vectores que son útiles en la invención es el Sistema de Producción UltraVectorMR (Intrexon Corp., Blacksburg, VA) como se describe en WO 2007/038276. Por ejemplo, la inserción de los fragmentos de ADN correspondientes a los elementos de respuesta y los promotores dentro de un vector adecuado, puede ser lograda mediante la ligadura de los fragmentos apropiados de ADN dentro de un vector elegido que tiene extremos cohesivos complementarios. Alternativamente, los extremos de las moléculas de ADN pueden ser enzimáticamente modificadas o cualquier sitio puede ser producido mediante la ligadura de secuencias nucleotídicas (ligadores) dentro de los extremos de ADN. Tales vectores pueden ser manipulados para contener genes marcadores seleccionables que proporcionan la selección de células que han incorporado el marcador dentro del genoma celular. Tales marcadores permiten la identificación y/o la selección de células hospederas que incorporan y expresan las proteínas codificadas por el marcador.

Los vectores virales, y particularmente vectores retrovirales , han sido utilizados en una amplia variedad de aplicaciones de distribución de genes en células, así como sujetos animales vivos. Los vectores virales que pueden ser utilizados incluyen, pero no están limitados a, retrovirus, virus adeno-asociados , viruela, baculovirus, vaccinia, herpes simple, Epstein-Barr, adenovirus, geminivirus, y vectores caulimovirus . Los vectores no virales incluyen plásmidos, liposomas, lípidos eléctricamente cargados (citofectinas) , complejos de ADN-proteína y biopolímeros . Además de un ácido nucleico, un vector puede también comprender una o más regiones reguladoras y/o marcadores seleccionabes útiles en la selección, medición y monitoreo de los resultados de la transferencia de ácido nucleico (transferencia a cuáles tejidos, duración de la expresión, etc.) .

El término "plásmido" se refiere a un elemento extracromosómico que a menudo posee un gen que no es parte del metabolismo central de la célula, y usualmente están en la forma de moléculas de ADN de doble hebra, circulares. Tales elementos pueden ser secuencias de replicación autónomas, secuencias de integración genómica, secuencias de fago o de nucleótido, lineales, circulares, o superenrolladas de un ADN o ARN de una sola hebra o de doble hebra, derivado de cualquier fuente, en el cual un número de secuencias nucleotídicas han sido unidas o recombinadas en una construcción única que es capaz de introducir un fragmento promotor y la secuencia de ADN para un producto génico seleccionado, junto con la secuencia 3' no traducida, apropiada, dentro de una célula.

Un "vector de clonación" se refiere a un "replicón", el cual es una longitud unitaria de un ácido nucleico, preferentemente un ADN, que se replica secuencialmente y que comprende un origen de replicación, tal como un plásmido, fago, o cósmido, al cual puede ser enlazado otro segmento de ácido nucleico, para dar origen así a la replicación del segmento enlazado. Los vectores de clonación pueden ser capaces de realizar la replicación en un tipo celular y la expresión en otro más ("vector lanzadera") . Los vectores de clonación pueden comprender una o más secuencias que pueden ser utilizadas para la selección de células que comprenden el vector y/o uno o más sitios de clonación múltiples para la inserción de las secuencias de interés.

El término "vector de expresión" se refiere a un vector, plásmido, o vehículo diseñado para hacer posible la expresión de una secuencia insertada de ácido nucleico después de la transformación dentro del hospedero. El gen clonado, por ejemplo, la secuencia insertada de ácido nucleico, es usualmente colocado bajo el control de elementos de control tales como un promotor, un promotor mínimo, un aumentador, o similares. Las regiones de control de inicio o los promotores, que son útiles para colocar la expresión de un ácido nucleico en la célula hospedera deseada, son numerosos y son familiares para aquellos expertos en la técnica. Virtualmente cualquier promotor capaz de impulsar la expresión de estos genes puede ser utilizado en un vector de expresión, incluyendo, pero no limitado a, promotores virales, promotores bacterianos, promotores animales, promotores de mamífero, promotores sintéticos, promotores, constitutivos, promotores específicos de tejidos, promotores relacionados a la, patogénesis o a la enfermedad, promotores específicos de desarrollo, promotores inducibles, promotores regulados por luz; CYC1, HIS3, GAll, GAL4 , GALIO, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3 , LEU2 , ENO, TPI , promotores de fosfatasa alcalina (útiles para la expresión en Saccharomyces) ; promotor AOX1 (útil para la expresión en Pichia) ; los promotores de ß-lactamasa, lac, ara, tet, trp, IPL, IPR, T7, tac, y trc (útiles para la expresión en Escherichia coli) ; el virus mosaico de la coliflor 35S, específico de ovario, específico de polen , específico de semillas, regulado por luz. CMV 35S mínimo, virus del mosaico de la vena de mandioca (CsVMV) , proteína de enlace a la clorofila a/b, ribulosa 1, 5-bisfosfato-carboxilasa, específico de brotes, específico de raíz, quitinasa, inducible por estrés, virus baciliforme de raíz tungro, super-promotor de plantas, leucina-aminopeptidasa de papa, nitrato-reductasa, manopina-sintasa, nopalin-sintasa, ubiquitina, proteína zeína, y promotores de antocianina (útiles para la expresión en células vegetales) ,- promotores animales y de mamífero conocidos en la técnica que incluyen, pero no están limitados a, la región temprana promotora del SV40 (SV40e) , el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' (LTR) del virus del sarcoma de Rous (RSV) , los promotores del E1A o los genes del promotor tardío mayor (MLP) de adenovirus (Ad) , el promotor delgado del citomegalovirus (CMV) , el promotor de la timidina-cinasa (TK) del virus del herpes simple (HSV) , un promotor de vaculovirus IE1, un promotor del factor 1 alfa de alargamiento (EF1) , un promotor de la fosfoglicerato-cinasa (PGK) , un promotor de ubiquitina (Ubc) , un promotor de albúmina, las secuencias reguladoras del promotor de metalotioneina-L de ratón y regiones de control transcripcional , promotores ubicuos (HPRT, vimentina, a-actina, tubulina y similares) , los promotores de los filamentos intermedios (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP, y similares) , los promotores de genes terapéuticos (del MDR, CFTR o el factor tipo VIII, y similares) , promotores relacionados a la patogénesis o a la enfermedad, y promotores que muestran especificidad de tejido y han sido utilizados en animales transgénicos , tales como la región de control del gen de la elastasa I que es activado en células acinares pancreáticas; la región de control del gen de la insulina, activa en células beta pancreáticas, la región de control del gen de inmunoglobulina activa, en células linfoides, la región de control del virus del tumor mamario de ratón activa en células testiculares , de mama, linfoides y mastocitos, el gen de la albúmina, las regiones de control Apo AI y Apo AII activas en hígado, la región de control del gen de la alfa-fetoproteína activa en hígado, la región de control del gen de antitripsina alfa 1-antitripsina en hígado, la región de control del gen de la beta-globina activa en células mieloides, la región de control del gen de la proteína básica de mielina activa en células de oligodendrocitos en el cerebro, la región de control del gen de la cadena 2 ligera de miosina activa en músculo esquelético, y la región de control del gen de la hormona de liberación de gonadotropina , activa en el hipotálamo, el promotor de la piruvato-cinasa, el promotor de la villina, el promotor de la proteína de enlace a ácidos grasos, el promotor de la alfa actina de célula del músculo liso y similares. Además, estas secuencias de expresión pueden ser modificadas por la adición de secuencias aumentadoras o reguladoras y similares.

Los vectores pueden ser introducidos dentro de las células hospederas deseadas mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transíección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE-dext ano, precipitación con fosfato de calcio, lipofección (fusión de lisosoma) , uso de una pistola de genes, o un transportador o vector de ADN (ver por ejemplo, Wu et . al, J. Biol . Chem. 267:963 (1992); Wu et al, J. Biol. Chem. 255:14621 (1988); y Hartmut et al, Solicitud de Patente Canadiense No. 2, 012, 311) .

Un polinucleótido de acuerdo con la invención puede ser también introducido in vivo mediante lipofección. En la última década, ha existido un uso cada vez mayor de liposomas para el encapsulamiento y transfeccion de ácidos nucleicos in vitro. Los lípidos catiónicos sintéticos diseñados para limitar las dificultades y los peligros encontrados con la transfeccion mediada por liposomas, pueden ser utilizados para preparar liposomas para la transfeccion in vivo de un gen que codifica para un marcador (Feigner et al, Proc. Nati Acad. Sci. USA. 84:7413 (1987); Mackey et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 55:8027 (1988); y Ulmer et al, Science 259:1745 (1993)). El uso de lípidos catiónicos pueden promover el encapsulamiento de ácidos nucleicos negativamente cargados, y también promover la fusión con membranas celulares negativamente cargadas (Feigner et al, Science 337:387 (1989)). Los compuestos lipidíeos particularmente útiles y las composiciones para la transferencia de ácidos nucleicos se describen en W095/18863, 096/17823 y U.S. 5,459,127. El uso de la lipofección puede introducir genes exógenos dentro de los órganos específicos in vivo, lo cual tiene ciertas ventajas prácticas. La dirección molecular de los liposomas a células específicas, representa un área de beneficio. Es claro que la dirección de la transfeccion a tipos celulares particulares, podría ser particularmente preferida en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, hígado, riñon, y cerebro, los lípidos pueden ser químicamente acoplados a otras moléculas para el propósito de dirección al objetivo (Mackey et al. 1988, supra) . Los péptidos dirigidos, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores , y proteínas tales como anticuerpos, o moléculas no peptídicas, podrían ser acoplados a liposomas químicamente .

Otras moléculas son también útiles para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, tal como un oligopétido catiónico (por ejemplo, W095/21931), péptidos derivados de proteínas de enlace al ADN (por ejemplo, WO96/25508) , o un polímero catiónico (por ejemplo, W095/21931) .

Es también posible introducir un vector in vivo como un plásmido de ADN desnudo (ver las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,693,622, 5,589,466 y 5,580,859). Los procedimientos de distribución de ADN mediados por receptor, puede ser también utilizados (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147 (1992); y Wu et al, J. Biol . Chem. 262:4429 (1987)).

El término "transfección" se refiere a la absorción de ARN o ADN exógeno o heterólogo por una célula. Una célula ha sido "transíectada" por ARN o ADN exógeno o heterólogo cuando tal ARN o ADN ha sido introducido dentro de la célula.

Una célula ha sido "transformada" por ARN o ADN exógeno o heterólogo cuando el ARN o ADN efectúa un cambio fenotípico. La transformación del ARN o ADN puede ser integrada (covalentemente enlazada) dentro del ADN cromosómico que constituye el genoma de la célula.

"Transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico dentro del genoma de un organismo hospedero, dando como resultado la herencia genéticamente estable. Los organismos hospederos que contienen fragmentos de ácido nucleicos transformados, son denominados como organismos "transgénicos " o "recombinantes" o "transformados" .

Además, el vector recombinante que comprende un polinucleótido de acuerdo a la invención puede incluir uno o más orígenes para la replicación en hospederos celulares en los cuales su amplificación o su expresión es buscada, en marcadores o marcadores seleccionables .

El término "marcador seleccionable" se refiere a un factor de identificación, usualmente un gen de resistencia a antibióticos o a productos químicos, que es capaz de ser seleccionado con base en el efecto del gen marcador, por ejemplo, resistencia a un antibiótico, resistencia a un herbicida, marcadores colorimétricos , enzimas, marcadores fluorescentes, y similares, en donde el efecto es utilizado para rastrear la herencia de un ácido nucleico de interés y/o para identificar una célula u organismo que ha heredado el ácido nucleico de interés. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables conocidos y utilizados en la técnica incluyen: genes que proporcionan resistencia a la ampicilina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, higromicina, herbicida bialafos, sulfonamida y similares; y genes que son utilizados como marcadores fenotípicos, por ejemplo, genes reguladores de antocianina, gen de la isopentanil-transferasa, y similares.

El término "gen reportero" se refiere a un ácido nucleico que codifica para un factor de identificación que es capaz de ser identificado con base en el efecto del gen reportero, donde el efecto es utilizado para rastrear la herencia de un ácido nucleico de interés, para identificar una célula u organismo que ha heredado el ácido nucleico de interés, y/o para medir la inducción de la expresión del gen o la transcripción. Los ejemplos de genes reporteros conocidos y utilizados en la técnica incluyen: luciferasa (L c) , proteína fluorescente verde (GFP) , cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT) , ß-galactosidasa (LacZ) , ß-glucuronidasa (Gus) , y similares. Los genes marcadores seleccionables pueden ser también considerados genes reporteros .

El "promotor" y "secuencia promotora" se utilizan intercambiablemente y se refieren a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o el ARN funcional. En general, una secuencia de codificación está localizada 3' a una secuencia promotora. Los promotores pueden ser derivados en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprenden segmentos de ADN sintéticos. Se entiende por aquellos expertos en la técnica que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares, o en diferentes etapas del desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales o fisiológicas. Los promotores que provocan que un gen sea expresado en la mayoría de los tipos celulares a la mayoría de los tiempos, son comúnmente denominados como "promotores constitutivos". Los promotores que provocan que un gen sea expresado en un tipo celular específico son comúnmente denominados como " promotores específicos de células" o "promotores específicos de tejidos". Los promotores que provocan que un gen sea expresado en una etapa específica del desarrollo o de la diferenciación celular, son comúnmente denominados como "promotores específicos del desarrollo" o "promotores específicos de la diferenciación celular" . Los promotores que son inducidos y provocan que un gen sea expresado después de la exposición o el tratamiento de la célula con un agente, molécula biológica, producto químico, ligando, luz o similar, que induce que el promotor sea comúnmente denominado como "promotor inducible" o "promotor regulable". Se reconoce además ya que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no han sido completamente definidos, los fragmentos de ADN longitudes diferentes pueden tener actividad promotora idéntica .

En cualquiera de los vectores de la presente invención, el vector comprende opcionalmente un promotor descrito en la presente. En una modalidad, el promotor es un promotor listado en la Tabla 1 de la presente.

En cualquiera de los vectores de la presente invención, el vector comprende opcionalmente un promotor específico de tejido. En una modalidad, el promotor específico de tejido es un promotor específico de tejido descrito en la presente. En otra modalidad más, el promotor específico de tejido es un promotor específico de tejido listado en la Tabla 2 de la presente.

La secuencia promotora está típicamente limitada en su extremo 3 ' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5 ' ) para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por arriba del antecedente. Dentro de la secuencia promotora es encontrado un sitio de inicio de la transcripción (convenientemente definido por ejemplo, mediante el mapeo con la nucleasa SI) , así como dominios de enlace a proteínas (secuencias de consenso) responsables del enlace de la AR -polimerasa .

"Promotor de cambio terapéutico" ("TSP") se refiere a un promotor que controla la expresión de un componente de cambio de gen. Los cambios de genes y sus componentes diversos son descritos con detalle en otro sitio en la presente. En ciertas modalidades, un TSP es constitutivo, por ejemplo, continuamente activo. Un TSP constitutivo puede ser ya sea constitutivo ubicuo (por ejemplo, en general funciona sin la necesidad para factores o reguladores adicionales, en cualquier tejido o célula) o específico de tejido o célula constitutivo (por ejemplo, en general en funciones sin la necesidad para factores o reguladores adicionales en un tipo de tejido o tipo celular específico) . En ciertas modalidades, un TSP de la invención es activado bajo condiciones asociadas con una enfermedad, trastorno o condición. En ciertas modalidades de la invención donde están involucrados dos o más TSPs, los promotores pueden ser una combinación de promotores constitutivos y activables. Como se utiliza en la presente, un "promotor activado bajo condiciones asociadas con una enfermedad, trastornos o condición" incluye, sin limitación, los promotores específicos de enfermedad, promotores que responden a condiciones fisiológicas, del desarrollo, de diferenciación o patológicas particulares, promotores que responden a moléculas biológicas específicas y promotores específicos para un tejido o tipo celular particular, asociados con la enfermedad, trastorno o condición, por ejemplo, tejido tumoral o células malignas. Los TSPs pueden comprender la secuencia de promotores de origen natural, secuencias modificadas derivadas de promotores de origen natural, o secuencias sintéticas (por ejemplo, inserción de un elemento de respuesta dentro de una secuencia promotora mínima para alterar la capacidad de respuesta del promotor) .

Una secuencia de codificación está "bajo el control" de secuencias de control transcripcionales y traduccionales en una célula, cuando la ARN-polímerasa transcribe la secuencia de codificación dentro del ARNm, que es luego trans-ARN empalmado (si la secuencia de codificación contiene intrones) y traducida en la proteína codificada por la secuencia de codificación.

Las "secuencias de control transcripcional y traduccional " se refieren a secuencias reguladoras del ADN, tales como promotores, aumentadores , terminadores , y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia de codificación en una célula hospedera. En células eucarióticas , las señales de poliadenilación son secuencias control .

El término "elemento de respuesta" se refiere a uno o más elementos de ADN de acción en posición cis, que confieren capacidad de respuesta a un promotor, mediada a través de la interacción con los dominios de enlace al ADN, de un factor de transcripción. Este elemento de ADN puede ser ya sea palindrómico (perfecto o imperfecto) en su secuencia o compuesto de porciones de secuencia o medios sitios separados por un número variable de nucleótidos. Los medios sitios pueden ser similares o idénticos y acomodados ya sea como repeticiones directas o invertidas o como un medio sitio simple o multímeros de medios sitios adyacentes en tándem. El elemento de respuesta puede comprender un promotor mínimo aislado de diferentes organismos, dependiendo de la naturaleza de la célula o del organismo dentro del cual se incorpora el elemento de respuesta. El dominio de enlace al ADN del factor de transcripción se enlaza, en presencia o ausencia de un ligando, a las secuencias de ADN de un elemento de respuesta para iniciar o suprimir la transcripción de o de los genes en dirección 3' bajo la regulación de este elemento de respuesta. Los ejemplos de secuencias de ADN para los elementos de respuesta del receptor de ecdisona natural, incluyen: RRGG/TTCANTGAC/ACYY (SEQ ID No.: 25) (ver Cherbas et . al, Genes Dev. 5:120 (1991) ) ; AGGTCAN(n)AGGTCA, donde N(n) pueden ser uno o más nucleótidos espaciadores (SEQ ID No. : 26) (ver D1 Avino et al, Mol. Cell. Endocrinol . 775:1 (1995)); y GGGTTGAATGAATTT (SEQ ID No.: 27) (ver Antoniewski et al, Mol. Cell Biol . 14:4465 (1994) ) .

El término "operablemente enlazado" se refiere a la asociación de las secuencias de ácido nucleicos sobre un fragmento de ácido nucleico simple, de modo que la función de uno es afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor es operablemente enlazado con una secuencia de codificación, cuando éste es capaz de afectar la expresión de esa secuencia de codificación (por ejemplo, que la secuencia de codificación está bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias de codificación pueden ser operablemente enlazadas a secuencias reguladoras en orientación en sentido o antisentido.

El término "expresión" como se utiliza en la presente, se refiere a la transcripción y a la acumulación estable del ARNm en sentido o el ARN antisentido derivado de un ácido nucleico o polinucleótido. La expresión puede también referirse a la traducción del ARNm en una proteína o polipéptido .

El términos "cásete", "cásete de expresión" y "cásete de expresión de gen" se refiere a un segmento de ADN que puede ser insertado dentro de un ácido nucleico o polinucleótido en sitios de restricción específicos o por recombinación homologa. El segmento de ADN comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de interés, y el cásete y los sitios de restricción están diseñados para asegurar la inserción del cásete en la estructura de lectura apropiada para la transcripción y la traducción. "Cásete de transformación" se refiere a un vector específico que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de interés que tiene elementos en adición al polinucleótido que facilitan la transformación de una célula hospedera particular. Los casetes, casetes de expresión, casetes de expresión de genes y casetes de transformación de la invención, pueden también comprender elementos que permiten la expresión mejorada de un polinucleótido que codifica para un polipéptido de interés en una célula hospedera. Estos elementos pueden incluir, pero no están limitados a: un promotor, un promotor mínimo, un aumentador, un elemento de respuesta, una secuencia terminadora, una secuencia de poliadenilación, y similares.

Para los propósitos de esta invención, el término "cambio de gen" se refiere a la combinación de un elemento de respuesta asociado con un promotor, y un sistema basado en factor de transcripción, dependiente del ligando, el cual, en presencia de uno o más ligandos, modulan la expresión de un gen dentro del cual son incorporados el elemento de respuesta y el promotor. El término "un polinucleótido que codifica para un cambio de gen" se refiere a la combinación de un elemento de respuesta asociado con un promotor, y un polinucleótido que codifica para un sistema basado en el factor de transcripción dependiente del ligando el cual, en presencia de uno o más ligandos, modula la expresión de un gen dentro del cual son incorporados el elemento de respuesta y el promotor.

Los promotores de cambio terapéutico de la invención pueden ser cualquier promotor que sea útil para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad, trastorno o condición específica. Los ejemplos incluyen, sin limitación promotores de genes que muestran expresión incrementada únicamente durante una enfermedad, trastorno o condición específica, y los promotores de los genes que muestran expresión incrementada bajo condiciones celulares específicas (por ejemplo, proliferación, apoptosis, cambio en el pH, estado de oxidación, nivel de oxígeno) . En algunas modalidades donde el cambio de gen comprende más de una secuencia del factor de transcripción, la especificad de los métodos terapéuticos puede ser incrementada al combinar un promotor específico de la enfermedad o de la condición, con un promotor específico del tejido o de la célula, para limitar los tejidos en los cuales es expresado el producto terapéutico. De este modo, los promotores específicos de tejido o de tipo celular son abarcados dentro de la definición de promotor de cambio terapéutico.

Como un ejemplo de promotores específicos de enfermedad, los promotores útiles para tratar el cáncer incluyen los promotores de oncogenes. Los ejemplos de clases de oncogenes incluyen, pero no están limitados a, factores de crecimiento, receptores de factor de crecimiento, cinasas proteicas, reguladores de muerte celular programada, y factores de transcripción. Los ejemplos específicos de oncogenes incluyen, pero no están limitados a, sis, erb B, erb B-2, ras, abl , myc y bel-2 y TERT. Los ejemplos de otros genes relacionados al cáncer incluyen genes de antígenos asociados a tumores, y otros genes que son sobreexpresados en células neoplásicas (por ejemplo, MAGE-1, antígeno carcinoembrionario, tirosinasa, antígeno específico de próstata, antígeno membranal específico de próstata, p53, MUC-1, MUC-2, MUC-4, HER-2/neu, T/Tn, MART-1, gplOO, GM2 , Tn, sTn, y antígeno de Thompson-Friedenreich (TF) ) .

Los ejemplos de las secuencias promotoras y otros elementos reguladores (por ejemplo, aumentadores ) que son conocidos en la técnica, y son útiles como promotores de cambio terapéutico en la presente invención son descritos en las referencias listadas en las Tablas 1 y 2, junto con la especificidad de enfermedad/trastorno (Tabla 1) o de tejido (Tabla 2) asociada con cada promotor. Las secuencias promotoras descritas en estas referencias son incorporadas aquí por referencia, en su totalidad.

Tabla 1 Gen 7 asociado a la cáncer 6, 841, 362 diferenciación de melanoma prostasina cáncer 6, 864, 093 Subunidad cáncer 6, 936,595 catalítica de telomerasa; ciclina-A Midkine; c-erbB-2 cáncer 7, 030, 099 Antígeno membranal Cáncer de próstata 7, 037, 647 específico de próstata p51 cáncer 7, 038, 028 ARN de telomerasa cáncer 7, 084,267 Fosfatasa ácida Cáncer de próstata 7, 094, 533 prostética pCA3dd3 Cáncer de próstata 7, 138, 235 DF3/MUC1 cáncer 7,247,297 Hex II cáncer 2001/0011128 Ciclooxigenasa-2 cáncer 2002/0107219 Super PSA Cáncer de próstata 2003/0078224 skp2 cáncer 2002/0107219 PRL-3 Cáncer de colon 2004/0126785 metastático CA125/M17S2 Cáncer de ovario 2004/126824 IAI .3B Cáncer de ovario 2005/0031591 CRG-L2 Cáncer de hígado 2005/0031591 TRPM4 Cáncer de próstata 2006/0188990 RTVP glioma 2006/0216731 TARP Cáncer de próstata, 2007/0032439 cáncer de mama Transcriptasa cáncer 2007/0059287 inversa del telómero Proteína amiloide Enfermedad de 5, 151, 508 A4 Alzheimer Precursor de Enfermedad de 5, 643, 726 proteína ß Alzheimer amieloide Precursor de la Enfermedad de 5, 853, 985 proteína amieloide Alzheimer A4 de la Enfermedad de Alzheimer Neuropéptikido FF Trastornos del SNC 6, 320, 038 Elementos de estrés Estrés 7, 049, 132 del retículo endoplásmico Urocortina II psicopatologías 7, 087, 395 Tirosina- Trastornos 7, 195, 910 hidroxilasa neurológicos Factor 3 del inflamación 5, 851, 822 com lemento; amiloide A3 de suero Inhibidor tisular Reumatismo, cáncer, 5, 854, 019 de metaloproteinasa trastorno 3 (TIMP-3) autoinmunitario, inflamación Receptor del factor Trastorno 5, 851, 822 de crecimiento de autoinmunitario necrosis tumoral p75 Factor-a de inflamación 6, 537, 784 necrosis tumoral Receptor activado Inflamación 6, 870, 044 por proliferador de peroxisoma/ fosfolipasa A2 secretada no pancreática IIA-1 SOCS-3 Trastornos del 2002/0174448 crecimiento, trastorno autoinmune, inflamación SR-BI Trastornos de lipidos 5, 965, 790 Ob Obesidad 5, 698, 389 proteasa sitio-1 Obesidad, diabetes 7, 045, 294 TIGR glaucoma 7.138, 511 VL30 ano ia 5, 681, 706 Transportador 2 de Isquemia del sistema 2004/0171108 aminoácido nervioso excitatorio MDTS9 Insuficiencia renal 2006/014931 LIM, pirrolin 5- Trastornos de 2006/0134688 carboxilato- próstata reductasa, SIM2 Bax apoptosis 5.744, 310 fas apoptosis 5, 888, 764 bbc3 apoptosis 7, 702, 024 PINK-1 Trastornos de la vía 2006/0228776 de la cinasa Pi3/Akt Tabla 2 Secuencia Promotora Especificidad de No. de Tejido Patente/ Solicitud Publicada Troponina T Músculo esquelético 5,266,488 myoD Músculo 5,352,595 actina Músculo 5,374,544 Músculo 22a de Músculo esquelético 5, 837, 534 músculo esquelético arterial utrofina Músculo 5, 972, 609 Miostatina músculo 6 , 284 , 882 Cadena pesada de Músculo liso 6, 780, 610 miosina de músculo liso Proteína de Músculo cardiaco 7.193, 075 repetición de ankirina cardiaca MLP Músculo 2002/0042057 Smoothelina Músculo liso 2003/0157494 MYBPC3 Cardiomioci os 2004/0175699 a-tubulina de Tal neuronas 5, 661, 032 Molécula 4 de Neuronas 5,753,502 adhesión intracelular (ICAM-4) Subunidad ß? del hipocampos 6, 066,726 receptor tipo A del ácido ?-aminobutí ico Subunidad ß2 del Neuronas 6.177.242 receptor de acetilcolina nicotínico neuronal Presenilina-1 Neuronas 6,255,473 Cinasa lia prosencéfalo 6,509,190 dependiente de calmodulina de calcio Receptor CRF2a Cerebro 7, 071, 323 Factor de Neuronas 2003/159159 crecimiento nervioso Receptor GLP-2 Intestino, cerebro 2002/0045173 Transglutaminasa Queratinocitos 5, 643 , 746 tipo I K14 Queratinocitos 6,596,515 Estearoil-CoA Piel 2002/0151018 desaturasa Megsina Células renales 6 , 790 , 617 prolactina Pituitaria 5, 082,779 GDF-9 Ovario, testículos, 7, 227, 013 hipotálamo, pituitaria, placenta PSP94 Próstata 2003/0110522 NLRL; NGAL Glándula mamaria 5, 773,290 Proteína ácida Glándula mamaria 5, 831, 141 larga de suero de leche Amiloide A asociada Células epiteliales 2005/0107315 a tej ido mamario de los ductos mamarios Endotelina-1 Células endoteliales 5,288,846 Serblicina Células 5, 340, 739 hematopoyéticas Molécula 1 de Plaquetas , 5, 668, 012 adhesión a células leucocitos, células endoteliales- endoteliales plaquetas (PECAM-1) Tirosina-cinasa del Células endoteliales, 5.877, 020 receptor Tie médula ósea KDR/flk-l Células endoteliales 5.888.765 endoglina Células endoteliales 6, 103, 527 CCR5 Células mieloides y 6,383,746 linfoides CDlld Células mieloides 6, 881, 834 Glicoproteína Ilb Células 6,884,616 de plaquetas hematopoyéticas Preproendotelina-1 Células endoteliales 7, 067, 649 Proteína de enlace Células mononucleares 2006/0239984 a la interleucina CD34 Células madre 5, 556, 954 hematopoyéticas Tiroina-cinasa Tec Células madre 6, 225,459 hematopoyéticas , hígado Otros genes que muestran cambios en el nivel de expresión durante los trastornos o enfermedades específicas, y por lo tanto pueden proporcionar promotores que son útiles en la presente invención incluyen, sin limitación, los genes (junto con el trastorno/enfermedad asociada) listadas en la Tabla 3.

Tabla 3 incorporada por referencia en la presente SEQ ID No. : 1 de la Carcinoma 2005/0037372 solicitud de patente hepatocelular publicación 2005/0037372, incorporada por referencia en la presente ATBo Carcinoma 2006/0280725 hepatocelular SEQ ID Nos . : 1 y 3 de la Cáncer de hígado 2007/0042420 solicitud de patente de los Estados Unidos publicación 2007/0037372, incorporada por referencia en la presente CSA-1 Condrosarcoma 2001/0016649 SEQ ID Nos.: 1-15 de la Cáncer pancreático 2001/0016651 solicitud de patente de los Estados Unidos publicación 2001/0016651, incorporada por referencia en la presente SEQ ID Nos.: 1-15 de la Cáncer pancreático 2003/0212264 solicitud de patente de los Estados Unidos publicación 2003/0212264, incorporada por referencia en la presente SYG972 Cáncer de mama 2002/0055107 Urb-ctf Cáncer de mama 2003/0143546 BCU399 Cáncer de mama 2003/0180728 TBX2 Cáncer de mama 2004/0029185 Cyr61 Cáncer de mama 2004/0086504 DIAPH3 Cáncer de mama 2005/0054826 SEQ ID Nos.: 1-24 de la Cáncer de mama 2007/0134669 solicitud de patente de los Estados Unidos publicación 2007/0134669, incorporada por referencia en la presente aspartil (asparaginil) beta Cáncer del SNC 2002/0102263 -hidroxilasa humana B EHAB Cáncer del SNC 2003/0058661 IL-8 Sarcoma de Kaposi 2003/0096781 SEQ ID Nos.: 1-278 de la Cánceres 2003/0198362 solicitud de patente de hematológicos los Estados Unidos publicación 2002/0198362, incorporada por referencia en la presente BLSA Cáncer de células B 2002/0147887 BP1 Leucemia 2003/0171273 DAP-cinasa, H0XA9 Cáncer pulmonar no 2003/0224509 microcítico ARP Cáncer renal de 2004/0010119 células claras, trastornos inflamatorios Nbk Cáncer renal 2005/0053931 CD43 Cáncer de ovario 2004/0216231 SEQ ID Nos. : 1-15 de la Cáncer de ovario 2005/0053931 solicitud de patente de los Estados Unidos publicación 2007/0054268, incorporada por referencia en la presente l-hcG, ßd-hCG, 6e-hCG, Tumores uterinos 2006/0292567 MTAls Cáncer insensible a 2006/0099660 hormonas Old-35, old-64 Proliferación 6, 794, 131 tumoral LAGE-1 Cáncer 6, 174, 679 CIF150/hTAFnl50 Cáncer 5, 773, 215 Proteína oncofetal P65 Cáncer 2002/0025518 Telomerasa Cáncer 2002/0052013 CYP1B1 Cáncer 2002/102245 14-4-s Cáncer 2002/0106367 NES1 Cáncer 2002/0119541 CAR-1 Cáncer 2002/0120120 HMGI , MAG Cáncer 2002/0132329 ELL2 Cáncer 2002/0136726 Efrina B2 Cáncer 2002/0142442 WAF1 Cáncer 2002/0143154 CIF130 Cáncer 2002/01rr447 C35 Cáncer 2002/0159986 B P2 Cáncer 2002/0159986 BUB3 Cáncer 2002/0160403 Polimerasa kappa Cáncer 2003/0017573 EAG1 , EAG2 Cáncer 2003/0040476 SEQ ID Nos. : 18, 20, 22 cáncer 2003/0044813 de la solicitud de patente de los Estados Unidos publicación 2003/0044813, incorporada por referencia en la presente HMG1 Cáncer 2003/0051260 HLTF Cáncer 2003/0082526 Barx2 cáncer 2003/0087243 SEQ ID Nos. : 18, 20, 22, Cáncer 2003/0108920 32,34, 36 de la patente de los Estados Unidos publicación 2003/0108920, incorporada por referencia en la presente Cables cáncer 2003/0109443 Pp 32rl Cáncer 2003/0129631 BMP4 Cáncer 2003/0134790 TS10q23.3 cáncer 2003/0139324 Proteína de asociación al cáncer 2003/0157072 husillo nuclear PFTAIRE Cáncer 2003/0166217 SEMA3B cáncer 2003/0166557 MOGp Cáncer, esclerosis 2003/0166898 múltiple, trastorno inflamatorio Fortilina cáncer 2003/0172388 SEQ ID No . : 1 de la cáncer 2003/0215833 patente de los Estados Unidos publicación 2003/0215833, incorporada por referencia en la presente IGFBP-3 cáncer 2004/0005294 Polihomeótico 2 Cáncer 2004/0005294 PNQALRE cáncer 2004/0077009 SEQ ID No. : 1, 3 de la cáncer 2004/0086916 patente de los Estados Unidos publicación 2004/0086916, incorporada por referencia en la presente SCN5A cáncer 2004/0146877 miR15, miR16 Cáncer 2004/0152112 Headpina Cáncer 2004/0180371 PAOhl/S O Cáncer 2004/0229241 Hippo, Mst2 Cáncer 2005/0053592 Similar a PSMA Cáncer, trastornos 2005/0064504 neurológicos JABI Cáncer 2005/0069918 NF-AT Cáncer 2005/0079496 P281NG5 Cáncer 2005/0097626 MTG16 Cáncer 2005/0107313 ErbB-2 Cáncer 2005/0123538 HDAC9 Cáncer 2005/0130146 GPBP cáncer 2005/0130227 MG20 Cáncer 2005/0153352 KLF6 Cáncer 2005/0181374 ARTS1 Cáncer 2005/0266443 Dock 3 Cáncer 2006/0041111 Annexina 8 Cáncer 2006/0052320 MH15 Cáncer 2006/0068411 DELTA-N p73 Cáncer 2006/088825 RapR6 Cáncer 2006/099676 StarDlO cáncer 2006/0148032 Cizl Cáncer 2006/0155113 HLJ1 Cáncer 2006/0194235 RapR7 Cáncer 2006/0240021 A34 Cáncer 2006/0292154 Sef Cáncer 2006/0293240 Kilina cáncer 2007/072218 SGA-1M Cáncer 2007/0128593 Receptor tipo II de TFF Cáncer 2002/0064786 Genes asociados a GCA Arteritis de 6, 743.903 células gigantes PRV-1 Policitemia 6, 686, 153 verdadera SEQ ID Nos. : 1, 4 de la Isquemia 5, 948, 637 patente de los Estados Unidos 5,948,637, incorporada por referencia en la presente Vezf1 Trastornos 2002/0023277 vasculares MLP Cardiomiopatía 2002/0042057 dilatatoria VEG1 Angiogénesis 2002/0111325 patológica PR0256 Trastornos 2002/0123091 cardiovasculares AOP2 Ateroesclerosis 2002/0142417 Reraodelina Restenosis 2002/0161211 arterial, fibrosis Fosfodiesterasa 4D Apople ía 2003/0054531 Subtipo EP3 del receptor Trastorno oclusivo 2003/0157599 de prostaglandina arterial periférico CARP Trastornos 2004/0014706 cardiacos HOP Trastorno cardiaco 2004/0029158 congénito SEQ ID Nos.: 1-4 de la Apoplej ía 2004/0087784 patente de los Estados Unidos publicación 2004/0087784, incorporada por referencia en la presente PLTP Ateroesclerosis , 2006/0252787 trastorno vascular, hipercolesterolemia , enfermedad de Tangier, trastorno por deficiencia de HDL familiar SEQ ID Nos. : 1, 3-8, 15, Trombosis 2007/0160996 16 de la patente de los Estados Unidos publicación 2007/0160996, incorporada por referencia en la presente UCP-2 Apoplej ía 2002/0160996 FIJ11011 Anemia de Fanconi 2006/0070134 Codanin-1 Anemia 2006/0154331 SEQ ID Nos. : 1, 6, 8 de Diabetes mellitus 5, 763, 591 la patente de los Estados dependiente de la Unidos 5,763,591, insulina incorporada por referencia en la presente Resistina Diabetes tipo 2 2002/0161210 Archipelina Diabetes 2002/0202976 SEQ ID Nos. : 2, 7, 16, 27 Diabetes , 2004/0053397 de la patente de los hiperlipidemia Estados Unidos publicación 2004/0053397, incorporada por referencia en la presente Neuronatina Trastorno 2004/025977 metabólicos Ncb5or Diabetes 2005/0031605 7B2 Trastornos 2005/0086709 endocrinos PTHrP, PEX Trastornos óseos 2005/0196784 metabólicos KchIPl Diabetes tipo II 2005/0141462 SLIT-3 Diabetes tipo II 2006/0141462 CX3CR1 Diabetes tipo II 2006/0160076 SMAP-2 Diabetes 2006/0210974 SEQ ID Nos. : 2, 8, 12, Diabetes tipo II 2006/0228706 16,22, 26, 28, 32 de la patente de los Estados Unidos publicación 2006/0228706, incorporada por referencia en la presente IC- FX Diabetes 2006/0264611 E21GF2 Diabetes , 2007/0036787 resistencia a la insulina, obesidad SEQ ID Nos. : 2, 8, 10, Diabetes 2007/0122802 14, 18, 24, 26, 30, 34, 38, 44, 50, 54, 60, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110 de la patente de los Estados Unidos publicación 2007/0122802, incorporada por referencia en la presente UCP2 Trastornos de peso 2002/0127600 -· corporal Receptor Ob Trastornos de peso 2002/0182676 corporal Ob Trastornos de peso 2004/0214214 corporal Dpi Trastornos 2001/0021771 neurodegenerativos NRG- 1 Esquizofrenia 2002/045577 Sinapsina III Esquizofrenia 2002/0064811 NRG1AGI Esquizofrenia 2002/0094954 AL-2 Trastornos 2002/0142444 neuronales Polina-deshidrogenasa Trastorno bipolar, 2002/0193581 trastorno depresivo mayor, esquizofrenia, trastorno obsesivo- compulsivo MNR2 Trastorno 2002/0197678 neurodegenerativo crónico ATM Ataxia- 2004/0029198 telangiectasia Ho-1 Trastornos de 2004/0033563 demencia 8 CON202 Esquizofrenia 2004/0091928 Ataxin-1 Trastornos 2004/0177388 neurodegenerativos NR3B Trastornos de las 2005/0153287 neuronas motoras NIPA-1 Paraplegia 2005/0164228 espástica hereditaria DEPP, adrenomedulina, Esquizofrenia 2005/0227233 csdA Inf-20 Trastornos 2006/0079675 neurodegenerativos EOPA Trastornos del 2007/0031830 desarrollo y degeneración cerebral SERT autismo 2007/0037194 FERP-1 Glaucoma 2002/0049177 amiloide A sérico Glaucoma 2005/0153927 BMP2 Osteoporosis 2002/0072758 BMPR1A Poliposis juvenil 2003/0084464 ACLP gastrosquisis 2003/0138826 Molécula ß similar a la Poliposis 2003/0138826 resistina adenomatosa familiar, diabetes, resistencia a insulina, cáncer de colon, trastorno inflamatorio del intestino Dlg5 Trastorno 2006/0100132 inflamatorio del intestino SEQ ID Nos. : 1-82 de la osteoartritis 2002/0119452 patente de los Estados Unidos publicación 2002/0119452, incorporada por referencia en la presente TRANCE Trastornos del 2003/0185820 sistema inmunitario Matrilina-3 Osteoartritis 2003/0203380 Sinoviolina Artritis reumatoide 2004/0152871 SEQ ID Nos.: 9, 35 de la Osteoartritis 2007/0028314 patente de los Estados Unidos publicación 2007/0028314, incorporada por referencia en la presente HIV LTR Infección por VIH 5, 627, 023 SHIVA Infección por VIH 2004/0197770 EBI 1, EBI 2, EBI 3 Infección por el 2002/0040133 virus de Epstein Barr Familia NM23 Trastornos 2002/0034741 cutáneos/ intestinales SEQ ID No. : 1 de la psoriasis 2002/0169127 patente de los Estados Unidos publicación 2002/0169127, incorporada por referencia en la presente Eps8 Trastornos de piel, 2003/0180302 sanado de heridas Beta-10 Patología de la 2002/0015981 glándula tiroides SEQ ID No. : 2 de la Condiciones de la 2003/0207403 patente de los Estados tiroides Unidos publicación 2003/00207403 , incorporada por referencia en la presente SEQ ID No. : 3 de la Trastornos de la 2007/0020275 patente de los Estados tiroides Unidos publicación 2003/0020275, incorporada por referencia en la presente Factor de crecimiento del Alopecia 2004/0036174 folículo piloso Corneodesmosina Alopecia 2003/0211065 GCR9 Asma, linfoma, 2003/0166150 leucemia SEQ ID Nos. : 1-71 de la Asma 2004/0002084 patente de los Estados Unidos publicación 2004/0002084, incorporada por referencia en la presente Bg Síndrome de 2002/0115144 Chediak-Higashi SEQ ID Nos. : 1-16 de la Endometriosis 2002/0127555 patente de los Estados Unidos publicación 2002/0127555, incorporada por referencia en la presente FGF23 Trastornos 2005/0156014 hipofosfatémicos BBSR Síndrome de Basdet- 2003/0152963 Biedl IC-1 Anorma1idades 2004/0053325 fetales, cáncer, trastornos inflamatorios , aborto, parto prematuro MIA-2 Daño hepático 2004/0076965 IL-17B Trastornos 2004/0171109 degenerativos de los cartílagos Enzima generadora de Deficiencia de 2004/0229250 formilglicina sulfatasa múltiple LPLA2 Proteinosis 2006/0008455 alveolar pulmonar CXCL10 Enfermedad 2006/0040329 respiratorio SEQ ID No. : 3 de la nefropatía 2006/0140945 patente de los Estados Unidos publicación 2003/0020275, incorporada por referencia en la presente SEQ ID Nos.: 1, 2 de la patente de los Estados Unidos publicación 2006/0140945, incorporada por referencia en la presente HFE2A Trastorno de 2007/0166711 metabolismo del hierro Una vez que un gen con un patrón de expresión que es modulado durante una enfermedad, trastorno o condición es identificado, el promotor del gen que puede ser utilizado en el cambio génico de la invención. La secuencia de muchos genes incluyendo la región promotora, es conocida en la técnica y es conocida en las bases de datos públicas, por ejemplo, GenBank. De este modo, una vez que es identificado un gen apropiado, la secuencia promotora puede ser fácilmente identificada y obtenida. Otro aspecto más de la presente invención está dirigido a la identificación de genes adecuados cuyo promotor puede ser aislado y colocado dentro de un cambio de gen. La identidad del gen, por lo tanto, puede no ser crítica para las modalidades específicas de la presente invención, con la condición de que el promotor pueda ser aislado y utilizado en panoramas o ambientes subsiguientes. La presente invención incluye de este modo el uso de promotores provenientes de genes que todavía no han sido identificados. Una vez que los genes adecuados sean identificados, es un asunto de habilidad rutinaria o de experimentación determinar las secuencias genéticas necesarias para la función promotora. Por supuesto, existen diversos protocolos comerciales para ayudar en la determinación de la región promotora de los genes de interés. A manera de ejemplo, Ding et al. elucidaron recientemente la secuencia promotora del nuevo gen Sprouty [Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol Physiol 287: L52 (2004), las que se incorporan por referencia) al suprimir progresivamente la secuencia 51 -flanqueante del gen Sprouty humano. En resumen, una vez que fue determinado el sitio de inicio de la transcripción, los fragmentos de PCR fueron generados utilizando los cebadores de PCR comunes para clonar los segmentos del segmento 51 -flanqueante de una manera unidireccional. Los segmentos generados fueron clonados dentro de un vector reportero de luciferasa y la actividad de luciferasa fue medida para determinar la región promotora del gen Sprouty4 humano.

Otro ejemplo más de un protocolo para adquirir y validar los promotores de genes incluyen los siguientes pasos: (1) adquirir muestras de células/tejidos enfermas y no enfermas de un tipo de tejido similar/igual; (2) aislar el ARN o el ARNm total de las muestras; (3) realizar el análisis de microarreglo diferencial del ARN enfermo y no enfermo; (4) identificar los transcritos candidatos específicos de la enfermedad; (5) identificar las secuencias genómicas asociadas con los transcriptos específicos de la enfermedad; (6) adquirir o sintetizar la secuencia de ADN con dirección 5' y 3' del sitio de inicio de la transcripción predicho del transcrito específico de la enfermedad; (7) diseñar y producir los vectores reporteros promotores utilizando diferentes longitudes de ADN del paso 6; y (8) probar los vectores reporteros promotores en células/tejidos enfermos y no enfermos, así como en células/tejidos no relacionados.

La fuente del promotor que es insertada dentro del cambio de gen puede ser natural o sintética, y la fuente del promotor no debe limitar el alcance de la invención descrita aquí. En otras palabras, el promotor puede ser directamente clonado a partir de las células, o el promotor puede haber sido previamente clonado a partir de una fuente diferente, o el promotor puede haber sido sintetizado.

Sistemas de Cambio de Gen El cambio de gen puede ser cualquier cambio de gen que regule la expresión del gen por adición o eliminación de un ligando específico. En una modalidad, el cambio de gen es uno en el cual el nivel de la expresión del gen es dependiente del nivel de ligando que está presente. Los ejemplos de complejos del factor de transcripción dependientes del ligando, que pueden ser utilizados en los cambios de gen de la invención incluyen, sin limitación miembros de la superfamilia de receptores nucleares activada por sus ligandos respectivos (por ejemplo, glucocorticoide , estrógeno, progestina, retinoide, ecdisona, y análogos y miméticos de los mismos) y rTTA activado por tetraciclina . En un aspecto de la invención, el cambio de gen es un cambio de gen basado en EcR. Los ejemplos de tales sistemas incluyen, sin limitación, los sistemas descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,258,603, 7,045,315, las Solicitudes de Patentes de los Estados Unidos Publicadas Nos. 2006/0014711, 2007/0161086, y la Solicitud Internacional Publicada No. WO 01/70816. Los ejemplos de sistemas receptor de ecdisona quiméricos se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 7,091,038, las Solicitudes de Patentes Publicadas de los Estados Unidos Nos. 2002/0110861, 2004/0033600, 2004/0096942, 2005/0266457, y 2006/0100416, y las Solicitudes Internacionales Publicadas Nos. WO 01/70816, WO 02/066612, WO 02/066613, WO 02/066614, WO 02/066615, WO 02/29075, y WO 2005/108617, cada una de las cuales son incorporadas por referencia en su totalidad. Un ejemplo de un sistema regulado por el agonista de ecdisona no esteroide es el Sistema de Expresión Inducible en Mamífero RheoSwitch® (New England Biolabs, Ipswich, MA) . En otro aspecto más de la invención, el cambio de gen está basado sobre la heterodimerización de la proteína de enlace a FK506 (FKBP) con la proteína asociada a la. rapamicina FKBP (FRAP) y es regulado a través de la rapamicina o sus análogos no inmunosupresores . Los ejemplos de tales sistemas, incluyen sin limitación, la Tecnología Transcripcional ARGENTMR (ARIAD Pharmaceuticals , Cambridge, MA) y los sistemas descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,015,709, 6,117,680, 6,479,653, 6,187,757, y 6,649,595.

En una modalidad, el cambio de gen comprende una secuencia del factor de transcripción simple, que codifica para un complejo del factor de transcripción dependiente del ligando bajo el control de un promotor de cambio terapéutico. La secuencia del factor de transcripción puede codificar para un complejo del factor de transcripción dependiente del ligando, que es un complejo del factor de transcripción dependiente del ligando, de origen natural o artificial. Un factor de transcripción artificial es uno en el cual la secuencia natural del factor de transcripción ha sido alterada, por ejemplo, mediante mutación de la secuencia o por la combinación de dominios provenientes de diferentes factores de transcripción. En una modalidad, el factor de transcripción comprende un dominio de enlace al ligando del receptor nuclear del Grupo H. En una modalidad, el dominio de de enlace al ligando del receptor nuclear del Grupo H es proveniente de un receptor de ecdisona, un receptor ubicuo (UR) , un receptor huérfano 1 (OR-1), un receptor 1 nuclear de hormona esteroide (NER-I), una proteína 15 de interacción con el receptor de retinoides X (RIP-15), un receptor ß hepático X (LXR ) , una proteína similar al receptor de hormona esteroide (RLD-I), un receptor hepático X (LXR) , un receptor a hepático X (LXRa) , un receptor de farnesoide X (FXR) , una proteína 14 de interacción con el receptor (RIP- 14), o un receptor de farnesol (FIRR-1) . En otra modalidad, el LBd del receptor nuclear del grupo H es proveniente de un receptor de ecdisona.

A. Cambio de Gen Basado en Ecdisona El EcR y los otros receptores nucleares del Grupo H son miembros de la superfamilia de receptores nucleares en donde todos los miembros están en general caracteizados por la presencia de un dominio de transactivación amino-terminal (AD, también denominado intercambiablemente como "TA" o "TD"), opcionalmente fusionado a un socio de heterodimerización (HP) para formar una proteína de co-activación (CAP) , un domino de enlace al ADN (DBD) , y un LBD fusionado al DBD vía una región de bisagra para formar un factor de transcripción dependiente del ligando (LTF) . Como se utiliza en la presente, el término "domino de enlace al ADN" comprende una secuencia polipeptídica mínima de una proteína de enlace al ADN, hasta la longitud completa de una proteína de enlace al ADN, siempre y cuando el dominio de enlace al ADN funcione para asociarse con un elemento de respuesta particular. Los miembros de la superfamilia de receptores nucleares están caracterizados por la presencia de cuatro o cinco dominios: A/B, C, D, E, y en algunos miembros F (ver Patente de los Estados Unidos US 4,981,784 y Evans, Science 240:889 (1988)). El dominio "A/B" corresponde al dominio de transactivación. "C" corresponde al dominio de enlace de ADN. "D" corresponde a la región de bisagra, y "E" corresponde al dominio de enlace al ligando. Algunos miembros de la familia pueden también tener otro dominio de transactivación sobre el lado carboxilo-terminal del LBD correspondiente a "F" .

Se reportó la siguiente secuencia polipeptídica como una secuencia polipeptídica del receptor de Ecdisona (receptor de Ecdiesteroide) (receptor de 20-hidroxi-ecdisona) (receptor de 20E) (EcRH) (miembro 1 del grupo H de la subfamilia 1 de receptores nucleares) y tiene el número de acceso P34021 en Genbank..

Receptor de Ecdisona (878aa) de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) (SEQ ID No. : 5) 1 mkrrwsnngg fmrlpeesss evtsssnglv lpsgvnmsps sldshdycdq dlwlcgnesg 61 fggsnghgl sqqqqsvitl amhgcsstlp aqttiiping nangnggstn gqyvpgatnl 121 galangmlng gfngmqqqiq nghglinstt pstpttplhl qqnlggaggg giggmgilhh. 181 angtpnglig wgggggvgl gvggggvggl gmqhtprsds vnsissgrdd lspssslngy 241 sanescdakk skkgpaprvq eelclvcgdr asgyhynalt cegckgffrr svtksavycc 301 kfgracemdm ymrrkcqecr lkkclavgmr pecwpenqc amkrrekkaq kekdkmttsp 361 ssqhggngsl asgggqdfvk keildlmtce ppqhatipll pdeilakcqa rnipsltynq 421 laviykliwy qdgyeqpsee dlrrimsqpd enesqtdvsf rhiteitilt vqlivefakg 481 lpaftkipqe dqitllkacs sevmmlrmar rydhssdsif fannrsytrd sykmagmadn 541 iedllhfcrq mfsmkvdnve yalltaivif sdrpglekaq lveaiqsyyi dtlriyilnr 601 hcgdsmslvf yakllsilte lrtlgnqnae mcfslklknr klpkfleeiw dvhaip svq 661 shlqitqeen erleraermr asvggaitag idcdsastsa aaaaaqhqpq pqpqpqpssi 721 tqndsqhqtq pqlqpqlppq lqgqlqpqlq pqlqtqlqpq iqpqpqllpv sapvpasvta 781 pgslsavsts seymggsaai gpitpattss itaavtasst tsavpmgngv gvgvgvggnv 841 smyanaqtam almgvalhsh qeqliggvav ksehstta El DBD está caracterizado por la presencia de dos dedos de zinc de cisteína entre los cuales están dos porciones de aminoácido, la caja P y la caja D, que contienen especificidad para los elementos de respuesta. Estos dominios pueden ser ya sea nativos, modificados o quimeras de diferentes dominios de proteínas del receptor heterologo. El EcR, como un subgrupo de la familia de receptores nucleares, también posee menos regiones bien definidas responsables de las propiedades de heterodimerización . Debido a que los dominios de los receptores nucleares son modulares por naturaleza, el LBD, DBD, y AD pueden ser intercambiados.

En otra modalidad más, el factor de transcripción comprende un AD, un DBD que reconoce un elemento de respuesta asociado con la proteína terapéutica o el polinucleótido terapéutico cuya expresión va a ser modulada; y un LBD del receptor nuclear del Grupo H. En ciertas modalidades, el LBD del receptor nuclear del Grupo H comprende una mutación por sustitución .

En otra modalidad más, el cambio de gen comprende una primera secuencia del factor de transcripción, por ejemplo, un CAP, bajo el control de un primer promotor de cambio terapéutico (TSP-I) y una segunda secuencia del factor de transcripción, por ejemplo, un LTF, bajo el control de un segundo promotor de cambio terapéutico (TSP-2) , en donde las proteínas que codifican por la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor de transcripción interactúan para formar un complejo proteico (LDTFC) , por ejemplo, un cambio de gen basado en "cambio doble" o "dos híbrido". El primero y segundo TSPs pueden ser el mismo o diferentes. En esta modalidad, la presencia de dos TSPs diferentes en el cambio de gen que son requeridos para la expresión de la molécula terapéutica, aumenta la especificidad del método terapéutico (ver Figura 2) . La Figura 2 también demuestra la habilidad para modificar el cambio de gen terapéutico para tratar cualquier enfermedad, trastorno o condición simplemente por la inserción de los TSPs apropiados .

En una modalidad adicional, la primera y la segunda secuencia factor de transcripción, por ejemplo, un CAP o un LTF, está bajo el control de un promotor de cambio terapéutico simple (por ejemplo, TSP-1 en la Figura 1) . La activación de este promotor generará CAP y LTF con una estructura de lectura abierta simple. Esto puede ser logrado con el uso de un ligador transcripcional tal como un IRES (sitio de entrada ribosomal interno) . En esta modalidad, ambas porciones del complejo del factor de transcripción dependiente del ligando, son sintetizados después de la activación de TSP-1. TSP-1 puede ser un promotor constitutivo o únicamente activado bajo condiciones asociadas con la enfermedad, el trastorno o la condición.

En una modalidad adicional, una secuencia del factor de transcripción, por ejemplo, un LTF, está bajo el control de un promotor de cambio terapéutico únicamente activado bajo condiciones asociadas con la enfermedad, el trastorno o la condición (por ejemplo, TSP-2 o TSP-3 en la Figura 4) y la otra secuencia del factor de transcripción, por ejemplo, CAP, está bajo el control de un promotor de cambio terapéutico constitutivo (por ejemplo, TSP-I en la Figura 4) . En esta modalidad, una porción del complejo del factor de transcripción dependiente del ligando, está constitutivamente presente, mientras que la segunda porción únicamente será sintetizada bajo condiciones asociadas con la enfermedad, el trastorno o la condición.

En otra modalidad más, una secuencia del factor de transcripción, por ejemplo, CAP, está bajo el control de un primer TSP (por ejemplo, TSP-1 en la Figura 3) y dos o más secundas secuencia del factor de transcripción diferentes, por ejemplo, LTF-1 y LTF-2 están bajo el control de diferentes TSPs (por ejemplo, TSP-2 y TSP-3 en la Figura 3) . En esta modalidad, cada uno de los LTFs puede tener un DBD diferente que reconoce una secuencia diferente del promotor regulado por el factor (por ejemplo, un DBD-A se enlaza a un elemento de respuesta asociado con el promotor regulado por el factor 1 (FRP-1) y DBD-B se enlaza a un elemento de respuesta asociado con el promotor 2 regulado por el factor (FRP-2) . Cada uno de los promotores regulados por el factor puede ser operablemente enlazado a un gen terapéutico diferente. De esta manera, puede ser proporcionado simultáneamente múltiples tratamientos.

En una modalidad, la primera secuencia del factor de transcripción codifica para un polipéptido que comprende un AD, un DBD que reconoce un elemento de respuesta asociado con la secuencia del producto terapéutico cuya expresión va a ser modulada; y un LBD del recepto nuclear del Grupo H, y la segunda secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción que comprende un LBD del receptor nuclear seleccionado de un receptor del retinoides X de vertebrado (RXR) , un RXR de invertebrado, una proteína ultraespiráculo (USP) , o un receptor nuclear quimérico que comprende al menos dos fragmentos polipeptídicos del dominio de enlace al ligando, del receptor nuclear diferentes, seleccionados de un RXR de vertebrado, un RXR de invertebrado, y una USP (ver WO 01/70816 A2 y Patente de los Estados Unidos US 2004/0096942 Al) . El dominio de enlace al ligando del receptor nuclear "socio" puede comprender además una mutación por truncamiento, una mutación por supresión, una mutación por sustitución, u otra modificación.

En otra modalidad más, el cambio de gen comprende una primera secuencia del factor de transcripción que codifica para un primer polipéptido que comprende un receptor nuclear LBD y un DBD que reconoce un elemento d respuesta asociado con la secuencia del producto terapéutico cuya expresión va a ser modulada, y una segunda secuencia del factor de transcripción que codifica para un segundo polipéptido que comprende un AD y un LBD del receptor nuclear, en donde uno de los LBD del receptor nuclear es un LBD del receptor nuclear del Grupo H. En una modalidad preferida, el primer polipéptido está sustancialmente libre de un AD y el segundo polipéptido está sustancialmente libre de un DBD. Para propósitos de la invención, "sustancialmente libre" significa que la proteína en cuestión no contiene una secuencia suficiente del dominio en cuestión para proporcionar la activación o la actividad de enlace.

En otro aspecto más de la invención, la primera secuencia del factor de transcripción codifica para una proteína que comprende un socio de heterodimerización y un AD (un "CAP") y la segunda secuencia del factor de transcripción codifica para una proteína que comprende un DBD y un LBD (un "LTF") .

Cuando únicamente un LBD del receptor nuclear es un LBD del Grupo H, el otro LBD del receptor nuclear puede ser proveniente de cualquier otro receptor nuclear que forme un dímero con el LBD del Grupo H. Por ejemplo, cuando el LBD del receptor nuclear del Grupo H es un EcR LBD, el otro "socio" del LBD del receptor nuclear puede ser proveniente de un EcR, un RXR de vertebrado, un RXR de invertebrado, una proteína ultraespiráculo (USP) , o un receptor nuclear quimérico que comprende al menos dos diferentes fragmentos polipeptídicos de LBD del receptor nuclear, seleccionados de un RXR de vertebrado, un RXR de invertebrado, o una USP (ver WO 01/70816 A2 , Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US02/05235 y Patente de los Estados Unidos No. US 2004/0096942 Al, incorporadas por referencia en su totalidad) . El dominio de enlace al receptor nuclear "socio" puede comprender además una mutación por truncamiento, una mutación por supresión, una mutación por sustitución, u otra modificación .

En una modalidad, el LBD de RXR de vertebrado es proveniente de un humano Homo sapiens, de ratón Mus musculus, de rata Rattus norvegicus, de pollo Gallus gallus, de cerdo Sus scrofa domestica, de rana Xenopus laevis, de pez cebra Danio rerio, de tunicado Polyandrocarpa misakiensis, o de medusa Tripedalia cysophora RXR.

En una modalidad, el dominio de enlace al ligando RXR de invertebrado es proveniente de un polipéptido ultraespiráculo de langosta Locusta migratoria polipéptido ultraespiráculo ("LmUSP"), un homólogo 1 RXR de la garrapata ixodide Amblyomma americanum ( "AmaRXRl " ) , un homólogo 2 de RXR de la garrapata ixodide Amblyomma americanum ( "AmaRXR2 " ) , un homólogo de RXR del cangrejo violinista Celuca pugilator ("CpRXR"), un homólogo RXR del escarabajo Tenebrio molitor ( "TmRXR" ) , un homólogo de XRX de la abeja mielera Apis mellifera ("AmRXR"), un homólogo de RXR del áfido Myzus persicae ("MpRXR"), o un homólogo de RXR no díptero/no lepidópero .

En una modalidad, lel LBR de RXR comprende al menos dos fragmentos polipeptídicos seleccionados de un fragmento polipeptídico de RXR de especie de vertebrado, un fragmento polipeptídico de RXR de especie de invertebrado, o un fragmento polipeptídico del homólogo de RXR de especie de invertebrado, no díptero/no lipidóptero. Un dominio de enlace al ligando RXR quimérico para el uso en la presente invención puede comprender al menos dos fragmentos polipeptídicos de RCS de diferente especie, o cuando la especie es la misma, los dos o más fragmentos polipeptídicos pueden ser provenientes de dos o más isoformas diferentes del fragmento polipeptídico de RXR de la especie.

En una modalidad, el dominio de enlace al ligando RXR quimérico comprende al menos un fragmento polipeptídico de RXR de especie de vertebrado y un fragmento polipeptídico de RXR de especie de invertebrado.

En una modalidad, el dominio de enlace al ligando RXR quimérico comprende al menos un fragmento polipeptídico de RXR de especie de vertebrado y un fragmento polipeptídico del homólogo de RXR de especie de invertebrado no díptero/no lepidópero.

El ligando, cuando es combinado con el LBD del o de los receptores nucleares, que a su vez son enlazados al elemento de respuesta de un FRP asociado con una secuencia del producto terapéutico, proporciona regulación temporal externa de la expresión de la secuencia de producto terapéutico. El mecanismo de enlace o el orden en el cual los diversos componentes de esta invención se enlazan uno con el otro, es decir, por ejemplo, el ligando a LBD, DBD al elemento de respuesta, AD al promotor, etc., no es crítico.

En un ejemplo específico, el enlace del ligando al LBD de un receptor nuclear del Grupo H y su socio de LBD del receptor nuclear, hace posible la expresión de la secuencia del producto terapéutico. Este mecanismo no excluye el potencial para el enlace del ligando al receptor nuclear del Grupo H (GHNR) o su socio, y la formación resultante de los complejos homodímeros activos (por ejemplo, GHNR + GHNR o socio + socio) . Preferentemente, uno o más de los dominios del receptor es variado produciendo un cambio de gen híbrido. Típicamente, uno o más de los tres dominios, DBD, LBD, y AD, pueden ser elegidos de una fuente diferente de la fuente de los otros dos dominios, de modo que los genes híbridos y las proteínas híbridas resultantes son optimizados en la célula u organismo hospedero elegido para la actividad de transactivación, el enlace complementario del ligando, y el reconocimiento de un elemento de respuesta específico.

Además, el elemento de respuesta mismo puede ser modificado o sustituido con el elemento de respuestas para otros dominios de la proteína de enlace al ADN, tal como la proteína GAL-4 de levadura (ver Sadowski et al, Nature 555:563 (1988)) o la proteína LexA de Escherichia coli (ver Brent et al., Cell 43:729 (1985)), o los elementos de respuesta sintéticos específicos para las interacciones dirigidas con proteínas diseñada, modificadas, y seleccionadas para tales interacciones específicas (ver, por ejemplo, Kim et al, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 94:3616 (1997)) para acomodar los receptores híbridos. Otra ventaja más de los sistemas de dos híbridos es que éstos permiten la elección de un promotor utilizado para impulsar la expresión del gen de acuerdo a un resultado final deseado. Tal control doble puede ser particularmente importante en las áreas de terapia génica, especialmente cuando son producidas proteínas citotóxicas, debido a que la sincronización de expresión así como las células en donde ocurre la expresión, pueden ser controladas. Cuando los genes, operablemente enlazados a un promotor adecuado, son introducidos dentro las células del sujeto, la expresión de los genes exógenos es controlada por la presencia del sistema de esta invención. Los promotores pueden ser constitutiva o indeciblemente regulados, o pueden ser específicos de tejido (es decir, expresados únicamente en un tipo particular de células) o específicos para ciertas etapas del desarrollo del organismo.

El dominio de enlace del ADN a la primera proteína híbrida se enlaza, presencia o ausencia de un ligando, a la secuencia de ADN de un elemento de respuesta para iniciar o suprimir la transcripción del o de los genes con dirección 3' bajo la regulación de este elemento de respuesta.

El LDTFC funcional, por ejemplo, un complejo EcR, puede también incluir una o varias proteínas adicionales tales como las inmunofilinas . Los miembros adicionales de la familia del receptor nuclear de proteínas, conocidos como factores transcripcionales (tales como DHR38 o betaFTZ-1) , pueden también ser socios dependientes o independientes del ligando para EcR, USP, y/o RXR. Además, pueden ser requeridos otros co-factores tales como proteínas en general conocidas como co-activadores (también denominados como adaptadores o mediadores) . Estas proteínas no se enlazan específicamente en secuencia al ADN y no están involucradas en la transcripción basal . Éstas pueden ejercer su efecto sobre la activación de la transcripción a través de diversos mecanismos, incluyendo la estimulación del enlace al ADN de los activadores, al afectar la estructura de la cromatina, o al mediar las interacciones del activador-complej o de iniciación. Los ejemplos de tales co-activadores incluyen RIP 40, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC- l/NCoA- 1 , TIF2/GRIP/NCoA-2 , ACTR/AIB1/RAC3/pCIP así como la proteína de enlace al elemento de respuesta al co-activador B promiscuo, CBP/p300 (para revisión ver Glass et al, Curr. Opin. Cell Biol . 9:222 (1997)). También, los cofactores proteicos en general conocidos como co-represores (también conocido como represores, silenciadores, o mediadores de silenciamiento, pueden ser requeridos para inhibir de manera efectiva la activación transcripcional en ausencia del ligando. Estos co-represores pueden interactuar con el EcR no ligado para silenciar la actividad en el elemento de respuesta. La evidencia actual sugiere que el enlace del ligando cambia la formación del receptor, lo cual da como resultado la liberación del co-represor y el reclutamiento de los coactivadores anteriormente descritos, con lo cual se suprime su actividad silenciadora . Los ejemplos de los co-represores incluyen N-CoR y SMRT (para revisión, ver Horwitz et al., Mol Endocrinol . J OA 167 (1996)). Estos co-factores pueden ser ya sea endógenos dentro de la célula o el organismo, o pueden ser agregados exógenamente , como transgenes para ser expresados de una manera regulada o no regulada.

B. Cambio de Gen Basado en Rapamicina La presente invención proporciona además un sistema de cambio de gen que utiliza la proteína de enlace FK506 como el complejo del factor de transcripción dependiente del ligando, y la rapamicina como el ligando. En una modalidad, la construcción que codifica para el cambio de gen comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica para un primera proteína quimérica que se enlaza a la rapamicina o un análogo de la misma, y que comprende al menos un dominio de la proteína de enlace a FK506 (FKBP) y al menos un dominio de proteína heterólogo a éste, en donde el dominio de FKBP comprende una secuencia peptídica seleccionada de:: (1) una FKBP de origén natural (2) una variante de una FKBP de origen natural en la cual hasta 10 residuos de aminoácidos han sido suprimidos, insertados o reemplazados con aminoácidos sustitutos, y (3) un FKBP que codifica por una secuencia de ADN que se híbrida selectivamente a una secuencia de ADN que codifica para un FKBP de (1) 6(2); (b) un segundo polinucleótido que codifica para una segunda proteína quimérica que forma un complejo con (a) la rapamicina o un análogo de rapamicina (b) la primera proteína quimérica, y que comprende al menos un dominio de enlace a FKBP : rapamicina (FRB) y al menos un dominio de proteína heterólogo a éste, en donde el dominio de FRB comprende una secuencia peptídica seleccionada de: (4) un dominio FRB origen natural, (5) una variante de un dominio FRB de origen natural, en el cual hasta 10 residuos de aminoácidos han sido suprimidos, insertados, o reemplazados con aminoácidos sustitutos, y (6) un dominio FRB codificado por una secuencia de ADN que se híbrida selectivamente a una secuencia de DNa que codifica para un FRB de (4) ó (5) .

En este sistema de cambio de gen, cada uno del primer polinucleótido y el segundo polinucleótido están bajo el control de uno o más promotores de cambio terapéuticos, como se describe en otro sitio en la presente. Además, en ciertas modalidades, al menos un dominio de proteína heterólogo a los dominios FKBP y/o FRB en la primera y segunda proteína quimérica, pueden ser uno o más dominios de "acción" o "efectores". Los dominios efectores pueden ser seleccionados de una amplia variedad de dominios proteicos que incluyen los dominios de enlace al ADN, dominios de activación de la transcripción, dominios de localización celular y dominios de señalización (por ejemplo, los dominios que son capaces de agrupamiento o multimerización, de disparar el crecimiento celular, la proliferación, la diferenciación, la apoptosis, y la transcripción de genes, etc . ) .

En ciertas modalidades, una proteína de fusión contiene al menos un dominio de enlace al ADN (por ejemplo, un dominio de enlace al ADN de GAL4 o ZFHDl) y otra proteína de fusión contiene al menos un dominio de activación de la transcripción (por ejemplo, un dominio de activación a la activación de VP 16 ó p65) . La asociación ligada por el ligando de las proteínas de fusión representa la formación de un complejo del factor de transcripción y conduce al inicio de la transcripción de un gen objetivo ligado a una secuencia de ADN reconocida por, (por ejemplo, capaz de enlazarse con) el dominio de enlace al ADN sobre una de las proteínas de fusión. La información respecto al sistema de expresión del gen ha sido como el ligando se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,187,757 Bl, 6,649,595 Bl, 6,509, 152 Bl, 6,479,653 Bl, y 6, 117,680 Bl .

En otras modalidades, la presente invención proporciona un sistema de cambio de gen que comprende polinucleótidos que codifican para dos proteínas de fusión las cuales se autoagregan en presencia de un ligando, en donde (a) la primera la proteína de fusión comprende un dominio de agregación condicional que se enlaza a un ligando seleccionado y a un dominio de activación de la transcripción, y (b) la segunda proteína de fusión que comprende un dominio de agregación condicional que se enlaza a un ligando seleccionado y a un dominio de enlace al ADN, y (c) en la ausencia de un ligando, las células expresan un gen operablemente enlazado al ADN regulador al cual se enlaza el dominio de enlácela ADN. Las células modificadas que comprenden el sistema del cambio de gen son expandidas en la presencia de un ligando en una cantidad suficiente para la represión del gen. La eliminación del ligando induce la expresión de la proteína codificada que provoca muerte celular. Los ácidos nucleicos que codifican para las dos proteínas de fusión están bajo el control de al menos un promotor condicional. El sistema de expresión del gen que utiliza los dominios de agregación condicionales, se describen en la Publicación de los Estados Unidos No. 2002/0048792.

C. Sistema de Cambio de Gen Basado en Represor/Operador Procariótico En una modalidad, la presente invención proporciona el sistema de cambio de gen que consiste (a) un primer polinucleótido que codifica para una proteína de fusión transactivadora, que comprende un represor de tetraciclina eucariótico ("tet") y un dominio de enlace de proteína activadora transcripcional euciótica; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para una proteína terapéutica o polipéptido terapéutico, en donde el segundo polinucleótido está operablemente enlazado a un promotor mínimo y al menos una secuencia operadora tet. El primer polinucleótido que codifica para una proteína de fusión transactivadora, puede comprenden el promotor de cambio terapéutico como se describe en otro sitio en la presente. La expresión de la proteína letal es supra-regulada en ausencia de tetraciclina, (ver, por ejemplo, Gossen et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci . 89: 5547-5551; Gossen et al. (1993) TIBS .18: 471-475; Furth et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci . 91: 9302-9306; y Shockett et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. 92: 6522-6526). El sistema de expresión TetO es descrita en la Patente de los Estados Unidos No. 5,464,758 Bl .

En otra modalidad más, el sistema de cambio de gen comprende los sistemas represores-operadores de lactosa ("Lac") de la bacteria Escherichia coli. El sistema de cambio de gen de la presente invención puede también comprender (a) un primer polinucleótido que codifica para una proteína de fusión transactivadora que comprende un represor lac I procariótico y un dominio proteico activador transcripcional eucariótico; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para una proteína terapéutica o polipéptido terapéutico, en donde el segundo polinucleótido está operablemente enlazado a un promotor de cambio terapéutico. En el sistema Lac, un operón lac es inactivado en ausencia de lactosa, o análogos sintéticos tales como isopropil -b-D-tiogalactósido .

Los sistemas de cambio de gen adicionales incluyen aquellos descritos en los siguientes documentos: US7 , 091 , 038 ; WO2004078924 ; EP1266015; US20010044151 ; US20020110861 ; US20020119521; US20040033600 ; US20040197861 ; US20040235097 ; US20060020146 ; US20040049437 ; US20040096942 ; US20050228016 ; US20050266457; US20060100416 ; WO2001/70816 ; WO2002/29075 ; WO2002/066612 ; O2002/066613 ; WO2002/066614 ; W02002/066615 ; O2005/108617; US 6,258,603; US20050209283 ; US20050228016 ; US20060020146; EP0965644; US 7,304,162; US 7,304,161; MX234742; KR10 -0563143 ; AU765306; AU2002 -248500 ; y AU2002-306550.

D. Combinación de los Sistemas de Cambio de Gen La presente invención proporciona las composiciones de ácido nucleico, las células modificadas, y los biorreactores que comprenden dos o más sistemas de cambio de gen que comprenden diferentes complejos del factor de transcripción dependiente del ligando que son activados por una cantidad efectiva de uno o más ligandos, en donde dos o más sistemas de cambio de gen comprenden un primer cambio de gen y un segundo cambio de gen, los cuales selectivamente inducen la expresión de uno o más polipéptidos terapéuticos o polipéptidos terapéuticos, después del enlace a uno o más ligandos. Dentro del alcance de la presente invención, están cualesquiera números de y/o combinaciones de sistemas de cambio de gen.

En una modalidad, la presente invención proporciona una composición de ácido nucleico que comprende: a. un primer sistema de cambio de gen que comprende: i. un primer cásete de expresión del gen que comprende a polinucleótido que codifica para un primer polipéptido híbrido que incluye: 1. un dominio de transactivación, que activa un promotor regulado por el factor, operablemente asociado con polinucleótido que codifica para un polinucleótido terapéutico o polinucleótido terapéutico; y 2. un dominio socio heterodímero, ii. un segundo cásete de expresión del gen que comprende un polinucleótido que codifica a un segundo polipéptido de hibridación que comprende: 1. un dominio de enlace al ADN, que reconoce un promotor regulado por el gen, operablemente asociado con un polinucleótido que codifica para un polipéptido terapéutico o polinucleótido terapéuticos; y 2. un dominio de enlace al ligando; y iii. un tercer cásete de expresión del gen que comprende un polinucleótido que codifica a un polipéptido o un polinucleótido terapéutico que comprende: 1. un promotor regulado por el factor, que es activado por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y 2. un polinucleótido que codifica para un polipéptido terapéutico o un polinucleótido terapéutico, y b. un segundo sistema de expresión de gen que comprende: i. un primer cásete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica par un polipéptido híbrido, el cual comprende : 1. un domino de enlace de transactivación, el cual activa, un promotor regulado por el factor, operablemente asociado con un polinucleótido que codifica para un polipéptido terapéutico o un polinucleótido terapéutico; y 2. un dominio de socio heterodímero, ii. un segundo un cásete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica par un segundo polipéptido híbrido, el cual comprende: 1. un domino de enlace de ADN, 1 cual reorganiza un promotor regulado por el factor, operablemente asociado con un polinucleótido que codifica para un polipéptido terapéutico o un polinucleótido terapéutico; y 2. un dominio de enlace al ligando; y iii. un tercer cásete de expresión del gen que comprende un polinucleótido que codifica a un polipéptido o un polinucleótido terapéutico que comprende: 1. un promotor regulado por un factor, que es activado por el dominio de la transactivación del segundo polipéptido híbrido; y, 2. un polinucleótido que codifica para un polipéptido terapéutico o un polinucleótido terapéutico.

Los sistemas de expresión de genes inducibles múltiples proporcionan la expresión de un polinucleótido terapéutico o polipéptido terapéutico dado, ¿ajo condiciones asociadas con diferentes enfermedades, trastornos o condiciones, o la expresión de múltiples polipéptidos o polinucleótidos terapéuticos ya sea bajo las mismas condiciones asociadas con la misma enfermedad, trastorno o condición, o bajo diferentes condiciones asociadas con diferentes enfermedades, trastornos o condiciones.

En ciertas modalidades, la combinación de dos o más sistemas de cambio de gen pueden ser (1) un sistema de expresión de gen basado en el receptor de ecdisona, de doble cambio, y (2) un cambio de gen basado en receptor de ecdisona de cambio simple. En otras modalidades, la combinación puede ser (1) un cambio de gen basado en el receptor de ecdisona de cambio simple o doble, y (2) un cambio de gen basado en rapamicina. Alternativamente, la combinación de los sistemas de cambio de gen pueden ser dos o sistemas de cambio de gen basados en rapamicina, idénticos, descritos anteriormente. Cualesquiera combinaciones posibles de los sistemas de cambio de gen están dentro del alcance de la invención.

Ligandos Como se utiliza en la presente el término "ligando" como se aplica a los cambios de genes basados en LDTFC, por ejemplo, los cambios de genes basados en el complejo EcD, describe moléculas pequeñas y solubles que tienen capacidad de activar un cambio de gen para estimular la expresión de un polipéptido codificado en éste. El ligando para un complejo del factor de transcripción dependiente del ligando, de la invención, se enlaza al complejo proteico que comprende uno o más dominios de enlace al ligando, el domino de socio heterodímero, el dominio de enlace al ADN, y el dominio de transactivación. La elección del ligando para activar el complejo del factor de trascripción dependiente del ligando, depende del tipo de cambio de gen utilizado.

Los ejemplos de ligandos incluyen, sin limitación, un ecdisteroide, tal como la ecdisona, 20-hidroxiecdisona, ponasterona A, muristerona A, y similares, el ácido 9-cis-retinoico, análogos sintéticos de ácido retinoico, ?,?'-diacilhidrazinas tales como aquellas descritas en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,013,836; 5,117,057; 5,530,028; y 5,378,726 y las Solicitudes de los Estados Unidos Nos. 2005/0209283 y 2006/0020146; oxadiazolinas como se describe la Solicitud Publicada de los Estados Unidos No. 2004/0171651; dibenzoilalquil-cianohidrazinas tales como aquellas descritas en la Solicitud Europea No. 461,809; N-alquil-?,?' -diaroilhidrazinas tales como aquellas descritas en la Patente No. 5,225,443; N-acil-N-alquilcarbonilhidrazinas tales como aquellas descritas en la Solicitud Europea No. 234,994; - N-aroil-N-alquil- 1 -aroilhidrazinas tales como aquellas descritas en la Patente No. 4,985,461; amidocetonas tales como aquellas descritas en la Solicitud Publicada de los Estados Unidos No. 2004/0049037; cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente, y otros materiales y similares que incluyen 3 , 5-di-ter-butil-4-hidroxi-N-isobutil-benzamida, 8-O-acetilharpágido, oxiesteroles , 22 (R) -hidroxicolesterol , 24 (S) -hidroxicolesterol, 25-epoxicolesterol , T0901317, 5-alfa-6-alfa-epoxicolesterol-3-sulfato (ECHS) , 7-cetocolesterol-3-sulfato, famesol, ácido biliares, ésteres de 1 , 1-bifosfonato, hormona juvenil III, y similares. Los ejemplos de ligandos de diacilhidrazina útiles en la presente invención incluyen la N- ( l-etil-2 , 2 -dimetil-propil ) - 1 - (2 -metil-3 -metoxi-benzoil) -hidrazida) del ácido (3 , 5-dimetil-benzoico) , RG-115932 N- ( 1-ter-butil-butil ) -N' - (2-etil-3-metoxi-benzoil) -hidrazida) del ácido (R) -3 , 5-dimetil-benzoico, y RG-115830 N- ( 1-ter-butil-butil) - 1 - (2 -etil-3 -metoxi-benzoil) -hidrazida) del ácido (3 , 5-dimetil-benzoico) . Ver por ejemplo la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de Serie 12/155,111, y la solicitud del PCT No. PCT/US2008/006757 , las cuales se incorporan por referencia en la presente en su totalidad.

Por ejemplo, un ligando para el cambio de gen basado en el receptor de ecdisona, puede ser seleccionado de cualesquiera ligandos adecuados. Los análogos de ecdisona o ecdison de origen natural (por ejemplo, 20-hidroxiecdisona, muristerona A, ponasterona A, ponasterona B, ponasterona C, 26-yodoponasterona A, inokosterona o 26-mesilinokosterona) y los inductores no esteroides pueden ser utilizados como un ligando para el cambio de gen de presente invención. La patente No. 6,379,945 Bl, describe un receptor esteroide de insecto aislado de Heliothis virescens ("HEcR") el cual es capaz de actuar como un cambio de gen que responde a ciertos inductores esteroides y no esteroides. Los inductores no esteroides tienen una ventaja distinta sobre los esteroides, en este y muchos otros sistemas que responden a los inductores esteroides y no esteroides, por un número de razones que incluyen, por ejemplo: más bajo costo de fabricación, estabilidad metabólica, ausencia de insectos, plantas o mamíferos, y aceptabilidad ambiental. La patente de los Estados Unidos No. 6,379,945 Bl describe la utilidad de dos dibenzoilhidrazinas , 1, 2-dibenzoil-l-ter-butil-hidrazina y tebufenozida (N- (4 -etilbenzoil) -N ' - ( 3 , 5-dimetilbenzoil) -N' -ter-butil-hidrazina) como ligandos para un cambio de gen basado en ecdisona. También incluidas en la presente invención como un ligando están otras dibenzoilhidrazinas, tales como aquellas descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 5,117,057 Bl . El uso de tebufenozida como un ligando químico para el receptor de ecdisona de Drosophila melanogaster es también descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 6,147,282. Ejemplos no limitantes, adicionales de ligando de ecdisona son 3,5-di-tert-butil-4-hidroxi-N-isobutil-benzamida, 8-0- acetilharpágido, a 1 , 2 -diacilhidrazina , una hidrazina N1-substituida-N, 1 -disustituida, una dibenzoilalquil-cianohidrazina, una N-sustituido-N-alquil-N, N-diaroil-hidrazina, una N-sustituido-N-acil-N-alquil-carbonilhidrazina o una N-aroil -N 1 -alquil -N 1 -aroilhidrazina , (Ver la patente de los Estados Unidos No. 6,723,531).

En una modalidad, el ligando para un sistema de cambio de gen basado en ecdisona es un ligando de diacilhidrazina o un ligando de diacilhidrazina quiral. El ligando utilizado del sistema de cambio de genes pueden ser los compuestos de la fórmula I .

Fórmula I en donde A es alcoxi, arilalquiloxi o ariloxi; B es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y l y R2 son independientemente alquilo opcionalmente sustituido, arilalquilo, hidroxialquilo, haloalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, o heteroarilo opcionalmente sustituido; o las sales, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos, todas farmacéuticamente aceptables.

En otra modalidad más, el ligando pueden ser compuestos enantiómericamente enriquecidos de la Fórmula II Fórmula en donde A es alcoxi, arilalquiloxi , ariloxi, arilalquilo, arilo opcionalmente sustituido, o heteroarilo opcionalmente sustituido; B es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y Rl y R2 son independientemente alquilo opcionalmente sustituido, arilalquilo, hidroxialquilo, haloalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; con la condición de que Rl no sea igual a R2 ; en donde la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que posee Rl y R2 es predominantemente S; o las sales, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos, todas farmacéuticamente aceptables.

En ciertas modalidades, el ligando pueden ser compuestos enantiornéricamente enriquecidos de la Fórmula III Fórmula III en donde A es alcoxi, arilalquiloxi , ariloxi, arilalquilo, arilo opcionalmente sustituido, o heteroarilo opcionalmente sustituido; B es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y Rl y R2 son independientemente alquilo opcionalmente. sustituido, arilalquilo, hidroxialquilo, haloalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; con la condición de que Rl no sea igual a R2 ; en donde la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que posee Rl y R2 es predominantemente R; o las sales, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos, todas farmacéuticamente aceptables.

En una modalidad, un ligando puede ser la N- (1-ter-butil-butil) -N' - (2-etil-3-metoxi-benzoil) -hidrazida del ácido (R) -3 , 5 -dimetil-benzoico, que tiene un exceso enantiomérico de al menos 95% o una sal, hidrato, forma cristalina o forma amorfa del mismo, farmacéuticamente aceptables.

Los ligandos de diacilhidrazina de la Fórmula I y los ligandos de diacilhidrazina quirales de la Fórmula II o III, cuando se utilizan con un sistema de cambio de gen basado en ecdisona, proporcionan el medio para la regulación temporal externa de la expresión de un polipéptido terapéutico o de un polinucleótido terapéutico de la presente invención. Ver solicitud de los Estados Unidos No. 12/155,111, presentada el 29 de Mayo del 2008, la cual se incorpora por referencia en la presente.

Los ligandos utilizados en la presente invención pueden formar sales. El término "sal o sales" como se utiliza en la presente, denota las sales ácidas y/o básicas formadas con ácidos y bases orgánicos y/o inorgánicos. Además, cuando un compuesto de la Fórmula I, II o III contiene una porción básica y una porción ácida, pueden ser formados anfoteros ("sales internas") y son incluidas dentro del término "sal o sales" como se utiliza en la presente. Las sales farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, no tóxicas, farmacéuticamente aceptables, se utilizan, aunque otras sales son también útiles, por ejemplo, en pasos de aislamiento o purificación que pueden ser empleados durante la preparación. Las sales de los compuestos de las Fórmulas I, II o III pueden ser formadas, por ejemplo, mediante la reacción de un compuesto con una cantidad de ácido base, tal como una cantidad equivalente, en un medio tal como uno en el cual la sal se precipita o en un medio acuoso seguido por la liofilización.

Los ligandos que contienen una porción básica pueden formar sales con una variedad de ácido orgánicos e inorgánicos. Las sales por adición de ácido, ejemplares, incluyen acetatos (tales como aquellas formadas con ácido acético o ácido trihaloacético, por ejemplo ácido trifluoroacético) , adipatos, alginatos, ascorbatos, aspartatos, benzoatos, bencensulfonatos , bisulfatos, boratos, butiratos, citratos, camforatos, canforsulfonatos, ciclopentanpropionatos , digluconatos , dodecilsulfatos , etansulfonatos , fumaratos, glucoheptanoatos , glicerofosfatos , hemisulfatos , heptanoatos, hexanoatos, clorhidratos (formados con ácido clorhídrico), bromhidratos (formados con bromuro de hidrógeno), yodhidratos, 2 -hidroxietansulfonatos , lactatos, maleatos (formados con ácido maleico) , metansulfonatos (formados con ácido metansulfónico) , 2 -naftalensulfonatos , nicotinatos, nitratos, oxalatos, pectinatos, persulfatos, 3-fenilpropionatos , fosfatos, picratos, pivalatos, propionatos, salicilatos, succinatos, sulfatos (tales como aquellos formados con ácido sulfúrico) , sulfonatos (tales como aquellos mencionados en la presente), tartratos, tiocianatos, toluensulfonatos tales como tosilatos, undecanoatos , y similares .

Los ligandos que contienen una porción ácida pueden formar sales con una variedad de bases orgánicas e inorgánicas. Las sales básicas ejemplares incluyen sales de amonio, sales de metal alcalino, tales como las sales de sodio, litio y potasio, sales de metal alcalinotérreo, tales como las sales de calcio y magnesio, sales con bases orgánicas (por ejemplo, aminas orgánicas) tales como benzatinas, diciclohexilaminas , hidrabaminas (formadas con N, -bis (deshidroabietil) etilendiamina) , N-metil-D-glucaminas, N-metil-D-glucamidas, t-butilaminas , y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina, y similares.

Los ejemplos no limitantes de los ligandos para el sistema de expresión de gen inducible que utiliza el dominio de enlace a FK506, son FK506, Ciclosporina A, o Rapamicina. FK506, rapamicina, y sus análogos son descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,649,595 B2 y 6,187,757. Ver también las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,276,498 y 7,273,874.

Los ligandos descritos en la presente pueden ser administrados solos o como parte de una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composición farmacéutica está en la forma soluciones, suspensiones, tabletas, cápsulas, ungüentos, elíxires o composiciones inyectables.

El término "basado en receptor de ecdisona", con respecto a un cambio de gen, se refiere a un cambio de gen que comprende al menos una parte funcional de un dominio de enlace al ligando del receptor de ecdisona, de origen natural o sintético, y el cual regula la expresión del gen en respuesta a un ligando que se enlaza al dominio de enlace del ligando del réceptor de ecdisona. Los ejemplos de sistemas que responden a la ecdisona son descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,091,038 y 6,258,603. En una modalidad, el sistema es el sistema terapéutico RheoSwitch® (RTS) , el cual contiene dos proteínas de fusión, los dominios de un receptor de ecdisona mutagenizado (EcR) fusionado con un dominio de enlace al ADN de Gal4 y los dominio EF de un RXR quimérico fusionado con un dominio de activación de transcripción VP16, expresado bajo un promotor constitutivo como se ilustra en la Figura 1.

Los términos "modulan" y "modula" significa que inducen, reducen o inhiben la expresión del ácido nucleico o el gen, dando como resultado la inducción, reducción o inhibición respectiva de la producción de proteína o polipéptido.

Los polinucleótidos o vectores de acuerdo a la invención pueden comprender además al menos un promotor adecuado para impulsar la expresión de un gen en una célula hospedera .

Los aumentadores que pueden ser utilizados en las modalidades de la invención incluyen, pero no están limitados a: un aumentador del SV40, un aumenador del citomegalovirus (CMV) , un aumentador del factor de alargamiento 1 (EF1) , aumentadores de levadura, aumentadores de genes virales y similares .

Las regiones de control de la terminación, por ejemplo, las secuencias terminadoras o de poliadenilación, pueden también ser derivadas de diversos genes nativos para los hospederos preferidos. Opcionalmente , un sitio de terminación puede ser innecesario, no obstante, se prefiere más si se incluye. En una modalidad de la invención, la región de control de terminación puede estar comprendida o ser derivada de una secuencia sintética, señal de poliadenilación sintética, una señal de poliadenilación tardía del SV40, una señal de poliadenilación del SV40, una señal de poliadenilación de la hormona bovina del crecimiento (BGH) , secuencias terminadoras virales, o similares.

Los términos "secuencias de no codificación 3'" o "región no traducida 3 ' (UTR) " se refieren a secuencias de ADN localizadas corriente abajo (3') de una secuencia de codificación, y pueden comprender secuencias de reconocimiento de poliadenilación [poli (A) ] y otras secuencias que codifican para señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento del ARNm o la expresión del gen. La señal de poliadenilación es usualmente caracterizada por afectar la adición de tramos de ácido poliadenílico hacia el extremo 3' del precursor de ARNm.

"Región reguladora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que regula la expresión de una segunda secuencia de ácido nucleico. Una región reguladora puede incluir secuencias que son naturalmente responsables por la expresión de un ácido nucleico particular (una región homologa) o pueden incluir secuencias de un origen diferente que son responsables de la expresión de diferentes proteínas o incluso proteínas sintéticas (una región heteróloga) . En particular, las secuencias pueden ser secuencias de genes procarióticos , eucarióticos o virales o secuencias derivadas que estimulan o que reprimen la transcripción de un gen de una manera específica o no específica, y de una manera inducible o no inducible. Las regiones reguladoras incluyen orígenes de replicación, sitios de empalme al ARN, promotores, aumentadores , secuencias de terminación de la transcripción, y secuencia de señal que dirigen el polipéptido hacia las vías secretoras de la célula objetivo.

Una región reguladora proveniente de un "fuente heteróloga" se refiere a una región reguladora que no está naturalmente asociada con al ácido nucleico expresado. Incluidas entre las regiones reguladoras heterólogas están las regiones reguladoras provenientes de diferentes especies, regiones reguladoras provenientes de un gen diferente, secuencias reguladoras híbridas, y secuencias reguladoras que no aparecen en la naturaleza, pero que son diseñadas por una persona que tiene experiencia ordinaria en la técnica.

"Transcrito de ARN" se refiere al producto resultante de la transcripción catalizada por la ARN-polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando el transcrito de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, éste es denominado como transcrito primario y puede ser una secuencia de ARN derivada del procesamiento post-transcripcional del transcrito primario, y es denominado como ARN maduro. El "ARN mensajero (ARNm) " se refiere al ARN que está sin intrones y que puede ser traducido en proteína por la célula. "ADNc" se refiere a un ADN de doble hebra que es complementario a y derivado del ARNm. ARN "en sentido" se refiere al transcrito de ARN que incluye el ARNm y así pues puede ser traducido en proteína por la célula. "ARN antisentido" se refiere a un transcrito de ARN que es complementario a todo o parte de un transcrito primario objetivo o ARNm, y que bloquea la expresión de un gen objetivo. La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte del transcrito del gen específico, por ejemplo, en la secuencia de no codificación 5', la secuencia de no codificación 31 , o la secuencia de codificación. "ARN funcional" se refiere al ARN antisentido, ARN ribozimal, u otro ARN que no es traducido todavía pero tiene un efecto sobre los procesos celulares.

"Polipéptido" , "péptido" y "proteína" son utilizados intercambiablemente y se refieren a un compuesto polimérico comprendido de residuos de aminoácidos covalentemente enlazados .

Un "polipéptido aislado", "péptido aislado" o "proteína aislada" se refieren a un péptido o proteína que está sustancialmente libre de aquellos compuestos que están normalmente asociados con éste en su estado natural (por ejemplo, otras proteínas o polipéptidos , ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos) . "Aislado" no se entiende que excluya mezclas artificiales o sintéticas con otros compuestos, o la presencia de impurezas que no interfieren con la actividad biológica, y que pueden ser, por ejemplo, debido a la purificación incompleta, la adición de estabilizadores, o la composición en una preparación farmacéuticamente aceptable.

Un "polipéptido mutante de sustitución" o "mutante de sustitución" significará un polipéptido mutante que comprende una sustitución de al menos un aminoácido de tipo silvestre o de origen natural con un aminoácido diferente con relación al polipéptido de tipo silvestre o de origen natural. Un polipéptido mutante de sustitución puede comprender únicamente una sustitución de aminoácido de tiempo silvestre o de origen natural, y puede ser denominado como un "mutante puntual" o polipéptido "mutante puntual" simple. Alternativamente, un polipéptido mutante de sustitución puede comprender una sustitución de dos o más aminoácidos de tipo silvestre o de origen natural con dos o más aminoácidos con relación al polipéptido de tipo silvestre o de origen natural. De acuerdo a la invención. De acuerdo a la invención, un polipéptido de dominio de enlace al ligando del receptor nuclear del grupo H, que comprende una mutación de sustitución, comprende una sustitución de al menos un aminoácido de tipo silvestre o de origen natural, con un aminoácido diferente con relación al polipéptido de dominio de enlace al ligando, del receptor nuclear del grupo H, de tipo silvestre o de origen natural.

Cuando el polipéptido mutante de sustitución comprende una sustitución de dos o más aminoácidos de tipo silvestre o de origen natural, esta sustitución puede comprender ya sea un número equivalente de aminoácidos de tipo silvestre o de origen natural suprimidos para la sustitución, por ejemplo, dos aminoácidos de tipo silvestre o de origen natural reemplazados con dos aminoácidos no de origen silvestre o no de origen natural, o un número no equivalente de aminoácidos de tipo silvestre suprimidos para la sustitución, por ejemplo, dos aminoácidos de tipo silvestre sustituidos con un aminoácido de tipo silvestre (una mutación de sustitución+supresión) , o dos aminoácidos de tipo silvestre reemplazados con tres aminoácidos no de tipo silvestre (una mutación de sustitución+inserción) .

Los mutantes de sustitución pueden ser descritos utilizando un sistema de nomenclatura abreviado para indicar el residuo de aminoácido y el número reemplazado dentro de la secuencia del polipéptido de referencia y el residuo de aminoácido sustituido nuevo. Por ejemplo, un mutante de sustitución en el cual el vigésimo (20°) residuo de aminoácido de un polipéptido está sustituido, puede ser abreviado como "x20z", en donde "x" es el aminoácido que va a ser reemplazado, "20" es la posición del residuo de aminoácido o el número dentro del polipéptido, y "z" es el nuevo aminoácido sustituido. Por lo tanto, un mutante de sustitución abreviado intercambiablemente, "E20A" o "Glu20Ala" indica que el mutante comprende un residuo de alanina (comúnmente abreviado en la técnica como "A" o "Ala") en lugar de ácido glutámico (comúnmente abreviado en la técnica como "E" o "Glu") en la posición 20 del polipéptido.

Una mutación por sustitución puede ser realizada mediante cualquier técnica para la mutagénesis, conocida en la materia, incluyendo pero no limitada a mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson et al, J. Biol . Chem. 253:6551 (1978); Zoller et al, ADN 3:479 (1984); Oliphant et al, Gene 44:177 (1986); Hutchinson et al, Proc . Nati Acad. ScL USA 83:710 (1986)), el uso de ligadores TAB® (Pharmacia), digestión con endonucleasa de restricción/supresión o sustitución de fragmentos, mutagénesis mediada por PCR/dirigida al oligonucleótido, y similares. Las técnicas basadas en PCR son preferidas para la mutagénesis dirigida al sitio (ver Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer ADN", in PCR Technology: Principies and Applications for ADN Amplification, H. Erlich, ed. , Stockton Press, Cap. 6, pp . 61-70) .

El término "fragmento", como se aplica a un polipéptido, se refiere a un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es más corta que aquella del polipéptido de referencia y que comprende, sobre la porción completa con estos polipéptidos de referencia, una secuencia de aminoácidos idéntica. Tales fragmentos pueden, donde es apropiado, ser incluidos en un polipéptido más grande del cual éstos son parte. Tales fragmentos de un polipéptido de acuerdo a la invención pueden tener una longitud de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 25, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 240, o 300 o más aminoácidos .

Una "variante" de un polipéptido o proteína se refiere cualquier análogo, fragmento, derivado, o mutante que sea derivado de un polipéptido o proteína, y que conserve al menos una propiedad biológica del polipéptido o proteína. Diferentes variantes del polipéptido o proteína pueden existir en la naturaleza. Estas variantes pueden ser variantes alélicas caracterizadas por diferencias en la secuencia de nucleótidos del gen estructural que codifica para la proteína, o pueden involucrar empalme diferencial o modificación postraduccional . El experto en la materia puede producir variantes que tienen sustituciones, supresiones, adiciones o reemplazos simples o múltiples de aminoácidos. Estas variantes pueden incluir, entre otras: (a) variantes en las cuales uno o más residuos de aminoácidos están sustituidos con aminoácidos conservadores o no conservadores, (b) variantes en las cuales uno o más aminoácidos son agregados al polipéptido o proteína, (c) variantes en las cuales uno o más de los aminoácidos incluyen un grupo sustituyente , y (d) variantes en las cuales el polipéptido o la proteína está fusionado con otro polipéptido tal como la albúmina sérica. Las técnicas para obtener estas variantes, incluyendo las técnicas genéticas (supresiones, omisiones, , mutaciones, etc.), químicas y enzimáticas, son conocidas para las personas que tienen experiencia ordinaria en la materia. En una modalidad, un polipéptido variante comprende al menos aproximadamente 14 aminoácidos.

El término "homología" se refiere al porcentaje de identidad entre dos porciones polinucleotídicas o dos porciones de polipéptido. La correspondencia entre la secuencia de una porción a otra puede ser determinada mediante técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, la homología puede ser determinada por una comparación directa de la información de la secuencia entre dos moléculas polipeptídicas por alineación de la información de la secuencia y el uso de programas de computadora fácilmente disponibles. Alternativamente, la homología puede ser determinada mediante hibridación de los polinucleótidos bajo condiciones que forman dúplex estables entre regiones homologas, seguido por la digestión con una o varias nucleasas específicas de una sola hebra, y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos.

Como se utiliza en la presente, el término "homólogo" en todas sus formas gramaticales y variaciones de deletreo, se refiere a la relación entre proteínas que poseen un "origen evolutivo común", incluyendo proteínas provenientes de superfamilias (por ejemplo, la superfamilia de inmunoglobulinas) , y proteínas homologas provenientes de diferentes especies (por ejemplo, cadena ligera de miosina etc.) (Reeck et al, Cell 50:667 (1987)). Tales proteínas (y sus genes de codificación) tienen homología secuencial, como es reflejado por su alto grado de similitud secuencial. Sin embargo, en el uso común y en la aplicación, el término "homólogo", cuando se modifica con un adverbio tal como "altamente", puede referirse a la similitud de la secuencia y no a un origen evolutivo común.

En consecuencia, el término "similitud secuencial" en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos de las proteínas, que pueden o no compartir un origen evolutivo común (ver Reeck et al., Cell 50:667 (1987)). En una modalidad, dos secuencias ADN son " substancialmente homologas" o " substancialmente similares" cuando al menos aproximadamente 50% (por ejemplo, al menos aproximadamente 75%, 90%, o 95%) de los nucleótidos concuerdan sobre la longitud definidas de la secuencia de ADN. Las secuencias que son sustandadamente homologas pueden ser identificadas al comparar las secuencias utilizando software estándar disponible en los bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación de Southern, por ejemplo, bajo condiciones estrictas como se define para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la experiencia de la técnica (ver por ejemplo, Sambrook et al, 1989, su ra) .

Como se utiliza en la presente, "substancialmente similar" se refiere a los fragmentos de ácido nucleico en donde los cambios en una o más bases nucleotídicas dan como resultado la sustitución de uno o más aminoácidos, pero no afectan las propiedades funcionales de la proteína codificada por la secuencia de ADN. "Substancialmente similar" también se refiere a los fragmentos de ácido nucleico en donde los cambios en una o más bases nucleotídicas no afectan la habilidad del fragmento de ácido nucleico para mediar la alteración de la expresión del gen por tecnología antisentido o de co-supresión . "Substancialmente similar" también se refiere a las modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la invención, tales como la supresión o inserción de una o más bases de nucleótidos que no afectan sustancialmente las propiedades funcionales del transcrito resultante. Se entiende por lo tanto que la invención abarca más que las secuencias ejemplares específicas. Cada una de las modificaciones propuestas está muy por dentro de la experiencia rutinaria en la técnica, como lo es la determinación de la retención de actividad biológica de los productos codificados.

Además, la persona experta reconoce que las secuencias sustancialmente similares abarcadas por esta invención son también definidas por su habilidad para hibridarse, bajo condiciones estrictas (0.1X SSC, 0.1% SDS, 65°C y lavadas con 2X SSC, 0.1% SDS seguido por 0.1 X SSC, 0.1% SDS), con las secuencias ejemplificadas en la presente. Los fragmentos de ácido nucleico substancialmente similares de la invención son aquellos fragmentos de ácido nucleico cuyas secuencias de ADN son al menos aproximadamente 70%, 80%, 90% o 95% idénticas a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico reportados en la presente.

Dos secuencias de aminoácidos son " substancialmente homologas" o " sustancialmente similares" cuando más de aproximadamente 40% de los aminoácidos son idénticos, o más de 60% son similares ( funcionalmente idénticos) . Preferentemente, las secuencias similares u homologas son identificadas por alineación utilizando, por ejemplo, el programa GCG (Genetics Computer Group, Programa Manual para el paquete GCG, Versión 7, Madison, Wisconsin) .

El término "correspondiente a" se utiliza en la presente para referirse a secuencias similares u homologas, ya sea que la posición exacta sea idéntica o diferente de la molécula a la cual se mide la similitud u homología. La alineación de la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos puede incluir espacios. De este modo, el término "correspondiente a" se refiere a la similitud secuencial y no a la numeración de los residuos de aminoácidos o las bases nucleotídicas .

Un "porción sustancial" de una secuencia de aminoácidos ó de nucleótidos, comprende suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia nucleotídica de un gen para identificar putativamente ese polipéptido o gen, ya sea por evaluación manual de la secuencia por una persona experta en la materia, o mediante comparación de secuencia automatizada por computadora y la identificación utilizando algoritmos tales como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al, J. Mol Biol . 215:403 (1993)); disponible en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). En general, una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos, es necesaria con el fin identificar putativamente un polipéptido o secuencia de ácido nucleico como homologa a una proteína o gen conocido. Además, con respecto a las secuencias nucleotídicas , las sondas oligonucleotídicas específicas del gen que comprende 20-30 nucleótidos contiguos, pueden ser utilizadas en los métodos dependientes de la secuencia, de la identificación de genes (por ejemplo, hibridación de Southern) y aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de bacteriófagos). Además, los oligonucleótidos cortos de 12 a 15 bases pueden ser utilizados como cebadores de amplificación en PCR con el fin obtener un fragmento de ácido nucleico particular que comprende los cebadores. En consecuencia, una "porción sustancial" de una secuencia nucleótidos comprende suficiente de la secuencia para identificar y/o aislar específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia.

El término "identidad porcentual", como es conocido en la técnica, es una relación entro dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos , como son determinados por comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de parentesco secuencial entre las secuencias de polipéptido o del polinucleótido, como pueda ser el caso, como es determinado por la concordancia entre tramos de tales secuencias. La "identidad" y "similitud" pueden ser fácilmente calculados mediante métodos conocidos, incluyendo pero no limitados a aquellos descritos en: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M. , ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing : Informatics and Genome Projects (Smith, D. ., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M. , and Griffin, H. G. , eds . ) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G. , ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J. , eds.) Stockton Press, New York (1991). Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para dar la mejor concordancia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud son codificados en programas de computadora públicamente disponibles. Los alineamientos secuenciales y los cálculos de identidad porcentual pueden ser realizados utilizando el software de análisis de secuencia tal como el programa Megalign del programa de cómputo de bioinformática LASERGENE (ADNSTAR Inc., Madison, WI) . Múltiples alineaciones de las secuencias pueden ser realizadas utilizando el método Clustal de alineamiento (Higgins et al, CABIOS. 5:151 (1989)), con los parámetros por omisión (PENALIDAD POR ESPACIO VACÍO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DE ESPACIO VACÍO = 10) . Los parámetros por omisión para los alineamientos apareados utilizando el método de Clustal pueden ser seleccionados: KTUPLE 1, PENALIDAD POR ESPACIO VACÍO = 3 , VENTANA = 5 y DIAGONALES AHORRADAS = 5.

El término "software de análisis de secuencia" se refiere a cualquier algoritmo de computadora o programa de software que sea útil para el análisis de las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. El "software de análisis de secuencia" puede ser comercialmente disponible o independientemente desarrollado. El software de análisis de secuencia típico incluye, pero no está limitado a, el conjunto de programas GCG (Paquete Wisconsin Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, I) , BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol . 215:403 (1990)), y ADNSTAR (ADNSTAR, Inc. 1228 S. Park St . Madison, WI 53715 USA) . Dentro del contexto de esta solicitud, se entenderá que donde se utiliza el software de análisis secuencial para el análisis, los resultados del análisis estarán basados en los "valores por omisión" del programa referido, a no ser que se especifique de otro modo. Como se utilizan en la presente los "valores por omisión" se entenderán cualquier grupo de valores o parámetros que originalmente se cargan con el software cuando es primeramente inicializado .

"Químicamente sintetizado", relacionado a una secuencia de AD , significa que los nucleótidos componentes pueden ser ensamblados in vitro. La síntesis química manual del ADN puede ser lograda utilizando procedimientos bien establecidos, o la síntesis química automatizada puede ser realizada utilizando una de un número de máquinas comercialmente disponibles. En consecuencia, los genes pueden ser diseñados a la medida para la expresión óptima del gen, con base en la optimización de la secuencia nucleotídica para reflejar la desviación del codón de la célula hospedera. El experto en la materia aprecia la probabilidad de expresión génica exitosa si el uso del codón es desviado hacia aquellos codones favorecidos por el hospedero. La determinación de los codones preferidos puede estar basada en una supervisión de los genes derivados de la célula hospedera, donde está disponible la información de la secuencia.

Como se utiliza en la presente, se dice que dos o más sistemas de regulación génica individualmente operables, son "ortogonales" cuando; a) la modulación de cada uno de los sistemas dados por su ligando respectivo, a una concentración elegida, da como resultado un cambio mensurable en la magnitud de la expresión del gen de ese sistema, y b) el cambio es estadísticamente y significativamente diferente del cambio en la expresión de todos los otros sistemas simultáneamente operables en la célula, tejido, o el organismo, no obstante de la simultaneidad o la secuencialidad de la modulación efectiva. Preferentemente, la modulación de cada sistema de regulación de gen individualmente operable, efectúa un cambio en la expresión del gen al menos dos veces mayor que todos los otros sistemas operables en la célula, tejido u organismo, por ejemplo, 5 veces, 10 veces, 100 veces, o 500 veces mayor. Idealmente, la modulación de cada uno de los sistemas dados por su ligando respectivo, a una concentración elegida, da como resultado un cambio mensurable en la magnitud de la expresión del gen de ese sistema, y ningún cambio mensurable en la expresión de todos los otros sistemas operables en la célula, tejido u organismo. En tales casos, se dice que el sistema de regulación génica inducible múltiple es "completamente ortogonal". Los ligandos ortogonales útiles y los sistemas de expresión de genes basados en receptores ortogonales, se describen en el documento US 2002/0110861 Al.

El término "gen exógeno" significa un gen extraño para el sujeto, es decir, un gen que es introducido dentro del sujeto a través de un proceso de transformación, una versión no mutada de un gen mutado endógeno o una versión mutada de un gen no mutado endógeno. El método de transformación no es crítico para esta invención, y puede ser cualquier método adecuado para el sujeto conocido por aquellos expertos en la materia. Los genes exógenos pueden ser ya sea genes naturales o sintéticos que son introducidos dentro del sujeto en la forma de ADN o ARN, que pueden funcionar a través de un intermediario de ADN tal como mediante transcriptasa inversa. Tales genes pueden ser introducidos dentro de las células objetivo, directamente introducidos dentro de un sujeto, o indirectamente introducidos por la transferencia de células transformadas dentro del sujeto.

El término "producto terapéutico" se refiere a un polipéptido terapéutico o polinucleótido terapéutico, que imparte una función benéfica a la célula hospedera en la cual tal producto es expresado. Los polipéptidos terapéuticos pueden incluir, sin limitación, polipéptidos tan pequeños como de tres aminoácidos de longitud, proteínas de cadena simple o de cadena múltiple, y proteínas de fusión. Los polinucleótidos terapéuticos pueden incluir, sin limitación, oligonucleótidos antisentido, ARNs de interferencia pequeños, ribozimas, y secuencias guía externas de ARN. El producto terapéutico puede comprender una secuencia de origen natural, una secuencia sintética o una combinación de secuencias naturales y sintéticas.

El término "complejo del factor de transcripción dependiente del ligando" o "LDTFC" se refiere a un factor de transcripción que comprende una o más subunidades de proteína, cuyo complejo puede regular la expresión del gen impulsada por un "promotor regulado por el factor" como se define en la presente. Un modelo LDTFC es un "complejo del receptor de ecdisona" que se refiere en general a un complejo de proteína heterodimérica que tiene al menos dos miembros de la familia de receptores nucleares, en receptor de ecdisona ("EcR") y proteínas de ultraespiráculo ("USP") (ver Yao et al, Nature 366:476 (1993)); Yao et al, Cell 71:63 (1992)). Un LDTFC funcional tal como un complejo EcR puede también incluir una o varias proteínas adicionales tales como inmunofilinas . Los miembros adicionales de la familia de proteínas de receptores nucleares, conocidos como factores transcripcionales (tales como DHR38, betaFTZ-1 u otros homólogos de insecto) , pueden también ser socios dependientes o independientes del ligando, para EcR y/o USP. Un LDTFC tal como un complejo EcR puede también ser un heterodímero de la proteína EcR y el homólogo vertebrado de la proteína ultraespiráculo, la proteína del receptor X del ácido retinoico ("RXR") o una quimera de USP y RXR. Los términos "LDTFC" y "complejo EcR" también abarcan los complejos homodiméricos de la proteína EcR o USP, así como los polipéptidos simples o trímeros, tetrámeros u otros multímeros que sirven la misma función.

Un LDTFC tal como un complejo EcR puede ser activado por un ligando ecdisteroide o no-esteroide activo, enlazado a una de las proteínas del complejo, inclusive de EcR, pero no excluyendo otras proteínas del complejo. Un LDTFC tal como un complejo EcR incluye proteínas que son miembros de la superfamilia de receptores nucleares, en donde todos los miembros están caracterizados por la presencia de una o más subunidades polipeptídicas que comprenden un dominio de transactivación amino-terminal ("AD," "TD, " o "TA, " utilizados intercambiablemente en la presente) , un dominio de enlace al ADN ("DBD"), y un dominio de enlace al ligando ("LBD" ). El AD puede estar presente como una fusión con un "socio de heterodimerización" o "HP" . Una proteína de fusión que comprende un AD y HP de la invención es denominada en la presente como una "proteína de coactivación" o "CAP". El DBD y el LBD pueden ser expresados como una proteína de fusión, denominada en la presente como un "factor de transcripción inducible por ligando ("LTF"). Los socios de fusión pueden ser separados por ligador, por ejemplo, una región de bisagra. Algunos miembros de la familia LTF pueden tener también otro dominio de transactivación sobre el lado carboxilo-terminal del LBD. El DBD está caracterizado por la presencia de dos dedos de zinc de cisteína, entre los cuales están dos porciones de aminoácidos, la caja P y la caja D, que confieren especificidad para los elementos de respuesta a la ecdisona. Estos dominios pueden ser ya sea nativos, modificados o quimeras de diferentes dominios de proteínas receptoras heterólogas .

Las secuencias de ADN que constituyen el gen exógeno, el elemento de respuesta, y el LDTFC, por ejemplo, el complejo EcR, pueden ser incorporados dentro de células procarióticas , arqueobacterias , tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis, y otras enterobacterias , o células eucarióticas tales como células vegetales o animales. No obstante, debido a que muchas de las proteínas expresadas por el gen son procesadas incorrectamente en bacterias, son preferidas las células eucarióticas. Las células pueden estar en la forma de célula simples u organismos multicelulares. Las secuencias nucleotídicas para el gen exógeno, el elemento de respuesta, y el complejo del receptor, pueden ser también incorporadas como moléculas de ARN, preferentemente en la forma de ARNs virales funcionales, tales como el virus mosaico del tabaco. De las células eucarióticas, las células de vertebrados son preferidas debido a que éstas carecen naturalmente de las moléculas que confieren respuestas a los ligandos de esta invención, para EcR. Como resultado, éstas son " sustancialrnente insensibles" a los ligandos de esta invención. De este modo, los ligandos útiles de esta invención tendrán efectos fisiológicos despreciables u otros efectos sobre las células transformadas, o el organismo completo. Por lo tanto, las células pueden desarrollarse y expresar el producto deseado, sustancialmente no afectado por la presencia del ligando mismo .

El término "complejo del receptor de ecdisona" se refiere en general a un complejo de proteína heterodimérica que tiene al menos dos miembros de la familia de receptores nucleares, el receptor de ecdisona ("EcR") y las proteínas ultraespiráculo ("USP") (ver Yao et al, Nature 366:476 (1993)); Yao et al., Cell 71:63 (1992)). El complejo EcR funcional puede también incluir una o varias proteínas adicionales tales como inmunofilinas . Los miembros adicionales de la familia de receptores nucleares de proteínas, conocidos como factores transcripcionales (tales como DHR38, betaFTZ-1 u otros homólogos de insecto), pueden también ser dependientes del ligando o socios independientes para EcR y/o USP. El complejo EcR puede también ser un heterodímero de la proteína EcR y el homólogo de vertebrado de la proteína ultraespiráculo, la proteína del receptor X del ácido retinoico ( 11RXR" ) o una quimera de USP y RXR. El término complejo de EcR también abarca los complejos homodiméricos de la proteína EcR o USP.

Un complejo de EcR puede ser activado por un ligando ecdisteroide o no esteroide activo, enlazado a una de las proteínas del complejo, inclusive de EcR, pero no excluyendo otras proteínas del complejo. Como se utiliza en la presente, el término "ligando", como se aplica a los cambios de genes basados en EcR, describe moléculas pequeñas y solubles que tienen la capacidad de activar un cambio de gen para estimular la expresión de un polipéptido codificado en éste. Los ejemplos de ligandos incluyen, sin limitación, un ecdisteroide , tal como la ecdisona, 20-hidroxiecdisona, ponasterona A, muristerona A, y similares, el ácido 9-cis-retinoico, análogos sintéticos de ácido retinoico, ?,?'-diacilhidrazinas tales como aquellas descritas en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,013,836; 5,117,057; 5,530,028; y 5,378,726 y las Solicitudes de los Estados Unidos Nos. 2005/0209283 y 2006/0020146; oxadiazolinas como se describe la Solicitud Publicada de los Estados Unidos No. 2004/0171651; dibenzoilalquil -cianohidrazinas tales como aquellas descritas en la Solicitud Europea No. 461,809; N-alquil-?,?1 -diaroilhidrazinas tales como aquellas descritas en la Patente No. 5,225,443; N-acil-N-alquilcarbonilhidrazinas tales como aquellas descritas en la Solicitud Europea No. 234,994; N-aroil-N-alquil-N' -aroilhidrazinas tales como aquellas descritas en la Patente No. 4,985,461; amidocetonas tales como aquellas descritas en la Solicitud Publicada de los Estados Unidos No. 2004/0049037; y otros materiales y similares que incluyen 3 , 5-di-ter-butil-4-hidroxi-N-isobutil-benzamida, 8-0-acetilharpágido, oxiesteroles , 22 (R) -hidroxicolesterol , 24 (S) -hidroxicolesterol, 25-epoxicolesterol , T0901317, 5-alfa-6-alfa-epoxicolesterol-3-sulfato (ECHS) , 7-cetocolesterol-3-sulfato, famesol, ácido biliares, ésteres de 1, 1-bifosfonato, hormona juvenil III, y similares. Los ejemplos de ligandos de diacilhidrazina útiles en la presente invención incluyen la N- ( 1-etil-2 , 2-dimetil-propil) -N 1 - (2 -metil-3-metoxi-benzoil) -hidrazida) del ácido (3 , 5-dimetil-benzoico) , RG-115932 N- (1-ter-butil-butil) -N' - (2-etil-3-metoxi-benzoil) -hidrazida) del ácido (R) -3 , 5-dimetil-benzoico, y RG-115830 N- (1-ter-butil-butil) -N' - (2-etil-3-metoxi-benzoil) -hidrazida) del ácido (3 , 5-dimetil-benzoico) . Ver por ejemplo la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de Serie 12/155,111, presentada el 29 de Mayo del 2008, y PCT/US2008/006757 presentada el 29 de Mayo del 2008, para diacilhidrazinas adicionales que son útiles en la práctica de la invención.

El complejo EcR incluye proteínas que son miembros de la superfamilia de receptores nucleares en donde todos los miembros están caracterizados por la presencia de un dominio de transactivación amino-terminal ("TA"), un dominio de enlace al ADN ("DBD"), y un dominio de enlace al ligando ("LBD" ) separados por una región de bisagra. Algunos miembros de la familia LTF pueden tener también otro dominio de transactivación sobre el lado carboxilo-terminal del LBD.

El DBD está caracterizado por la presencia de dos dedos de zinc de cisteína, entre los cuales están dos porciones de aminoácidos, la caja P y la caja D, que confieren especificidad para los elementos de respuesta a la ecdisona. Estos dominios pueden ser ya sea nativos, modificados o quimeras de diferentes dominios de proteínas receptoras heterólogas .

Las secuencias de ADN que constituyen el gen exógeno, el elemento de respuesta, y el complejo EcR, pueden ser incorporados dentro de células procarióticas , arqueobacterias , tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis, y otras enterobacterias , o células eucarióticas tales como células vegetales o animales. No obstante, debido a que muchas de las proteínas expresadas por el gen son procesadas incorrectamente en bacterias, son preferidas las células eucarióticas. Las células pueden estar en la forma de célula simples u organismos multicelulares. Las secuencias nucleotídicas para el gen exógeno, el elemento de respuesta, y el complejo del receptor, pueden ser también incorporadas como moléculas de AR , preferentemente en la forma de ARNs virales funcionales, tales como el virus mosaico del tabaco. De las células eucarióticas, las células de vertebrados son preferidas debido a que éstas carecen naturalmente de las moléculas que confieren respuestas a los ligandos de esta invención, para EcR. Como resultado, éstas son " sustancialmente insensibles" a los ligandos de esta invención. De este modo, los ligandos útiles de esta invención tendrán efectos fisiológicos despreciables u otros efectos sobre las células transformadas, o el organismo completo. Por lo tanto, las células pueden desarrollarse y expresar el producto deseado, sustancialmente no afectado por la presencia del ligando mismo.

Los ligandos EcR cuando son utilizados con el complejo EcR que a su vez es unido al elemento de respuesta ligado a un gen exógeno (por ejemplo, IL- 12) , proporcionan los medios para la regulación temporal externa de la expresión del gen exógeno. El orden en el cual los diversos componentes se enlazan uno al otro, es decir, el ligando al complejo del receptor y el complejo del receptor al elemento de respuesta, no es crítico. Típicamente, la modulación de la expresión del gen exógeno es en respuesta al enlace del complejo EcR a un elemento de ADN de control específico o regulatorio. La proteína EcR, como otros miembros de la familia de receptores nucleares, posee al menos tres dominios, un dominio de transactivación, un domino de enlace al ADN, y un dominio de enlace al ligando. Este receptor, como un subgrupo de la familia de receptores nucleares, también posee menos regiones bien definidas responsables de las propiedades de heterodimerización . El enlace del ligando al domino de enlace al ligando de la proteína EcR, después de la heterodimerización con la proteína USP o RXR, hace posible que los dominios de enlace al ADN de las proteínas heterodiméricas se enlacen al elemento de respuesta en una forma activada, dando como resultado de este modo la expresión o la supresión del gen exógeno. Este mecanismo no excluye el potencial para el enlace al ligando ya sea a EcR o USP, y la formación resultante de los complejos homodiméricos activos (por ejemplo, EcR+EcR o USP+USP) . En una modalidad, uno o más de los dominios del receptor pueden ser variados produciendo un cambio de gen quimérico. Típicamente, uno o más de los tres dominios pueden ser elegidos de una fuente diferente de la fuente de los otros dominios, de modo que el receptor quimérico es optimizado en la célula hospedera elegida o en el organismo elegido para la actividad de transactivación, el enlace complementario del ligando y el reconocimiento de un elemento de respuesta específico. Además, el elemento de respuesta mismo puede ser modificado o sustituido con elementos de respuesta para otros dominio de la proteína de enlace al ADN, tales como la proteína GAL-4 de levadura (ver Sadowski et al, Nature 335:563 (1988) o la proteína LexA de E. coli (ver Brent et al, Cell 43:729 (1985)) para acomodar los complejos EcR quiméricos. Otra ventaja más de los sistemas quiméricos es que éstos permiten la elección de un promotor utilizado para impulsar el gen exógeno de acuerdo a un resultado final deseado. Tal control doble puede ser particularmente importante en áreas de terapia génica, especialmente cuando son producidas proteínas citotóxicas, debido a que la sincronización de la expresión, así como las células en donde ocurre la expresión, pueden ser controladas. Cuando los genes exógenos, operativamente enlazados a un promotor adecuado, son introducidos dentro de las células del sujeto, la expresión de los genes exógenos es controlada por la presencia del ligando de esta invención. Los promotores pueden ser constitutiva o induciblemente regulados o pueden ser específicos de tejidos (es decir, expresados únicamente en un tipo particular de células) o específicos para cierta etapas del desarrollo del organismo .

En ciertas modalidades, el promotor del cambio terapéutico descrito en los métodos es constitutivo. En ciertas modalidades, el promotor de cambio terapéutico es activado bajo condiciones asociadas con una enfermedad, trastorno o condición, por ejemplo, el promotor es activado en respuesta a una enfermedad, en respuesta a una condición fisiológica, del desarrollo, de diferenciación o patológica particular, y/o en respuesta a una o más moléculas biológicas específicas; y/o el promotor es activado en un tejido particular o en tipos celulares particulares. En ciertas modalidades, la enfermedad, el trastorno o la condición responden al polipéptido o al polinucleótido terapéutico. Por ejemplo, en ciertas modalidades no limitantes, el polinucleótido o el polipéptido terapéutico es útil para tratar, prevenir, mejorar, reducir los síntomas, prevenir la progresión, o curar la enfermedad, el trastorno o la condición, pero no necesita lograr una o todas estas cosas. En ciertas modalidades, el primero y el segundo polinucleótidos son introducidos para permitir la expresión del complejo del factor de transcripción dependiente del ligando, bajo condiciones asociadas con una enfermedad, trastorno o condición. En una modalidad, los métodos terapéuticos son llevados a cabo tal que el polipéptido terapéutico o el polinucleótido terapéutico es expresado y diseminado a través del sujeto a un nivel suficiente para tratar, mejorar, o prevenir dicha enfermedad, trastorno o condición. Como se utiliza en la presente, "diseminado" significa que el polipéptido es expresado y liberado de la célula modificada, suficientemente para tener un efecto o actividad en el sujeto. La diseminación puede ser sistémica, local o cualquier cosa entre ellas. Por ejemplo, el polipéptido terapéutico o el polinucleótido terapéutico pueden ser sistémicamente diseminados a través de la corriente sanguínea o del sistema linfático.

Alternativamente, el polipéptido terapéutico o el polinucleótido terapéutico pueden ser diseminados localmente en un tej ido u órgano que va a ser tratado .

Numerosas secuencias de ácido nucleico genómico y de ADNc que codifican para una variedad de polipéptidos tales como los factores de transcripción y las proteínas reporteras, son bien conocidos en la materia. Aquí los expertos en la técnica tienen acceso a información de las secuencias de ácidos nucleicos virtualmente para todos los genes conocidos, y pueden ya sea obtener la molécula de ácido nucleico directamente de un depositario público, la institución que publicó la secuencia, o bien emplear métodos rutinarios para preparar la molécula. Ver por ejemplo la descripción de los números de acceso de secuencias, más adelante .

El cambio de gen puede ser cualquier sistema de cambio de gen que regule la expresión del gen por la adición o eliminación de un ligando específico. En otra modalidad, el cambio de gen es uno en el cual el nivel de expresión del gen es dependiente del nivel en el que el ligando esté presente. Los ejemplos de factores de trascripción dependientes del ligando, que pueden ser utilizados en los cambios de gen de la invención incluyen, sin limitación, los miembros de la superfamilia de receptores nucleares activados por sus ligandos respectivos (por ejemplo, glucocorticoide , estrógeno, progestina, retinoide, ecdisona, y análogos y miméticos de los mismos) y rTTA activada por tetraciclina . En un aspecto de la invención, el cambio de gen es un cambio de gen basado en EcR. Los ejemplos de tales sistemas incluyen, sin limitación, los sistemas descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,258,603, 7,045,315, las Solicitudes de Patente Publicadas de los Estados Unidos Nos. 2006/0014711, 2007/0161086, y la Solicitud Publicada Internacional No. O 01/70816. Los ejemplos de sistemas de receptores de ecdisona, quiméricos se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 7,091,038, las solicitudes de Patente Publicadas de los Estados Unidos Nos. 2002/0110861, 2004/0033600, 2004/0096942, 2005/0266457, y 2006/0100416, y las Solicitudes Publicadas Internacionales Nos. WO 01/70816, WO 02/066612, WO 02/066613, WO 02/066614, WO 02/066615, WO 02/29075, y WO 2005/108617. Un ejemplo de un sistema regulado por agonista de ecdisona no esteroide, es el Sistema de Expresión Inducible en Mamífero RheoSwitch® (New England Biolabs, Ipswich, MA) .

En una modalidad, un polinucleótido que codifica para el cambio de gen comprende una secuencia del factor de transcripción simple, que codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, bajo el control de un promotor. La secuencia del factor de transcripción puede codificar para un factor de transcripción dependiente del ligando, que es de origen natural o un factor de transcripción artificial. Un factor de transcripción artificial es uno en el cual la secuencia natural del factor de transcripción ha sido alterada, por ejemplo, mediante mutación de la secuencia o mediante la combinación de los dominios provenientes de diferentes factores de transcripción. En una modalidad, el factor de transcripción comprende un dominio de enlace al ligando del receptor nuclear del grupo H (LBD) . En una modalidad, el LBD del receptor nuclear del Grupo H es proveniente de un EcR, un receptor ubicuo, un receptor huérfano 1, un NER-I, un receptor nuclear de hormona esteroide, una proteína 15 de interacción con el receptor del retinoide X, un receptor ß de hígado X, una proteína similar al receptor de hormona esteroide, un receptor hepático X, un receptor hepático X, un receptor de farnesoide X, una proteína 14 de interacción con el receptor, o un receptor de farnesol . En otra modalidad más, el LBD del receptor nuclear del Grupo H es proveniente de un receptor de ecdisona.

El EcR y los otros receptores nucleares del Grupo H son miembros de la superfamilia de receptores nucleares, en donde todos los miembros están en general- caracterizados por la presencia de un dominio de transactivación amino-terminal (TD) , un dominio de enlace al ADN (DBD) , y un LBD separado de DBD por una región de bisagra. Como se utiliza en la presente, el término "dominio de enlace al ADN" comprende una secuencia polipeptídica mínima de una proteína de enlace al ADN, hasta la longitud completa de una proteína de enlace al ADN, siempre y cuando el dominio de enlace al ADN funcione para asociarse con un elemento de respuesta particular. Los miembros de la superfamilia de receptores nucleares están también caracterizados por la presencia de cuatro o cinco dominios: A/B, C, D, E, y en algunos miembros F (ver US 4,981,784 y Evans, Science 240:889 (1988)). El domino "A/B" corresponde al dominio de trasactivación, "C" corresponde al dominio de enlace al ADN, "D" corresponde a la región de bisagra, y "E" corresponde al dominio de enlace al ligando. Algunos miembros de la familia pueden también tener otro dominio de transactivación sobre el lado carboxilo-terminal del LBD correspondiente a "F" .

El DBD está caracterizado por la presencia de dos dedos de zinc de cisteína entre los cuales están dos porciones de aminoácido, la caja P y la caja D, que pueden conferir especificidad para elementos de respuesta. Estos dominios pueden ser ya sea nativos, modificados o quimeras de diferentes dominios de las proteínas receptoras heterólogas. El EcR, como un subgrupo de la familia de receptores nucleares, también posee menos regiones bien definidas, responsables de las propiedades de heterodimerización. Debido a que los dominios de los receptores nucleares son modulares por naturaleza el LBD, DBD, y el TD pueden ser intercambiados .

En otra modalidad más, el factor de transcripción comprende un TD, un DBD que reconoce un elemento de respuesta asociado con el gen exógeno cuya expresión va a ser modulada; un LBD del receptor nuclear del Grupo H. En ciertas modalidades, el LBD del receptor nuclear del Grupo H comprende una mutación por sustitución.

En otra modalidad más, un polinucleótido que codifica para el cambio de gen comprende una primera secuencia del factor de transcripción bajo el control de un primer promotor, y una segunda secuencia del factor de transcripción bajo el control de un segundo promotor, en donde las proteínas codificadas por la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor de transcripción interactúan para formar un complejo proteico que funciona como un factor de transcripción dependiente del ligando, por ejemplo, un cambio de gen basado en "cambio doble" o "dos híbridos". El primero y el segundo promotores pueden ser los mismos o diferentes.

En ciertas modalidades, el polinucleótido que codifica para un cambio de gen comprende una primera secuencia del factor de transcripción y una segunda secuencia del factor de transcripción bajo el control de un promotor, en donde las proteínas codificadas por la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor de transcripción interactúan para formar un complejo proteico que funciona como un factor de transcripción dependiente del ligando, por ejemplo, un "cambio de gen simple". La primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor de transcripción pueden ser conectadas por un sitio de entrada ribosomal interno (IRES) . El IRES puede ser un IRES de EMCV.

En una modalidad, la primera secuencia del factor de transcripción codifica para un polipéptido que comprende un TD, un DBD que reconoce un elemento de respuesta asociado con el gen exógeno, cuya expresión va a ser modulada; y LBD del receptor nuclear del Grupo H, y la segunda secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción que comprende un LBD del receptor nuclear, seleccionado de un RXR LBD, de vertebrado, un RXR LBD, de invertebrado, un LBD de proteína ultraespiráculo, y un LBD quimérico que comprende dos fragmentos polipeptídicos , en donde el primer fragmento polipeptíd co es proveniente de un RXR LBD, de vertebrado, un RXR LBD de invertebrado, o un LBD de proteína ultraespiráculo, y el segundo fragmento polipeptídico es proveniente de RXR LBD de vertebrado diferente, RXR LBD de invertebrado, o LBD de proteína ultraespiráculo.

En otra modalidad más, el cambio de gen comprende una primera secuencia del factor de transcripción que codifica para un primer polipéptido que comprende un LBD de receptor nuclear y un DBD que reconoce un elemento de respuesta asociado con el gen exógeno, cuya expresión va a ser modulada, y una segunda secuencia del factor de transcripción que codifica para un segundo polipéptido que comprende un TD, y un LBD del receptor nuclear, en donde uno de los LBDs del receptor nuclear es un LBD del receptor nuclear del Grupo H. En una modalidad preferida, el primer polipéptido está sustancialmente libre de un TD, y el segundo polipéptido está sustancialmente libre de un DBD. Para fines de la invención, "sustancialmente libre" significa que la proteína en cuestión no contiene una secuencia suficiente del dominio en cuestión, para proporcionar activación o actividad de enlace.

En otro aspecto más de la invención, la primera secuencia del factor de transcripción codifica para una proteína que comprende un socio heterodímero y un TD, y la segunda secuencia del factor de transcripción codifica para una proteína que comprende un DBD y un LBD.

Cuando únicamente un LBD del receptor nuclear es un LBD del Grupo H, el otro LBD del receptor nuclear puede ser proveniente de cualquier otro receptor nuclear que forma un dímero con el LBD del Grupo H. Por ejemplo, cuando el LBD del receptor nuclear del Grupo H es un EcR LBD, el otro "socio" del LBD del receptor nuclear puede ser proveniente de un EcR, un RXR de vertebrado, RXR de invertebrado, una proteína ultraespiráculo (USP) , o un receptor nuclear quimérico que comprende al menos dos diferentes fragmentos polipeptídicos del LBD del receptor nuclear seleccionados de un RXR de vertebrado, un RXR de invertebrado, y una USP (ver O 01/70816 A2, Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US02/05235 y US 2004/0096942 Al) . El dominio de enlace al ligando del receptor nuclear "socio" puede comprender además una mutación por truncamiento, una mutación por supresión, una mutación por sustitución u otra modificación.

En una modalidad, el RXR LBD de vertebrado es proveniente de humano Homo sapiens, ratón Mus musculus, rata Rattus norvegicus, pollo Gallus gallus, cerdo Sus scrofa domestica, rana Xenopus laevis, pez cebra Danio rerio, tunicado Polyandrocarpa misakiensis, o medusa Tripedalia cysophora RXR.

En una modalidad, el dominio de enlace al ligando RXR de invertebrado proveniente de un polipéptido ultraespiráculo de langosta Locusta migratoria ("LmUSP"), un homólogo 1 de RXR de la garrapata ixodide Amblyomma americanum ("AmaRXRl"), un homólogo 2 de RXR de la garrapata ixodide Amblyomma americanum ("AmaRXR2"), un homólogo de RXR del cangrejo violinista Celuca pugilator ("CpRXR"), un homólogo RXR del escarabajo Tenébrio molitor ("TmRXR"), un homólogo de RXR de la abeja mielera Apis mellifera ("AmRXR"), un homólogo de RXR del áfido Myzus persicae ("MpRXR"), o un homólogo de RXR no díptero/no lepidóptero.

En una modalidad, RXR LBD quimérico comprende al menos dos fragmentos polipeptídicos seleccionados de un fragmento polipeptídico de RXR de especie vertebrada, un fragmento polipeptídico de RXR de especie invertebrada y un fragmento polipeptídico homólogo de RXR de especie invertebrada no díptero/no lepidóptero. Un dominio de enlace al ligando RXR quimérico para el uso en la invención puede comprender fragmentos polipeptídicos RXR de al menos dos especies diferentes, o cuado la especie es la misma, los dos o más fragmentos polipeptídicos pueden ser provenientes de dos o más isoformas diferentes del fragmento polipeptídico RXR de la especie.

En una modalidad, el dominio de enlace al ligando RXR quimérico comprende al menos un fragmento polipeptídico de RXR de especie vertebrada y un fragmento polipeptídico RXR de especie invertebrada.

En otra modalidad más, el dominio de enlace al ligando RXR quimérico comprende al menos un fragmento polipeptídico de RXR de especie vertebrada y un fragmento polipeptídico homólogo de RXR de especie invertebrada no díptero/no lepidóptero.

El ligando, cuando es combinado con el LBD del o de los receptores nucleares, que a su vez están enlazados al elemento de respuesta ligado al gen exógeno, proporciona regulación temporal externa de la expresión del gen exógeno. El mecanismo de enlace o el orden en el cual los diversos componentes de esta invención se enlazan uno con el otro, es decir, por ejemplo, el ligando al LBD, DBD al elemento de respuesta, TD al promotor, etc., no es critico.

En un ejemplo específico, el enlace del ligando al LBD de un receptor nuclear del Grupo H y su socio de LBD del receptor nuclear, hace posible la expresión del gen exógeno. Este mecanismo no excluye el potencial para el enlace al ligando al receptor nuclear del Grupo H (GHNR) o su socio, y la formación resultante de los complejos homodiméricos activos (por ejemplo, GHNR + GHNR, o socio + socio) . Preferentemente, uno o más de los dominios del receptor son variados produciendo un cambio de gen híbrido. Típicamente, uno o más de los tres dominios, DBD, LBD, y TD, puede ser elegido de una fuente diferente de la fuente de los otros dominios, de modo que los genes híbridos y las proteínas híbridas resultantes son optimizadas en la célula u organismo hospedero elegido para la actividad de transactivación, el enlace complementario del ligando, y el reconocimiento de un elemento de respuesta específico. Además, el elemento de respuesta mismo puede ser modificado o sustituido con elementos de respuesta para otros dominios proteicos de enlace al ADN tales como la proteína GAL-4 de levadura (ver Sadowski et al, Nature 555:563 (1988)) o la proteína LexA de Escherichia coli (ver Brent et al, Cell 43:729 (1985)), o los elementos de respuesta sintéticos específicos para las interacciones dirigidas con las proteínas diseñadas, modificadas y seleccionadas para tales interacciones específicas (ver, por ejemplo, Kim et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 94:3616 (1997)) para acomodar los receptores híbridos .

El complejo EcR funcional puede también incluir una o varias proteínas adicionales tales como inmunofilinas . Los miembros adicionales de la familia de proteínas del receptor nuclear, conocidos como factores transcripcionales (tales como DHR38 o betaFTZ-1) , pueden también ser socios dependientes o independientes del ligando para EcR, USP, y/o RXR. Además, otros cofactores pueden ser requeridos, tales como proteínas en general conocidas como coactivadores (también denominados como adaptadores o mediadores) . Estas proteínas no se enlazan específicamente de secuencia al ADN, y no están involucradas en la transcripción basal . Éstas pueden ejercer su efecto sobre la activación de la transcripción a través de diversos mecanismos, incluyendo la estimulación del enlace al ADN de los activadores, al afectar la estructura de la cromatina, o por mediación de interacciones activador-complejo de iniciación. Los ejemplos de tales coactivadores incluyen RIP 140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-l/NCoA-1, TIF2/GRIP/NCoA-2 , ACTR/AIB1/RAC3/pCIP así como la proteína de enlace al elemento B de respuesta del coactivador C promiscuo, CBP/p300 (para revisión ver Glass et al, Curr. Opin. Cell Biol 9:222 (1997)). También, los cofactores proteicos en general conocidos como co-represores (también conocidos como represores, silenciadores o mediadores de silenciamiento) , pueden ser requeridos para inhibir de manera efectiva la activación transcripcional en ausencia del ligando. Estos co-represores pueden interactuar con el EcR no ligado para silenciar la actividad en el elemento de respuesta. La evidencia actual sugiere que el enlace del ligando cambia la conformación del receptor, lo cual da como resultado la liberación del co-represor y el reclutamiento de los coactivadores anteriormente descritos, con lo cual se suprime su actividad de silenciamiento. Los ejemplos de co-represores incluyen N-CoR y SMRT (para revisión, ver Horwitz et al., Mol Endocrinol . 70:1167 (1996)) . Estos cofactores pueden ser ya sea endógenos dentro de la célula u organismo, o pueden ser agregados exógenamente como transgenes para ser expresados de una manera regulada o no regulada .

El gen exógeno es operablemente enlazado a un promotor que comprende al menos un elemento de respuesta que es reconocido por el DBD o el factor de transcripción dependiente del ligando, codificado por el cambio de gen. En una modalidad, el promotor comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más copias del elemento de respuesta. Los promotores que comprenden los elementos de respuesta deseados, pueden ser promotores de origen natural o promotores artificiales creados utilizando técnicas que son bien conocidas en la materia, por ejemplo uno o más elementos de respuesta operablemente enlazados a un promotor mínimo.

Para introducir los polinucleótidos dentro de las células, puede ser utilizado un vector. El vector puede ser, por ejemplo, un vector plásmido o un vector viral de ARN o ADN de una sola hebra o de doble hebra. Tales vectores pueden ser introducidos dentro de las células mediante técnicas bien conocidas para la introducción de ADN y ARN dentro de las células. Los vectores virales pueden ser competentes en replicación o defectuosos en replicación. En el último caso, la propagación viral en general ocurrirá únicamente en las células hospederas complementarias. Como se utiliza en la presente, el término "célula hospedera" o "hospedero" se utiliza para dar a entender una célula de la invención que está albergando uno o más polinucleótidos de la invención .

De este modo, a lo mínimo, los vectores deben incluir los polinucleótidos de la invención. Otros componentes del vector pueden incluir, pero no están limitados a, marcadores seleccionables , dominios de modificación de cromatina, promotores adicionales que promueven la expresión de otros polipéptidos que pueden también estar presentes sobre el vector (por ejemplo, un polipéptido letal), sitios de integración genómicos, sitios de recombinación, y pivotes de inserción molecular. Los vectores pueden comprender cualquier número de estos elementos adicionales, ya sea dentro o no dentro de los polinucleótidos , tal que el vector puede ser diseñado a la medida para las metas específicas de los métodos terapéuticos deseados .

En una modalidad de la invención, los vectores que son introducidos dentro de las células comprenden además un "gen marcador seleccionable" el cual, cuando es expresado, indica que la construcción del cambio del gen de la invención ha sido integrada dentro del genoma de la célula hospedera. De esta manera, el gen seleccionador puede ser un marcador positivo para la integración genómica. Mientras que no es crítica para los métodos de la invención, la presencia de un gen marcador seleccionable permite al practicante seleccionar una población de células vivas donde la construcción vector ha sido integrada dentro del genoma de las células. De este modo, ciertas modalidades de la invención comprenden la selección de células donde el vector ha sido integrado exitosamente. Como se utiliza en la presente, el término "seleccionar" o variantes del mismo, cuando se utiliza en conjunto con las células, está destinado a significar los métodos estándares, bien conocidos, para elegir las células con una constitución o fenotipo genético específico. Los métodos típicos incluyen, pero no están limitados a, el cultivo de células en presencia de antibióticos, tales como G418, neomicina y ampicilina. Otros ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen, pero no están limitados a, genes que confieren resistencia a la dihidrofolato-reductasa, higromicina o ácido micofenólico . Otros métodos de selección incluyen, pero no están a, un gen marcador seleccionable que permite el uso de la timidina-cinasa , hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa o adenina-fosforribosiltransferasa como agentes de selección. Las células que comprenden una construcción vector que incluye un gen o genes de resistencia a antibióticos, podrían ser entonces capaces de tolerar el antibiótico en cultivo. De igual modo, las células que no comprenden una construcción vector que incluye uno o varios genes de resistencia a antibióticos, podrían no ser capaces de tolerar el antibiótico en cultivo.

Como se utiliza en la presente, un "dominio de modificación de cromatina" (CMD) se refiere a las secuencias nucleotídicas que interactúan con una variedad de proteínas asociadas con el mantenimiento y/o la alteración de la estructura de la cromatina, tales como, pero no limitados a aisladores de ADN. Ver Ciavatta et al, Proc . Nat ' 1 Acad. Sci U.S.A., 103:9958 (2006). Los ejemplos de CMDs incluyen, pero no están limitados a, el aislador de la ß-globulina de pollo y el sitio 4 hipersensible de pollo (cHS4) . El uso de diferentes secuencias de CMD entre uno o más programas de genes (por ejemplo, un promotor, la secuencia de codificación, y la región reguladora 3'), por ejemplo, pueden facilitar el uso de las secuencias de ADN de CMD diferenciales, tales como los "brazos de homología mini" en combinación con diversos microorganismos o tecnologías de recombinación in vitro para "intercambiar" programas de genes entre vectores lanzadera multigénicos y monogénicos existentes. Otros ejemplos de dominios de modificación de la cromatina son conocidos en la técnica o pueden ser fácilmente identificados .

Los vectores particulares para el uso con la invención son vectores de expresión que codifican para las proteínas o polinucleótidos . En general, tales vectores comprenden regiones de control de acción cis, efectivas para la expresión en un hospedero operablemente enlazado al polinucleótido que va a ser expresado. Los factores de acción trans apropiados son suministrados por el hospedero, suministrados por un vector complementario o suministrados por el vector mismo después de la introducción dentro del hospedero .

Una gran variedad de vectores de expresión pueden ser utilizados para expresar proteínas o polinucleótidos. Tales vectores incluyen vectores cromosómicos , episomales y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de episomas de levadura, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como virus adenoasociados , lentivirus, vaculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus de la vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus y retrovirus de la pseudorrabia, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de elementos genéticos plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos . Todos pueden ser utilizados para la expresión de acuerdo con este aspecto de la invención. En general, cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos o proteínas en un hospedero, pueden ser utilizados para la expresión a este respecto.

La secuencia polinucleotídica en el vector de expresión es operativamente enlazada a la o las secuencias de control de expresión apropiadas que incluyen, por ejemplo, un promotor para dirigir la transcripción del AR m. Los representantes de los promotores adicionales incluyen, pero no están limitados a, promotores constitutivos y promotores específicos de tejidos o inducibles. Los ejemplos de promotores eucarióticos constitutivos incluyen, pero no están limitados a, el promotor del gen de la metalotioneina I de ratón (Hamer et al., J. Mol. Ap l . Gen. 7:273 (1982)); el promotor TK del virus del Herpes virus (McKnight, Cell 57:355 (1982)); el promotor temprano del SV40 (Benoist et al., Nature 290:304 (1981)); y el promotor del virus de la vaccinia. Los ejemplos adicionales de los promotores que podrían ser utilizados para impulsar la expresión de una proteína o polinucleótido incluyen, pero no están limitados a, promotores específicos de tejidos y otros promotores endógenos para proteínas específicas, tales como el promotor de albúmina (hepatocitos) , un promotor de proinsulina (células beta pancreáticas) y similares. En general, las construcciones de expresión contendrán sitios para la transcripción, inicio terminación y, en la región transcrita, un sitio de enlace al ribosoma, para la traducción. La porción de codificación de los transcritos maduros expresados por las construcciones, pueden incluir un AUG de inicio de traducción al comienzo y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) apropiadamente colocado al final del polipéptido que va a ser traducido.

Además, las construcciones pueden contener regiones de control que regulan, así como también engendran la expresión. En general, tales regiones operarán mediante el control de la transcripción, tales como los sitios de enlace al receptor y los aumentadores , entre otros.

Los ejemplos de vectores eucarióticos incluyen, pero no están limitados a pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl y pSG disponibles de Stratagene; pSVK3 , pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Amersham Pharmacia Biotech; y pCMVDsRed2 -express, pIRES2 -DsRed2 , pDsRed2-Mito, y pCMV-EGFP disponibles de Clontech. Muchos otros vectores son bien conocidos y comercialmente disponibles.

Los vectores particularmente útiles, que comprenden pivotes de inserción molecular para la inserción y eliminación rápida de elementos de programas de genes, se describen en la solicitud de Patente de los Estados Unidos Publicada No. 2004/0185556, Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 11/233,246 y las Solicitudes Publicadas Internacionales Nos. WO 2005/040336 y WO 2005/116231. Un ejemplo de tales vectores es el Sistema de Producción UltraVectorMR (Intrexon Corp., Blacksburg, VA), como se describe en WO 2007/038276. Como se utiliza en la presente, un "programa de genes" es una combinación de elementos genéticos que comprenden un promotor (P) , una secuencia de expresión (E) , y una secuencia reguladora 3' (3), tal como "PE3 " es un programa de genes. Los elementos dentro del programa de genes pueden ser fácilmente intercambiados entre pivotes moleculares que flanquean cada uno de los elementos del programa de genes. Un pivote molecular, como se utiliza en la presente, es definido como un polinucleótido que comprende al menos dos sitios de restricción raros o no comunes, no variables, acomodados de una manera lineal. En una modalidad, el pivote molecular comprende al menos tres sitios de restricción raros o no comunes, no variables acomodados de una manera lineal. Típicamente, cualquier pivote molecular podría no incluir un sitio de restricción rarp o no común de cualquier otro pivote molecular dentro del mismo programa de genes. Las secuencias cognadas de más de 6 nucleótidos sobre las cuales actúa una enzima de restricción dada, son denominadas como sitios de restricción "raros" . No obstante, existen sitios de restricción de 6 pares de bases que aparecen más infrecuentemente de lo que sería estadísticamente predicho, y estos sitios y las endonucleasas que los rompen son denominados sitios de restricción "no comunes" . Los ejemplos de las enzimas de restricción raras o no comunes incluyen, pero no están limitados a AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Ase I, MIu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BSi I, Sfo I, Sgr AI, AflIII, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, FIp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I, Nru I, Acl I, Cía I, Csp45 I, Age I, Bstl 107 1, BstB I, Hpa I, Aat II, EcoR V, Nhe I, Spe I, Avi II, Avr II, fe I, Afe I, Fsp I, Kpn I, Sea I, BspE I, Nde I, Bfr I, Xho I, Pml I, ApaL I, Kas I, Xma I, BsrB I, Nsi I, Sac II, Sac I, BIp I, PspoM I, Pci I, Stu I, Sph I, BamH I, Bsu36 I, Xba I, BbvC I, Bgl II, Neo I, Hind III, EcoR I, BsrG I y Sse8781 I.

El vector puede también comprender sitios de restricción para una segunda clase de enzimas de restricción llamadas enzimas endonucleasas domésticas (HE) . Las enzimas HE tienen sitios de restricción asimétricos, grandes (de 12 a 40 pares de bases) , y sus sitios de restricción son infrecuentes en la naturaleza. Por ejemplo, la HE conocida como I-Scel tiene un sitio de restricción de 18 pares de bases (5 ' TAGGGATAACAGGGTAAT3 ' (SEQ ID NO: 28)), que se predice aparece únicamente una vez en cada 7x1010 pares de bases de secuencia aleatoria. Esta proporción de aparición es equivalente únicamente a un sitio en un genoma que es 20 veces el tamaño de un genoma de mamífero. La naturaleza rara de los sitios HE incrementa en gran medida la posibilidad de que un ingeniero genético pueda cortar un programa de genes sin perturbar la integridad del programa de genas si los sitios HE son incluidos en las posiciones apropiadas en un plásmido vector de clonación.

La selección de los vectores y promotores apropiados para la expresión en una célula hospedera es un procedimiento bien conocido, y las técnicas requeridas para la construcción de vectores y la introducción dentro del hospedero, así como su expresión en el hospedero son habilidades rutinarias en la técnica.

La introducción de los polinucleótidos dentro de las células puede ser una transfección transitoria, transfección estable, o puede ser una inserción específica de locus del vector. La transfección transitoria y estable de los vectores dentro de la célula hospedera puede ser efectuada mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Tales métodos son descritos en muchos manuales de laboratorio estándares, tales como Davis et al. , Basic Methods in Molecular Biology (1986); Keown et al, 1990, Methods Enzymol . 185: 527- 37; Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. Estos métodos de transfección estables dan como resultado la inserción aleatoria del vector dentro del genoma, de la célula. Además, el número de copias y la orientación de los vectores son también, hablando en general, aleatorios.

En una modalidad de la invención, el vector es insertado dentro de un sitio bio-neutro en el genoma. Un sitio bio-neutro es un sitio en el genoma donde la inserción de los polinucleótidos interfiere muy poco, si es que la hay , con la función normal de la célula. Los sitios bio-neutros pueden ser analizados utilizando bioinformática disponible. Muchos sitios bio-neutros son conocidos en la técnica, por ejemplo, el locus equivalente a ROSA. Otros sitios bio-neutros pueden ser identificados utilizando técnicas rutinarias bien conocidas en la materia. La caracterización del o de los sitios de inserción genómica se realiza utilizando métodos conocidos en la materia. Para controlar la posición, el número de copias y/o la orientación de los polinucleótidos cuando se introduce el vector dentro de las células, pueden ser utilizados métodos de inserción específicos de locus. Los métodos de inserción específicos del locus son bien conocidos en la técnica e incluyen pero no están limitados a, recombinación homologa e inserción de genoma mediada por recombinasa. Por supuesto, si los métodos de inserción específicos de locus van a ser utilizados en los métodos de la invención, los vectores pueden comprender elementos que ayudan en esta inserción específica del locus, tal como, pero no limitados a, la recombinación homologa. Por ejemplo, los vectores pueden comprender uno, dos, tres, cuatro o más sitios de integración genómica (GISs) . Como se utiliza en la presente, un "sitio de integración genómica" es definido como una porción de la secuencia vector cuya secuencia nucleotídica es idéntica o casi idéntica a las porciones del genoma dentro de las células, lo que permite la inserción del vector en el genoma. En particular, el vector puede comprender dos sitios de inserción genómica que flanquean al menos los polinucleótidos. Por supuesto, los GISs pueden flanquear elementos adicionales, o incluso todos los elementos presentes sobre el vector.

En otra modalidad más, la inserción específica del locus puede ser llevada a cabo mediante la inserción de genes específica del sitio de recombinasa. En resumen, las enzimas recombinasas bacterianas, tales como, pero no limitadas a la integrasa PhiC31 pueden actuar sobre sitios de "pseudo" recombinación dentro del genoma humano. Estos sitios de pseudo-recombinación pueden ser objetivos para la inserción específica del locus utilizando las recombinasas. La inserción del gen, específica de recombinasa, se describe en Thiagarajan et al, Mol. Cell Biol. 21:3926 (2001). Otros ejemplos de recombinasas y sus sitios respectivos que pueden ser utilizados para la inserción del gen específica del sitio de recombinasa incluyen, pero no están limitadas a, recombinasas de serina tales como R4 y TP901-1 y recombinasas descritas en WO 2006/083253.

En una modalidad adicional, el vector puede comprender un gen de quimiorresistencia, por ejemplo, el gen mdrl, de resistencia a múltiples fármacos, la hidrofolato-reductasa, la 06 -alquilguanina-ADN-alquiltransferasa . El gen de quimiorresistencia puede estar bajo el control de un promotor constitutivo (por ejemplo, CMV) o inducible (por ejemplo, RheoSwitch®) . En esta modalidad, si se desea tratar un trastorno en un sujeto mientras que se mantienen las células modificadas dentro del sujeto, un clínico puede aplicar un agente quimioterapéutico para destruir las células enfermas, mientras que las células modificadas podrían ser protegidas del agente debido a la expresión de un gen de quimiorresistencia adecuado, y puede continuar siendo utilizado para el tratamiento, mejoramiento o prevención de una enfermedad o trastorno. Al colocar el gen de quimiorresistencia bajo un promotor inducible, puede ser evitada la expresión innecesaria del gen de quimiorresistencia, todavía estará disponible en el caso que se necesite el tratamiento continuo. Si las células modificadas mismas se llegan a enfermar, éstas podrían todavía ser destruidas por inducción de la expresión de un polipéptido letal como se describe más adelante.

Los métodos de la invención son llevados a cabo mediante la introducción de los polinucleótidos que codifican para el cambio de gen, y el gen exógeno dentro de las células de un sujeto. Cualquier método conocido para introducir un polinucleó ido dentro de una célula, conocido en la técnica, tales como aquellos descritos anteriormente, puede utilizado.

Cuando los polinucleótidos van a ser introducidos dentro de las células ex vivo, las células pueden ser obtenidas de un sujeto mediante cualquier técnica conocida en la materia, incluyendo, pero no limitadas a, biopsias, raspados, y retiro quirúrgico de tejidos. Las células aisladas pueden ser cultivadas por una cantidad suficiente de tiempo para permitir que los polinucleótidos sean introducidos dentro de las células, por ejemplo, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36, 48, horas o más. Los métodos para cultivar células primarias por periodos cortos de tiempo son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden ser cultivadas en placas (por ejemplo, en placas de micropozos) adheridas o en suspensión.

Para los métodos terapéuticos ex vivo, las células son aisladas de un sujeto y cultivadas bajo condiciones adecuadas para introducir los polinucleótidos dentro de las células. Una vez que los polinucleótidos han sido introducidos dentro de las células, las células son incubadas por un periodo de tiempo suficiente para permitir que el factor de transcripción dependiente del ligando, sea expresado, por ejemplo 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 18, o 24 horas o más. En algún punto después de la introducción de los polinucleótidos dentro de las células (ya sea antes o después de que se expresan niveles significativos del factor de transcripción dependiente del ligando) , las células son introducidas nuevamente dentro del sujeto. La reintroducción puede ser llevada a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, infusión intravenosa, o inyección directa dentro de un tejido o cavidad. En una modalidad, la presencia de los polinucleótidos en las células es determinada antes de introducir las células nuevamente al sujeto. En otra modalidad más, las células que contienen los polinucleótidos son seleccionadas (por ejemplo, con base en la presencia de un marcador seleccionable en los polinucleótidos) y únicamente aquellas células que contienen los polinucleotidos son reintroducidas dentro del sujeto. Después de que las células son reintroducidas al sujeto, el ligando es administrado al sujeto para inducir la expresión del polipéptido terapéutico o del polinucleótido terapéutico. En una modalidad alternativa, el ligando puede ser agregado a las células incluso antes de que las células sean reintroducidas al sujeto, tal que el polipéptido terapéutico o el polinucleó ido terapéutico es expresado antes de la reintroducción de las células. El ligando puede ser administrado mediante cualquier método adecuado, ya sea sistémicamente (por ejemplo, oralmente, intravenosamente) o localmente (por ejemplo, intraperitonealmente , intratecalmente , intraventricularmente , inyección directa dentro del tejido u órgano donde las células son reintroducidas) . La sincronización óptima de la administración del ligando puede ser determinada para cada tipo de célula y enfermedad o trastorno utilizando únicamente técnicas rutinarias.

Los métodos terapéuticos in vivo de la invención involucran la introducción directa in vivo de los polinucleótidos dentro de las células del sujeto. Los polinucleótidos pueden ser introducidos dentro del sujeto sistémica o localmente (por ejemplo, en el sitio de la enfermedad o trastorno) . Una vez que los polinucleótidos han sido introducidos al sujeto, el ligando puede ser administrado para inducir la expresión del polipéptido terapéutico o del polinucleótido terapéutico. El ligando puede ser administrado mediante cualquier método adecuado, ya sea sistémicamente (por ejemplo, oralmente, intravenosamente) o localmente (por ejemplo, intraperitonealmente, intratecalmente, intraventricularmente, inyección directa dentro del tejido u órgano donde está ocurriendo la enfermedad o el trastorno) . La sincronización óptima de la administración del ligando puede ser determinada para cada tipo de célula y enfermedad o trastorno utilizando únicamente técnicas rutinarias.

Para el uso in vivo, los ligandos descritos en la presente pueden ser recogidos en portadores farmacéuticamente aceptables, tales, por ejemplo, soluciones, suspensiones, tabletas, cápsulas, ungüentos, elíxires, y composiciones inyectables. Las composiciones farmacéuticas pueden contener de 0.01 % a 99% en peso del ligando. Las composiciones pueden estar ya sea en formas de dosis simple o múltiples. La cantidad del ligando en cualquier composición farmacéutica particular dependerá de la dosis efectiva, es decir, la dosis requerida para promover la expresión o supresión génica deseada .

Las rutas adecuadas de administración de las preparaciones farmacéuticas (incluyendo administración oral y sublingual), vaginal, parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intratumoral , intradérmica, intratecal y epidural) o por tubo nasogástrico . Podrá ser entendido por aquellos expertos en la técnica que la ruta de administración preferida dependerá de la condición que se trate y puede variar con factores tales como la condición del paciente .

Como se utiliza en la presente, el término "rAD . RheoIL12 " se refiere a un vector polinucleotídico adenoviral que alberga el gen de IL- 12 bajo el control de un cambio de gen del sistema terapéutico RheoSwitch® (RTS) , que es capaz de producir la proteina IL-12 en presencia del ligando de activación. Como se utiliza en la presente, el término "rAd.cIL12" se refiere a un vector de control de polinucleótido adenoviral que contiene el gen de IL-12 bajo el control de un promotor constitutivo.

Como se utiliza en la presente, el término "IL-12p70" se refiere a la proteína IL-12, que tiene de manera natural dos subunidades comúnmente denominadas como p40 y p35. El término IL-12p70 abarca las proteínas de fusión que comprenden las dos subunidades de IL-12 (p40 y p35) , en donde la proteína de fusión puede incluir los aminoácidos ligadores entre las subunidades.

Como se utiliza en la presente, el término "una proteína que tiene la función de un inmunomodulador" se refiere a una proteína que tiene al menos 20% (por ejemplo, al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%) de alguna bioactividad de un inmunomodulador seleccionado de IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R o una subunidad de los mismos, DN, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-alfa, IFN-gamma, CCL3 (MIP-Ia) , CCL5 (RANTES) , CCL7 (MCP3), XCL1 (linfotactina) , CXCLl (MGSA-alfa) , CCR7 , CCL19 (MIP-3b) , CXCL9 (MIG) , CXCLlO (IP-10), CXCL 12 (SDF-I), CCL21 (6Ckine) , OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-Defensina, HMGBl, Flt L, IFN-beta, TNF-alfa, dnFADD, BCG, TGF-alfa, PD-L1, TGFbRII DN, ICOS-L y S100. De igual modo el término "una proteína que tiene la función de IL-12" se refiere a una proteína que tiene al menos 20% (por ejemplo, al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%) de alguna bioactividad de la IL-12 humana. Las bioactividades de tales inmunomoduladores son bien conocidas. Ver la siguiente Tabla Tabla 4. Inmunomoduladores y sus funciones proliferación de células B, y la actividad del factor de crecimiento de fibroblastos. Las proteínas IL-1 están involucradas en la respuesta inflamatoria .

Interleucina-2 (IL-) La IL-12 es una familia de citocinas que es producida por las células T en respuesta a la estimulación antigénica o mitogénica, esta proteína es requerida para la proliferación de células T y otras actividades cruciales para la regulación de la respuesta inmunitaria. IL-2 puede estimular las células B, los monocitos, las células asesinas activadas por linfocina, células asesinas naturales, y células gliomas .

Interleucina-3 (IL-3) IL-3 estimula la proliferación de células progenitoras pluripotenciales hematopoyéticas . Esta es secretada por las células T activadas para soportar el crecimiento y la diferenciación de células T provenientes de la médula ósea, en una respuesta inmunitaria. La erapia combinada del gen Ad-mIL- 3 intratumoral , en combinación con radioterapia mostró que suprime significativamente el crecimiento tumoral (Oh 2004) .

Interleucina-4 (IL-4) IL-4 es una citocina que participa en al menos varios procesos de activación de células B, así como de otros tipos celulares. Este es un coestimulador de la síntesis de ADN. Induce la expresión de moléculas MHC de la clase II sobre las células B en reposo. Aumenta la secreción y la supresión de IgE e IgGl en la superficie celular. También regula la expresión del factor Fe de baja afinidad para IgE (CD23) sobre linfocitos y monocitos .

Interleucina- 5 (IL-5) IL-5 estimula el crecimiento de células B e incrementa la secreción de inmunoglobulina, e induce la supresión tumoral (Nakashima 1993, Wu 1992) .

Interleucina-7 (IL-7) IL-7 es un citocina que es un factor de crecimiento hematopoyético capaz de estimular la proliferación de progenitores linfoides. Ésta es importante para la proliferación durante ciertas etapas de la maduración de células B.

Interleucina-9 (IL-9) IL-9 apoya el desarrollo independiente de IL-4 e independiente de IL-2, de las células T cooperadoras Interleucina-15 (IL- IL-15 es una citocina que estimula 15) la proliferación de linfocitos T.

La estimulación por IL-15 requiere la interacción de IL-15 con componentes de IL-2R, incluyendo IL-2R beta y probablemente IL-2R gamma pero no IL-2R alfa Interleucina-18 (IL- IL-18 aumenta la actividad de las 18) células asesinas naturales en células del bazo, y estimula la producción de interferón gamma en las células T cooperadoras tipo I Interleucina-21 (IL - IL-21 es una citocina con actividad 21) inmunorreguladora . IL-21 puede promover la transición entre la inmunidad innata y adaptativa.

Interleucina-23 (11- IL-23 actúa directamente sobre DC 23) para promover la presentación inmunogénica del péptido tumoral, y puede dar como resultado la infiltración de células T CD8(+) y CD4(+) intratumoral robusta, e inducir una respuesta específica tipo TH-1 hacia el tumor en los nodulos linfáticos regionales y en el bazo (Hu 2006) .

Interleucina- 27 (IL- IL-27 es una citocina con 27) propiedades pro- y anti- inflamatorias , que pueden regular el desarrollo de las células T cooperadoras, suprimir la proliferación de células T, estimular la actividad de células T citotóxicas, inducir el cambio de isotipo en las células B, y que tiene efectos diversos sobre las células inmunitarias innatas.

Interleucina-24 (IL- IL-24 ha mostrado que suprime el 23) crecimiento de tumores (Susan 2004, Fisher 2003) .

INF-alfa (IFNa) IF-alfa tiene función antitumoral (Taqliaferri 2005) .

Interferón beta IFNB1 es un miembro del grupo de (IFNB1) proteínas interferones que se enlazan a receptores específicos de la superficie celular (IFNAR) , y estimula los macrófagos y las células asesinas naturales (NK) para promover actividades antivirales, antibacterianas y anticancerosas .

Interferón gamma IFN-gamma es producido por (IFN-gamma) linfocitos activados por antígenos o mitógenos específicos. IFN- gamma, además de tener actividad antiviral, tiene funciones inmunorreguladoras importantes.

Este es un potente activador de los macrófagos, tiene efectos antiproliferativos sobre las células transformadas y puede potenciar los efectos antivirales y antitumorales de los interferones tipo I.

Factor de necrosis TNF-oc es principalmente secretado tumoral (TFN-alfa) por los macrófagos y puede inducir la muerte celular de ciertas líneas celulares tumorales. Es un potente pirógeno, provocando fiebre por acción directa o por estimulación de la secreción de la interleucina- 1 en linfocitos de sangre periférica.

La combinación de XCL1 con IL-2 e IL-12 puede mejorar la inmunoterapia y aumentar la respuesta antitumoral (Emtage 1999, Wang 2002) .

Ligando 3 de quimiocina El ligando 3 de quimiocina (CCL3) , (CCL3) también conocido como proteína 1 inflamatoria de macrofagos (MIP-1) , que es una denominada monocina (un tipo de citocina producida principalmente por monocitos y macrofagos) que está involucrada en el estado inflamatorio agudo en el reclutamiento y activación de leucocitos polimorfonucleares CC15 (RANTES) CCL5 (RANTES) , es un quimioatrayente para monocitos de sangre, células T cooperadoras de memoria y eosinófilos. Provoca la liberación de histamina de los basófilos y activa los eosinófilos.

Se enlaza a CCR1 , CCR3 , CCR4 , y CCR5. Uno de los factores principales supresores del VIH producidos por las células T CD8+.

Ligando 7 de quimiocina CCL7 es un factor quimiotáctico que CC (CCL7) atrae monocitos y eosinófilos, pero no neutrófilos. CCL7 también aumenta la actividad antitumoral de monocitos. También induce la liberación de gelatinasa B.

Ligando 9 de quimiocina CXCL9 es una citocina que afecta el (porción CXC) (CXCL9) crecimiento, el movimiento o el estado de activación de las células que participan en la respuesta inmunitaria e inflamatoria.

Quimiotáctico para células T activadas .

Ligando 10 de El ligando 10 de quimiocina quimiocina (porción (porción C-X-C) (CXCL10) es una CXC) (CXCL10) citocina pequeña con papeles en la quimioatracción para células en el sistema inmunitario, adhesión de células T a las células endoteliales , actividad antitumoral y angiogénesis Ligando 12 de El ligando 12 de quimiocina quiraiocina (porción (porción C-X-C) (CXCL12) , también CXC) (CXCL12) conocido como factor 1 derivado de células estromales (SDF-1) , es una citocina pequeña que pertenece a la familia de intercrinas, miembros de los cuales activan los leucocitos y son a menudo inducidos por estímulos proinflamatorios tales como LPS, TNF o IL1.

Receptor 7 de CCR7 es el receptor para la Quimiocina (porción C- quimiocina MIP-3 beta. Probable C) (CCR7) mediador de los efectos de EBV sobre los linfocitos B y de las funciones de los linfocitos normales .

Ligando 19 de CCL19 juega un papel no solamente quimiocina (porción C- en las respuestas inflamatoria e C) (CCL19, también inmunitaria, sino también en la conocida como ???-3ß) recirculación y alojamiento de linfocitos normales. CCL19 tiene un papel importante en el tráfico de células T en el timo y la migración de las células T y células B a los órganos linfoides secundarios. Ésta se enlaza específicamente al receptor de quimiocina CCR7.

Ligando 21 de CCL21 inhibe la hemopoyesis y quimiocina CC (CXCL21) estimula la quimiotaxis. CCL21 es quimiotáctico in vitro para timocitos y células T activadas, pero no para células B, macrófagos o neutrófilos.

Interleucina-8 (IL-8) IL-8 es un factor quimiotáctico que atrae los neutrófilos, basófilos, y células T, pero no los monocitos.

Está también involucrado en la activación de neutrófilos. Es liberado de varios tipos celulares en respuesta a un estímulo inflamatorio .

Factores de Crecimiento Factor estimulador de GM-CSF es una citocina que estimula colonias de el desarrollo de diferenciación de granulocitos/macrófagos células precursoras (GM-CSF) hematopoyéticas , provenientes de diversas líneas, incluyendo granulocitos , macrófagos, eosinófilos y eritrocitos.

Ligando de tirosina- El ligando de tirosina-cinasa cinasa relacionado a relacionado a FMS (ligando FMS (ligando FLT3/FLK2 , FLT3/FLK2, Flt3L) , que puede Flt3L) funcionar como un receptor del factor de crecimiento sobre las células madre hematopoyéticas o células progenitoras o ambas.

TGFA TGF-alfa es un polipéptido mitogénico que es capaz de enlazarse al receptor de TGF, y actuar sinérgicamente con TGF beta para promover la proliferación celular independiente del anclaje, en agar suave .

Adyuvantes Beta-defensina Las beta-defensinas son péptidos antimicrobianos implicados en la respuesta inmunitaria innata, contra muchas bacterias Gram- negativas y Gram-positivas , hongos y virus Caja 1 de grupo de alta Las proteínas de la caja 1 del movilidad (HMGB1) grupo de alta movilidad (HMGB1) son proteínas cromosómicas no histonas que funcionan como citocinas, mediando las respuestas locales y sistémicas a la muerte celular necrótica y al cáncer, invasión por patógenos, trauma y sepsis.

S100 Las proteínas fagocíticas S100 son mediadoras de respuestas inflamatorias y reclutan células inflamatorias hacia los sitios de daño tisular, y son miembros de las moléculas del patrón molecular asociado al daño (DAMP) que son importantes para la inmunidad innata .

Mañano El mañano, un polisacárido vegetal, que es un polímero de la azúcar mañosa, es útil para la generación de una respuesta inmunitaria.

Bacilo de Calmette- El bacilo de Calmette-Guerin (BCG) , Guerin (BCG) una especie viva de micobacterium atenuado, se utiliza como vacuna para prevenir la tuberculosis severa y f tal .

Lipopolisacáridos Los lipopolisacáridos bacterianos bacterianos (LPS) (LPS) son endotoxinas que inducen una fuerte respuesta inmunitaria después de la infección con bacterias Gram-negativas .

Molécula co-estimuladora (positiva) Ligando 0X40 El ligando 0X40 (OC40L) pertenece al miembro 4 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (ligando) (Tnfsf4) , es expresado sobre células dendríticas y promueve la diferenciación de células Th2.

Ligando 4-1BB (4-1BBL) El ligando 4-1BB (4-1BBL) pertenece al miembro 9 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (ligando) (Tnfsf9) , que es una glucoproteína transmembranal tipo 2 y es expresado sobre linfocitos T activados. 4-1BBL induce la proliferación de las células T de sangre periférica activadas, y tiene un papel en la muerte celular inducida por activación (AICD) .

CD40 La proteína CD40 pertenece al miembro 5 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, es esencial en la mediación de una amplia variedad de respuestas inmunitarias e inflamatorias incluyendo el cambio de clase de inmunoglobulina dependiente de células T, desarrollo de las células B de memoria y la formación del centro germinal .

Proteína relacionada a GITR puede evocar inmunidad tumoral la familia del receptor efectiva vía la estimulación de del factor de necrosis células T. La administración del tumoral, inducido por anticuerpo monoclonal (mAb) anti-glucocorticoide (GITR) GITR puede provocar una potente inmunidad específica del tumor, y erradicar tumores establecidos sin promover enfermedad autoinmunitaria notoria .

Ligando GITR (GITRL) GITRL es el ligando para GITR.

CD70 CD70 es una citocina que se enlaza a CD27. Ésta juega un papel en la activación de células T. Induce la proliferación de células T coestimuladas y aumenta la generación de células T citolíticas .

LIGHT (HSVgD) El ligando de enlace del mediador de entrada del virus del herpes (HVEM) (HSVgD) , también denominado como p30 o LIGHT es un miembro de la familia de TNF, involucrado en la coestimulación de células T.

PD-L1 (también conocido La proteína PD-L1 (también conocida como CD274) como CD274) es expresada en monocitos activados, células T y B. PD-L1 es suprarregulada en monocitos después del tratamiento con IFN-gamma, y en células dendríticas y queratinocitos después del tratamiento con IFN- gamma, junto con otros activadores.

ICOS-L ICOS-L es un ligando para el receptor ICOS de la superficie celular específico de células T, y actúa como una señal coestimuladora para la proliferación de células T y la secreción de citocina; induce también la proliferación de células B y la diferenciación en células plasmáticas .

Molécula co-estimuladora (Negativa) Anti -CTLA4 El miembro 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA4) es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas y es una molécula coestimuladora expresada en células T activadas.

Anti-PD-Ll El enlace de un receptor de PD-1 sobre una célula T por PD-L1, transmite una señal coestimuladora negativa a la célula, lo cual previene que las células progresen a través del ciclo celular, e incrementa la proliferación de células T. La inhibición de una interacción entre PD-L1 y el receptor sobre las células T con un anticuerpo anti-PD-Ll da como resultado la subregulación de la respuesta inmunitaria denominada como anergia de células inmunitarias .

Anti-PD-L2 PD-L2 está involucrado en la señal co-estimuladora, esencial para la proliferación de los linfocitos T y la producción de IFN-gamma de una manera independiente de PDCDl, pero se sabe que el ligando actúa principalmente a través de PD1 dando como resultado respuestas anérgicas .

Supresor Inm nitario Contrario (Inhibidores de la Tolerancia) TGFR2DN Después del enlace al ligando, TGFR2 forma un complejo de receptor que consiste de dos cinasas de serina/treonina transmembranales tipo II y dos tipo I. Los receptores tipo II fosforilan y activan los receptores tipo I los cuales autofosforilan, luego se enlazan y activan los reguladores transcripcionales SMAD. Los receptores para TGF-beta. La supresión del dominio citoplásmico de cinasa/serina/treonina, predicho (nucleótidos 1172-2036 de TGF R2 ADNc H2-3FF, disponible de las bases de datos públicas como número de acceso M85079 y la secuencia de aminoácidos disponible como número de acceso AAAS1164) deteriora las tres expresiones de genes dependientes de TGF^(1,2 y 3) Anti-TGF-beta TGF-beta es un péptido multifuncional que controla la proliferación, diferenciación y otras funciones en muchos tipos celulares. TGF-beta actúa sinérgicamente con TGF-alfa en la inducción de transformación. También actúa como un factor de crecimiento autócrino negativo. La desregulación de la activación y la señalización de TGF-beta puede dar como resultado la apoptosis. La administración del anticuerpo anti- TGF-beta puede prevenir la insuficiencia renal y la glomeruloesclerosis en ratón db/db, un modelo de diabetes tipo II que desarrolla nefropatía evidente.

Anti-ILIO IL10 es una citocina producida por las células Th2 activadas, las células B, queratinocitos , monocitos y macrófagos . IL10 es útil en la promoción del crecimiento y diferenciación de células B humanas activadas, inhibiendo las respuestas de Thl para prevenir el rechazo al trasplante y los trastornos autoinmunitarios mediados por células T.

Anti-supresor de El supresor de la señalización 1 de señalización 1 de citocina (SOCS1) es un inhibidor de citocina (SOCS1) la señalización del interferón gamma, y previene las acciones neonatales potencialmente fatales de esta citocina.

»Anti-TGF-ot TGF-oc es un polipéptido mitogénico que es capaz de enlazase al receptor de EGF y actúa sinérgicamente con TGF-ß para promover la proliferación celular independiente del anclaje, en agar suave .

Fas contiene proteína FADD es esencial para la asociada a Fas señalización inducida por Fas y TNF citoplásmico, con para la muerte celular programada dominio de muerte (apoptosis) y la oligomerización (FADD) del receptor.

Las bioactividades de IL-12 son también conocidas e incluyen, sin limitación, diferenciación de células T intactas y células Thl, estimulación del desarrollo y función de células T, producción de interferón-gamma (IFN-gamma) y el factor alfa de necrosis tumoral (TNF- ) provenientes de células T y células asesinas naturales (NK) , la reducción de la supresión mediada por IL-4 de IFN-gamma, aumento de la actividad citotóxica de células NK y linfocitos T citotóxicos CD8+, estimulación de la expresión de IL-12R^1 e IL-12R^2, facilitación de la presentación de antígenos tumorales a través de la suprarregulación de las moléculas MHC I y II, y actividad anti-angiogénica . El término "una proteína que tiene la función de IL-12" abarca mutantes de la secuencia de IL-12 de tipo silvestre, en donde la secuencia de tipo silvestre ha estado alterándose por uno o más de adición, supresión o sustitución de aminoácidos, así como las proteínas no IL-12 que imitan una o más de las bioactividades de IL-12.

Como se utiliza en la presente, los términos, "activación" o "activar" se refieren a cualquier incremento mensurable en la actividad celular de un cambio de gen dando como resultado la expresión de un gen de interés (por ejemplo, seleccionado de IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IOR o una subunidad del mismo DN, IL- 15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-alfa, IFN-gamma, CCL3 (MIP-Ia) , CCL5 (RA TES) , CCL7 (MCP3 ) , XCL1 (linfotactina) , CXCL1 (MGSA-alfa) , CCR7, CCL 19 (MIP-3b) , CXCL9 (MIG) , CXCL10 (IP-IO), CXCL 12 (SDF-I), CCL21 (6Ckine), OX40L, 4- IBBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-Defensina, HMGB1, Flt3L, IFN-beta, TNF-alfa, dnFADD, TGF-alfa, PD-Ll AR i , un oligonucleótido antisentido de PD-Ll, TGFbRII DN, ICOS-L y S100.

Como se utilizan en la presente, los términos "tratar" o 11tratamiento" de un trastorno o enfermedad, se refieren a la ejecución de un protocolo, que puede incluir la administración de uno o más fármacos o células manipuladas in vitro a un mamífero (humano o no humano) , en un esfuerzo para aliviar los signos o síntomas del trastorno. De este modo, el "trato" o "tratamiento" no debe ser necesariamente considerado como el que requiere alivio completo de los signos o síntomas, no requiere una curación, y específicamente incluye los protocolos que tienen únicamente efecto marginal sobre el sujeto.

Como se utiliza en la presente, "células inmunitarias" incluyen células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, mastocitos, eosinófilos, basófilos, células asesinas naturales y linfocitos (por ejemplo células B y T) .

Como se utilizan en la presente, los términos "células dendríticas" y "DC" son utilizados intercambiablemente .

Como se utiliza en la presente, el término "células de soporte de terapia" (TSC) son células que pueden ser modificadas (por ejemplo, transfectadas , sometidas a electroporesis , etc.,) con el vector de la invención para distribuir una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador y, opcionalmente , una proteína que tiene la función de IL-12, hacia los microambientes tumorales. Tales TSC incluyen, pero no están limitadas a, células madre, fibroblastos, células endoteliales , y queratinocitos .

Como se utilizan en la presente, los términos "células inmunitarias manipuladas in vitro" o "población manipulada in vitro de células inmunitarias" o "una población de células inmunitarias manipuladas por ingeniería" o "células inmunitarias que expresan un inmunomodulador" o "células inmunitarias que expresan IL-12", se refieren a células inmunitarias, por ejemplo, células dendríticas, que expresan condicionalmente un inmunomodulador y/o IL-12 como pueda ser el caso, bajo el control de un cambio de gen, que puede ser activado por un ligando de activación.

Como se utilizan en la presente, los términos "TSC manipulado in vitro" o "población manipulada in vitro de TSC" o "una población de TSC manipulada por ingeniería" o "TSC que expresa un inmunomodulador" o "TSC que expresan IL-12" se refieren a las células de soporte de terapia, por ejemplo, células madre, fibroblastos, células endoteliales y queratinocitos , que expresan condicionalmente un inmunomodulador y/o IL-12, como pueda ser el caso, bajo el control de un cambio de gen, que puede ser activado por el ligando de activación.

Como se utiliza en la presente, el término "célula modificada" se refiere a las células que han sido alteradas por un proceso que incluye, pero no está limitado a, transíección, electroporación, microinyección, transducción, fusión de células, DEAE-dextrano, precipitación con fosfato de calcio y lipofección (fusión de lisosomas) .

Como se utilizan en la presente, los términos "MOI" o "Multiplicidad de Infección" se refieren al número promedio de partículas adenovirales que infectan una célula simple en un experimento específico (por ejemplo, adenovirus recombinante o adenovirus control) .

Como se utiliza en la presente, el término "tumor" se refiere a todo crecimiento y proliferación de células benignas o malignas ya sea in vivo o in vitro, ya sean células y/o tejidos precancerosos o cancerosos.

Los ejemplos de cánceres que pueden ser tratados de acuerdo a la invención incluyen cáncer de mama, cáncer de próstata, linfoma, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de colon, melanoma, melanoma maligno, cáncer de ovario, cáncer de cerebro, carcinoma cerebral primario, cáncer de cabella y cuello, glioma, glioblastoma, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer pulmonar no microcítico, carcinoma de cabeza o cuello, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de pulmón, carcinoma pulmonar microcítico, tumor de ilms1, carcinoma cervical, carcinoma testicular, carcinoma de vejiga, carcinoma pancreático, carcinoma de estómago, carcinoma de colon, carcinoma prostático, carcinoma genitourinario, carcinoma de tiroides, carcinoma esofágico, mieloma, mieloma múltiple, carcinoma adrenal, carcinoma de células renales, carcinoma endometrial, carcinoma de la corteza adrenal, insulinota pancreático maligno, carcinoma carcinoide maligno, coriocarcinoma, micosis fungoides, hipercalcemia maligna, hiperplasia cervical, leucemia, leucemia linfocitica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielogénica aguda, leucemia mielogénica crónica, leucemia granulocítica crónica, leucemia granulocítica aguda, leucemia de células pilosas, neuroblastoma, rabdomiosarcoma , sarcoma de Kaposi, policitemia verdadera, trombocitosis esencial, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, sarcoma de tejido blando, mesotelioma, sarcoma osteogénico, macroglobulinemia primaria, y retinoblastoma, y similares.

La invención proporciona la ingeniería de células, por ejemplo, células inmunitarias y TSC, para que expresen condicionalmente una proteína que tiene la función de inmunomodulador y opcionalmente , IL-12 y los usos terapéuticos y/o las aplicaciones para el tratamiento del cáncer o tumores o ambos . Las células inmunitarias manipuladas in vitro y TSC que expresan condicionalmente una proteína que tiene la función de un inmunomodulador y opcionalmente IL-12, son un mejoramiento seguro sobre la producción constitutiva de la o las proteínas. Adicionalmente , la habilidad para controlar la sincronización y el nivel del inmunomodulador y opcionalmente la expresión de IL-12, proporciona control mejorado de la eficacia del tratamiento. Por lo tanto, las células inmunitarias manipuladas in vitro y TSC pueden ser formuladas en composiciones farmacéuticas como productos farmacéuticos para el tratamiento de un cáncer o de un tumor en un organismo humano o no humano. Alternativamente, las poblaciones manipuladas in vitro de células inmunitarias , TSC o subgrupos de las mismas, pueden ser utilizadas como vehículos para distribuir condicionalmente un inmunomodulador y opcionalmente la producción de proteína IL-12 hacia un área específica (tejido normal, cáncer, o tumor) en el cuerpo de un organismo humano o no humano. Las células inmunitarias pueden ser autólogas o pueden ser células dendríticas no autólogas . Las células dendríticas pueden ser aisladas de médula ósea o de circulación de sangre periférica. En paciente humanos, las poblaciones de células dendríticas pueden ser aisladas vía un procedimiento de leucoforesis , donde una fracción de células sanguíneas blancas es aislada y removida y otros componentes sanguíneos son reinfundidos al paciente .

En otra modalidad más, las células dendríticas pueden ser preparadas mediante la transfección de células madre hematopoyéticas humanas, con un vector de la invención que expresa una proteína que tiene la función de un inmunomodulador y opcionalmente una proteína que tiene la función de IL-12, y diferenciando la célula madre transfectada para dar una célula dendrítica. Ver Patente de los Estados Unidos 6,734,014.

En una modalidad, es proporcionado un vector adenoviral de ácido nucleico que contiene un cambio de gen, en donde las secuencias de codificación para VP16-RXR y Gal4-Ec son separadas por la secuencia del sitio de entrada al ribosoma interno EMCV (IRES) , son insertadas dentro del vector lanzadera adenoviral bajo el control del promotor de ubiquitina C humana. Las secuencias de codificación para las subunidades p40 y p35 de IL-12 separadas por una secuencia IRES, y colocadas bajo el control de un promotor inducible sintético, son insertadas corriente arriba del promotor de ubiquitina C.

En otra modalidad más, la invención proporciona un vector lanzadera que posee unidades de transcripción (VP16- RXR y Gal4-EcR) para los proteínas de fusión, y las subunidades IL-12 inducibles recombinadas con las cadena principal adenoviral (AdEasil) en células de E. coli BJ5183.

Después de verificar el clon recombinante , el plásmido que posee el genoma rAd.RheoIL12 es desarrollado en y purificado de las células XLIO-Gold, digeridas de la cadena principal plasmídica y empaquetadas mediante transfeccion dentro de las células HEK 293.

En una modalidad particular, la reserva viral primaria resultante es amplificada mediante reinfección de las células HEK 293 y es purificada mediante centrifugación por gradiente de densidad de CsCl .

En una modalidad, el inmunomodulador y/o el gen de IL-12 es una secuencia génica de tipo silvestre. En otra modalidad más, el inmunomodulador y/o el gen IL-12 es una secuencia génica modificada, por ejemplo, una secuencia quimérica o una secuencia que ha sido modificada para utilizar codones preferidos.

En una modalidad, el inmunomodulador y/o el gen IL-12 es la secuencia tipo silvestre humana. En otra modalidad más, la secuencia es al menos 85% idéntica a la secuencia humana de tipo silvestre, por ejemplo, al menos 90%, 95%, o 99% idéntica a la secuencia humana de tipo silvestre. En una modalidad adicional, la secuencia génica codifica para el polipéptido humano. En una modalidad otra modalidad más, el gen codifica para un polipéptido que al menos 85% idéntico al polipéptido humano de tipo silvestre, por ejemplo, al menos 90%, 95%, o 99% idéntico al polipéptido humano de tipo silvestre .

En una modalidad, el gen de IL-12 es la secuencia de IL-12 de ratón de tipo silvestre. En otra modalidad más, la secuencia es al menos 85% idéntica a la IL-12 de ratón de tipo silvestre, por ejemplo, al menos 90%, 95%, o 99% idéntica a la IL-12 de ratón de tipo silvestre. En una modalidad adicional, la secuencia génica IL-12 codifica para el polipéptido IL-12 de ratón. En otra modalidad más, el gen codifica para un polipéptido que es al menos 85% idéntico a la IL-12 de ratón de tipo silvestre, por ejemplo, al menos 90%, 95%, o 99% idéntica a la IL-12 de ratón de tipo silvestre.

DC puede ser aislado de médula ósea de humanos, ratones u otros mamíferos. Las células dendríticas pueden ser aisladas de sangre de humanos, ratones u otros mamíferos. En pacientes humanos, las poblaciones de células dendríticas pueden ser aisladas vía un procedimiento de leucoforesis como es conocido en la técnica, donde una fracción de células sanguíneas blancas es aislada y removida, y otros componentes sanguíneos son reinfundidos al paciente. En una modalidad, las DC son derivadas de médula ósea murina como se describió previamente (Tatsumi et ah, 2003) . En resumen, la médula ósea (BM) de ratón de tipo silvestre o EGFP Tg es cultivada en medio condicionado (CM) suplementado con 1000 units/ml del factor estimulador de colonias de granulocitos/macrófagos murino, recombinante, y mIL-4 recombinante (Peprotech, Rocky Hill, NJ) a 37 °C en una incubadora al de C02 al 5% humidificada por 7 días. Las DC CDllIc+ son luego aisladas por ejemplo, utilizando esferas MACSTM específicas, siguiendo las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) . Las DC CDllc+ producidas de esta manera más de >95% puras con base en la morfología y la coexpresión de CDllb, CD40, CD80, y los antígenos MHC de la clase I y clase II.

Una modalidad de la invención proporciona células inmunitarias y TSC manipuladas por ingeniería, que expresan condicionalmente una proteína que tiene la función de un inmunomodulador y opcionalmente IL-12 adecuada para aplicaciones terapéuticas para el tratamiento del cáncer, o tumores o ambos, como terapia génica en organismos humanos o no humanos. En una modalidad, la invención proporciona las células inmunitarias manipuladas por ingeniería, y las TSC manipuladas que contienen el cambio del gen.

En otra modalidad más, la invención proporciona las células inmunitarias y las TSC manipuladas con ingeniería que contienen al menos una porción de un receptor de ecdisona. En otra modalidad más, la invención proporciona las células inmnitarias manipuladas con ingeniería, y las TSC que contienen un cambio del gen basado en el receptor de ecdisona. En otra modalidad más, la invención proporciona las células imunitarias y las TSC manipuladas por ingeniería, que contienen RheoSwitch. En otra modalidad más, la invención proporciona un kit que comprende células inmunitarias y TSC manipuladas por ingeniería, que contienen un cambio de gen y un ligando que modula el cambio de gen. En otra modalidad más, el kit comprende además un ligando de diacilhidrazina . En otra modalidad más, el kit comprende además RG-115830 o RG-115932.

En una modalidad, la invención proporciona una población manipulada por ingeniería de células inmunitarias y TSC. En una modalidad, las DC cultivadas 7 días son tratadas con adenovirus recombinante que codifica para un inmunomodulador y/o IL-12 impulsado fuera de un promotor constitutivo o inducible, o son infectadas con el vector adenoviral control, o control negativo (rAdi|;5) , sobre un intervalo de multiplicidad de infección (MOIs) . Después de 48 horas, las DC infectadas son cosechadas y analizadas para el fenotipo y para la producción de un inmunomodulador y/o IL-12 utilizando el kit de ELISA específico (BD-PharMingen, San Diego, CA) , con un nivel más bajo de detección de 62.5 ¦ pg/ml.

En otra modalidad más, la invención proporciona una población manipulada por ingeniería in Vitro de células inminitarias , y TSC que comprenden un vector, por ejemplo, un vector de ADN, que tiene un cambio de gen capaz de expresar condicionalmente una proteína que tiene la función de un inmunomodulador y/o IL-12, y que comprende además la activación del ligando.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un método para tratar el cáncer, por ejemplo, melanoma o glioma, al administrar las DC manipuladas por ingeniería a un paciente, y luego administrando un ligando de activación, tal como RG-115819, RG-115830 o RG-115932, al paciente. El paciente puede ser un humano o un animal con cáncer. El método de tratamiento y los productos, las células manipuladas por ingeniería, los kits y los liganados tienen aplicación en terapia humana y en terapia animal veterinaria. Por lo tanto, los productos y métodos con contemplados para ser utilizados para fines humanos y animales veterinarios.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica adecuada para la administración a un humano o no humano, que comprende un población de células inmunitarias manipuladas por ingeniería in vi ro o TSC, que expresan una proteína que tiene la función de un inmunomodulador y/o IL-12, en donde la formulación es adecuada para la administración por administración intratumoral . La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un ligando de activación tal como RG-115819, RG-115830 o RG-115932, en donde la composición es adecuada para la administración mediante la vía intraperitoneal , oral o subcutánea.

En la modalidad particular descrita en la presente, la invención proporciona un método para tratar un tumor, que comprende los pasos en orden de: a. administrar intratumoralmente en un mamífero una población de células inmunitarias manipuladas in vi ro o TSC; y b. administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un ligando de activación.

En una modalidad, el ligando de activación es administrado sustancialmente al mismo tiempo que las céluls inmunitarias o TSC manipuladas por ingeniería in vitro, por ejemplo, dentro de una hora antes o después de la administración de las células. En otra modalidad más, el ligando de activación es administrado en o en menos de 24 horas después de la administración de las células inmunitarias o TSC manipuladas in vitro. En otra modalidad más, el ligando de activación es administrado a o en menos de aproximadamente 48 horas después de las células inmunitarias o TSC manipuladas in vitro. En otra modalidad más, el ligando es RG-115932. En otra modalidad más, el ligando es administrado a una dosis de aproximadamente 1 a 50 mg/kg/día. En otra modalidad más el ligado es administrado en una dosis de aproximadamente 30 mg/kg/día. En otra modalidad más, el ligando es administrado a una dosis de aproximadamente 7 a 28 mg/kg/día. En otra modalidad más el ligado es administrado diariamente por un periodo de 14 días. En otra modalidad más, se administran aproximadamente 1 x 106 a 1 x 108 células. En otra modalidad más, se administran aproximadamente 1 x 10 a 1 x 107 células.

En una modalidad, las células dendríticas son manipuladas para expresar condicionalmente IL-2 e IL- 12. IL-2 ejerce efectos inmunorreguladores potentes sobre las células T, NK y NK-T efectoras y reguladoras. Se espera que la expresión de IL-2 e IL-12 en células dará como resultado la suprarregulación recíproca de otros receptores, e inducen diferencias por efectos biológicos complementarios, en virtud de las vías de señalización separadas. Se espera también que la combinación de IL-2 e IL-12 prolongará la duración de estimulación inmunitaria y reducirá la dosis efectiva de las células que pueden ser más toleradas por el animal . Ver Dietrich 2002, igginton 2002, 2001, 1996 y Koyama, 1997, McDermott y Atkins 2008; Berntsen et al 2008; Tarhini et al 2008; Heemskerk et al 2008; Horton et al 2008. Las secuencias polinucleotídicas de IL-2 están disponibles bajo los números de acceso U25676 (humano) ; NM 008366 (ratón) ; NM_204153 (pollo) ; y NM_053836 (rata) . Las secuencias polinucleotídicas de IL-12 están disponibles bajo los números de acceso NM 000882 (humano IL12A) ; NM_002187 (humano IL12B) ; NM_008351 (ratón IL12a) ; NM_008352 (ratón IL12b) ; NM_213588 (pollo IL12A) ; NM_213571 (pollo IL12B) ; NM 053390 (rata IL12a) ; y NM_022611 (rata IL12b) . Las SEQ ID NOS: 13, 15, 21 y 23 codifican para la IL-12 humana y de ratón y subunidades de las mismas.

En otra modalidad más, las células dendríticas son manipuladas para expresar condicionalmente IL-18 e IL-12. IL-18 induce la producción de IFN-gamma y promueve el desarrollo de células T cooperadoras y la activación de células NK. Además, IL-18 puede aumentar la producción GM-CSF y disminuir la producción de IL-10. Se espera que la expresión de IL-18 e IL-12 superará las limitaciones observadas cuando la citocina sea administra sola. Se espera que la expresión de IL-12 e IL-18 en células dendríticas estimulará respuestas de Thl específicas del antígeno tumoral más vigorosas, que cuando las células dendríticas son transducidas con cualquier citocina sola.

La inyección intratumoral de DCs manipuladas por ingeniería para secretar IL-12 e IL-18, son mediadoras de los más altos niveles de producción de INF-? y rechazo tumoral completo (Tatsumi 2003). Ver, Vujanovic, 2006. Ver también Coughlin, 1998, Subleski, 206, Tatsumi, 2003, y Sabel, 2007; Shiratori et al 2007; Lian et al 2007; Iinuma et al 2006. Ver arriba para las secuencias del polinucleótido de IL-12. Las secuencias del polinucleótido de IL-18 están disponibles bajo los números de acceso U90434 (humano) ; NM_008360 (ratón) ; EU747333 (pollo) ; y AY258448 (rata) .

En otra modalidad más, las células dendríticas son manipuladas por ingeniería para expresar condicionalmente IL-15 e IL- 12. IL-15 comparte algunas actividades biológicas con IL-2 que también lo hace potencialmente útil para terapias contra el cáncer. IL-15 estimula la proliferación de células NK y células T activadas, y soporta la expansión de las células T efectoras. Se ha reportado que la presentación de IL-15 sinergizó con IL-12 para la producción aumentada de IFN-gamma en células NK. Koka, 2004; Basak 2008; Lasek et al 2004. La distribución intratumoral de IL-15 e IL-12 indujo regresión tumoral significativa en un modelo de melanoma (Lasek 1999) . Ver arriba para las secuencias del polinucleótido IL-12. Las SEQ ID NOS: 11 y 19 codifican para la IL-15 humana y de ratón. Las Figuras 2 y 4 son mapas de plásmidos para el sistema de expresión que pueden ser utilizados para la IL-12 e IL-15 de humano y de ratón.

En otra modalidad más, las células dendríticas son manipuladas por ingeniería para expresar condicionalmente IL-21 e IL-12. IL-21 y su receptor comparten homología de secuencia con IL-2 e IL-15. IL-21 promueve la expansión y la maduración de las células NK. Los efectos biológicos de IL-21 sinergizan potencialmente con IL-12 ya que el tratamiento de células NK con IL-21 da como resultado una suprarregulación significativa del receptor de IL-12. Además, IL-21 puede aumentar la transducción de la señal de IL-12 y cooperar para la producción incrementada de IFN-gamma. Ver arriba para las secuencias del polinucleótido de IL-12. Las secuencias del polinucleótido de IL-21 están disponibles bajo los números de acceso AF254069 (humano) ; NM_021782 (ratón) ; NM_001024835 (pollo) ; y NM_001108943 (rata). Las SEQ ID NOS: 6, 7, 8, 9, y 17 codifican para IL-21 humana y de ratón. Las SEQ ID NOS: 1 y 2 son construcciones de polinucleótido que codifican para IL-12 e IL-21 de ratón y de humano. Las Figuras 7 y 8 son mapas de plásmidos para los sistemas de expresión que pueden ser utilizados para expresar IL-12 e IL-21, respectivamente.

En otra modalidad más, las células dendríticas son manipuladas por ingeniería para expresar condicionalmente TNF-alfa e IL-12. TNF-alfa es un potente activador de las células inmunitarias y es mediador de las propiedades antitumorales . Además, TNF-alfa puede sinergizar con IL-12 para la expresión aumentada de IFN-gamma y el receptor de IL-12 sobre las células T. En estudios con animales, la aplicación de IL-12 y TNF-alfa dio como resultado infiltración tumoral por las células T DN8+, producción significativa de IFN-gamma, y regresión tumoral subsiguiente. Ver Sabel, 2003, 2004, 2007, Taniguchi , 1998, Lasek, 2000; y Xia et al 2008. Ver arriba para las secuencias del polinucleótido de IL-12. Las secuencias de polinucleótido que codifican para TNF-alfa están disponibles bajo los números de acceso X02910 (humano) ; NM_013693 (ratón) ; y BC107671 (rata) .

En otra modalidad más, las células dendríticas son manipuladas por ingeniería para expresar condicionalmente IL-7 e IL-12. IL-7 es un miembro de la familia IL-2 y es importante para la linfopoyesis de células T y células B. IL-7 regula la homeostasis de la supervivencia y la proliferación de células T CD8+ intactas y de memoria. Se ha probado que IL-7 aumenta la generación de CTL contra tumores. Además, IL-12 actúa dirigido sobre las células T CD8+ para aumentar la proliferación mediada por IL-7. Además, se ha reportado que IL-7 e IL-12 aumentan sinérgicamente la citotoxicidad de células T CD8+ . Mehrotra, 1995; Sharma et al 2003; Tirapu et al 2002. De este modo, se espera que la coexpresión de IL-7 e IL-12 proporcionará respuestas antitumorales más óptimas. Ver arriba para las secuencias polinucleotídicas que codifican para IL-12. Las secuencias del polinucleótido que codifican para IL-7 están disponibles bajo los números de acceso J04156 (humano) ; NM 008371 (ratón) ; NM_001037833 (pollo) ; y NM_013110 (rata) .

En otra modalidad más, las células dendríticas son manipuladas por ingeniería para expresar condicionalmente GM-CSF e IL-12. GM-CSF regula la diferenciación y proliferación de células progenitoras hematopoyéticas , y juega un papel particularmente importante en la maduración de células profesionales presentadoras de antígeno (APC) tales como las células dendríticas. GM-CSF también aumenta la capacidad de las células dendríticas para procesar y presentar antígeno. GM-CSF funciona de manera diferente a IL-12, y ambos promueven respuestas antitumorales significativas en estudios animales. La combinación de IL-12 (activación de células T) y GM-CSF (activación de células dendríticas) se espera que de como resultado una unidad antitumoral más potente. En estudios animales, GM-CSF en combinación con el tratamiento con IL-12 suprimió significativamente el crecimiento tumoral en múltiples modelos de cáncer. Wang, 2001; Chang, 2007; Jean, 2004; Nair, 2006; Hill 2002; Small et al 2007. En pruebas con humanos, GM-CSF + IL-12 se utilizaron exitosamente para tratar pacientes con mieloma, donde las acciones combinadas de ambas citocinas condujeron a una reducción en las células B circulantes. Rasmussen, 2003; Hansson, 2007; Abdalla, 2007. Se espera que la coexpresión de GM-CSF e IL-12 en una célula simple evitará efectos sistémicos no deseados tales como reducciones en las células B circulantes. Ver para las secuencias polinucleotidicas que codifican para IL-12. Las secuencias polinucleotidicas de GM-CSF están disponibles bajo los números de acceso Mi 1734 (humano) ; NM_009969 (ratón) ; EU520303 (pollo) ; NM_001037660 (rata Csf2ra) ; y NM_133555 (rata Csf2rb) .

En otra modalidad más, las células dendríticas son manipuladas para expresar condicionalmente una quimiocina (por ejemplo, CCL3 (MIP-Ia) , CCL5 (RA TES) , CCL7 (MCP3) , XCLl (linfotactina) , CCL 19 (MIP-3b) , CXCL9 (MIG) , CXCLlO (IP-10) , CXCL 12 (SDF-I) , o CCL21 (6Ckine)) e IL-12. Las quimiocinas son citocinas quimioatrayentes que regulan el tráfico y la activación de leucocitos y otros tipos celulares bajo una variedad de condiciones inflamatorias y no inflamatorias. Las citocinas inflamatorias controlan el reclutamiento de leucocitos en la inflación y el daño tisular. Las quimiocinas homeostáticas cumplen funciones de mantenimiento doméstico tales como los leucocitos navegantes (por ejemplo, células dendríticas) hacia y dentro de los órganos linfoides secundarios, así como la médula ósea y el timo durante la hematopoyesis. En estudios animales, la co- inyección intratumoral de dos adenovirus separados que expresan IL-12 y CXCL10 condujo a la regresión del 100% de los nodulos tumorales derivados de la línea celular de adenocarcinoma colorrectal murino CT26. Narvaiza et al., 2000. Emtage et al, 1999, describen dos vectores adenovirales recombinantes dobles que expresan ya sea IL2 y XCLl ( linfotactina) o IL-12 y XCLl. La inyección intratumoral de los vectores a tumores de adenocarcinoma de mama en ratones, promovió respuestas antitumorales potentes y dio origen a inmunidad protectora. En otros estudios animales, la cotransducción de vectores adenovirales que expresan IL-12 y CCL27 dio como resultado la regresión del tumor y la inmunidad específica a largo plazo. Gao et al, 2007. De este modo, se espera que la coexpresión de una quimiocina e IL-12 de acuerdo a la invención dará como resultado actividad antitumoral sinérgica.

En otra modalidad más, las células dendríticas son manipuladas por ingeniería para expresar condicionalmente una citocina anti-angiogénica (por ejemplo, IP-10 y Mig) e IL-12. IP-10 y Mig son quimioatrayentes para las células T y las células NK, y su habilidad para inhibir la angiogénesis es dependiente de las células NK. Los estudios en animales han mostrado que la terapia en combinación con dos adenovirus, uno que expresa IP10 y otro más que expresa IL-12, dio como resultado sinergia antitumoral marcada. Narvaiza et al, 2000. En otros estudios, los vectores adenovirales que expresan IP10 o MIG y/o IL-12 fueron administrados intratumoralmente en un modelo murino de adenocarcinoma mamario y fibrosarcoma . Se encontró que la administración de IP-10 o MIG en combinación con IL-12 dio como resultado regresión tumoral considerable e incrementó el tiempo de supervivencia de los animales que poseían tumores, en comparación a IP10, MIG, IL-12 solo o animales tratados con el control, con la combinación de IP-10 e IL-12 que es la más efectiva. Palmer, 2001. Ver also Mazzolini, 2003; y Huang 2004. De este modo, se espera que la coexpresión de una citocina anti -angiogénica e IL-12 dará como resultado actividad antitumoral sinérgica.

Para demostrar una terapia génica mediada por IL- 12, efectiva, se utiliza un sistema de expresión de ADNc condicional que alguien encienda un inmunomodulador y/o la producción de IL-12 por las células inmunitarias o TSC en diversos puntos de tiempo después de la inyección intratumoral . Con base en los resultados en el modelo de melanoma B16 agresivo en ratones C57BL/6 se realizan las siguientes conclusiones: 1) son secretados niveles elevados de IL-12 de DC.RheoIL12 en presencia del ligando de activación RG-115830, pero no en ausencia del ligando; 2) la terapia intratumoral basada en DC.RheoIL12 es tan efectiva como la terapia intratumoral basada en DC.CIL12, siempre y cuando RG- 115830 sea administrado a los animales tratados dentro de 24 horas de la inyección de DC (y a puntos de tiempo posteriores de la provisión del ligando, la terapia con RG-115830 falla) ; 3) la expresión de IL-12 en DC parece prolongar la supervivencia de estas células en el microambiente tumoral, y está asociada con más altos números de DC inyectado intratumoralmente que migran hacia los nodulos linfáticos de drenado tumoral; y 4) la correlación inmunitaria más fuerte hacia el resultado de la terapia es el nivel de células T CD8+ específicas del tumor, aprestadas cruzadamente por la terapia, y no el número de DC inyectadas, sustentadas en el microambiente tumoral. En general, estos datos sugieren que las terapias basadas en DCIL-12 probablemente tienen éxito con base en su influencia positiva sobre el aferente (aprestamiento cruzado) de los efectores de células T CD8+ de tipo 1, y no sobre eventos eferentes posteriores, tal como el reclutamiento mediado por DC inyectadas de las células T antitumorales dentro del microambiente tumoral, etc.

Antes de la inyección intratumoral, las células (células inmunitarias o TSC) pueden ser tratadas con un factor para estimular la actividad de las células. Por ejemplo, las células pueden ser tratadas con una molécula coestimuladora tal como la molécula coestimuladora positiva que incluye OX40L, 4-IBBL, CD40, CD40L, GITRL, CD70, LIGHT o ICOS-L o una molécula co-estimuladora negativa tales como los anticuerpos anti-CTLA4f anti-PD-Ll o anti-PD-L2. Por ejemplo, las células (por ejemplo, células inmunitarias o TSC) pueden ser incubadas con una célula que expresa una o más moléculas coestimuladoras , por ejemplo, las células del linfoma J588 que expresan la molécula del ligando CD40. En otra modalidad más, las células (células inmunitarias o TSC) pueden ser tratadas con una molécula inmunosupresora contraria (inhibidor de tolerancia) tales como los anticuerpos anti-TGF-beta (para inhibir la señalización de TGF dentro del microambiente) , anticuerpos anti-IL10, TGFbRII DN (para inhibir la señalización de TGF dentro de las células modificadas con el gen) , IL-IOR DN, dnFADD (parea inhibir las vías de muerte celular dentro de las células) , anticuerpos anti-SOCSl, siARN o decoy (para inhibir la señalización de citocina supresora dentro de las células) , o anticuerpos anti-TGFa .

Los adenovirus recombinantes que poseen las secuencias polinucletídicas mostradas en las figuras 1-8, son producidos. Por ejemplo, hIL-21 es producido mediante cotransfección del vector de expresión hlL-21 linearizado mediante digestión de restricción en un sitio con dirección 5' del ITR izquierdo, y la cadena principal adenoviral apropiada (por ejemplo suprimida en E3) en una línea celular permisiva tales como las células HEK293. El vector adenoviral que posee los genes inmunomoduladores murinos se utiliza para la transducción de células dendríticas murinas TSC para el uso en modelos terapéuticos murinos. Para la aplicación terapéutica en humanos, un polinucleótido que codifica para el homólogo humano del gen inmunomodulado , es insertado en el vector apropiado. El vector adenoviral para la aplicación terapéutica humana es producido bajo condiciones de GMP. El ejemplo de un perfil de tratamiento (prueba clínica) para los pacientes con melanoma de etapa III/IV es como sigue: El tratamiento en este caso involucra una inyección intratumoral de las células dendríticas transducidas , adenovirales , y la administración oral por 14 días del fármaco activador (ligando) . Los sujetos son seleccionados 30 días a una semana antes de la prueba clínica. A cada sujeto se le pide que firme un consentimiento informado antes de que se inicie cualquier procedimiento. El investigador informará a todos los sujetos de la naturaleza los objetivos, la duración, los peligros potenciales, y los procedimientos que van a ser realizados durante la prueba, y la posibilidad de que sus registro médicos puedan ser revisados por la FDA. Los sujetos (un total de 16 a 20) son aleatoriamente agrupados en cuatro grupos. Todos los grupos recibirán una inyección intratumoral de hasta 5xl07 células dendríticas transducidas aproximadamente 3 horas después de la primera dosis de la administración oral del ligando. Los 4 grupos diferentes en la dosis diaria oral del ligando recibieron: grupo ejemplar 1 = O.Olmg/kg; grupo 2 = 0.3 mg/kg; grupo 3 = 1 mg/kg; grupo 4 =3 mg/kg. Durante el curso del tratamiento, se extrae sangre a los intervalos de tiempo especificados para la evaluación de la dosis simple y la farmacocinética en estado de reposo del fármaco activador y sus metabolitos mayores. También, es extraída sangre en los puntos de tiempo especificados para la evaluación de las respuestas inmunitarias humorales y celulares contra el vector viral, los componentes de RTS y el tumor. Se recolecta orina y se extrae sangre a los puntos de tiempo específicos para la química del suero, el análisis urinario y la hematología (perfil de seguridad) . Biopsias de tumor de los nodulos linfáticos con drenado son tomadas en los puntos de tiempo especificados para evaluar la expresión del transgen y la respuesta inmunitaria hacia el tumor como resultado de la. terapia. Los criterios para la terminación temprana son establecidos para los pacientes en caso de eventos adversos. Y los eventos adversos son registrados. Los pacientes son seguidos hasta 1, 2, 3 y 4 meses para eventos adversos y el resultado terapéutico.

En otra modalidad más un sujeto en necesidad de tratamiento de un tumor es (a) administrado con células dendríticas manipuladas por ingeniería para expresar un inmunomodulador, por ejemplo, un inmunomodulador descrito en la presente, ya sea constitutivamente o condicionalmente, y (b) un vector que expresa un inmunomodulador, por ejemplo un inmunomodulador descrito en la presente, ya sea constitutiva o condicionalmente, es inyectado intratumoralmente al sujeto. En una modalidad preferida, las células dendríticas son manipuladas por ingeniería para expresar un vector Ad-inmunomodulador, y particularmente el vector Ad-RTS-inmunomodulador . En otra modalidad preferida, el vector que es inyectado intratumoralmente al sujeto es un vector Ad-immunomodulador, y particularmente el vector Ad-RTS-immunomo.dulador .

En otra modalidad más, un sujeto en necesidad de tratamiento de un tumor es (a) administrado con células dendríticas manipuladas para expresar IL-12, ya sea constitutiva o condicionalmente, y (b) un vector que expresa IL-12, ya sea constitutiva o condicionalmente, es inyectado intratumoralmente al sujeto. En una modalidad preferida, las células dendríticas son manipuladas para expresar un vector Ad-IL-12, y particularmente el vector Ad-RTS-IL-12. En otra modalidad preferida, el vector que es inyectado intratumoralmente al sujeto es un vector Ad-IL-12, y particularmente el vector Ad-RTS-IL-12.

En otra modalidad más, un sujeto en necesidad de tratamiento de un tumor es (a) administrado con las células dendríticas manipuladas para expresar IL-12, ya sea constitutiva o condicionalmente , y (b) el sujeto es administrado con uno o más agentes quimioterapéuticos anti-cáncer. En una modalidad preferida, las células dendríticas manipuladas por ingeniería son manipuladas para expresar un vector Ad-IL-12, y particularmente el Ad- TS-IL-12. Uno o más agentes quimioterapéuticos anti -cáncer pueden ser administrados antes de que las células dendríticas manipuladas por ingeniería sean administradas, después de que las células dendríticas manipulada son administradas, o concurrentemente con la administración de las células dendríticas manipuladas. En una modalidad preferida, el agente quimioteraéutico anti -cáncer es el paclitaxel, un derivado o análogo del paclitaxel, temozolomida, un derivado o análogo de temozolomida, sunitinib, un derivado o análogo de sunitinib, gemcitabina, o un derivado o análogo de gemcitabina .

En otra modalidad más, un sujeto en necesidad de tratamiento de un tumor es (a) administrado con las células dendríticas manipuladas para expresar IL-12, ya sea constitutiva o condicionalmente, (b) un vector que expresa IL-12, ya sea constitutiva o condicionalmente, es inyectado intratumoralmente al sujeto, y (c) el sujeto es administrado con uno o más agentes quimioterapéuticos anti-cáncer. En una modalidad preferida, las células dendríticas son manipuladas para expresar un vector Ad-IL-12, y particularmente el vector, Ad-RTS-IL-12. En otra modalidad preferida, el vector que es inyectado intratumoralmente al sujeto es un vector Ad-IL-12r, y particularmente el vector Ad-RTS-IL-12. Uno o más agentes quimioterapéuticos anti-cáncer pueden ser administrados antes de que las células dendríticas manipuladas y el vector que expresa IL-12, sean administrados, después de que las células dendríticas manipuladas y el vector que expresa IL-12 son administrados, o concurrentemente con la administración de las células dendriticas manipuladas por ingeniería, y el vector que expresa IL-12. En una modalidad preferida, el agente quimioterapeutico anti-cáncer es paclitaxel, un derivado o análogo de paclitaxel, temozolomida, temozolomida, un derivado o análogo de temozolomida, sunitinib, un derivado o análogo de sunitinib, gemcitabina, o un derivado o análogo de gemcitabina .

En otra modalidad más, un sujeto en necesidad de tratamiento de un tumor es (a) administrado con células dendríticas manipuladas para expresar un inmunomodulador, por ejemplo, un immunomodulador descrito en la presente, ya sea constitutiva o condicionalmente y (b) un vector que expresa un inmunomodulador, por ejemplo, un immunomodulador descrito en la presente, ya sea constitutiva o condicionalmente, es inyectado intratumoralmente al sujeto. En una modalidad preferida, las células dendríticas son manipuladas para expresar un vector Ad-inmunomodulador, y particularmente el vector Ad-RTS-inmunomodulador . En otra modalidad preferida, el vector que es inyectado intratumoralmente al sujeto es un vector Ad-IL-inmunomodulador, y particularmente el vector Ad-RTS- inmunomodulador .

En otra modalidad más, un sujeto en necesidad de tratamiento de un tumor es (a) administrado con células dendríticas manipuladas para expresar un inmunomodulador, por ejemplo, un inmunomodulador descrito en la presente, ya sea constitutiva o condicionalmente , y (b) el sujeto es administrado con uno o más agentes quimioterapéuticos anti-cáncer. En una modalidad preferida, las células dendríticas manipuladas por ingeniería son manipuladas para expresar un vector Ad-inmunomodulador, y particularmente el vector Ad-RTS-inmunomodulador. Uno o más agentes quimioterapéuticos anti-cáncer pueden ser administrados antes de que las células dendríticas manipuladas sean administradas, después de las células dendríticas manipuladas sean administradas, o concurrentemente con la administración de las células dendríticas manipuladas. En una modalidad preferida, el agente quimioterapéutico anti-cáncer es el paclitaxel un derivado o análogo de paclitaxel, temozolomida, temozolomida, un derivado o análogo de temozolomida, sunitinib, un derivado o análogo de sunitinib, gemcitabina, o un derivado o análogo de gemcitabina .

En una modalidad más, un sujeto en necesidad de tratamiento de un tumor es (a) administrado con células dendríticas manipuladas para expresar un inmunomodulador, por ejemplo, un inmunomodulador descrito en la presente ya sea constitutiva o condicionalmente, (b) un vector que expresa un inmunomodulador, por ejemplo, un inmunomodulador descrito en la presente, ya sea constitutiva o condicionalmente, es inyectado intratumoralmente al sujeto, y (c) el sujeto es administrado con uno o más agentes quimioterapéuticos anti-cáncer. En una modalidad preferida, las células dendríticas son manipuladas para expresar un vector Ad- inmunomodulador y y particularmente el vector Ad-RTS- inmunomodulador . En otra modalidad preferida, el vector que es inyectado intratumoralmente al sujeto es un vector Ad-inmunomodulador, y particularmente el vector Ad-RTS- inmunomodulador . Uno o más agentes quimioterapéuticos anti -cáncer pueden ser administrados antes de que sean administradas las células dendríticas manipuladas y el vector que expresa el inmunomodulador, después de que las células dendríticas manipuladas y el vector que expresa el inmunomodulador sean administrados, o concurrentemente con la administración de las células dendríticas manipuladas y el vector que expresa el inmunomodulador. En una modalidad preferida, el agente quimioterapéutico anti -cáncer es paclitaxel, un derivado o análogo de paclitaxel, temozolomida , temozolomida, un derivado o análogo de temozolomida, sunitinib, un derivado o análogo de sunitinib, gemcitabina, o un derivado o análogo de gemcitabina .

En cualquiera de los métodos de presente invención la enfermedad o trastorno puede ser una enfermedad o trastorno descrito en la presente solicitud. En una modalidad, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno listado en la Tabla 1 de la presente. En una modalidad más, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno listado en la Tabla 3 de la presente.

En cualquiera de los métodos de la presente invención, el cáncer o el tumor puede ser una enfermedad o trastorno descrito en la presente solicitud. En una modalidad, el cáncer o el tumor es un cáncer o tumor listado en la Tabla 1 de la presente. En una modalidad más, el cáncer o el tumor es un cáncer o tumor listado en la Tabla 3 de la presente.

Es posible medir el efecto de un inmunomodulador y/o la expresión de IL-12 sobre una población de células mediante la medición del nivel de expresión o actividad de la citocina Thl/Tcl, IFN-gamma en una muestra biológica de un sujeto .

Para los propósitos de la invención, la invención proporciona un método para determinar la eficacia de un régimen terapéutico basado en TSC o inmunológico manipulado por ingeniería in vitro, en un paciente con cáncer, que comprende : a. medir el nivel de expresión o el nivel de actividad o ambos del interferón-gamma (IFN-gamma) en una primera muestra biológica obtenida de un paciente humano antes de la administración de las células in vitro por ejemplo, células inmunitarias o TSC, con lo cual se genera un nivel de control; b. administrar intratumoralmente al paciente las células manipuladas in vitro; c. administrar al paciente una cantidad efectiva del ligando de activación; d. medir el nivel de expresión o el nivel de actividad o ambos de IFN-gamma en una segunda muestra biológica obtenida del paciente a un tiempo después de la administración del ligando de activación, con lo cual se generan datos para un nivel de prueba; y e. comparar el nivel control al nivel de prueba de IFN-gamma, en donde los datos que muestran un incremento en el nivel de expresión, actividad o ambos de IFN-gamma en el nivel de prueba con relación al nivel control, indican que el régimen de tratamiento terapéutico es efectivo en el paciente. La invención puede también comprender adicionalmente los pasos adicionales de f. tomar biopsia y contar los linfocitos de infiltración tumoral (TIL) y/o g. observar la regresión del tumor en respuesta al tratamiento .

El término "sujeto" significa un insecto, planta o animal intacto. Se anticipa también que los ligandos funcionarán igualmente bien cuando el sujeto es un hongo o levadura. Los animales para el uso con la invención incluyen, pero no están limitados a, vertebrados por ejemplo, mamíferos tales como humanos, roedores, monos, y otros animales, con los humanos o los ratones que son los más preferidos. Otros animales incluyen animales veterinarios tales como perros, gatos, caballos, reses, ovejas, cabras, cerdos, y similares.

Sin desear estar comprometido por alguna teoría, se espera que la invención apoyará el uso de la terapia génica basada en TSC e inmunoterapia, manipulados por ingeniería in vitro, intratumoralmente administrados, en el panorama clínico, enfocándose a la respuesta clínica objetiva como un punto final del estudio primario, y las células T CD8+ antitumorales cruzadamente aprestadas (produciendo IFN-gamma) como un punto final de estudio secundario. La habilidad para encender y apagar la expresión del inmunomodulador y/o de IL-12 in vivo, agrega un elemento de seguridad y de control terapéutico al tratamiento, ya que la sincronización y el nivel de expresión de proteína pueden ser controlados por la administración del ligando, y además que la sincronización de la expresión del inmunomodulador y/o de IL-12 se espera que sea crítica para la efectividad terapéutica del método.

La invención apoya además las aplicaciones terapéuticas de las células manipuladas in vitro, con genes condicionalmente expresados de interés, como procedimientos innovadores para el tratamiento efectivo y eficiente de trastornos humanos .

En el caso de conflicto entre cualquier enseñanza o sugerencia de cualquier referencia citada en la presente y en la especificación, la última prevalecerá, para fines de la invención .

Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones citadas aquí son completamente incorporadas por referencia en su totalidad.

Se debe entender que las modalidades anteriormente descritas y las ej emplificaciones no están destinadas a ser limitantes en ningún aspecto para el alcance de la invención, y que las reivindicaciones presentadas en la presente están destinadas a abarcar todas las modalidades y ej emplificaciones ya sea explícitamente o no presentadas aquí .

La solicitud de los Estados Unidos No. 12/247,738, titulada "Células Dendríticas Manipuladas por Ingeniería y Usos para Tratamiento del Cáncer", presentada el 8 de Octubre, 2008, es incorporada por referencia en la presente en su totalidad. La solicitud de los Estados Unidos no. 12/241,018, titulada "Construcciones de Cambio de Gen Terapéuticas Y Biorreactores Para la Expresión de Moléculas Bioterapéuticas Y Usos de los Mismos" presentada el 29 de September, 2008, es también incorporada por referencia en la presente en su totalidad.

EJEMPLO 1 Es emprendido un estudio para determinar la dosis de las células dendríticas y la citocina más efectiva que es capaz de inducir respuestas inmunitarias específicas del tumor, y la actividad antitumoral en un modelo de tumor de cáncer de células renales Renca.

Dos líneas de células tumorales son utilizadas en este estudio: Renca y Renca-HA. La última línea celular es elaborada mediante la transfección de células Renca con la hemaglutinina del virus de la influenza (HA) . La ventaja del modelo Renca-HA es la habilidad para rastrear las células T específicas del antígeno, ya que ambos epitopos derivados de HA específicos de CD8 y CD4 son conocidos y han sido utilizados .

Objetivo Específico - determinar la inducción de las respuestas inmunitarias específicas de HA después de la administración intratumoral de las células dendríticas.

El tumor Renca-HA es establecido subcutáneamente en ratones BALB/c. Cuando el tumor se vuelve palpable, las células dendríticas son inyectadas intratumoralmnte . La administración de células dendríticas va a ser repetida dos veces a intervalos de 7 días, para un total de 3 administraciones .

Se utilizan los siguientes grupos de ratones (cada Grupo incluye 3 ratones) : 1. Ratones no tratados; 2. Ratones tratados con 5xl05 células dendríticas transducidas con el plásmido control; 3. Ratones tratados con 106 células dendríticas transducidas con el plásmido control; 4. Ratones tratados con 5xl06 células dendríticas transducidas con plásmido control; 5. Lo mismo que los Grupos 2-4 utilizando células dendríticas transducidas con IL-12; 6. Lo mismo que los Grupos 2-4 utilizando células dendríticas transducidas con IL-15; y 7. Lo mismo que los Grupos 2-4 utilizando células dendríticas transducidas con IL-21.

Para probar el efecto de la combinación de las diferentes citocinas, los ratones son tratados simultáneamente con: 8. 5xl05 células dendríticas transducidas con IL-12, y 5xl05 células dendríticas transducidas con IL- 15, 9. 5xl05 células dendríticas transducidas con IL-12 y 5xl05 células dendríticas transducidas con IL-21, y 10. 5xl05 células dendríticas transducidas con IL-21 y 5xl05 células dendríticas transducidas con IL-21.

Cuatro días después de la administración, los nodulos linfáticos de los ratones que poseen tumores son recolectados, y las células son estimuladas ya sea. con el péptido equiparado a MHC clase I (para detectar las respuestas de células T CD8+) o el péptido equiparado a MHC clase II (para detectar las respuestas de células T CD4+) .

Se utilizan los siguientes ensayos: 1. ELISPOT IF -Y y IL-2; 2. proliferación de células T; 3. Detección de liberación de TNFa, IL-10, IL-4, y GM- CSF por células de nodulos linfáticos.

Además, es evaluada la actividad NK de las células de nodulo linfático, utilizando células YAC como objetivos.

En paralelo, las células son estimuladas con anticuerpos anti-CD3/CD28 para evaluar la respuesta no específica de células T.

La dosis más efectiva de las células dendríticas capaces de inducir respuestas inmunitarias específicas del antígeno, son determinadas.

Objetivo Específico 2 - evaluar la actividad antitumoral de las células dendríticas transducidas con genes de citocina. Únicamente aquellas células dendríticas transducidas con citocina que demostraron inducción estadísticamente significativa de las respuestas inmunitarias , son utilizadas en experimentos posteriores.

El tratamiento de ratones que poseen el tumor Renca-HA se realiza como se describe en el objetivo específico 1. Una dosis de DCs transducidas con citocinas que muestran actividad específica en experimentos previos, es utilizada. Como un control, se utilizan células dendríticas transducidas con adenovirus control. Para alcanzar la significancia estadística, cada grupo incluye 10 ratones.

El crecimiento tumoral es evaluado. El rumor Renca-HA contiene un epitopo inmunogénico que es útil para el monitoreo inmunitario y para la prueba inicial del efecto antitumoral. No obstante, para verificar la actividad antitumoral potencial del tratamiento, necesitan ser utilizadas las células tumorales no transíectadas . Por lo tanto, los experimentos descritos anteriormente son repetidos utilizando el modelo de tumor Renca. 1 EJEMPLO 2 Serán evaluados la seguridad, la tolerancia, la función del transgen, y los efectos inmunitarios de la o las inyecciones intratumorales de las células dendríticas autólogas, transducidas con adenovirus, manipuladas para expresar hIL-12, y uno o más de otros inmunomoduladores bajo el control del RTS, en sujetos con melanoma de etapa III y IV a través de procedimientos tales como aquellos descritos más adelante.

Un estudio que involucra los sujetos de estudio con melanoma de etapa III y IV será conducido en 4 grupos (Grupos) de sujetos, recibiendo cada sujeto una inyección intratumoral simple (dentro de un tumor de melanoma) de células dendríticas autólogas transducidas con adenovirus (reinsertadas dentro del mismo sujeto del que provinieron) (DCs) manipuladas por ingeniería para expresar interleucina-12 humana (hIL-12) , y uno o más de otros inmunomoduladores, a una dosis de 5 x 107 en combinación con dosis orales diarias del fármaco activador (ligando de activación) . El estudio utilizará inyecciones de células dendríticas transducidas ex vivo (después de que las células son retiradas de los sujetos) con el vector adenoviral para la expresión inducible de la IL-12 humana y uno o más de otros inmunomoduladores. La producción de IL-12 y uno o más de otros inmunomoduladores es "encendida" (inducida) a partir de las DCs inyectadas a través de la activación del RTS por la administración oral del fármaco activador (RG-115932) . La seguridad y la tolerancia serán evaluadas a través de exámenes físicos (incluyendo la condición de funcionamiento de ECOG) , mediciones de los signos vitales, química de suero, análisis urinario, hematología, eventos de "efectos colaterales", y anticuerpos y respuesta inmunitaria celular hacia los adenovirus, componentes de RTS, y el fármaco activador. Para evaluar el progreso, será medida una dosis simple y la farmacocinética en estado de reposo/ADME del fármaco activador oral, y sus metabolitos mayores, el análisis de los niveles de hIL-12, otros niveles de inmunomoduladores y la respuesta inmunitaria celular (células T) en biopsias de tumores objetivo, nodulos linfáticos de drenado, y circulación periférica, así como un perfil de citocina en suero .

Por ejemplo, 16 sujetos con melanoma en etapa III y IV son divididos en cuatro grupos con los grupos 1 y 2 que contienen tres sujetos, y los grupos 3 y 4 que contienen 5 sujetos. Todos los sujetos recibirán una inyección intratumoral simple de 5xl07 DC autólogas transducidas con el vector adenoviral que codifica para la IL-12 humana, y uno o más de otros inmunomoduladores bajo el control de RTS. Por ejemplo, los sujetos son administrados con una inyección intratumoral de DC autólogas transducidas con el vector adenoviral que codifica para la IL-12 humana bajo el control de RTS y un inmunomodulador tal como IL-15 o IL-21.

Los sujetos recibirán una dosis oral diaria simple del fármaco activador (grupo 1: 0.01 mg/kg, grupo 2: 0.1 mg/kg, grupo 3: 1.0 mg/kg o grupo 4: 3 mg/kg) comenzando la primera dosis aproximadamente 3 horas antes de la inyección de la DC en el día 1 y continuando por 13 días consecutivos más. La o las inyecciones adicionales de las células dendríticas autólogas, adenoviralmente transducidas, en combinación con 14 dosis orales diarias simples (una vez) de fármaco activado pueden ser administradas a los sujetos elegibles quienes cumplen los criterios para el retratamiento. La seguridad, la tolerancia, y la función de las células dendríticas son evaluadas para todos los sujetos en cada grupo por hasta un mes después de la inyección de las células dendríticas manipuladas in vitro, antes de enrolar a los sujetos para recibir la siguiente dosis más alta del fármaco activador. La evaluación de la seguridad continuará en todos lo sujetos por 3 meses después de la inyección inicial de las células dendríticas manipuladas por ingeniería, con la posibilidad de extender el periodo de seguimiento hasta un total de 6 meses para monitorizar la seguridad del sujeto si la toxicidad es observada o el sujeto recibe una o varias inyecciones adicionales de las células dendríticas .

Tal estudio demuestra la seguridad y la tolerancia de una o varias inyecciones intratumorales simple o múltiples de las células dendríticas autólogas, transducidas adenoviralmente, en combinación con un fármaco activador oral en sujetos con melanoma. El estudio proporciona farmacocinética en estado de reposo/ADME del fármaco activador oral. El estudio demuestra funcionalidad del RTS en sujeto por medición de la expresión de hIL-12 y la expresión de uno o más de otros inmunomoduladores de las células dendríticas autólogas transducidas adenoviralmente , en tumores objetivo y/o en nodulos linfáticos de drenado, en respuesta a la activación del RTS por la administración oral del fármaco activador. Además, el estudio demuestra los efectos inmunitarios de las células dendríticas autólogas, transducidas adenoviralmente, en términos de la respuesta inmunitaria celular en el tumor objetivo, los nodulos linfáticos de drenado, y la circulación periférica después de la administración oral del fármaco activador.

El melanoma es seleccionado como un cáncer ejemplar. El melanoma en particular entre los tumores sólidos, ha mostrado que responde a procedimientos de inmunoterapia , y los tumores de melanona son fácilmente accesibles para la inyección intratumoral y la biopsia. Los sujetos incluidos en el estudio tienen melanoma no extirpable de etapa III o IV, que tiene al menos 0.5 cm de diámetro, cualquier espesor de tumor, cualquier número de involucramiento de nodulos linfáticos, metástasis en tránsito, o metástasis distante.

' Preparación de Adenovirus que Albergan el Sistema Terapéutico RheoS itch, hIL-12 y Uno o Más de Otros Inmunomoduladores El ADN recombinante es transferido a células dendríticas (DC) mediante transducción del vector adenoviral ex vivo. El ADN recombinante es utilizado para expresar IL- 12(p70) humana y uno o más de otros inmunomoduladores provenientes de células dendríticas inmaduras, intratumoralmente inyectadas, que confieren supervivencia y estimulan la maduración de las DC en el ambiente tumoral, dando como resultado su migración subsiguiente a los nodulos linfáticos de drenado. Esto conduce a una desviación hacia diferenciación de las células T cooperadoras al tipo Thl, y también la activación de las células citotóxicas especificas del tumor, mediante aprestamiento cruzado con los antígenos' tumorales .

El ADN recombinante utilizado como el vector adenoviral recombinante, permite la expresión de la IL-12 humana y uno o más de otros inmunomoduladores bajo el control del sistema terapéutico RheoSwitch® (RTS) . El RTS comprende un mensaje bicistrónico expresado a partir del promotor de ubiquitina C humana, y codifica para dos proteínas de fusión: Gal4- EcR y VP16-RXR. Gal4-EcR es una fusión entre el domino de enlace al ADN (aminoácidos 1-147) de Gal4 de levadura y los dominios DEF del receptor de ecdisona proveniente del insecto Choristoneura fumiferana. En otra modalidad más, el RTS consiste de un mensaje bicistrónico expresado a partir del promotor de ubiquitina C humana, y codifica para dos proteínas de fusión: Gal4-EcR y VP16-RXR. GaM-EcR es una fusión entre el dominio de enlace al ADN (aminoácidos 1-147) de Gal4 de levadura y los dominio DEF del receptor de ecdisona provenientes del insecto Choristoneura fumiferana. VP16-RXR es una fusión entre el dominio de activación de la transcripción HSV-VP 16 y los dominios EF de un RXR quimérico derivado de secuencias de humano y de langosta. Estas secuencias Gal4-EcR y VP16-RXR están separadas por un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) del EMCV. Estas dos proteínas de fusión se dimerizan cuando Gal4-EcR se enlaza a un fármaco de molécula pequeña (RG-115932) y activa la transcripción de hIL-12 y uno o más de otros inmunomoduladores a partir de un promotor que responde a Gal4, que contiene seis sitios de enlace a Gal4 y un promotor mínimo sintético. La unidad de transcripción de RTS anteriormente descrita, es colocada con dirección 3' de la hIL-12 y uno o más otras unidades de transcripción de los inmunomoduladores . Este cásete RTS-ML12 - inmunomodulador completo, es incorporado dentro del genoma del adenovirus 5 en el sitio donde ha sido suprimida la región El. La cadena principal adenoviral también carece del gen E3. Un mapa para el vector adenoviral Ad-RTS-hIL-12 es mostrado en la FIG. 8 del documento US 2009/0123441 Al.

El vector adenoviral recombinante utilizado en este estudio contiene los siguientes elementos reguladores ejemplares, además de las secuencias de vector viral: el promotor de la ubiquitina C humana, el sitio de entrada al ribosoma interno, derivado de EMCV, un promotor inducible que contiene 6 copias del sitio de enlace a Gal4 , 3 copias de los sitios de enlace a SP-I, y una secuencia promotora mínima sintética, los sitios de poliadenilación SV40, y una secuencia de terminación de la transcripción derivada del gen de la alfa-globina humana. Se debe entender que otros elementos reguladores podrían ser utilizados como alternativas .

Un vector adenoviral recombinante ejemplar Ad-RTS-hIL-12-inmunomodulador (s) es producido de la siguiente manera. Las secuencias de codificación para las proteínas de fusión del receptor, VP16-RXR y GaW-EcR separadas por el EMCV-IRES (sitio de entrada al ribosoma, interno) , son insertadas dentro del vector lanzadera adenoviral bajo el control del promotor de ubiquitina C humana (promotor constitutivo). Subsecuentemente, las secuencias de codificación para las subunidades p40 y p35 de hIL-12, separadas por IRES, y uno o más de otros inmunomoduladores , se colocan bajo el control de un promotor inducible sintético que contiene seis copias del sitio de enlace a Gal4, se insertan con dirección 5' del promotor de ubiquitina C y la secuencias receptoras. El vector lanzadera contiene las secuencias de adenovirus serotipo 5 provenientes del extremo izquierdo para mapear la unidad 16 (mul6) , de la cual las secuencias El son suprimidas y reemplazadas por RTS, IL- 12 y una o más secuencias inmunomoduladoras (RTS-hIL-12) . El vector lanzadera que posee el RTS-hlL-12-immunodulador (s) es probado mediante transfección transitoria en células HT-1080 para IL-12 dependiente del fármaco activador, y otra expresión del o de los inmunomoduladores . El vector lanzadera es luego recombinado con la cadena principal adenoviral mediante cotransfección dentro de células HEK 293 para obtener adenovirus recombinantes Ad-RTS-hIL-12 -immunomodulador (es) . La cadena principal adenoviral contiene las supresiones de secuencia de mu 0 a 9.2 en el extremo izquierdo del genoma, y el gen E3. El vector lanzadera y la cadena principal adenoviral contiene la secuencia de traslape proveniente de mu 9.2 a mu 16 que permite la recombinación de ellos y la producción del vector adenoviral recombinante . Ya que el vector adenoviral recombinante es deficiente en las regiones El y E3, el virus es deficiente en replicación en células normales de mamífero. No obstante, el virus puede replicarse en células HEK 293 que albergan la región El del adenovirus 5, y por lo tanto proporcionan la función El en posición trans .

Un vector adenoviral recombinante ejemplar es producido de la siguiente manera: el vector lanzadera linealizado que posee los elementos de ADN para la expresión inducible de IL-12 y uno o más de otros inmunomoduladores , y la cadena principal adenoviral son cotransfectados dentro de las células HEK293. La recombinación entre las secuencias de traslape sobre el vector lanzadera y la cadena principal viral, da como resultado la producción de adenovirus recombinantes y es empaqueta en partículas virales en las células HEK293. Las células HEK293 son desarrolladas en DMEM que contiene suero fetal bovino.

El virus utilizado para el estudio propuesto fue purificado mediante centrifugación en gradiente de densidad de CsCl . El adenovirus recombinante sufre dos rondas de purificación en placa y la reserva de siembra resultante es utilizada para producir un banco viral maestro (MVB) mediante amplificación en células HEK293 a partir de un banco de cédulas maestras completamente caracterizado. El MVB sufre pruebas de liberación de cGMP/GLP intensivas que incluyen el adenovirus competente en replicación ( (RCA) , esterilidad, micoplasma, virus adventicios, retrovirus, virus humanos HIV1/2, HTLV1/2, HAV, HBV, HCV, EBV, B19, CMV, HHV-6, 7 y 8, virus bovino y porcino, secuenciamiento de vector completo y prueba funcional por expresión inducida por AD de IL-12, y uno o más de otros inmunomoduladores en las líneas celulares humanas .

El virus del MVB fue utilizado para la producción del virus purificado en una instalación de cGMP, y puede sufrir nuevamente pruebas de liberación que incluyen identidad, RCA, esterilidad, micoplasma, virus adventicios, proporción de partículas virales a unidades infecciosas, contaminación del ADN de célula hospedera, endotoxina y proteínas, y prueba funcional por expresión de IL-12 inducida por AD, y uno o más de otros inmunomoduladores en líneas celulares humanas.

Transducción de Células Dendríticas Autólogas por el Adenovirus que contiene el Transgen hIL-12 y Uno o Más de Otros Inmunomoduladores y Sistemas Terapéuticos RheoSwitch® (RTS) .

Las células dendríticas derivadas de los sujetos humanos son transducidas ex vivo e inyectadas en el tumor. Las DC serán caracterizadas antes de la transducción viral para la viabilidad, pureza (típicamente >80% de células que muestran el fenotipo (DC) , esterilidad, micoplasma y endotoxina. Después de la transducción viral, las células son lavadas repetidamente para eliminar cualesquiera virus no absorbidos. El sobrenadante proveniente del último lavado será probado para el contenido de virus residual por PCR. Ya que las DCs son transducidas ex vivo por el vector adenoviral (virus de no integración) y el lapso de vida de las DCs después de la inyección intratumoral y la migración subsiguiente hacia los nodulos linfáticos en drenado, es corta, no se espera que el ADN viral será incorporado dentro de cualquiera de las células no objetivo. El protocolo utilizado para la transducción adenoviral de las DCs se espera que produzca 80-90% de transducción y se considera muy eficiente .

Cosecha de PBMC por leucocitaferesis : Los sujetos sufren una leucocitaferesis estándar de 90 a 120 minutos en la Unidad de Aféresis de pacientes externos de UPCI . El procedimiento de leucocitaferesis involucra el retiro de sangre de una vena en un brazo; el paso de la sangre a través de una centrifuga (separador de células) , donde sus componentes son separados y uno o más componentes son removidos; y el retorno de los componentes remanentes a la vena del sujeto en el mismo o en el otro brazo. No más de 15% del volumen sanguíneo total del sujeto es retirado a cualquier tiempo ya que la sangre es procesada a través del dispositivo separador de células. En el separador de células, la sangre es separada en plasma, plaquetas, células blancas y células sanguíneas rojas. Las células sanguíneas blancas (WBC) son removidas y todos los otros componentes son devueltos a la circulación del sujeto. Cada intento es realizado para utilizar dos líneas IV periféricas para este procedimiento. Si eso no es posible, puede ser necesaria una línea central. El sujeto tiene que ser informado por el médico que sufre leucocitaferesis , y es rutinariamente seleccionado para los signos vitales (incluyendo la presión sanguínea) antes del procedimiento.

Procesamiento : Después de la recolección, el leucopaquete es distribuido manualmente al CPL, y es inmediatamente procesado mediante elutriación centrifuga en ELUTRATM. Este es un sistema cerrado validado para el uso clínico. La fracción de monocitos es recuperada, y después de que se establece la recuperación y la viabilidad de las células, estas son transferidas a un cartucho Astrom para el cultivo de 6 días en presencia de IL-4 y GM-CSF. Todos los procedimientos de procesamiento y lavado son realizados bajo condiciones estériles.

Siembra en Placa Inicial: Los leucocitos recuperados del leucopaquete simple son contados en presencia de colorante azul de tripan para determinar el número de células viables. Los monocitos son evaluados para la pureza por citometría de flujo. Los monocitos son resuspendidos de 5 a 10 x 106 células/ml en medio CellGenix libre de suero y libre de antibiótico, que contiene 1,000 Ul/ml de IL-4 y 1,000 Ul/ml de GM-CSF para SOP-CPL- 0166 , y colocados en un cartucho Aastrom. Un volumen de carga mínimo de 50 mi y un número mínimo de células son requeridos para la inoculación del cásete.

Cultivo: El cartucho Aastrom es colocado en la incubadora en el Sistema Replicell, un dispositivo de cultivo automatizado, compatible con cGMP, completamente cerrado, para la generación de DC inmaduras.

Cosecha de DC Inmaduras : En el día 6, el cartucho Aastrom es retirado de la incubadora y las DCs inmaduras son cosechadas. Las células son recuperadas mediante centrifugación a 1500 rpm, lavadas en el medio CellGenix, contadas en presencia de un colorante azul de tripan y verificadas para las características morfológicas y fenotípicas.

Viabilidad: Esta es determinada mediante la realización de las cuentas de células en hemocitometro en presencia de azul de tripan. En general, más del 95% de las células cosechadas son viables, por ejemplo, excluyen un colorante de azul de tripan. Si la viabilidad es menor de 70%, las DCs inmaduras serán desechadas.

Fenotip ficación : Las células generadas en cultivo son contadas mediante observación microscópica en un hemocitometro, y se obtiene una cuenta diferencial preliminar (DC vs . linfocitos) , utilizando el colorante de azul de tripan. La confirmación de la cuenta diferencial es realizada mediante citometría de flujo, comparando DC vs . linfocitos utilizando las propiedades de alta dispersión delantera y lateral de las DC inmaduras como el criterio para su identificación. Las DCs inmaduras rutinariamente contienen más de 80% de células con morfología de células dendríticas y tienen fenotipo DC.

Ensayo de Potencia de IL-12p7Q: Se ha establecido que las DCs maduras (mDCs) tienen la habilidad para producir IL-12p70 espontáneamente después de la activación con CD40L con o sin adición de señales de inmunidad innatas (por ejemplo LPS) . Un ensayo de producción de IL-12p70 estandarizado fue recientemente establecido y es aplicable a muestras pequeñas o lotes grandes de vacunas de DC generadas bajo una variedad de condiciones. El ensayo de potencia actual consiste de dos pasos distintos, el primero que involucra la coincubación de las DCs respondedoras con células de linfoma J588 establemente transfectadas con el gen del ligando CD40 humano como estimuladores. El segundo paso involucra la prueba de los sobrenadantes provenientes de estos co-cultivos para los niveles de IL-12p70 secretados por las DCs estimuladas con J558/CD40L +/-LPS en el sistema Luminex. El ensayo de potencia tiene un CV inter-ensayo de 18.5% (n=30) y un intervalo dinámico amplio, que facilita la evaluación de diversos productos de DC caracterizados por niveles muy diferentes de producción de IL-12p70. El intervalo normal para el ensayo establecido utilizando los productos de DC generados de los monocitos de 13 donadores normales fue de 8-999 pg/ml, con una media de 270 pg/ml.

Criterios de Producción y Liberación para Células Dendríticas Cada lote de las células dendríticas generadas in vivo es probado para la presencia de contaminantes microbianos (bacterias aeróbicas y anaeróbicas, hongos y micoplasma) , así como endotoxina y son funcionalmente caracterizadas. Todas las células dendríticas que van a ser inyectadas dentro de los sujetos serán frescas y no sufrirán criopreservación.

Prueba de Aseguramiento de Calidad de PC; Las DC generadas como se describe anteriormente son evaluadas para la esterilidad, viabilidad, pureza, potencia y estabilidad. Los criterios para la liberación de producto celular son establecidos y rigurosamente seguidos.

Viabilidad : Las células generadas en cultivo son contadas mediante observación microscópica sobre un hemocitómetro, y se obtiene una cuenta diferencial (DC vs . linfocitos) utilizando un colorante de azul de tripan. Esta cuenta proporciona el porcentaje de células viables en el cultivo probado. Más del 70% de viabilidad celular por exclusión de azul de tripan y un mínimo de 70% de células que expresan HLA-D y CD86 como los marcadores de DC derivados de monocitos, son requeridas para pasar los criterios de liberación. Marcadores adicionales pueden ser incluidos para el análisis exploratorio tal como CD83 y CCR7 para evaluar el estado de maduración de DC, y CD3 y CD19 para evaluar la contaminación de los linfocitos.

Pureza : El análisis de citometría de flujo de dos colores de las células teñidas con los mAbs conjugados a FITC y PE, se utiliza para determinar que la población de DC identificada morfológicamente, exprese los antígenos de superficie definidos por DC y carezca de los antígenos de línea de monocitos y de células T y B. Para la preparación de vacunas, las DC generadas deben expresar HLA-DR y CD86 y no deben expresar CD3 , CD19, o CD14. Para se consideradas como mDC, las células deben expresar CD83+ y CCR7+ .

Potencia : Para definir una medida de potencia para las DC, se determinó su habilidad para producir IL-12p70 como se describe anteriormente.

Esterilidad : Las DC son probadas por cultivos bacterianos (aeróbicos y anaeróbicos) y fúngicos utilizando el sistema BD Bactec (Becton Dickinson Co . , Sparks, MD) en el Laboratorio de Microbiología del Centro Médico de la Universidad de Pittsburg. Los resultados finales de los cultivos microbianos están disponibles en 14 días. Antes de la liberación de las DC para uso en vacunas, una tinción gram es realizada y debe ser negativa para la presencia de microorganismos .

Las pruebas de IMCPL para micoplasma se realizan mediante el uso del Sistema de detección Rápida de Cultivo de Tejidos de Micoplasma (Gen-Probe, Inc. San Diego, CA) , que está basado en la tecnología de hibridación de ácido nucleico. La prueba de endotoxina es realizada utilizando el ensayo de Limulus Amoebocyte Lysate Pyrogen Plus (Bio Whittaker, Inc., Walkerville, MD) . La prueba de endotoxina es realizada sobre el cultivo celular al tiempo de la cosecha y antes de la liberación del producto final. El nivel de endotoxina aceptable es <5EU/kg de peso corporal. Las células dendríticas no transducidas y transducidas serán criopreservadas para el análisis futuro.

Se espera que todas las células transducidas expresarán el transgen. Se espera que más del 80% de las DCs serán transducidas. El producto será biológicamente activo ya que la secuencia de codificación activas es mantenida en el transgen. Las DCs transducidas viralmente, inyectadas dentro del tumor son de fenotipo DC inmaduro y no expresan IL-12 y uno o más de otros inmunomoduladores hasta que está sufra maduración, y por lo tanto en esta etapa, la expresión de IL-12 y uno o más de otros moduladores es principalmente proveniente del transgen. Ya que la expresión de la IL-12 y uno o más de otros transgenes inmunomoduladores es inducida por el fármaco activador de molécula pequeña RG-115932 de una manera dependiente de la dosis, se puede controlar el nivel de expresión del transgen en las DCs transducidas, a los niveles deseados. Una pequeña porción de las DCs transducidas preparadas para la administración a sujetos humanos puede ser probada in vitro para la inducción dependiente del fármaco activador, de la expresión de IL-12 y uno o más de otros inmunomoduladores . La expresión de IL- 12 y uno o más de otros inmunomoduladores puede ser evaluada mediante ELISA con una sensibilidad de 4 ng/ml .

Se espera que la inducción in vitro e IL-12 y uno o más de otros inmunomoduladores provenientes de las células transducidas por el vector utilizado en el estudio propuesto, produzca aproximadamente 500 ng de IL-12 y uno o más de otros inmunomoduladores por 106 células en 24 horas, determinado mediante Elisa. En estudios preclínicos utilizando el modelo de ratón de melanoma, inyección intratumoral de 106 o más DCs transducidas muestran eficacia. No obstante, se espera que la inyección intratumoral requerida pueda mostrar eficacia a niveles por debajo de esta cantidad, y por lo tanto pueden ser utilizadas inyecciones de 5xl07 DCs transducidas como un punto inicial para determinar si se requieren cantidades menores o mayores .

Por ejemplo, in vitro, las líneas celulares humanas y de ratón y las células primarias transducidas con el vector adenoviral recombinante que posee los genes para IL-12 y uno o más de otros inmunomoduladores, muestran inducción de la expresión de IL-12 en respuesta al fármaco activador de una manera dependiente de la dosis. 6.3 Formulación del Fármaco Activador El fármaco activador utilizado en la presente es formulado en cualquiera de las siguientes formulaciones: (1) 100% Labrasol; (2) Labrasol saborizado con Listerine (Latitude Pharmaceuticals Inc., USA) que comprende (a) mentol, (b) timol, (c) eucaliptol, (d) aspartame, (e) sacarina sódica, (f) ácido cítrico, (g) sabor menta, (h) sabor crema, (i) labrasol ; (3) Mygliol 812 y fosfolipón 90G (Latitude Pharmaceuticals Inc . , USA) ; o (4) Mygliol 812, fosfolipón 90G y succinato de tocoferil-polietilenglicol Vitamina E (Latitude Pharmaceuticals Inc., USA) .

Distribución Mientras que una variedad de concentraciones y protocolos específicos pueden ser imaginados, un ejemplo para tratar pacientes podría incluir pacientes que reciben una o varias inyecciones int atumorales de las células dendríticas autólogas transducidas (AdDCs) a una concentración de 5 x 107 suspendidas en solución salina estéril, manipuladas para expresar hIL-12 ( interleucina humana 12) y uno o más de otros inmunomoduladores bajo el control del RTS , en combinación con el fármaco activador oral (RG-115932) .

Tratamiento Inicial .

Día 1 Visita de Paciente interno: En el día 1, se realiza un examen físico de línea base (incluyendo signos vitales, peso y condición ECOG) . Se recolecta orina y se extrae sangre para la química de suero de línea base, análisis urinario y hematología (perfil de seguridad) . Aproximadamente 3 horas antes de la inyección intratumoral de las células dendríticas manipuladas in vitro, cada sujeto es dosificado con un fármaco activador (grupo 1 - 0.01 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1.0 mg/kg, y 3 mg/kg) inmediatamente después de una comida. Se extrae sangre a los intervalos de tiempo especificado (predosis, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 16, y 24 horas después de la dosis AD) en el día 1 para la evaluación de la farmacocinética de dosis simple del fármaco activador y sus metabolitos mayores. Cada sujeto recibe una inyección intatumoral simple de las células dendríticas autólogas transducidas , adenovirales , a una concentración de 5 x 107 células, manipuladas para expresar hIL-12 y uno o más de otros inmunomoduladores bajo el control de RTS . Los sujetos son cuidadosamente monitorizados para las reacciones en el sitio de inyección local y/o las reacciones de hipersensibilidad. Día 2 al día 14 de la Vista del Paciente interno: Los días 2 al 14, cada sujeto es dosificado con el fármaco activador inmediatamente después de una comida. Los signos vitales y los eventos adversos son recolectados diariamente en los días 2 al 14. En el día 4 ± 24 horas, son retiradas biopsias del tumor y/o del drenado de los nodulos linfáticos de aproximadamente 50% de los sujetos para la medición de hIL-12 y la respuesta inmunitaria celular. En el día 8 se mide el peso. En el día 8 ± 24 se retiran biopsias del tumor y/o del drenado de los nodulos linfáticos, de los sujetos quienes no tuvieron una biopsia realizada el día 4 para la medición de hIL-12, y uno o más de otros inmunomoduladores y la respuesta inmunitaria celular. Se extrae sangre en el día 4 + 24 horas y en el día 8 + 24 para la evaluación de los anticuerpos potenciales y de la respuesta inmunitaria celular contra el adenovirus y/o los componentes de RTS . Un perfil de citocina en suero es también obtenido para determinar si la expresión de otras citocinas es afectada por el tratamiento con hIL-12 y uno o más de otros transgenes inmunomoduladores. En el día 8, se recolecta orina y se extrae sangre para la química sérica de línea base, análisis de orina, y hematología (perfil de seguridad) . En el día 8, se extrae sangre a los intervalos de tiempo especificados (predosis, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16, y 24 horas después de la dosis AD) para la evaluación de la farmacocinética/ADME en estado _ de reposo del fármaco activador y sus metabolitos mayores.

Visita del Paciente interno en el día 14 : En el día 14, cada sujeto es dosificado con el Fármaco Activador inmediatamente después de una comida. Cada sujeto recibe un examen físico (incluyendo los signos vitales, altura, peso y condición ECOG) . Se recolecta orina y se extrae sangre para la química de suero, análisis de orina, y hematología (perfil de seguridad) . Se extrae sangre en el día 14 ± 24 horas para la evaluación de los anticuerpos potenciales y la respuesta inmunitaria celular contra el adenovirus y/o los componentes RTS. Un perfil de citocina en suero es también obtenido para determinar si la expresión de otras citocinas es afectada.

Se recolecta sangre de los sujetos en las visitas especificadas de los pacientes internos y de los pacientes externos para medir anticuerpos potenciales y la respuesta inmunitaria celular al adenovirus y los componentes de RTS. Se obtiene sangre para un perfil de citocina sérica de línea base. El ensayo tipo bloqueo de infectividad de AdVeGFP es utilizado para detectar una respuesta de anticuerpo al vector adenoviral (Gambotto, Robins et al. 2004). La respuesta del anticuerpo a los componentes de RTS será evaluada mediante análisis de Western blot y/o ELISA utilizando el suero proveniente del paciente y las proteínas RTS producidas de un vector de expresión. Además, la prueba de citocina compleja será realizada en el suero mediante Luminex para IL- 12, IFN-gamma, IP-IO, y otras citocinas Thl/Th2 tales como IL-2, TNF-alpha, IL-4, IL-5, y IL-10. Estos ensayos de anticuerpo y citocina necesitarán aproximadamente 10 mi de sangre.

Anticuerpo Potencial y Respuesta Inmunitaria Celular al Adenovirus y/o Componentes del RTS : Será recolectada sangre de los sujetos en las visitas especificadas de pacientes internos y pacientes externos para evaluar la respuesta inmunitaria celular y la respuesta de anticuerpo potencial al adenovirus y a los componentes del RTS y los antígenos tumorales . El ensayo tipo bloqueo de infectividad de AdVeGFP será utilizado para detectar una respuesta de anticuerpo al vector adenoviral (Nwanegbo, et al. 2004) . La respuesta del anticuerpo a los componentes de RTS será evaluada mediante análisis de Western blot y/o ELISA utilizando suero proveniente de los sujetos y las proteínas de RTS producidas por un vector de expresión. Además, la prueba de citocina multiplex será realizada en el suero mediante Luminex para IL-12, IFN-gamma, IP-10, y otras citocinas Thl/Th2 tales como IL-2, TNFa, IL-4, IL-5 y IL-10. Estos ensayos de anticuerpo y citocina necesitarán aproximadamente 10 mi de sangre.

Los ensayos de la respuesta inmunitaria celular utilizan aproximadamente 50-60 mi de sangre y los subgrupos de células CD4 y CD8 serán separados de ésta. Las células T separadas serán mezcladas con DCs análogas transducidas con el vector AdV vacío, AdV-RTS, o los vectores inmunomoduladores de AdV-RTS-hIL12 - en un ensayo de ELISPOT para la producción de IFN-gamma por las células T activadas por antígenos derivados de AdV y de RTS, si los hay. Serán realizados ensayos similares utilizando las células tumorales como tales y/o DCs que expresan antígenos de melanoma compartidos, para evaluar la respuesta inmunitaria temprana al tumor. Los ensayos adicionales pueden ser también realizados como sea necesario.

PRUEBA DE EMBARAZO: A mujeres con el potencial para estar embarazadas se les aplica la prueba de embarazo en orina en la visita de selección y antes de la primera visita de pacientes internos de la fase de retratamiento. La prueba es realizada al menos 72, 48, 24, o 12 horas antes de la administración del Fármaco Activador durante el tratamiento inicial y todos los periodos de retratamiento. Si la prueba de embarazo en orina es positiva, entonces la confirmación será obtenida con una prueba de embarazo en suero. Si se confirma el embarazo, al sujeto no se le permitirá entrar a la prueba o continuar en la fase de retratamiento. La prueba de embarazo puede ser nuevamente realizada tantas veces como sea necesario.

PREGUNTAS DE MEDICAMENTOS CONCOMITANTES: En la selección, y antes de la primera visita de los pacientes internos de la fase de retratamiento, a cada sujeto se le pide que proporcione una lista de medicamentos concurrentes para determinar cualquier relación posible a los eventos adversos que ocurren durante la fase de prueba y de seguimiento .

CRITERIOS DE RETRATAMIENTO : Si un sujeto ha tolerado la inoculación de AdDC previa sin reacciones adversas que sean limitantes, y no ha mostrado progresión de la enfermedad o declinación sintomática al tiempo del retratamiento potencial, estos serán considerados para el retratamiento. Si en la opinión del investigador principal, y del médico que trata, existe un beneficio clínico potencial para una o varias inyecciones intratumorales de AdDCs en combinación con el fármaco activador (dosis máxima tolerada del grupo 1) por 14 días consecutivos, el retratamiento será ofrecido al sujeto, con la condición de que se cumplan los siguientes criterios : 1. No deben de existir toxicidades limitantes; 2. La enfermedad del sujeto es estable o muestra signos clínicos o subjetivos de mejoramiento, y 3. No existe evidencia de respuesta inmunitaria celular o de anticuerpo a los componentes adenovirales del Sistema Terapéutico RheoSwitch®.

EVALUACION DE LA FUNCION DEL TRANSGEN Y EFECTOS INMUNITARIOS : Biopsias por punción o extirpación del tumor y el drenado de nodulos linfáticos asociados, serán recolectados durante la selección (día -12 a día -7), día 4, día 8 y día 14 de la prueba y al mes 1 del seguimiento (ver Tabla 3-5) para la evaluación in vivo de la expresión del transgen de la expresión de hIL-12 y uno o más de otros inmunomoduladores , y la respuesta inmunitaria celular. Las biopsias por aspiración con aguja fina del tumor y los nodulos linfáticos de drenado asociados, serán recolectadas en el día -12 al -7 y en el día 14 del periodo de tratamiento para la evaluación in vivo de la expresión del transgen de hIL-12, y uno o más de otros inmunomoduladores, y la respuesta inmunitaria celular. Las biopsias serán evaluadas mediante microscopía de luz estándar e inmunohistoquímica para evaluar la infiltración celular de las células T dentro del tumor y los nodulos linfáticos de drenado. Las secciones de biopsias serán leídas por un patólogo no enterado de los antecedentes del sujeto de estudio. Para distinguir entre la expresión de IL-12 endógena e inducida por DCs en el tumor y los nodulos linfáticos de drenado, se utilizarán RT-PCR sobre AR con los cebadores apropiadamente diseñados. Se extraerá sangre para un perfil de citocina en suero en la selección, en el día 4, en el día 8 y en el día 14 de la prueba, al mes 1 del seguimiento y en el día -12 al -7, el día 8 y el día 14 del periodo de retratamiento (ver Tablas 3-5) . Un perfil de citocina en suero será obtenido para determinar si la expresión de las otras citocinas es afectada por el tratamiento con el transgen hIL-12. La prueba de citocina Multiplex será realizada en el suero por Luminex para IL-12, IFN-gamma, IP-10, y otras citocinas Thl/Th2 tales como IL-2, TNFa, IL-4, IL-5 y IL-10. Estos ensayos de anticuerpo y citocina necesitarán aproximadamente 10 mi de sangre.

DOSIS SIMPLE Y FARMACOCINETICA EN ESTADO DE REPOSO DEL FARMACO ACTIVADOR: Será extraída sangre a los intervalos de tiempo especificados (predosis, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 16, y 24 horas después de la dosis matutina) en el día 1 de la prueba para la evaluación de la farmacocinética de dosis simple y en el día 8 de la prueba para la medición de la farmacocinética en estado de reposo/ADME del fármaco activador, y sus metabolitos mayores. El plasma será evaluado mediante HPLC para obtener los siguientes puntos finales farmacocinéticos en estado de reposo del fármaco activador y los metabolitos mayores: Cmax (concentración plasmática máxima observada) , Tmax (tiempo hasta la concentración plasmática máxima observada) , Ctrough (concentración plasmática observada mínima computada como el promedio de las concentraciones a las 0 y 24 horas) , C24h (concentración plasmática a las 24 horas) , AUC24h (área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo del tiempo 0 hasta las 24 horas) , Ke (velocidad de eliminación aparente) , y T112 (vida media aparente) .

Se debe entender que las modalidades anteriormente descritas y las ejemplificaciones no están destinadas a ser limitantes en ningún aspecto hacia el alcance de la invención, y que el alcance de las reivindicaciones presentadas en la presente están destinadas a abarcar todas las modalidades y ej emplificaciones , ya sea explícitamente o no presentadas en la presente.

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Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un vector para expresar condicionalmente una o varias proteínas que tienen la o las funciones de uno o más inmunomoduladores que comprenden un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, caracterizado porque el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción que está operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, y (2) un polinucleótido que codifica para una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador operablemente enlazado a un promotor que es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando, en donde uno o más inmunomoduladores se seleccionan de IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R DN o una subunidad de los mismos, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-alfa, IFN-gamma, IFN-alfa 1, IFN-alfa 2, IL-15-R-alfa, CCL3 (MIP-Ia) , CCL5 (RA TES) , CCL7 (MCP3) , XCL1 (linfotactina) , CXCLl (MGSA-alfa) , CCR7 , CCL 19 (MIP-3b) , CXCL9 (MIG) , CXCLlO (IP-10), CXCL 12 (SDF-1), CCL21 (6Ckine) , OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-Defensina, HMGBl , Flt3L, IFN-beta, TNF-alfa, dnFADD, BCG, TGF-alfa, PD-L1 ARNi , un oligonucleótido antisentido PD-L1, TGFbRII DN, ICOS-L y S100.

2. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un vector adenoviral .

3. El vector de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de IL-12.

4. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para una o más proteínas que tienen las funciones de inmunomoduladores y el polinucleótido que codifica para una o más proteínas que tienen la función de IL-12, están bajo el control de un promotor regulado del cambio de gen.

5. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cambio de gen es un cambio de gen basado en el receptor de ecdisona (EcR) .

6. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para un cambio de gen comprende una primera secuencia del factor de transcripción bajo el control de un primer promotor, y una segunda secuencia del factor de transcripción bajo el control del segundo promotor, en donde las proteínas codificadas por la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor transcripción interactúan para formar un complejo proteico que funciona como un factor de transcripción dependiente del ligando.

7. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para una o más proteínas que tienen las funciones de inmunomodulador, codifica para el o los inmunomoduladores humanos .

8. El vector de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de IL-12, codifica para la IL-12 humana.

9. Un método para producir una población de células inmunitarias o células de soporte de terapia (TSC) que expresan una o varias proteínas que tienen la función de uno o más inmunomoduladores , caracterizado porque comprende modificar las células inmunitarias con un vector recombinante que expresa condicionalmente una o varias proteínas que tienen la o las funciones de uno o más inmunomoduladores, en donde el vector comprende un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, y (2) un polinucleótido que codifica para una o más proteínas que tienen la función del inmuno-modulador enlazado a un promotor que es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando, en donde uno o más inmunomoduladores se seleccionan de IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R DN o una subunidad de los mismos, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-alfa, IFN-gamma, IFN-alfa 1, IFN-alfa 2, IL-15-R-alfa, CCL3 (MIP-Ia) , CCL5 (RA TES) , CCL7 (MCP3), XCLl ( linfotactina) , CXCLl (MGSA-alfa) , CCR7 , CCL 19 (MIP-3b) , CXCL9 (MIG) , CXCL10 (IP-10), CXCL 12 (SDF-1) , CCL21 (6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-Defensina, HMGBl , Flt3L, IFN-beta, TNF-alfa, dnFADD, BCG, TGF-alfa, PD-L1 AR i, un oligonucleótido antisentido PD-Ll, TGFbRII DN, ICOS-L y S100.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque es un vector adenoviral.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el vector comprende además un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de IL-12.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de inmunomodulador y el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de IL-12, están bajo el control de cambio de gen.

13. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el cambio de gen es un cambio de gen basado en EcR.

14. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para un cambio de gen comprende una primera secuencia del factor de transcripción bajo el control de un primer promotor, y una segunda secuencia del factor de transcripción bajo el control del segundo promotor, en donde las proteínas codificadas por la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor transcripción interactúan para formar un complejo proteico que funciona como un factor de transcripción dependiente del ligando.

15. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de inmunomodulador, codifica para el inmunomodulador humano.

16. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de IL-12, codifica para la IL-12 humana.

17. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las células son células dendríticas humanas .

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque las células dendríticas son células dendríticas de médula ósea.

19. Una población de células inmunitarias o TSC que expresan una o varias proteínas que tienen la función de uno o más inmunomoduladores , que han sido modificadas con un vector recombinante que expresa condicionalmente una o varias proteínas que; tienen la o las funciones de uno o más inmunomoduladores, caracterizada porque el vector comprende un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción que está operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, y (2) un polinucleótido que codifica para una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador enlazado a un promotor que es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando, en donde uno o más inmunomoduladores se seleccionan de IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R DN o una subunidad de los mismos, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-alfa, IFN-gamma, IFN-alfa 1, IFN-alfa 2, IL-15-R-alfa, CCL3 (MIP-la) , CCL5 (RANTES) , CCL7 (MCP3) , XCL1 (linfotactina) , CXCL1 (MGSA-alfa) , CCR7 , CCL 19 (MIP-3b) , CXCL9 (MIG) , CXCL10 (IP-10), CXCL 12 (SDF-1) , CCL21 (6Ckine) , OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-Defensina, HMGBl, Flt3L, IFN-beta, TNF-alfa, dnFADD, BCG, TGF-alfa, PD-L1 ARNi, un oligonucleótido antisentido PD-L1, TGFbRII DN, ICOS-L y S100.

20. La población de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque es un vector adenoviral.

21. La población de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el vector comprende además un polinucleotido que codifica para una proteína que tiene la función de IL-12.

22. La población de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el polinucleotido que codifica para la proteína que tiene la función de inmunomodulador y el polinucleotido que codifica para la proteína que tiene la función de IL-12, están bajo el control de cambio de gen.

23. La población de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el cambio de gen es un cambio de gen basado en EcR.

24. La población de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el polinucleotido que codifica para un cambio de gen comprende una primera secuencia del factor de transcripción bajo el control de un primer promotor, y una segunda secuencia del factor de transcripción bajo el control del segundo promotor, en donde las proteínas codificadas por la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor transcripción interactúan para formar un complejo proteico que funciona como un factor de transcripción dependiente del ligando .

25. La población de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de inmunomodulador, codifica para el inmunomodulador humano.

26. La población de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de IL-12, codifica para la IL-12 humana.

27. La población de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque las células son células dendríticas humanas.

28. La población de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque las células dendríticas son células dendríticas de médula ósea.

29. Una célula inmunitaria o una TSC manipulada in vitro, caracterizada porque comprende un vector que incluye un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido que codifica para un cambio de gen, comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, operablemente enlazado a un promotor, y (2) un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de un inmunomodulador enlazado a un promotor que es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando, en donde el inmunomodulador se selecciona de IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R DN o una subunidad de los mismos, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-alfa, IFN-gamma, IFN-alfa 1, IFN-alfa 2, IL-15-R-alfa, CCL3 (MIP-la) , CCL5 (RANTES) , CCL7 (MCP3) , XCL1 (linfotactina) , CXCL1 (MGSA-alfa) , CCR7 , CCL 19 (MIP-3b) , CXCL9 (MIG) , CXCL10 (IP-10), CXCL 12 (SDF-1), CCL21 (6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-Defensina, HMGBl , Flt3L, IFN-beta, TNF-alfa, dnFADD, BCG, TGF-alfa, PD-L1 AR i , un oligonucleótido antisentido PD-L1, TGFbRII DN, ICOS-L y S100.

30. La célula inmunitaria manipulada in vitro de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el vector es un vector adenoviral.

31. La célula inmunitaria manipulada in vitro de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el vector comprende además un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de IL-12.

32. La célula inmunitaria manipulada in vitro de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de inmunomodulador y el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de IL-12, están bajo el control de cambio de gen.

33. La célula inmunitaria manipulada in vitro de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el cambio de gen es un cambio de gen basado en EcR.

34. La célula inmunitaria manipulada in vitro de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el polinucleótido que codifica para un cambio de gen comprende una primera x secuencia del factor de transcripción bajo el control de un primer promotor, y una segunda secuencia del factor de transcripción bajo el control del segundo promotor, en donde las proteínas codificadas por la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor transcripción interactúan para formar un complejo proteico que funciona como un factor de transcripción dependiente del ligando .

35. La célula inmunitaria manipulada in vitro de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de inmunomodulador, codifica para el inmunomodulador humano .

36. La célula inmunitaria manipulada in vitro de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de IL-12, codifica para la IL-12 humana.

37. La célula inmunitaria manipulada in vitro de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la célula inmunitaria es una célula dendrítica humana.

38. La célula inmunitaria manipulada in vitro de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la célula dendrítica es una célula dendrítica de médula ósea.

39. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la población de células inmunitarias o TSC manipuladas in vitro, de conformidad con la reivindicación 19.

40. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende las células inmunitarias o TSC manipuladas in Vitro, de conformidad con la reivindicación 29.

41. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39 o 40, caracterizada porque la composición farmacéutica es adecuada para la administración intratumoral , intraperitoneal o subcutánea.

42. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación '39, caracterizada porque la población de células comprende al menos 104 células.

43. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la población de células comprende al menos 107 células.

44. Un método para tratar un tumor en un mamífero, caracterizado porque comprende: (a) administrar intratumoralmente a los microambientes tumorales, una población de una célula inmunitaria o TSC, que es manipulada in vitro para expresar condicionalmente una o más proteínas que tienen las funciones de un inmunimodulador ; y (b) administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más ligandos de activación; con lo cual se induce la expresión de una o más proteínas que tienen las funciones de inmunomodulador y se trata el tumor, en donde el inmunomodulador se selecciona de IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R DN o una subunidad de los mismos, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, G -CSF, IFN-alfa, IFN-gamma, IFN-alfa 1, IFN-alfa 2, IL-15-R-alfa, CCL3 (MIP-la), CCL5 (RANTES) , CCL7 (MCP3), XCLl (linfotactina) , CXCL1 (MGSA-alfa) , CCR7 , CCL 19 (MIP-3b) , CXCL9 (MIG) , CXCL10 (IP-10), CXCL 12 (SDF-1) , CCL21 (6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-Defensina, HMGBl, Flt3L, IFN-beta, TNF-alfa, dnFADD, BCG, TGF-alfa, PD-L1 ARNi, un oligonucleótido antisentido PD-L1, TGFbRII DN, ICOS-L y S100.

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el tumor es un tumor benigno.

46. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el tumor es un tumor maligno.

47. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el tumor es un melanoma.

48. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el tumor es un cáncer de piel de melanoma maligno.

49. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque las células inmunitarias manipuladas in vitro comprenden un vector que comprende un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción que está operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, y (2) un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función del inmunomodulador enlazado a un promotor que es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando.

50. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el vector es un vector adenoviral.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el vector comprende además un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de IL-12.

52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de inmunomodulador y el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de IL-12, están bajo el control de cambio de gen.

53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el cambio de gen es un cambio de gen basado en EcR.

54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para un cambio de gen comprende una primera secuencia del factor de transcripción bajo el control de un primer promotor, y una segunda secuencia del factor de transcripción bajo el control del segundo promotor, en donde las proteínas codificadas por la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor transcripción interactúan para formar un complejo proteico que funciona como un factor de transcripción dependiente del ligando.

55. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de inmunomodulador, codifica para el inmunomodulador humano.

56. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de IL-12, codifica para la IL-12 humana.

57. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque las células inmunitarias son células dendríticas humanas .

58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque las células dendríticas son células dendríticas de médula ósea.

59. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el ligando es una diacilhidrazina .

60. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el ligando se selecciona de RG-115819, RG-115932, y RG-115830.

61. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el ligando es una amidocetona u oxadiazolina .

62. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el ligando se administra menos de una hora antes o después de las células inmunitarias manipuladas in vitro.

63. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el ligando se administra menos de 24 horas después de las células inmunitarias manipuladas in vitro.

64. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el ligando se administra menos de 48 horas después de las células inmunitarias manipuladas in vitro.

65. Un método para determinar la eficacia de un régimen terapéutico basado en células inmunitarias manipuladas in vitro, en un paciente, caracterizado porque comprende : (a) medir el nivel de expresión o el nivel de actividad del interferón gamma (IFN-?) en una primer muestra biológica obtenida del paciente en necesidad del mismo, antes de la administración de células inmunitarias manipuladas in vitro, con lo cual se genera un nivel de control; (b) administrarle a un paciente en necesidad de las mismas, las células inmunitarias manipuladas in vitro, manipuladas para expresar condicionalmente una o más proteínas que tienen las funciones de un inmunomodulador y opcionalmente una proteína que tiene la función de IL-12; (c) administrarle al paciente que tiene necesidad de la misma, una cantidad efectiva de un ligando de activación; (d) medir el nivel de expresión o el nivel de actividad de IFN-? en una segunda muestra biológica obtenida del paciente en necesidad de la misma, después de la administración de células inmunitarias manipuladas in vitro y el ligando de activación, con lo cual se genera un nivel de prueba; y (e) comparar el nivel control al nivel de prueba de IFN-?, en donde un incremento en el nivel de prueba de la expresión, la actividad, o ambas de IFN-y con relación al nivel control, indica que el régimen terapéutico es efectivo en el paciente en necesidad del mismo, en donde el modulador se selecciona de IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R DN o una subunidad de los mismos, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-alfa, IFN-gamma, IFN-alfa 1, IFN-alfa 2, IL-15-R-alfa, CCL3 (MIP-la) , CCL5 (RANTES) , CCL7 (MCP3 ) , XCL1 ( linfotactina) , CXCL1 (MGSA-alfa) , CCR7 , CCL 19 (MIP-3b) , CXCL9 (MIG) , CXCL10 (IP-10), CXCL 12 (SDF-1) , CCL21 (6Ckine) , OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-Defensina, HMGBl, Flt3L, IFN-beta, TNF-alfa, dnFADD, BCG, TGF-alfa, PD-L1 AR i, un oligonucleótido antisentido PD-Ll, TGFbRII DN, ICOS-L y S100.

66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el paciente en necesidad del mismo es un paciente humano.

67. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el paciente es un paciente con cáncer.

68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el paciente con cáncer es un paciente con melanoma.

69. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el nivel de IFN-? es medido mediante ELISA.

70. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque las células inmunitarias son manipuladas in vitro para expresar condicionalmente una o más proteínas que tienen las funciones de un inmunomodulador y opcionalmente la proteína que tiene la función IL-12, y comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica para un cambio de gen, en donde el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción que está operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, y (2) un polinucleótido que codifica para una o más proteínas que tienen la función del inmunomodulador y, opcionalmente la IL-12 enlazada a un promotor que es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando

71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el vector es un vector adenoviral.

72. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el cambio de gen es un cambio de gen basado en Ec .

73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el ligando se enlaza al dominio de enlace al ligando de EcR.

74. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el ligando es una diacilhidrazina .

75. El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el ligando se selecciona de RG-115819, RG-115932, y RG-115830.

76. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el ligando es una amidocetona u oxadiazolina .

77. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para un cambio de gen comprende una primera secuencia del factor de transcripción bajo el control de un primer promotor, y una segunda secuencia del factor de transcripción bajo el control del segundo promotor, en donde las proteínas codificadas por la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor transcripción interactúan para formar un complejo proteico que funciona como un factor de transcripción dependiente del ligando.

78. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para la proteína que tiene la función de IL-12, codifica para la IL-12 humana.

79. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque las células inmunitarias son células dendríticas humanas.

80. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque las células dendríticas son células dendríticas de médula ósea.

81. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el ligando de activación es administrado intratumoralmente , oralmente, intraperitonealmente o subcutáneamente.

82. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el ligando de activación es administrado en menos de una hora antes o después de las células dendríticas manipuladas in vitro.

83. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el ligando de activación es administrado en menos de 24 horas después de las células dendríticas manipuladas in vitro.

84. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el ligando de activación es administrado en menos de 48 horas después de las células dendríticas manipuladas in vitro.

85. Un kit, caracterizado porque comprende: (a) células inmunitarias manipuladas para contener un vector que comprende un polinucleótido que codifica para un cambio de gen que controla la expresión de una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador y, opcionalmente , una proteína que tiene la función de IL-12, y (b) un ligando que activa el cambio de gen.

86. El kit de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque el ligando es RG-115819, RG-115830 o RG-115932.

87. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para un cambio de gen comprende una primera secuencia del factor de transcripción y una segunda secuencia del factor de transcripción, bajo el control de un promotor, en donde las proteínas codificadas por la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor de transcripción interactúan para formar un complejo proteico que funciona como un factor de transcripción dependiente del ligando .

88. El vector de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor de transcripción son conectadas por un sitio de entrada ribosomal interno del EMCV (IRES) .

89. La célula inmunitaria manipulada in vitro, de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el polinucleótido que codifica para un cambio de gen comprende una primera secuencia del factor de transcripción y una segunda secuencia del factor de transcripción, bajo el control de un promotor, en donde las proteínas codificadas por la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor de transcripción interactúan para formar un complejo proteico que funciona como un factor de transcripción dependiente del ligando.

90. La célula inmunitaria manipulada in vitro de conformidad con la reivindicación 89, caracterizada porque la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor de transcripción son conectadas por un sitio de entrada ribosomal interno del EMCV (IRES) .

91. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el polinucleotido que codifica para un cambio de gen comprende una primera secuencia del factor de transcripción y una segunda secuencia del factor de transcripción bajo el control del segundo promotor, en donde las proteínas codificadas por la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor transcripción interactúan para formar un complejo proteico que funciona como un factor de transcripción dependiente del ligando .

92. La célula inmunitaria manipulada in vitro de conformidad con la reivindicación 91, caracterizada porque la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor de transcripción son conectadas por un sitio de entrada ribosomal interno del EMCV (IRES) .

93. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el polinucleotido que codifica para un cambio de gen comprende una primera secuencia del factor de transcripción y una segunda secuencia del factor de transcripción bajo el control de un promotor, en donde las proteínas codificadas por la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor transcripción interactúan para formar un complejo proteico que funciona como un factor de transcripción dependiente del ligando.

94. La célula inmunitaria manipulada in vitro de conformidad con la reivindicación 93, caracterizada porque la primera secuencia del factor de transcripción y la segunda secuencia del factor de transcripción son conectadas por un sitio de entrada ribosomal interno del EMCV (IRES) .

95. Una composición, caracterizada porque comprende una composición que incluye dos o más poblaciones de células inmunitarias manipuladas in vitro o células de soporte de terapia, en donde cada una de las poblaciones de las células manipuladas in vitro en la composición, comprende un vector que comprende un polinucleóítido que codifica para un cambio de gen en donde el polinucleótido comprende (1) al menos una secuencia del factor de transcripción que está operablemente enlazada a un promotor, en donde al menos una secuencia del factor de transcripción codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando, y (2) un polinucleótido que codifica para una proteína que tiene la función de un inmunomodulador enlazado a un promotor que es activado por el factor de transcripción dependiente del ligando, y en donde cada población de células manipuladas in vitro en la composición expresan uno o más inmunomoduladores que son diferentes de uno o más inmunomoduladores expresados en la otra u otras poblaciones de células manipuladas in vitro, en la composición.

96. Un método para tratar un tumor en un mamífero, caracterizado porque comprende: (a) administrar intratumoralmente a los microambientes tumorales dos o más poblaciones de células inmunitarias o TSCs, que son manipuladas in vitro para expresar condicionalmente una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador en donde cada población ee células inmunitarias o TSCs expresan un grupo diferente de uno o más inmunomoduladores; y (b) administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más ligandos de activación, con lo cual se induce la expresión de las proteínas que tienen la función de los inmunomoduladores y se trata el tumor .

97. Un método para tratar un tumor en un mamífero, caracterizado porque comprende: (a) administrar intratumoralmente a los microambientes tumorales dos o más poblaciones de células inmunitarias o TSCs, que son manipuladas in vitro para expresar condicionalmente una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador y una proteína que tiene la función de IL-12, en donde cada población de células inmunitarias o TSCs expresan un grupo diferente de una o más proteínas que tienen la función de un inmunomodulador, en donde al menos una de las proteínas que tiene la función de inmunomodulador o IL-12 está bajo el control de un promotor condicional que es activado por un ligando; y (a) administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más ligandos de activación, con lo cual se induce la expresión de una proteína que tiene la función de los inmunomoduladores y/o la proteína que tiene la función de IL-12 y se trata el tumor.