CN107667169B - 遗传修饰的t细胞的选择方法 - Google Patents

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Abstract

在一些方面，提供了包含或表达转基因以及DHFRFS和/或TYMSSS的分离的转基因细胞(例如，转基因T细胞)。还提供了用于选择转基因细胞的方法。

Description

遗传修饰的T细胞的选择方法
本申请要求提交于2015年2月24日的美国临时专利申请No.62/120,329、提交于2015年2月25日的美国临时专利申请No.62/120,790和提交于2015年6月15日的美国临时专利申请No.62/175,794的权益，所述专利的每一个以引用方式整体并入本文。
序列表的并入
本文件中包含的序列表名称为“UTFCP1272WO_ST25.txt”，大小为13KB(如在Microsoft
Figure BDA0001386783750000011
中所测量的)并且创建于2016年2月2日，以电子提交的方式与本文件一起提交并且以引用方式并入本文中。
发明背景
1.发明领域
本公开涉及用于制备转基因T细胞并在从哺乳动物分离的T细胞群体中富集调节性T细胞的方法和组合物。
2.相关技术描述
使T细胞靶向人类疾病已经发展了超过25年。参见Yee C.,Immunologicalreviews 2014,257(1):250-263。临床试验的初期目的是指导T细胞靶向和杀死扩散性癌症，例如转移性黑素瘤和白血病。参见Yee C.,Immunological reviews 2014,257(1):250-263和Roddie C与Peggs KS，Expert opinion on biological therapy 2011,11(4):473-487。
本文所论述的公布仅仅是出于它们在本申请的申请日之前的公开内容而提供的。不得将本文任何内容视为承认本发明依靠现有发明而先于此类公布。此外，所提供的公布的日期可能与实际公布日期不同，这可能需要独立确认。
癌症上的抗原通常是在非癌细胞上存在的蛋白质的成倍过度表达或突变的型式。虽然癌症抗原理想地仅限定于癌症，但是在许多情况下，癌抗原存在于具有导致严重并发症的脱肿瘤(off-tumor)毒性风险的非癌细胞上，所述严重并发症已经屡次导致发病和死亡。T细胞疗法的强大性质是继续寻求以T细胞作为治疗剂的原因之一，但是T细胞疗法尚未在任何形式的疾病方面获得美国FDA批准。
虽然许多T细胞临床试验表现出超越治疗标准的更强益处，但是生产T细胞疗法的成本和对患者的风险持续阻碍了这些技术在一些专业中心以外地方的发展。由于肿瘤的复杂免疫抑制环境以及难以鉴定适当的肿瘤抗原，而存在进一步的限制。参见Corrigan-Curay J,Kiem HP等人，Molecular therapy:the Journal of the American Society ofGene Therapy 2014,22(9):1564-1574。应当注意的是，癌症的T细胞疗法最初被开发用于治疗黑素瘤和白血病，并且在中间的四分之一世纪的时间里尚未显著偏离那些癌症靶标。T细胞疗法的技术方面的进一步改进以及对免疫调节性药物的持续研究和开发将继续促进癌症的T细胞癌症疗法并且可能拓宽这些疗法的适用性。
过度炎症的疾病目前是由免疫调节或免疫抑制药物所靶向的。这些疗法通常是有效的，但具有不良的副作用，如以上部分中所论述。使用调节性T细胞(Tregs)可能实现更好的靶向免疫抑制。随着对Tregs的更好理解和培养技术变得更加先进，基于重组Tregs的细胞疗法将可能更快地走向临床试验。Tregs在临床试验中的用途已限于在造血干细胞移植(HSCT)后大部分地抑制GvHD。因为在临床前模型中已经靶向了许多其他形式的炎症，所以Treg的用途数目将可能扩大。与Treg的分离和增殖相关的技术挑战目前限制了此T细胞疗法的进展。参见Singer BD等人，Frontiers in immunology 2014,5:46。
开发非MHC依赖性T细胞增殖方法已经是T细胞疗法的重大技术进展。通过非抗原特异性依赖的选择(ASIS)生长T细胞产生了大量T细胞以用于再输注至患者。虽然在不进行直接的特异性选择的情况下生长T细胞可能看似是违反直觉的，但是大量的T细胞可以包括对所靶向的抗原是特异的T细胞的经活化和增殖的子集。寻求新型ASIS方法来增强对转基因T细胞的选择并选择治疗上有用的T细胞表型。虽然使用嵌合细胞因子受体的体外ASIS是最近报道的非免疫原性选择方法，但是其仅利用T细胞活化-细胞因子信号传导中的第三信号。参见Wilkie S等人，The Journal of biological chemistry 2010,285(33):25538-25544。一种可以利用人类基因的T细胞活化(CD3和共刺激信号传导)的第一和第二信号来不依赖于抗原特异性地活化和增殖T细胞的策略可以具有进一步的益处。
抗原特异性T细胞的过继转移是癌症免疫治疗的一个快速发展领域，其的各种制备方法已经测试并且已靶向新的抗原。可以对T细胞进行用于免疫治疗的遗传修饰，以不依赖于HLA(HLA是MHC的人类型式)表达地表达识别肿瘤相关抗原(TAA)的嵌合抗原受体(CAR)。来自早期临床试验的最近结果表明，CAR+T细胞(CART)疗法可导致恶性疾病的部分和完全缓解，包括在一些患有晚期/复发性B细胞肿瘤的受者中。参见Kalos M等人，Sciencetranslational medicine2011,3(95):95ra73和Kochenderfer JN等人，Blood 2012,119(12):2709-2720。
因此，尽管之前文献中已经报道过，但是需要改进的制备转基因T细胞、增殖T细胞以供进行治疗性治疗，以及选择调节性T细胞的方法。另外，制备和使用转基因T细胞的方法及调节转基因T细胞的增殖和选择的试剂将大大有助于治疗癌症、自体免疫性疾病、感染性疾病以及其中免疫系统起作用的任何数量的其他医学疾患。
发明概述
在一方面，提供了一种包含或表达转基因以及DHFRFS和TYMSSS中的一个或多个的分离的转基因哺乳动物T细胞。在一些实施方案中，该分离的转基因哺乳动物T细胞包含或表达转基因、DHFRFS和TYMSSS。在一些实施方案中，该转基因是一种自杀基因。在一些实施方案中，还包含自杀基因。在一些实施方案中，对DHFRFS、TYMSSS或该两者执行密码子优化。
在另一方面，提供了一种用于抑制哺乳动物T细胞中的抗胸苷酸(AThy)毒性的方法，该方法包括在所述哺乳动物T细胞中表达抗胸苷酸抗性(AThyR)转基因。在一些实施方案中，该AThyR转基因是DHFRFS。在一些实施方案中，该AThyR转基因是TYMSSS。在一些实施方案中，该转基因是一种自杀基因。在一些实施方案中，还包含自杀基因。在一些实施方案中，对DHFRFS、TYMSSS或该两者执行密码子优化。
在另一方面，提供了一种用于选择表达目标转基因的T细胞的方法。该方法包括：施加胸苷合成抑制剂到多个T细胞，该多个T细胞包括表达目标转基因和DHFRFS的T细胞；以及选择在施加胸苷合成抑制剂七天或更多天后存活的一个或多个T细胞，其中该一个或多个T细胞表达包含目标转基因和DHFRFS的载体。可以从由氨甲蝶呤(MTX)、5-FU、雷替曲塞和培美曲塞组成的组中选择胸苷合成抑制剂。在一些实施方案中，该转基因是一种自杀基因。在一些实施方案中，还包含自杀基因。在一些实施方案中，对DHFRFS、TYMSSS或该两者执行密码子优化。
另一方面是一种用于选择性增殖对MTX和5-FU具有抗性的外周血单核细胞(PBMC)的方法。该方法包括：使用包含AThyR基因的载体来转染外周PBMC，用胸苷合成抑制剂处理经转染的PBMC，以及选择表达AThyR基因的PBMC。在此方面的一些实施方案中，该方法进一步包括：从经转染的PBMC来增殖T细胞群体。在一些实施方案中，该胸苷合成抑制剂可以选自由氨甲蝶呤(MTX)、5-FU、雷替曲塞和培美曲塞组成的组。在一些实施方案中，该胸苷合成抑制剂是MTX。在一些实施方案中，该AThyR基因是TYMSSS。在一些实施方案中，该AThyR基因是DHFRFS。在一些实施方案中，对DHFRFS、TYMSSS或该两者执行密码子优化。
另一方面是一种包含含有目标转基因和编码DHFRFS或TYMSSS的核苷酸序列的核酸序列的分离的转基因哺乳动物T细胞。在一些实施方案中，该分离的转基因哺乳动物T细胞包含含有目标转基因和编码DHFRFS的核苷酸序列的核酸，其中该目标转基因和该编码DHFRFS的核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，该分离的转基因哺乳动物T细胞包含含有目标转基因和编码TYMSSS的核苷酸序列的核酸，其中该目标转基因和该编码TYMSSS的核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，该转基因是一种自杀基因。在一些实施方案中，还包含自杀基因。在一些实施方案中，对DHFRFS、TYMSSS或该两者执行密码子优化。
在另一方面，提供了一种表达转基因和DHFRFS的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中该T细胞包含(1)包含编码该转基因的序列的多核苷酸，以及(2)包含编码DHFRFS的序列的多核苷酸。在一些实施方案中，该转基因是一种自杀基因。在一些实施方案中，还包含自杀基因。在一些实施方案中，对DHFRFS执行密码子优化。
在另一方面，提供了一种表达转基因和TYMSSS的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述T细胞包含(1)包含编码该转基因的序列的多核苷酸，以及(2)包含编码TYMSSS的序列的多核苷酸。在一些实施方案中，该转基因是一种自杀基因。在一些实施方案中，还包含自杀基因。在一些实施方案中，对TYMSSS执行密码子优化。
在另一方面，提供了一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的T细胞，该T细胞为上述实施方案中的任何一个中的分离的T细胞。
在一些实施方案中，AThyR+T细胞与AThy疗法的联合疗法可以用于提高抗肿瘤免疫性。可以将具有AThyR+表型的分离的T细胞与MTX、5-FU、雷替曲塞和培美曲塞，或任何其它胸苷合成抑制剂一起施用。
在另一方面，提供了一种用于选择表达目标转基因的T细胞的方法，如在任意附图中所示或如在说明书中所描述。
在另一方面，提供了一种T细胞，如在任意附图中所示或如在说明书中所描述。
在另一方面，是一种用于选择性增殖对MTX、5-FU、雷替曲塞和培美曲塞中的一种或多种具有抗性的人T细胞的方法，如在任意附图中所示或如在说明书中所描述。在一些实施方案中，该人T细胞是原代人T细胞。
另一方面是一种通过以下步骤来在从哺乳动物分离的T细胞群体中富集调节性T细胞的方法：使所述群体与选自由MTX、5-FU、雷替曲塞和培美曲塞或其组合组成的组的胸苷合成抑制剂接触，以选择性地耗竭该群体中的效应T细胞。在一些实施方案中，将从哺乳动物分离的该T细胞群体与MTX和5-FU两者接触。在一些实施方案中，T细胞表达DHFRFS和TYMSSS中的一种或多种。在一些实施方案中，T细胞表达DHFRFS和TYMSSS两者。在一些实施方案中，对DHFRFS、TYMSSS或该两者执行密码子优化。
另一方面是一种通过以下步骤来在从哺乳动物分离的T细胞群体中耗竭调节性T细胞的方法：在一种或多种氨基糖苷类的存在下培养所述群体，以选择性地耗竭所述培养物中的调节性T细胞。在一些实施方案中，T细胞表达DHFRFS和TYMSSS中的一种或多种。在一些实施方案中，T细胞表达DHFRFS和TYMSSS两者。在一些实施方案中，对DHFRFS、TYMSSS或该两者执行密码子优化。
另一方面是一种用于选择从哺乳动物分离的调节性T细胞的方法。该方法包括：用胸苷合成抑制剂处理表达DHFRFS和TYMSSS中的一种或多种的多个T细胞，以及选择表达调节性T细胞的标记物的调节性T细胞。在一些实施方案中，T细胞表达DHFRFS。在一些实施方案中，该选择步骤包括使用抗CD4抗体、抗CD25抗体、抗CD3抗体、抗CD8抗体、抗CD25抗体、抗CD39抗体、抗CD45抗体、抗CD152抗体、抗KI-67抗体、抗LAP抗体和抗FoxP3抗体中的一种或多种，用磁珠分选来进行细胞分离。在一些实施方案中，该胸苷合成抑制剂选自由氨甲蝶呤(MTX)、5-FU、雷替曲塞或培美曲塞组成的组。在一些实施方案中，该方法还包括：用叶酸、亚叶酸和FU中的一种或多种来处理调节性T细胞。
在另一方面，提供了一种包含从哺乳动物分离的第一多个T细胞和胸苷合成抑制剂的组合物。相较于从哺乳动物分离的不包含胸苷合成抑制剂的第二多个T细胞，该第一多个T细胞富含调节性T细胞。
随着本发明的上述和其它目的、优点和特征将在下文中变得显而易见，通过参考以下对本发明的优选实施方案的详细描述和所附权利要求书，可以更清楚地理解本发明的性质。
在另一方面，提供了一种表达转基因和DHFRFS的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中该T细胞包含(1)包含编码该转基因的序列的多核苷酸，以及(2)包含编码DHFRFS的序列的多核苷酸。在一些实施方案中，对DHFRFS和/或编码目标转基因的序列执行密码子优化。在一些实施方案中，目标转基因和编码DHFRFS的核苷酸序列在表达后，被编码在同一mRNA上。在其他实施方案中，编码目标转基因的序列和编码DHFRFS的核苷酸序列由内部核糖体进入位点(IRES)或核糖体滑动序列分隔。在某些实施方案中，该目标转基因可以编码嵌合抗原受体(CAR)构建体、T细胞受体(TCR)、激素(例如，胰高血糖素)、细胞因子、趋化因子、自杀基因、转录因子或细胞表面多肽如受体(例如，整合素、细胞因子受体、趋化因子受体或激素受体)。
在另一方面，提供了一种表达转基因和TYMSSS的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述T细胞包含(1)包含编码该转基因的序列的多核苷酸，以及(2)包含编码TYMSSS的序列的多核苷酸。在一些实施方案中，对TYMSSS和/或编码目标转基因的序列执行密码子优化。在某些实施方案中，目标转基因和编码TYMSSS的核苷酸序列在表达后，被编码在同一mRNA上。在一些实施方案中，编码目标转基因的序列和编码TYMSSS的核苷酸序列由IRES或核糖体滑动序列分隔。在特定实施方案中，表达转基因和TYMSSS的分离的转基因哺乳动物T细胞还包含编码DHFRFS的核苷酸序列(任选地，编码DHFRFS的核苷酸序列可操作地连接至第二目标转基因)。在一些实施方案中，该目标转基因(例如可操作地连接至TYMSSS)是生长因子、CAR构建体、TCR、激素(例如，胰高血糖素)、细胞因子、趋化因子、自杀基因、转录因子(例如，FoxP3)或细胞表面多肽如受体(例如，整合素、细胞因子受体、趋化因子受体或激素受体)。在特定实施方案中，该细胞因子可以是IL-12或IL-15。
另一方面是一种用于提供第一转基因的受控表达的方法，该方法包括提供包含含有可操作地连接至编码TYMSSS的核苷酸序列的第一转基因的核酸的转基因哺乳动物细胞，所述细胞还包含编码DHFRFS的核苷酸序列。在一些实施方案中，该第一转基因和编码TYMSSS的核苷酸序列在表达后，被编码在同一mRNA上。在其他实施方案中，该编码第一转基因的序列和该编码TYMSSS的核苷酸序列由IRES或核糖体滑动序列分隔。在某些实施方案中，该第一目标转基因是生长因子、CAR构建体、TCR、激素(例如，胰高血糖素)、细胞因子、趋化因子、自杀基因、转录因子(例如，FoxP3)或细胞表面多肽如受体(例如，整合素、细胞因子受体、趋化因子受体或激素受体)。在特定实施方案中，该细胞因子可以是IL-12或IL-15。
在其他实施方案中，该编码DHFRFS的核苷酸序列可操作地连接至第二转基因。在一些实施方案中，该第二转基因和该编码DHFRFS的核苷酸序列在表达后，被编码在同一mRNA上。在其他实施方案中，编码第二目标转基因的序列和该编码DHFRFS的核苷酸序列由IRES或核糖体滑动序列分隔。在某些实施方案中，该第二转基因是自杀基因。在特定实施方案中，该自杀基因是可诱导的自杀基因。在具体实施方案中，该自杀基因是可诱导的半胱天冬酶9。在一些实施方案中，该哺乳动物细胞是T细胞。
在另一方面，提供了一种编码TYMSSS和第一转基因编码序列的重组核酸分子。在一些实施方案中，编码TYMSSS的序列和/或编码目标转基因的序列是经密码子优化的。在某些实施方案中，重组核酸是DNA或RNA(例如，mRNA)。在一些实施方案中，编码目标转基因的序列和编码TYMSSS的核苷酸序列由IRES或核糖体滑动序列分隔。在一些实施方案中，该目标转基因是生长因子、是生长因子、CAR构建体、TCR、激素(例如，胰高血糖素)、细胞因子、趋化因子、自杀基因、转录因子(例如，FoxP3)或细胞表面多肽如受体(例如，整合素、细胞因子受体、趋化因子受体或激素受体)。在特定实施方案中，该细胞因子可以是IL-12或IL-15。
附图简述
附图仅是示例性的，并且不应被解释为限制本发明。
图1A描绘了一种途径，示出了胸苷合成在DNA复制和细胞存活中的作用。
图1B描绘了抗AThy毒性的推定AThyR转基因的设计，以便赋予抗性给可用于和AThy化疗一起进行联合治疗的T细胞。AThyR与荧光蛋白共同表达，以指示含有转基因的存活细胞。这些转基因利用睡美人转座子/转座酶体系在Jurkat中诱导稳定的转基因表达。人突变蛋白DHFRFS-抗MTX(左)，人突变蛋白TYMSSS-抗5-FU(中心)，以及金标准新霉素抗性基因(NeoR)药物抗性基因-抗G418(右)被用于此研究中。用DHFRFS和TYMSSS的经密码子优化(CoOp)型式替换天然密码子DHFRFS和TYMSSS，以测试已知的转录后调控机制是否正在影响AThyR选择或存活。
图1C描绘了三个不同的图，示出了在用不同浓度的MTX(左图)，5-FU(中心图)和G418(右图)处理后eGFP+活Jurkat T细胞的百分比。左图涉及DHFRFS-2A-GFP(DG)、CoOp DG且无DNA，该DHFRFS-2A-GFP(DG)、CoOp DG经电穿孔进入Jurkat并在2天后经受MTX。中心图涉及TYMSSS-2A-GFP(TSG)、CoOp TSG且无DNA的电穿孔的Jurkat，该电穿孔的Jurkat在第2天用5-FU处理。右图涉及NeoR-GFP且无DNA的电穿孔的Jurkat，该电穿孔的Jurkat在第2天用G418处理。对于C中的每次实验，在加入药物后的第8至10天进行测试后给出了eGFP+活Jurkat的百分比。
图1D描绘了MTX和培美曲塞(Pemetrexid)对表达天然DHFR和TYMS(“无DNA”)或表达的细胞的存活的影响。DG和TYMSSS-2A-RFP(TSR)被共电穿孔到Jurkat内以确定组合DHFRFS和TYMSSS是否赋予对MTX(左)或培美曲塞(右)增强的存活。
图1E描绘，在1μM MTX中选择2周之后，[DHFRFS和TYMSSS]+Jurkat表现出均一和可重复的相关表达模式。如图所示，四个单独的[DHFRFS和TYMSSS]+Jurkat实验以不同的阴影深浅重叠。实验用4-6个重复试验独立地重复至少两次，*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001.；二氢叶酸(DHF)；DHF还原酶(DHFR)；脱氧尿苷单磷酸(dUMP)；脱氧胸苷单磷酸(dTMP)；5,10–亚甲基四氢叶酸(5,10CH2THF)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。
图2A-I描绘了涉及针对DHFRFS(左)、TYMSSS(右)和NeoR(中心)给定的Jurkat细胞的活力的实验。
图2A-II描绘了涉及针对DHFRFS(左)、TYMSSS(右)和NeoR(中心)给定的eGFP的平均荧光强度(MFI)的变化的实验。
图2B描绘了当雷替曲塞以及DHFRFS和TYMSSS被共穿孔到用Ral处理过的Jurkat中时确定是否发生增强的存活。
图2C描绘了独立表达的DHFRFS和TYMSSS质粒的表达相关性。观测表明，表达DHFRFS和TYMSSS作为独立质粒的细胞具有对每种质粒的相关表达。这可能对DHFRFS和TYMSSS的共调节具有影响。因此，eGFP和RFP的MFI与使用多种浓度的MTX、Pem和Ral进行的处理相关。线性回归数据包括在图中。每个实验用4至6个重复试验独立地重复至少两次，*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001。观测到了模拟电穿孔的Jurkat的提高表达，以及在5μM 5-FU中的微弱存活改善。不希望受理论约束，缺乏显著增强的存活可能是由于5-FU的替代机制导致了毒性，该毒性可能是已知的5-FU对mRNA和rRNA合成的抑制。参见LongleyDB,等人，The Journal of biological chemistry 2010,285(16):12416-12425。
图3A描述了示出初始AaPC刺激的增殖示意图。在AaPC刺激两天后，共培养物接受0.1μM MTX、5μM 5-FU或1.4mM G418，直到第14天。从第1天至第35天每7天用1:1比率的AaPC和给定的50IU/mL IL-2重新刺激该共培养物。药物施用期间的前14天和在药物施用已经结束后的21天追踪转基因表达中的表型变化
图3B-i示出了对T细胞在适当的选择药物的存在下(第2至14天)以及随后在该选择药物不存在下(第14至35天)对AThyRs DHFRFS-DG、TYMSSS-TG、[DG和TSR]两者以及NeoR-NRG的表达的追踪。所有实验含有5至6个生物重复试验，其中每个实验独立地重复两次，*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001；****＝p<0.0001。
图3B-ii示出了图4B-I中所示的表达辅助受体CD4的T细胞的百分比。
图3C-i示出了对T细胞对与每种AThyR转基因[DG和NRF]、[TSG和NRF]以及[DG和TSR和NRF]组合的Myc-ffLuc-2A-NeoR(NRF)的表达的追踪，以改善对由5-FU选择的AThyR的选择。选择发生在与图4B-I相同的条件下，除了加入100IU IL-2/mL以促进用G418处理的细胞的过生长(outgrowth)之外。所有实验含有5至6个重复试验，其中每个实验独立地重复两次，*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001；****＝p<0.0001。
图3C-ii示出了图4C-I中所示表达辅助受体CD4的T细胞的百分比。
图3D-i示出用以阐明5-FU和TYMSSS对被与DHFRFS一起共穿孔到T细胞中的DHFRFS、RFP或TYMSSS-RFP(TSR)的选择的影响。所有实验含有5至6个重复试验，其中每个实验独立地重复两次，*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001；****＝p<0.0001。
图3D-ii示出了图4D-I中所示表达辅助受体CD4的T细胞的百分比。
图4A-4C示出了AThyR+T细胞在MTX、5-FU和/或G418存在或缺乏的情况下的增殖特性。
图4A，将AThyR和NeoR电穿孔的原代T细胞在第21天与用相同条件处理的模拟电穿孔的T细胞进行比较。每个实验用5至6个重复试验独立地重复至少两次，*＝p<0.05，**＝p<0.01。
图4B-I描绘了图5A的实验在第35天的继续增殖。每个实验用5至6个重复试验独立地重复至少两次，*＝p<0.05，**＝p<0.01。
图4B-II描绘了当NeoR与DHFRFS和/或TYMSSS组合时，原代T细胞的过生长潜力在第35天时的变化。每个实验用5至6个重复试验独立地重复至少两次，*＝p<0.05，**＝p<0.01。
图4C示出了在第35天时5-FU对保持原代T细胞的过生长潜力的影响。每个实验用5至6个重复试验独立地重复至少两次，*＝p<0.05，**＝p<0.01。
图5A-5H：DHFRFS下游的顺式转基因在MTX的存在下不依赖于mRNA序列地增多，并且该增多受到胸苷合成恢复的抑制。
图5A：Jurkat细胞经遗传修饰以表达具有MTX抗性的FLAG-DHFRFS-2A-eGFP pSBSO(DFSG)(n＝4)，经密码子优化的(CoOp)DFSG-其中已知的mRNA结合元件DFSG被移除(n＝5)，以及[DFSG和FLAG-TYMSSS-2A-RFP pSBSO(TSSSR)]-通过加入抗MTX的TYMSSS而具有超过单独DFSG的增强的MTX抗性(n＝7)。将经遗传修饰的Jurkat细胞在1μM MTX中选择2周，然后在不存在MTX的情况下培养3至5周。在不存在MTX的情况下的稳定荧光蛋白表达用平均荧光强度(MFI)描绘。
图5B-I：将Jurkat细胞用0.5μM MTX处理72小时或不处理。描绘了MFI差异(Δ＝用MTX处理过的eGFP MFI-未处理过的eGFP MFI)。
图5B-II：展示Jurkat中MTX诱导的DHFRFS(左峰)和CoOp DHFRFS(右峰)的eGFP MFI变化的代表性直方图。
图5C-D：在原代T细胞中，将转基因DHFRFS、TYMSSS或它们的组合在细胞毒性药物的存在下选择2周，然后在没有选择的情况下增殖3周(参见实施例)。在第35天时，在MTX存在或不存在的情况下用抗CD3抗体、抗CD28抗体以及50IU/mL IL-2刺激T细胞。未处理细胞的荧光蛋白MFI示出于图5C中，并且图5D-I描绘了相较于不处理，用0.5μM MTX处理72小时后的ΔMFI。
图5D-II示出了代表性直方图，其展示了在存在或不存在MTX的情况下，观测到的DHFRFS+T细胞的eGFP荧光的偏移(n＝5)。(无DNA＝最左峰；DFSG和NRF，无Trx＝上部中心峰；DFSG和NRF，MTX＝上部右峰；DFSG和TSSSR，无Trx＝下部中心峰和下部右峰；DFSG和TSSSR，MTX＝最下部峰)
图5E：观测到了DHFR和TYMS连接的荧光蛋白的反式调控模式。来自在(图5A)中保持未处理的经1μM MTX选择的Jurkat的代表性流体图表明，未经选择的模拟电穿孔(无DNA——左下方的聚类)的Jurkat和DFSG+Jurkat(右下方的聚类)在RFP通道中具有球状外观，而DHFRFS与TYMSSS在[DFSG和TSSSR]+Jurkat中的共表达导致线性聚类(右上方的聚类)。
图5F：T细胞经电穿孔以含有DHFRFS并且与RFP对照或FLAG-TYMSSS-2A-RFP pSBSO(TSSSR)共转化，然后如前(在图5C中)所示在从第2至14天在0.1μM的MTX中选择下进行增殖，然后在不存在MTX的情况下继续增殖。示出了来自相同供体的原代人T细胞在第21天的代表性流体图，其中[DFSG和RFP(最右侧上的聚类)]、[DFSG和TSSSR(右上方的聚类)]和未转化的T细胞(左下象限)。当与TYMSSS共表达时再次注意到DHFRFS的线性聚类，这在仅使用RFP时未注意到。
图5G：用于鉴定DHFRFS和TYMSSS之间的关联表达的反式模式的进一步研究是在抗叶酸的MTX[0、0.01、0.1、0.5、1、5μM]、培美曲塞[0、10、50、100μM]和雷替曲塞[0、1、5、10μM]中对[DFSG和TSSSR]电穿孔的Jurkat进行选择的过程中鉴定的。在选择中的第2至14天后对每种表达模式下的DFSG和TSSSR的MFI作图。将该值作图，并使用来自皮尔森相关性(Pearson’s correlation)的R2和图上提供的线性回归的斜率进行线性拟合。此数据是从4个技术重复试验组合的。
图5H描绘了DHFR和TYMS的转录后调控模型。除了在图5G中描绘的实验以外，所有实验都独立地重复两次。使用鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskall-Wallis test)来测定使用多变量分析的显著性差异；*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001。TMP–胸苷单磷酸；UMP-尿苷单磷酸；DHF–二氢叶酸；THF–四氢叶酸；5,10–亚甲基四氢叶酸(5,10CH2THF)。
图5I-5L示出，DHFRFS与TYMSSS的共表达导致TYMSSS和顺式转基因在MTX存在下的受控表达。
图5I-5J：来自图5F中描述的实验的T细胞增殖至第35天。将T细胞用抗CD3抗体、抗CD28抗体、50IU/mL IL-2以及变化浓度的MTX刺激72小时。MTX诱导的DHFRFS的eGFP MFI变化示出于(图5I)中，而MTX对RFP和与TYMSSS共表达的RFP(TSSSR)的影响示出于(图5J)中(n＝6，独立地重复两次，通过使用Sidak多重比较检验(Sidak’s multiple comparison test)的双向ANOVA来进行分析)。
图5K：这种调控模式被应用于临床相关问题：细胞因子白细胞介素-12(IL-12)是T细胞中抗肿瘤活性的强促进剂，但是毒性高。在TYMSSS之后表达IL-12的构建体被称为TSSSIL-12，其用于结合构建体DFSiC9来调节IL-12表达。DFSiC9能够选择含有DHFRFS的T细胞或耗竭含有可诱导的半胱天冬酶9(iC9)的T细胞。相同供体的代表性流体图描述了IL-12和c-Myc-iC9在表达[DFSiC9和TSSSIL-12]的T细胞中的细胞内表达。在从第2至14天在0.1μMMTX中进行选择以及接着在从第14至21天用0.5μM MTX(右侧聚类)处理或不进行处理(左侧聚类)后在第21天时示出了这些细胞。在进行细胞内染色之前，将细胞的IL-12分泌阻断6小时。门控是基于对以相同方式染色的未转化、未经选择的T细胞的染色。
图5L：如在(K)中所示对三个供体进行处理，并且示出了在用0.5μM MTX进行处理7天后注意到的转基因表达变化。通过t检验分析每次测量。ns＝无显著性；*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001。
图6描绘了AThyR实验在第35天时的转基因表达的流体图。CD4和GFP表达的流体图描绘了被设计用于表征供体T细胞中的转基因表达的选择和维持的一系列实验的第35天。生长35天的T细胞，其中在第2至14天存在细胞毒性药物MTX、5-FU、G418或组合，如上述流体图所指出的。
图6A描绘了对应于针对图3B所描述的实验的实验条件。
图6B描绘了对应于针对图3C所描述的实验的实验条件。
图6C描绘了对应于针对图3D所描述的实验的实验条件。
图6D示出，在图6B中所指出的实验第35天时ffLuc-2A-NeoR-NRF-的存在是通过使用D-萤光素诱导T细胞化学发光而证明的。每个实验用6个重复试验独立地重复至少两次。描绘了代表性的流体图。*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001。
图7描绘了在MTX中处理72小时后AThyR+和AthyR-T细胞的AThyR挽救。将来自针对图3D所描述的实验的T细胞在第35天用抗CD3、抗CD28和IL-2以及不同剂量的MTX[0、0.1、0.5、1μM]刺激72小时。
图7A示出了门控策略和代表性流体图。
图7B示出了AThyR+T细胞培养物的增强活力。
图7C示出了对活CD3+、GFP-、RFP-T细胞(AThyR-)的存活评估。每个实验用总共6个生物重复试验独立地重复至少两次。描绘了来自一次实验的代表性流体图；ns＝无显著性；*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001；****＝p<0.0001。
图8描绘了AThyR选择目标转基因的实例。对于难以分离目标基因(诸如自杀基因)，增加对DHFRFS的选择是期望的。
图8A示出了其中自杀基因可诱导的半胱天冬酶9(iC9)被设计成在(A)中示出的质粒DFSiC9中与DHFRFS一起表达的构建体。
图8B示出了当示出PBMC存活时在用1:1比率的载有OKT3的AaPC刺激并用MTX从第2天处理到第7天的3个健康供体的PBMC中对在图8A中描述的构建体的测试。
图8C示出，T细胞经电穿孔而含有CD19特异性嵌合抗原受体(CAR)、DFSiC9和SB转座酶，并且在MTX的存在下在CARL+K562上扩增21天以选择各个转基因，其中CARL是CAR的配体的缩写。示出了相较于在载有OKT3的AaPC克隆4上扩增的模拟电穿孔的T细胞，共刺激T细胞受体CD4、CD8以及转基因CAR和DHFRFS在经21天CARL扩增的转基因T细胞中的表达。实验用4个正常供体进行并重复两次。每次比较的显著性是最初通过双向ANOVA，然后通过Sidak事后分析(Sidak’s post-hoc analysis)确定；*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001。
图8D示出了通过在第14天刺激后在存在或不存在MTX的情况下刺激CAR+T细胞7天，测试MTX对DHFRFS+CAR+T细胞中细胞毒性的影响。细胞毒性是在第21天使用CD19阳性或CD19阴性鼠淋巴瘤EL-4细胞，通过铬释放测定(CRA)评估的。将T细胞与EL-4以1个靶:5个效应物的比率共孵育。实验用4个正常供体进行并重复两次。每次比较的显著性最初通过双向ANOVA测定，然后通过Sidak事后分析测定；*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001。
图8E示出了在第21天通过将T细胞在10nM的AP20187中静息48小时而进行的对iC9的功能性的评估。T细胞先前已经在存在或不存在MTX的情况下刺激了7天。将存活的CAR+T细胞与匹配的未处理细胞进行比较。实验用4个正常供体进行并重复两次。每次比较的显著性是最初通过双向ANOVA确定，然后通过Sidak事后分析确定；*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001。DHFRFS与iC9而不是CAR共表达增加了通过加入二聚化AP20187的iC9化学诱导剂来消除T细胞的可能性。AP20187的加入不依赖于MTX显著地耗竭了静息CAR+T细胞。这表明DFSiC9可以选择iC9表达并在必要时耗竭经遗传修饰的T细胞。使用DHFRFS具有以下优点：在T细胞中不依赖于抗原特异性和抗原表达来选择转基因表达，从而使得DHFRFS成为用于各种T细胞研究中的更便携工具。
图9描绘了胸苷合成的转录后调控将DHFR的表达锁定到TYMS。MTX诱导的DHFR表达增加由胸苷合成(从UMP-尿苷单磷酸合成TMP–胸苷单磷酸)恢复抑制。类似地，MTX诱导的TYMS表达减少通过恢复DHFR活性以将DHF-二氢叶酸还原成THF-四氢叶酸而恢复到正常水平。
图10示出用MTX对TCD4,FoxP3进行的药物选择部分地通过毒性发生。通过靶向归因于MTX的作用的酶来分析MTX对TCD4,FoxP3的已知选择。当TCD4,FoxP3是PBMC的稀有组分时，基于药物的抑制最初是寻求分析该现象。具有类似于MTX的作用的多种药物被用来测定对TCD4,FoxP3的选择。在这种情况下，γ辐射、G418和顺铂(CDDP)被用于对照，因为这些处理中没有一种作用于已知的MTX酶促靶标。
图10A示出了每种药物与MTX酶靶标的关联。
图10B-I示出，向用抗CD3/CD28和可溶性人IL-2刺激的PBMC给予每次治疗的致死剂量，并在7天后测定活力。
图10B-II示出这些处理在第7天导致对TCD4,FoxP3的可变选择。靶向DHFR、TYMS或GARFT的叶酸类似物不能显著选择TCD4,FoxP3，这表明对AICARtf/肌苷单磷酸(IMP)环水解酶(ATIC)的抑制有助于此选择。在分析ATIC抑制剂在TCD4,FoxP3选择中的贡献之后进行剂量依赖性研究。图B-II中的研究指出，G418耗竭TCD4,FoxP3，因此这被用作阴性对照，而雷帕霉素(Rapa)对TCD4,FoxP3的已知选择是阳性对照。已知抑制ATIC的非叶酸类似物(iATIC)被用作ATIC的特异性抑制剂。
图10C-I、10D-I、10E-I和10F-I示出了G418(C-I)、MTX(D-I)、iATIC(E-I)和Rapa(F-I)的细胞毒性。
图10C-II、10D-II、10E-II和10F-II示出了G418(C-II)、MTX(D-II)、iATIC(E-II)和Rapa(F-II)对TCD4,FoxP3的选择。
图10G描绘了CD4和FoxP3表达的流体图。FoxP3表达被类似于Rapa作用的iATIC增强，这表明MTX选择部分依赖于细胞毒性并且部分地通过对ATIC的抑制来增强对TCD4,FoxP3的选择。所有测定使用4至7个供体独立地重复2至3次。使用针对活力的单向ANOVA以及针对TCD4,FoxP3的百分比的鲁斯卡尔-沃利斯检验来评估统计显著性；*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001。
图11示出了在通过对MTX的抗DHFR和抗TYMS作用的抗性从原代T细胞选择Tregs的过程中的相关发现。
图11A示出了在每次实验中第21天时评估的对TCD4,FoxP3的选择。每次实验中在第21天时评估对TCD4,FoxP3的选择。对应于图2的行I的实验中对TCD4,FoxP3的选择示出于A中。值得注意的是，使用NeoR对TCD4,FoxP3的挽救，以及使用MTX对DHFRFS的选择来进行对TCD4,FoxP3的早期选择。
图11B示出了流体图，其中对于相同的实验，在第35天刺激后时，FoxP3在顶行中与IL-2共表达，在中间行中与LAP共表达，或者在底行中与CTLA-4共表达。该实验使用5个供体，并独立地重复两次。通过双向ANOVA和Sidak事后分析来评估显著性；*＝p<0.05，**＝p<0.01。
图12A-D示出对MTX的抗DHFR和抗TYMS作用具有抗性的原代T细胞优先扩增Tregs。将原代T细胞分别与对MTX的抗DHFR和抗TYMS作用具有抗性的DHFRFS和TYMSSS转基因一起电穿孔，以便评估每种途径对TCD4,FoxP3的选择的贡献。将T细胞与表达耐药转基因的质粒一起电穿孔，并每周用人工抗原呈递细胞(AaPC)以1:1的比率刺激。在2周中选择与TYMSSS-2A-RFP(TSR)组合的T细胞，并使用MTX和5FU两者，或经G418选择的对照选择载体NeoR-2A-GFP(NRG)进行选择。5-FU对TYMSSS的选择是不完全的。因此，ffLuc-2A-NeoR(NRF)载体包含有MTX抗性转基因DG、TSG或[DG和TSR]以在行II所示的实验中移除未转化的T细胞。对每种转基因的等效选择显示，MTX增强了在MTX抗性DHFR的存在下对Treg的选择。尚不确定TYMS或5-FU的酶促活性是否部分作用于对Treg的选择。因此，执行行III中示出的实验以测试TYMS抑制对Treg选择的影响。对Treg表型的选择被发现与5-FU相关，而并不依赖于TYMS活性。使用鲁斯卡尔-沃利斯检验来评估5至6个生物重复试验的各组之间的差异，并且测试独立地重复两次；*＝p<0.05，**＝p<0.01。
图13是被认为影响对Treg的选择的生物化学相互作用和蛋白相互作用的图解表示。
图14示出通过氨基糖苷G418进行的核糖体抑制选择性地耗竭复制的TCD4,FoxP3。
图14A示出将解冻的PBMC在不断增加浓度的G418、潮霉素、博莱霉素或雷帕霉素的存在下用抗CD3/CD28和IL-2刺激7天，以及对TCD4,FoxP3的选择。
图14B示出了FoxP3和CD4表达的流体图，该图继而示出了一个供体在使用每种药物之后的代表性趋势。
图14C，顶部小图示出在未受刺激、解冻的PBMC中具有或不具有G418的情况下于9天的过程中测试了TCD4,FoxP3的损失，而底部小图示出G418对增殖和非增殖的TCD4,FoxP3的影响，如Ki-67所指示。
在图14D中，一个供体的代表性流体图在顶部小图中展示了G418对CD4和FoxP3表达的影响，而在底部小图中展示了FoxP3和Ki-67表达。庆大霉素是一种FDA批准的氨基糖苷类抗生素，并且随后在7天的时段中测试了相较于G418，其对TCD4,FoxP3的耗竭。所有实验用6个正常供体进行并独立地重复两次。
图14E描述了7天后庆大霉素(一种氨基糖苷)在静息PBMC中对TCD4,FoxP3的耗竭，并且表明了氨基糖苷类在耗竭TCD4,FoxP3方面的作用。接下来测试TCD4,FoxP3的耗竭是否对应于Treg标记物表达或选择性Treg毒性的损失。
图15示出了MTX、5-FU和G418在经分选的Treg中的效应。
图15A以图示方式示出，Treg和Teff如前所述用MTX、5-FU或G418处理7天，然后在该实验的剩余2周中在没有药物的情况下进行刺激。
图15B示出在第21天对Treg的标记物和活性进行评估，以确定每种药物对Treg的选择或耗竭的贡献，并且第21天时的活TCD4,FoxP3示出于图B中。
图15C示出，在用可溶性抗CD3/CD28和IL-2刺激48小时后，在C–I中评估T细胞中FoxP3与CD25的共表达，在C-II中评定T细胞中FoxP3与CTLA-4的共表达，及在C–IV中评定T细胞中FoxP3与LAP的共表达。用PMA/离子霉素刺激六小时被用来评估表达FoxP3的T细胞中的IL-2分泌损失，C–III。通过混合经处理的Treg与未经处理的Teff以及观察对两种不同浓度的[3H]胸苷的摄入来执行72小时的抑制测定，在D中所示。这个实验用5个正常供体进行并且重复两次。所有实验使用双向ANOVA来评估，并且显著性用Sidak事后分析来确定；*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001。
图16示出对TCD4,FoxP3的刺激增强了单磷酸腺苷(AMP)激酶(AMPK)活化并且导致对翻译延伸因子eEF2的抑制。TCD4,FoxP3与CD4+CD25-T细胞的区分是通过在受刺激和不受刺激的实验中门控来完成的。
图16A的上部小图描绘了在刺激后，通过T172处的磷酸化活化的AMPK的平均荧光强度(MFI)，而图16A的下部小图描绘了通过位点S235/S236处的磷酸化而活化的S6的MFI。
图16B描绘了流体图，该图在上部小图中示出了TCD4,FoxP3和CD4+CD25-T细胞中的AMPK磷酸化变化并在下部小图中示出了相对于门控CD4+细胞中的FoxP3表达，S6的磷酸化变化。
图16C是描绘在刺激后TCD4,FoxP3的荧光和形态变化的图像细胞术集。
图16D示出使用图像细胞仪来分析p-eEF2T56MFI并且描绘了TCD4,FoxP3的活化增加。
图16E示出了在图像细胞术集中与CD4+FoxP3-T细胞的差异。
定义
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于测试本发明的实践中，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明的过程中，将使用以下术语。
还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非旨在为限制性的。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。下文提供了以下术语。
冠词“一”和“一个”在本文中用于指代该冠词的语法对象为一个或多于一个(即至少一个)。举例而言，“一要素”是指一个要素或多于一个要素。因此，表述“一细胞”例如包括多个相同类型的细胞。
当指代可测量的值(诸如量、持续时间等)时，如本文所用的“约”旨在涵盖相对于指定值变化+/-20％或+/-10％、更优选+/-5％、更优选+/-1％、以及更优选+/-0.1％，因为这些变化适用于执行所公开的方法。
“动物”意指包括脊椎动物(例如，青蛙、蝾螈、鸡或马)和无脊椎动物(例如蠕虫等)的动物界的任何成员。“动物”还意在包括“哺乳动物”。优选的哺乳动物包括家畜动物(例如，有蹄类动物，诸如牛、水牛、马、绵羊、猪和山羊)以及啮齿动物(例如，小鼠、仓鼠、大鼠和豚鼠)、犬科动物、猫科动物、灵长类动物、狼(lupine)、骆驼科动物、鹿科动物、啮齿动物、禽类和鱼类(ichthyes)。
如本文所用，术语“抗体”意指完整的全抗体，及其Fab片段和F(ab)2片段。完整的全抗体包括单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体和人源化抗体。完整的全抗体、Fab片段和F(ab)2片段的抗体和蛋白质结构的产生以及编码这种分子的遗传序列的组构是众所周知的并且描述于例如Harlow等人，ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)中，该文献以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“自体”意指来自其随后将被重新导入到体内的相同个体的任何材料。
如本文所用的“有效量”意指提供治疗或预防益处的量。
“编码”是指多核苷酸中的核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)的特定序列用作生物过程中具有核苷酸(即rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列的其它聚合物和大分子的合成模板以及由此产生的生物学特性的固有特性。因此，如果与基因相对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA转录模板的非编码链两者均可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
“表位”意指抗体或其免疫原性片段特异性结合至的抗原分子上区域。表位可以是由蛋白质抗原分子的不同区域上的残基形成的三维表位，所述残基在天然状态下由于蛋白质折叠而紧密地并置(apposed)。如本文所用的“表位”还可意指由蛋白裂解酶的肽或半抗原部分产生的表位，而不是三维表位。
如本文所用的术语“表达”被定义为特定核苷酸序列由其启动子驱动的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足量顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中供应。表达载体包括本领域已知的所有那些表达载体，诸如掺入了重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，术语“融合蛋白”或“融合多肽”是由至少两条多肽和任选的连接序列组成的多肽，并且该至少两条多肽和任选的连接序列可操作地连接成一个连续蛋白质。在融合蛋白中连接的两个多肽通常来源于两个独立的来源(即，不是来自相同的亲本多肽)，因此融合蛋白包含在自然中正常不存在连接的两个连接的多肽。通常，两个多肽可以通过肽键直接可操作地附接，或者可以通过连接基团如间隔子结构域连接。融合多肽的实例是用作抗原受体的多肽，其中形成细胞外结构域的抗原结合多肽与不同的多肽融合，从而形成“嵌合抗原受体”。
靶基因的“敲入”意指例如通过导入靶基因的附加拷贝或通过可操作地插入提供靶基因的内源拷贝的增强表达的调控序列，而造成的宿主细胞基因组中的改变，该改变导致靶基因的改变表达(例如，增加的表达，包括异位表达)参见6,175,057。
基因“敲除”意指导致靶基因功能减少的基因序列改变，优选使得靶基因表达不可检测或不显著。参见6,175,057。
“调节”或“调控”意指试剂从在单个生物体中观测到的特定基因、蛋白质、因子或其他分子的活性的野生型水平进行改变的能力。
关于多肽或其部分(例如多肽的功能结构域)的“突变体”意指通过缺失、取代或插入至少一个氨基酸，而具有与对应的野生型多肽氨基酸序列不同的氨基酸序列的多肽。氨基酸序列或多肽中的“缺失”被定义为其中与野生型蛋白质相比不存在一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列变化。如本文所用，氨基酸序列或多肽中的“插入”或“添加”是已经导致与野生型蛋白相比添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列变化。
如本文所用，氨基酸序列或多肽中的“取代”是由于分别用与野生型蛋白质相比不同的氨基酸替代一个或多个氨基酸造成的。
“分离”意指从天然状态改变或移出。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，而与其天然状态下的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。
“分离的核酸”是指已经与天然存在状态下其所侧接的序列分离的核酸区段或片段，即已经从正常情况下从DNA片段相邻的序列(即，在该DNA片段所天然存在于其中的基因组中与该DNA片段相邻的序列)中移出的DNA片段。该术语也适用于已经从天然伴随该核酸的其他组分(即，RNA或DNA或蛋白质，所述组分在细胞中天然地伴随该核酸)基本上纯化的核酸。因此，该术语包括例如并入载体中、并入自主复制的质粒或病毒，或并入原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为与其他序列无关的单独分子(即作为cDNA或通过PCR或限制酶消化产生的基因组或cDNA片段)存在的重组DNA。其还包括为编码附加多肽序列的杂合基因的组成部分的重组DNA。
在本发明的上下文中，使用常见核酸碱基的以下缩写，“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，“U”是指尿苷。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的简并型式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语“编码蛋白质或RNA的核苷酸序列”也可以包含内含子至编码蛋白质的核苷酸序列可以在一些型式中含有内含子的程度。
如本文所用的“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在能够感染非分裂细胞的逆转录病毒中是独特的；它们可以将大量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。来源于慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。
本文所用的术语“接头”也被称为“间隔子”或“间隔子结构域”，是指任选地位于融合蛋白中的两个氨基酸序列之间的氨基酸或氨基酸序列。
术语“可操作地连接”(以及术语“在转录控制下”)是指在调控序列和异源核酸序列之间的导致异源核酸序列表达的功能连接。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系中时，该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，并且在必要时在相同的阅读框中连接两个蛋白质编码区。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换地使用，并且是指人类。
术语“多核苷酸”是核苷酸链，也被称为“核酸”。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域中可得的任何手段获得的所有核酸序列，并且包括天然存在的和合成的核酸。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且不限制可以构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指在本领域中通常还被称为例如肽、寡肽和寡聚物的短链和在本领域中通常被称为蛋白质(存在多种类型的蛋白质)的较长链两者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽，或它们的组合。
术语“启动子”意指由细胞的合成机制或引入合成机制识别，以引发多核苷酸序列的特异性转录所需的DNA序列。
“体细胞”意指不成为配子的任何多细胞生物(优选动物)细胞。
术语“治疗有效量”应指将引起研究者或临床医师所寻求的组织、系统或动物的生物或医学应答的药物或药剂的量。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”意指将外源核酸转移或导入宿主细胞内的过程。“转染”或“转化”或“转导”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。转导的细胞包括原代受试细胞及其后代。
如本文所用的术语“治疗”疾病意指减少受试者所经历的疾病或疾患的至少一种病征或症状的频率或严重性。
“载体”是包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质的组合物。载体的实例包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸，质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还被解释为包括有助于将核酸转移到细胞内的非质粒和非病毒化合物，诸如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
范围：在本公开全文中，本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对本发明的范围的僵化限制。因此，应考虑对范围的描述，以具有具体公开的所有可能的子范围以及在该范围内的各个数值。例如，对诸如从1至6的范围的描述应该被视为具有具体公开的子范围，诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围的单独数目，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。
在任何氨基酸序列以Swiss Prot.或GENBANK登记号特别提及的情况下，该序列以引用方式并入本文。与该登记号相关的信息，诸如信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域、启动子序列和翻译起始处的鉴定也整体以引用方式并入本文中。
说明性实施方案描述
在一方面，提供了一种包含或表达转基因以及DHFRFS和TYMSSS中的一个或多个的分离的转基因哺乳动物T细胞。在一些实施方案中，该分离的转基因哺乳动物T细胞包含或表达转基因、DHFRFS和TYMSSS。简言之，T细胞可以从外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤获得。可以使用本领域可获得的T细胞系。优选地，使用本领域的技术人员已知的任何数量的技术来从自受试者收集的单位血液中获得T细胞。T细胞的分离可以根据本领域中已知的程序进行，如在US2013/0287748 A1中所描述的。然后将所收获的T细胞使用本领域中众所周知的方法扩增，如在US2013/0287748 A1中所描述的。
根据一个实施方案，将T细胞收获并处理以供进行如下的慢病毒转导。将患者外周血单核细胞纯化并在含有1％人血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤。根据已知方法，通过使用磁珠耗竭单核细胞来富集淋巴细胞。根据先前由Levine等人，(1998),JHematother7:437-448所描述的良好制造生产规范(Good Manufacturing Practiceregulations)来培养淋巴细胞。将细胞在补充有10％的正常人抗体血清的无血清造血细胞培养基(例如，Lonza Group Ltd.的X-VIVO 15(化学上限定的无血清造血细胞培养基))中离体扩增14天，然后在培养的第14天进行处理以供再灌注。使用磁性细胞分离系统去除磁珠。将细胞收获、洗涤并重悬于含有1％人血清白蛋白的勃脉力A(Plasmalyte A)中，然后用慢病毒载体转导。
如本文所证实的，T细胞经遗传修饰以表达抗胸苷酸抗性(AThyR)转基因和其他转基因。AThyR显示为可以挽救T细胞免受抗胸苷酸(AThy)药物毒性，诸如由5-FU介导的AThy毒性和靶向DHFR和TYMS的抗叶酸制剂。此外，如本文所证实的，DHFR突变蛋白如DHFRFS允许氨甲蝶呤(MTX)可诱导的胸苷依赖型转基因表达的增加，而TYMS突变蛋白如TYMSSS允许MTX可诱导的二氢叶酸依赖型转基因表达的减少。如本文进一步证实的，AThyR可用于在不使用免疫原性基因或磁选择的情况下阳性选择目标转基因。
被单独或组合地工程化到表达目标转基因的T细胞内的AThyR转基因DHFRFS和TYMSSS的使用提供了在大量群体中选择转基因表达的独特能力，可以调节目标顺式和反式转基因的表达，并促进在毒性浓度的AThy中的存活。因此，表达目标转基因的T细胞，诸如表达靶向肿瘤的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，经进一步工程化以表达AThyR(诸如DHFRFS和/或TYMSSS)，其可用于治疗需要新治疗选项的癌症，诸如肺癌、结肠癌、乳腺癌和胰腺癌。
如本文所证实的，在T细胞中组合AThyR DHFRFS和AThyR TYMSSS导致了用毒性浓度的AThy:MTX、Pem或5-FU处理的此类细胞的显著存活优点。这些AThy药物通常用于治疗肺癌和结肠癌以及其他常见癌症。本文所述的发现表明AThyR T细胞可在毒性AThy浓度下存活。组合化疗如5-FU的免疫调节作用和抗5-FU的细胞毒性效应的T细胞可以显著提高患者的抗癌应答至超出单独使用的任一治疗剂的抗癌应答。
如本文所述，出于在T细胞表达中选择目标转基因的目的，将AThyR与最早的耐药转基因之一-NeoR进行比较。如本文所述，发现DHFRFS在促进代表性转基因(eGFP)的存活、选择和药物依赖性表达增加方面优于NeoR。值得注意的是，DHFRFS和TYMSSS具有如人类蛋白的较低免疫原性，并且MTX可以在体外和体内两处用来改善转基因选择，而G418不能。本文所述的发现表明DHFRFS可以选择表达转基因(诸如自杀基因iC9)的细胞。因此，DHFRFS和[DHFRFS和TYMSSS]是替代用于选择表达一个或多个目标转基因的T细胞的磁珠的有吸引力的替代物。事实上，使用MTX在体内选择AThyR+T细胞的可能性指示转基因选择可以在患者体内而不是离体进行。
在另一方面，提供了一种抑制哺乳动物T细胞中的AThy毒性的方法，该方法包括在所述哺乳动物T细胞中表达AThyR转基因。在一些实施方案中，该AThyR转基因是DHFRFS。在一些实施方案中，该AThyR转基因是TYMSSS。
在另一方面，提供了一种用于选择表达目标转基因的T细胞的方法。该方法包括：施加胸苷合成抑制剂到多个T细胞，该多个T细胞包括表达目标转基因和DHFRFS的T细胞；以及选择在施加胸苷合成抑制剂七天或更多天后存活的一个或多个T细胞，其中该一个或多个T细胞表达包含目标转基因和DHFRFS的载体。可以从由氨甲蝶呤(MTX)、5-FU、雷替曲塞和培美曲塞组成的组中选择胸苷合成抑制剂。
在一些实施方案中，将DNA序列，包括来自本文所述基因的DNA序列，插入载体中。来源于逆转录病毒的载体是优选的，因为它们之后提供长期的基因转移并允许转基因的稳定整合及其在子细胞中的增殖。编码本文所述的AThyR的核酸的表达可以使用众所周知的分子生物学技术，通过将编码AThyR的核酸可操作地连接至启动子以及将该构建体并入合适的表达载体内来实现。载体可以适用于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体含有可用于调节所需核酸序列的表达的转录和翻译终止子、启动序列以及启动子。
在一些实施方案中，一个或多个DNA构建体编码转基因和编码一个或多个AThyR、DHFRFS和TYMSSS的一个或多个DNA构建体。在其他实施方案中，该转基因和一个或多个AThyR、DHFRFS和TYMSSS可操作地连接。编码编码一种或多种转基因和一种或多种AThyR、DHFRFS和TYMSSS的各种核苷酸序列的嵌合构建体可以通过众所周知的分子生物学技术，从天然来源的或合成制备的编码所述组分的核酸来制备。嵌合构建体可以使用天然序列来制备。可以适当地分离和操纵天然基因，以便允许适当连接各个结构域。因此，可以通过采用导致基因的不希望部分缺失的合适引物进行聚合酶链式反应(PCR)来制备序列的截短部分。或者，可以使用引物修复，其中目标序列可以被在适当的宿主中克隆。在任一种情况下，可以采用导致终点的引物，该终点允许序列退火而产生编码CAR蛋白的所需开放阅读框。因此，序列可以经选择以提供钝端或具有互补重叠的限制性位点。优选地，构建体是通过重叠PCR制备的。
如本文所证实的，抗胸苷酸或胸苷合成的抑制剂，例如MTX，可以用来将转基因表达调节成较高或较低表达水平的对于DHFRFS或TYMSSS顺式表达的转基因。据信MTX可诱导的对顺式转基因的正或负调控在临床上可用于其中MTX被用来调控T细胞中危险但必需的转基因的空间和时间表达的情况，该危险但必需的转基因为诸如表达某些嵌合抗原受体(CAR)或细胞因子的转基因。DHFRFS与反式表达的TYMSSS的相关表达还可用于表达需要以几乎相等量表达的蛋白质，诸如TCRα和β，并且其中2A介导的切割位点的使用可能不利地影响蛋白质结构和功能。
另一方面是一种用于选择性增殖对MTX和5-FU具有抗性的外周血单核细胞(PBMC)的方法。该方法包括：使用包含AThyR基因的载体来转染外周PBMC，用胸苷合成抑制剂处理经转染的PBMC，以及选择表达AThyR基因的PBMC。在此方面的一些实施方案中，该方法进一步包括：从经转染的PBMC来增殖T细胞群体。在一些实施方案中，该胸苷合成抑制剂可以选自由氨甲蝶呤(MTX)、5-FU、雷替曲塞和培美曲塞组成的组。在一些实施方案中，该胸苷合成抑制剂是MTX。在一些实施方案中，该AThyR基因是TYMSSS。在一些实施方案中，该AThyR基因是DHFRFS。
另一方面是一种包含含有目标转基因和编码DHFRFS或TYMSSS的核苷酸序列的核酸序列的分离的转基因哺乳动物T细胞。在一些实施方案中，该分离的转基因哺乳动物T细胞所包含的核酸包含目标转基因和编码DHFRFS的核苷酸序列，其中该目标转基因和该编码DHFRFS的核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，该分离的转基因哺乳动物T细胞所包含的核酸包含目标转基因和编码TYMSSS的核苷酸序列，其中该目标转基因和该编码TYMSSS的核苷酸序列可操作地连接。
在另一方面，提供了一种表达转基因和DHFRFS的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中该T细胞包含(1)包含编码该转基因的序列的多核苷酸，以及(2)包含编码DHFRFS的序列的多核苷酸。
在某些方面，编码DHFRFS的序列编码与SEQ ID NO:12具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的多肽。在一些实施方案中，编码DHFRFS的序列编码相对于SEQ ID NO:12具有不超过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸缺失、插入或取代的多肽。
在另一方面，提供了一种表达转基因和TYMSSS的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述T细胞包含(1)包含编码该转基因的序列的多核苷酸，以及(2)包含编码TYMSSS的序列的多核苷酸。
在某些方面，编码TYMSSS的序列编码与SEQ ID NO:11具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的多肽。在一些实施方案中，编码TYMSSS的序列编码相对于SEQ ID NO:11具有不超过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸缺失、插入或取代的多肽。
在另一方面，提供了包含多个人细胞(例如T细胞)的组合物，其中所述细胞包含编码TYMSSS的序列和第一转基因，所述细胞已用MTX处理(例如，在培养中或在活生物体中)，从而改变转基因的表达。在某些实施方案中，转基因编码CAR、TCR、多肽激素(例如内分泌激素，诸如胰高血糖素)、细胞因子、转录因子或趋化因子。在另一方面，所述实施方案的转基因编码细胞表面多肽，诸如整合素、细胞因子受体、趋化因子受体或激素受体(例如神经或内分泌激素)。
在另一方面，提供了包含多个人细胞(例如T细胞)的组合物，其中所述细胞包含编码DHFRSS的序列和第一转基因，所述细胞已用MTX处理(例如，在培养中或在活生物体中)，从而改变转基因的表达。在某些实施方案中，转基因编码CAR、TCR、多肽激素(例如内分泌激素，诸如胰高血糖素)、细胞因子、转录因子或趋化因子。在另一方面，所述实施方案的转基因编码细胞表面多肽，诸如整合素、细胞因子受体、趋化因子受体或激素受体(例如神经或内分泌激素)。
在另一方面，提供了一种包含从哺乳动物分离并用胸苷合成抑制剂处理的第一多个T细胞的组合物，其中相较于从在抗体刺激期间用胸苷合成抑制剂耗竭的哺乳动物分离的第二多个T细胞，该第一多个T细胞富含调节性T细胞，所述抗体包括抗CD2、抗CD3、抗CD27、抗CD28、抗41BB、抗OX40、植物凝集素(PHA)、离子霉素或肽脉冲的抗原呈递细胞的任意单一或联合使用(如果被用来以使T细胞开始复制的方式刺激T细胞，则不论是合成的还是生物的，且为任何细胞来源的，是人类的或其他来源的)。
在另一方面，提供了一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的T细胞，该T细胞为上述实施方案中的任何一个中的分离的T细胞。虽然几乎没有细胞疗法并且没有基于细胞的基因疗法目前被FDA批准，但是本文报导的转基因技术中的任意一种可以用于制备施用给患有癌症的患者的组合物。此外，CAR介导的离体扩增可用于产生治疗有效量的的T细胞，该T细胞为上述实施方案中的任何一个中的分离的T细胞。
本发明的经加工T细胞可以通过将含有任何上述核酸构建体的慢病毒载体导入T细胞(诸如要治疗癌症或由IgE介导的变应性疾病的患者的自体T细胞)内来产生。从需要这种治疗的患者收集包含自体T细胞的组合物。将细胞工程化成离体的经加工T细胞，使用本文所述和本领域中已知的方法活化并扩增，然后输注回患者体内。经加工T细胞在体内复制，从而产生抵抗癌细胞或表达mIgE的其它细胞的持续免疫。
可以加工任何上述分离的T细胞，然后将经加工T细胞用如上所述的慢病毒载体转导以产生经加工T细胞供施用。转导是根据已知方案进行的。
将经加工T细胞施用于需要治疗IgE介导的变应性疾病的受试者。经加工T细胞能够在体内复制，从而提供可以导致持续的变应性疾病控制的长期持久性。经加工的T细胞可以单独施用或与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或与其它组分(例如细胞因子或其它细胞群体)组合而作为药物组合物施用。此类组合物可以包含缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。组合物优选经配制用于静脉内施用。优选地，T细胞包括自体T细胞，其从受试者中移除并且经离体工程化以表达CAR并施用于受试者。
经加工T细胞或其药物组合物可以通过导致有效量的细胞被有效递送至患者以实现药理效应的途径施用。施用通常是肠胃外的。静脉内施用是优选途径，其使用免疫疗法中通常已知的输注技术(参见例如Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。CAR+T细胞的数量和施用频率由诸如患者状况以及患者疾病的类型和严重程度的因素确定，尽管适当的剂量可以通过临床试验来确定。“有效量”是由医生考虑患者的年龄、体重、疾病状态和疾病严重程度的个体差异来确定的。通常，以单剂量给予的CAR+T的量将在约106至109个细胞/kg体重的范围内，包括在那些范围内的所有整数值。CAR+T可以以这些剂量多次施用。针对特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病病征并相应地调节治疗来容易地确定。
在另一方面，提供了一种用于选择表达目标转基因的T细胞的方法，如在任意附图中所示或如在说明书中所描述。
在另一方面，提供了一种T细胞，如在任意附图中所示或如在说明书中所描述。
在另一方面，提供了一种用于选择性增殖对MTX、5-FU、雷替曲塞和培美曲塞中的一种或多种具有抗性的原代人T细胞的方法，如在任意附图中所示或如在说明书中所描述。
另一方面是一种通过以下步骤来在从哺乳动物分离的T细胞群体中富集调节性T细胞的方法：使所述群体与选自由MTX、5-FU、雷替曲塞和培美曲塞或其组合组成的组的胸苷合成抑制剂接触，以选择性地耗竭该群体中的效应T细胞。在一些实施方案中，将从哺乳动物分离的该T细胞群体与MTX和5-FU两者接触。在一些实施方案中，T细胞表达DHFRFS和TYMSSS中的一种或多种。在一些实施方案中，T细胞表达DHFRFS和TYMSSS两者。
对5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷(AICAR)合成的特异性抑制已经在本文中表现为既对T细胞无毒性，也对TCD4,FoxP3无选择性。现已发现TCD4,FoxP3中的FoxP3表达被AICARtf抑制的特异性作用所增强，这表明AMPK的某种作用可以改善Treg表型。不希望受理论束缚，本文所述的分离的Treg研究表明MTX的作用是双重的：1)对Treg的选择依赖于Teff的缺失，因为Teff的去除阻碍了MTX处理后Treg的选择性增长。2)MTX的作用确实在一些方面增强了Treg的功能活性，因为Teff增殖的潜伏相关肽(LAP)表达和抑制被增加到高于未处理的Treg。AMPK在不存在用MTX进行的叶酸耗竭的情况下的活化在转基因T细胞实验中被实现并且增加了具有功能性Treg表型的T细胞的百分比。因此，MTX耗竭Teff并促进免疫抑制性的Treg表型。
另一方面是一种通过以下步骤来在从哺乳动物分离的T细胞群体中耗竭调节性T细胞的方法：在一种或多种氨基糖苷类的存在下培养所述群体，以选择性地耗竭所述培养物中的调节性T细胞。在一些实施方案中，T细胞表达DHFRFS和TYMSSS中的一种或多种。在一些实施方案中，T细胞表达DHFRFS和TYMSSS两者。在一些实施方案中，当存在阻止G418毒性的新霉素抗性基因时，可以从G418介导的耗竭中挽救Treg。氨基糖苷类耗竭可以特异地限于调节性T细胞。虽然氨基糖苷类已经被使用了几十年，但是这种药物耗竭Treg的能力尚未被描述。不希望受理论束缚，最有可能的解释是药物的体内使用剂量远低于在体外用于耗竭Treg的那些剂量，并且往往因为对多种组织的毒性而被中断。
在一些实施方案中，可将氨基糖苷类药物施用于患有肿瘤的患者，以增强抗肿瘤活性。例如，氨基糖苷类可以例如通过疗法中的预治疗来施用。
另一方面是一种用于选择从哺乳动物分离的调节性T细胞的方法。该方法包括：用胸苷合成抑制剂处理表达DHFRFS和TYMSSS中的一种或多种的多个T细胞，以及选择表达调节性T细胞的标记物的调节性T细胞。在一些实施方案中，T细胞表达DHFRFS。在一些实施方案中，该选择步骤包括使用抗CD4抗体、抗CD25抗体、抗CD3抗体、抗CD8抗体、抗CD25抗体、抗CD39抗体、抗CD45抗体、抗CD152抗体、抗KI-67抗体和抗FoxP3抗体中的一种或多种，用磁珠分选来进行细胞分离。在一些实施方案中，该胸苷合成抑制剂选自由氨甲蝶呤(MTX)、5-FU、雷替曲塞或培美曲塞组成的组。在一些实施方案中，该方法还包括：用叶酸、亚叶酸(leucovarin)和FU中的一种或多种来处理调节性T细胞。
如本文进一步证实的，AThyR保护AThyR T细胞免受来自MTX或Pem的抗叶酸毒性。本文描述的结果表明MTX对T细胞的毒性比Pem高，并且对<1μM MTX的MTX易感性可以通过对DHFRFS的密码子优化或者通过在T细胞中添加TYMSSS至DHFRFS来完全消除。在类风湿性关节炎的治疗期间达到了高达1μM MTX浓度。较高剂量的MTX是在癌症化疗中通过使用甲酰四氢叶酸实现的(>1mM MTX)。亚叶酸通过与DHFRFS和TYMSSS组合相同的途径挽救胸苷合成。因此，据信[DHFRFS和TYMSSS]+T细胞将可能抵抗由免疫抑制和癌症治疗所经历的MTX范围诱导的细胞毒性。
在另一方面，提供了一种包含从哺乳动物分离的第一多个T细胞和胸苷合成抑制剂的组合物。相较于从哺乳动物分离的不包含胸苷合成抑制剂的第二多个T细胞，该第一多个T细胞富含调节性T细胞。
在任何上述方面和实施方案中的各种实施方案中，如本文所用的T细胞(T淋巴细胞)可包含或由任何天然存在或人工(例如，合成地、遗传地、重组地)工程化的免疫细胞组成，所述免疫细胞表达天然存在T细胞受体或被制备成在细胞表面上表达或呈递人工(例如，合成地、遗传地、重组地)工程化的T细胞受体或其部分，包括例如但不限于嵌合、人源化、异源、异种、同种异体和自体的T细胞受体。
在任何上述方面和实施方案中的各种实施方案中，如本文所用的“T细胞”包括所有形式的T细胞，例如但不限于T辅助细胞(TH细胞)、细胞毒性T细胞(Tc细胞或CTL)、记忆T细胞(TCM细胞)、效应T细胞(TEM细胞)、调节性T细胞(Treg细胞；又被称为抑制性T细胞)、自然杀死T细胞(NKT细胞)、粘膜相关的不变T细胞、α-βT细胞(Tαβ细胞)以及γ-δT细胞(Tγδ细胞)。
应当理解，上述一般描述和以下详细描述仅仅是示例性和说明性的，而非限制所要求保护的本发明。通过引用并入本文并且构成本说明书的一部分的附图示出了本发明的某些实施方案，并与详细描述一起用来解释本发明的原理。
本申请中提及的所有引用的专利和出版物全文以引用方式并入本文。
实施例1
材料和方法
细胞和培养条件：
细胞：将来源于均在德克萨斯州休斯顿(Houston,Texas)的海岸区血库(GulfCoast Regional Blood Bank)或MDACC血库(MDACC Blood Bank)的外周血单核细胞(PBMC)使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare Biosciences,Piscataway Township,NJ；目录号17-1440-02)进行密度梯度离心。将PBMC在CliniMACS加上PBS/EDTA缓冲液(MiltenyiBiotec,Gladbach,Germany，目录号130-070-525)中洗涤一次并在杜尔贝科氏PBS(Dulbecco’s PBS)(D-PBS)(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri，目录号D8537)中洗涤两次，然后在用RPMI 1640(Thermo Scientific Hyclone,Bridgewater,NJ；目录号SH30096.01)、10％热灭活胎牛血清(FBS-Thermo Scientific Hyclone，目录号SH30070.03)和2mM GlutaMAX补充剂(Life Technologies,Grand Island,NY；目录号35050061)制成的完全培养基(CM)中静息。或者，将PBMC使用50％热灭活的FBS、40％RPMI1640和10％DMSO(Sigma-Aldrich,PA；目录号D2650)-冷冻培养基(FM)的制备混合物以4×107个细胞/mL冷冻。下面概述了在每个实验中静息或冷冻的PBMC的使用。在CM中使用并保持Jurkat细胞系，一种人T细胞急性成淋巴细胞性白血病(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection),Manassas,VA，目录号TIB-152)。此细胞系的身份是通过由MDACC癌症中心补助拨款表征的细胞系中心(MDACC Cancer Center SupportGrant Characterized Cell Line Core)执行的短串联重复DNA指纹识别确保的。使用活化和增殖的细胞(AaPC)来刺激T细胞。将表达CD86、CD137、CD64以及膜结合的IL-15的AaPC细胞系K562克隆4进行修饰以呈递用于多克隆刺激T细胞的OKT3抗体，如先前所描述的(Singh等人，Journal of immunotherapy2014,37(4):204-213)。为了增殖嵌合抗原受体(CAR)+T细胞，利用AaPC CARL+K562(Rushworth等人，Journal of immunotherapy 2014,37(4):204-213)。
将所有AaPC在37℃的水浴中迅速解冻，并洗涤两次，然后刺激T细胞(Singh等人，同上)。在使用前测试Jurkat和AaPC中的支原体存在。在0.1％台盼蓝(Trypan Blue)(Sigma-Aldrich,T8154)的混合物中使用Cellometer K2Image Cyotmeter(Nexcelom,Lawrence,MA)完成细胞计数。
化学试剂和生物试剂：
经由CD3和CD28进行的刺激是通过添加30ng/mL OKT3抗体(eBioscience,SanDiego,CA，目录号16-0037-85)、100ng/mL抗CD28抗体(EMD Millipore,Temecula,CA，目录号CBL517)实现的。T细胞刺激包括重组人IL-2(Proleukin,Prometheus Labs,San Diego,CA)。必要时，使用以下药物：5-FU、MTX、培美曲塞、雷替曲塞、G418和AP20187。关于每种药物的进一步信息在表1中给出。
DNA表达质粒：
用于测试抗胸苷酸抗性(AThyR)转基因的DNA质粒是使用先前描述的DNA质粒G4CAR作为骨架产生的(Rushworth等人，同上)。将商业合成的FLAG-DHFRFS、经密码子优化的(CoOp)DHFRFS、FLAG-TYMSss和CoOp TYMSss DNA(Life Technologies,Gene Art)以及新霉素抗性基因(NeoR)DNA产物用NheI和ApaI切割。具有N末端SV40核定位序列(RFP)的报告基因mCherry、可诱导的自杀基因CoOp iC9(均由GeneArt生产)和增强的绿色荧光蛋白。
表1.化学试剂
Figure BDA0001386783750000401
将(eGFP)DNA用ApaI和KpnI消化。将G4CAR骨架用NheI和KpnI限制性酶消化。将G4CAR骨架与NheI和ApaI消化的片段以及ApaI和KpnI消化的片段以三组分连接方式进行连接。NheI、KpnI和ApaI的酶消化位置示出于图1B中。将耐药组分(DHFRFS、TYMSss或NeoR)用转基因(RFP、CoOp iC9和GFP)置换以制备以下DNA质粒：FLAG-DHFRFS-2A-eGFP pSBSO(DG)、FLAG-CoOp DHFRFS-2A-eGFP pSBSO(CoOp DG)；FLAG-TYMSss-2A-GFP pSBSO(TSG)；FLAG-CoOp TYMSss-2A-GFP pSBSO(CoOp TSG)；FLAG-TYMSss-2A-RFP pSBSO(TSR)；NeoR-2A-GFPpSBSO(NRG)；以及FLAG-DHFRFS-2A-iC9pSBSO(DFSiC9)。构建体FLAG-TYMSSS-2A-IL-12p35-2A-IL-12p40pSBSO(TSSSIL-12)是从经密码子优化的(GeneArt,Life Technologies)IL-12p35和IL-12p40转基因合成并在2A区内被消化以将IL-12p35和IL-12p40与也在2A区内被消化的TYMSSS片段连接。TSSSG骨架消化点5’至TYMSSS的起始位点以及3’至IL-12p40终止位点将该三个组分以四部分连接方式连接到TSSSG的骨架中。还提供了一种构建体，其编码Myc-DHFRFS-2A(对应于Myc-DHFRFS-2A的多肽序列被提供为SEQ ID NO:10)。TYMSss的多肽序列被提供为SEQ ID NO:11。DHFRFS的多肽序列被提供为SEQ ID NO:12。执行对DHFRFS和TYMSss DNA的密码子优化，以避免mRNA转录物分别与DHFR和TYMS蛋白结合。DHFR和TYMS的mRNA的已知RNA结合基序分别由DHFR(Tai等人，The Biochemical journal 2004,378(Pt3):999-1006)和TYMS(Lin等人，Nucleic acids research 2000,28(6):1381-1389)识别。在保持每种蛋白质的氨基酸序列的同时尽可能地改变DHFRFS和TYMSss的密码子，以避免mRNA转录物的蛋白质结合。先前描述的CD19特异性嵌合抗原受体(CAR)(Rushworth等人，同上)是在不经修饰的情况下使用的。
Myc-ffLuc-NeoR pSBSO(NRF)是使用在用NheI和SpeI进行限制性消化后分离的CD19-2A-Neo pSBSO的骨架(Rushworth等人，同上)构建的。将经NheI和SpeI消化的Myc-萤火虫荧光素酶(ffLuc)插入物连接至CD19-2A-Neo骨架，然后用SpeI和EcoRV消化该连接产物。然后将经SpeI和EcoRV消化的NeoR片段连接至经消化的骨架以产生NRF。所有构建体含有睡美人(SB)间接/直接重复(IR/DR)位点，以诱导在SB转座酶的存在下的基因组整合。使用延伸因子1α(EF1-α)启动子来促进每个转基因。各构建体的卡通表示可见于图1B和图8A中。选定的DNA和蛋白序列可见于表2中。
表2.合成DNA/蛋白序列
Figure BDA0001386783750000421
Figure BDA0001386783750000422
细胞的遗传修饰与增殖：
使用Amaxa
Figure BDA0001386783750000431
II(Lonza,Allendale,NJ)电穿孔Jurkat和人PBMC两者。Jurkat细胞的电穿孔利用了含有5mM KCl、15mM MgCl2、pH 7.2的120mM Na2HPO4/NaH2PO4以及50mM DMSO的改良缓冲液(Chicaybam等人，Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America 2002,99(6):3400-3405)，其中将106个Jurkat细胞/比色皿使用程序T-14电穿孔，然后立即转移到CM。在电穿孔48小时后加入药物，并且使细胞培养保持不受干扰，直到电穿孔后10至12天时进行基因表达的取样。人PBMC电穿孔按照先前描述的方案(Rushworth等人，同上)。简言之，使用程序U14将1至2×107个解冻的PBMC/比色皿在Amaxa T细胞核转染溶液(Nucleofector solution)(LonzaBiosciences；目录号VPA-1002)中进行电穿孔。除非另有说明，否则在第二天将PBMC在新鲜CM中用1:1比率的AaPC(包含50IU/mL IL-2)比率刺激。在每次刺激时维持106个细胞/mL的细胞共培养浓度，并且将PBMC来源的T细胞每7天使用相同的浓度重新进行刺激。当在各次刺激之间更换培养基时加入IL-2。药物处理在共培养开始48小时后开始，并持续至第14天。药物仅与新鲜的CM一起加入。
蛋白质印迹：
将106个T细胞从培养物中离心，吸去上清液，并将沉淀物在液氮中快速冷冻。使用50mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸盐、1mM苯甲基磺酰氟、150mM对硝基苯磷酸盐和0.3μM抑肽酶，pH 7.4收获全细胞提取物。在还原条件下通过SDS-PAGE分离蛋白质，并将其使用表3所示的特异性一抗进行分析。使用增强的化学发光检测系统进行检测。
流式细胞术：
将培养的细胞重悬，并在FACS染色溶液中洗涤一次(Rushworth等人，同上)。如果寻求单独的转基因表达，则随后在流式细胞仪上分析试样。使用BD LSRFortessa(BDBiosciences)来分析RFP表达；或者使用BD FACSCalibur(BD Biosciences)。在4℃下在FACS染色溶液中用荧光染料缀合的抗体进行至少30分钟的表面抗体染色。抗体靶标、浓度和制造商列出于表4中。流式细胞术数据分析利用FlowJo v 10.0.5(Tree Star Inc.,Ashland,OR)。
荧光素酶测定：
通过D-荧光素(Perkin Elmer,Waltham,MA，目录号122796)的切割来测试所培养T细胞的ffLuc转基因持久性。将重悬的细胞涂铺并在D-PBS中洗涤一次，然后在0.14mg/mLD-荧光素的D-PBS溶液中进行测试。在37℃下孵育10分钟后，将板在TopCount NXT发光计数器(Perkin Elmer)上分析。
表3.蛋白质印迹抗体
Figure BDA0001386783750000441
表4.流式细胞术抗体
Figure BDA0001386783750000442
Figure BDA0001386783750000451
铬释放测定：
通过CRA评估抗原特异的细胞毒性。先前描述了此测定(Rushworth等人，同上)。简言之，在每个细胞系负载51Cr达3小时并随后与CD19特异性CAR+T细胞以1个靶标:5个效应细胞的比率孵育6小时后，比较抗原阳性CD19+EL-4与抗原阴性CD19-EL-4。用TopCount NXT闪烁计数器来评估来自细胞裂解的51Cr释放。
统计分析：
使用Prism v6.0(Graph Pad Software Inc.,La Jolla,Ca)来实现数据的统计分析和图形表示。多于一个变量的实验通过多变量分析来进行分析：在适当时使用Sidak多重比较检验进行双向ANOVA，在适当时使用适用的图基或邓奈特多重比较检验(Tukey’s orDunnett’s multiple comparison tests)进行单向ANOVA，非高斯分布(non-Gaussiandistributions)通过鲁斯卡尔-沃利斯检验以及之后进行的邓恩多重比较检验(Dunn’smultiple comparison test)进行评估。使用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)进行单变量检验(实验对比对照)。统计显著性被指定为α<0.05。
结果
A.在Jurkat中测试AThyR转基因选择
使用DHFRFS来确定T细胞是否可以被遗传修饰成抗在恶性肿瘤的初始治疗中使用的有毒剂量的AThy。抗MTX的DHFRFS+T细胞由Jonnalagadda等人，PloS one 2013,8(6):e65519和Jonnalagadda等人，Gene therapy 2013,20(8):853-860描述。在人细胞中测试先前在细菌培养系统中鉴定的抗5-FU的TYMS突变蛋白(Landis等人，Cancer research 2001,61(2):666-672)(数据未示出)，并选择TYMSss进行进一步研究，
为了测试每个AThyR的增强存活，将单独表达DHFRFS、TYMSss和NeoR的构建体连接到在eGFP上游含有睡美人(SB)转座元件的相同骨架中(图1B)。使用eGFP来追踪存活的经遗传修饰的T细胞的优势。将Jurkat细胞与每个构建体和SB11转座酶一起共电穿孔(Singhet等人，Cancer Research 2008,68(8):2961-2971)，该SB11转座酶介导每个构建体的基因组整合。电穿孔两天后加入细胞毒性药物。在第10至12天通过碘化丙啶(PI)排斥来评估Jurkat的活细胞中eGFP表达(图1C)。寻求以eGFP表达的增加百分比作为药物存在下的转基因选择的量度。eGFP的总体生存和平均荧光强度(MFI)还分别在图2AI和图AII中给出。总体而言，数据表明，DHFRFS具有比传统耐药转基因NeoR好得多的选择。该数据还表明，TYMSss没有独立增强Jurkat存活的能力。
更具体地，发现DHFRFS赋予对在0.01-0.5μM浓度范围内的MTX的抗性，并且DHFRFS的密码子优化将CoOp DHFRFS的耐药性范围增加至0.01-1μM(图1C)。密码子优化去除了潜在内源性DHFR结合至DHFRFS mRNA以及可能的微RNA结合结构域。值得注意的是，对eGFP+细胞的门控证明DHFRFS构建体导致了eGFP MFI的MTX依赖性增加。因此，单个细胞内的eGFP表达基于MTX的添加而增加。此发现的发生在达到5μM MTX之前不依赖于mRNA调节，其中内源性密码子DHFRFS表达相较于CoOp DHFRFS显著降低(p<0.0001)(图2A-II)。药物可诱导的转基因表达是罕见的现象。这种现象虽然罕见，但不是新的。尽管先前已对于天然DHFR进行了DHFR以MTX依赖性方式增加顺式表达的eGFP的能力的描述，但是这种现象归因于MTX结合DHFR、DHFR释放DHFR mRNA和游离的DHFR mRNA导致DHFR蛋白翻译增加(Meyer等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 2002,99(6):3400-3405)。在此应注意到，该现象还在使用抗MTX的DHFRFS时发生，并且在从0.01至1μM MTX时使用DHFRFS而不依赖于mRNA调节地发生。因此，不希望受任何理论约束，据信DHFR表达的调节部分地通过迄今为止未知的非mRNA依赖性机制发生。
当用5-FU测试时，对表达TYMSSS的Jurkat没有药物选择性优势(图1C)。天然密码子TYMSSS在任何浓度的5-FU下都没有超越无DNA Jurkat的表达优势。对eGFP+细胞的进一步eGFP MFI分析显示，与CoOp TYMSSS相比，TYMSSS在较低eGFP MFI下表达(图2A)。结论为，由于基于mRNA的抑制产生的TYMSFS的较低表达导致缺乏TYMSSS存活优势。当mRNA调控机制被密码子优化消除时，TYMSSS具有优于模拟电穿孔的Jurkat的显著表达优势，以及在5μM 5-FU中的微弱存活优势。不希望受任何理论约束，缺乏显著增强的存活可能是由于5-FU有助于毒性的替代机制导致的。
使用NeoR来在G418存在下选择Jurkat的增强存活。这旨在作为衡量DHFRFS和TYMSSS效用的标准。将NeoR电穿孔到Jurkat中改善了在G418存在下于0.72至1.1mM G418时的存活(图1C)。NeoR超过无DNA的存活优势由于变异性而不显著(图2A)，但是注意到了GFPMFI的G418依赖性增加。在1.4mM G418时，GFP MFI显著增加，高于无DNA Jurkat(图2A-II)。这些结果加强了以下观点：DHFRFS和NeoR能够在存活的Jurkat中提供剂量依赖性转基因选择优势。然而，仅DHFRFS在本实验中赋予给Jurkat可靠的存活优势(图2A-II)。
下一个实验通过将每个质粒共电穿孔到Jurkat内而组合了DHFRFS和TYMSSS。测试了组合的转基因抗常用抗叶酸AThy：MTX、Pem和雷替曲塞(Ral)的能力。如前，在第2天添加药物，并在第10至12天测试细胞。当与类似处理的无DNA或未处理的[DHFRFS和TYMSSS]+Jurkat相比时，在0.1至1μM MTX中存在对表达[DHFRFS和TYMSSS]的Jurkat的明显选择(图1D)。应当注意，在这些实验中使用内源密码子DHFRFS，并且通过在没有其他实验条件变化的情况下添加TYMSSS而将MTX抗性从0.5μM的MTX(图1C)增加至1μM MTX(图1D)。还注意到在50至100μM的Pem时有选择(图1D)。当与未处理的[DHFRFS和TYMSSS]+Jurkat相比时，使用10μMRal时也注意到了中等选择(图2B)。Ral主要靶向TYMS，而MTX和Pem则靶向DHFR和TYMS两者(Walling,Investigational new drugs 2006,24(1):37-77)，因此，在[DHFRFS和TYMSSS]+Jurkat中，MTX和Pem具有比Ral改善的选择。在1μM MTX内2周后，将存活的[DHFRFS和TYMSSS]+Jurkat在未处理的培养基中更新并生长3至5周。随后，通过流式细胞术测试[DHFRFS和TYMSSS]+Jurkat的转基因表达的稳定性，其中eGFP代表的DHFRFS表达和RFP代表的TYMSSS表达的共表达如图1E中可见。每种颜色代表一个单独的实验，并重叠以表示DHFRFS和TYMSSS以相关方式共表达的趋势。实际上，在多种浓度的多种抗叶酸药物下对GFP MFI代表的DHFRFS表达和RFP MFI代表的TYMSSS表达的分析表明，DHFRFS和TYMSSS以强皮尔森相关性(R2＝0.9)共表达(图2C)。不希望受理论束缚，此发现表明，DHFRFS表达在某种程度上受到TYMSSS表达的调控，反之亦然。
B.抗MTX和/或5-FU的原代人T细胞的选择性增殖。
如所证明的，TYMSSS增强了表达DHFRFS的Jurkat以在存在MTX和Pem的情况下存活的能力，MTX和Pem均靶向内源性DHFR和TYMS以阻止胸苷合成。鉴于DHFRFS和TYMSSS赋予对毒性MTX浓度的更稳健存活，进行使用MTX的实验以证明抗叶酸和AThy抗性。TYMSSS以及DHFRFS是通过电穿孔到人PBMC中而在人细胞中测试的。在电穿孔后第二天，用能够进行多克隆T细胞增殖的载有OKT3的AaPC刺激细胞。增殖示意图示出于图3A中。在AaPC刺激两天后，共培养物接受0.1μM MTX、5μM 5-FU或1.4mM G418，直到第14天，如在图3中指定的。从第1天至第35天每7天用1:1比率的AaPC和给定的50IU/mL IL-2重新刺激该共培养物。药物施用期间的前14天和在药物施用已经结束后的21天追踪转基因表达中的表型变化。转基因表达的每周变化可以在图3B-I、C-I、D-I中注意到。
对与荧光蛋白共表达的DHFRFS、TYMSSS和NeoR的初步测试证明了了使用MTX对DHFRFS表达以及G418对NeoR表达的快速和持续选择至几乎完全选择(图3B-I)。在第21天与无DNA T细胞相比，AThyR+T细胞(TAThyR)的存活和增殖表明AThyR或NeoR转基因的存在对T细胞存活和生长起作用(图4A)。在第35天，将表达AThyR和NeoR转基因的T细胞的总推断细胞计数与未处理的无DNA T细胞进行比较，并且NeoR+T细胞是在第35天时具有显著差生长的唯一T细胞(图4B-I)。与在Jurkat中的实验相反，TYMSSS在5-FU存在下在第21天存活的T细胞群体中表现出选择。然而，所选择的表达TYMSSS的T细胞未持续到第35天，并且当使用MTX和5-FU选择[DHFRFS和TYMSSS]时也注意到了缺乏持久性。不希望受任何理论束缚，胸苷合成可以通过TYMSSS恢复，并且胸苷转运蛋白随后使胸苷可用于未转化的细胞。不希望受任何理论束缚，这可能是由平衡的核苷转运蛋白介导的，因为允许5-FU进入的相同转运蛋白也介导胸苷的平衡转运。由于TYMSSS恢复氨甲蝶呤存在下的胸苷合成，所以DHFRFS不再能够选择表达DHFRFS和TYMSSS的T细胞，如图3B–I所示。
为了实现对TYMSSS的完全选择以便可能用于组合疗法中，将NeoR与DHFRFS、TYMSSS和[DHFRFS和TYMSSS]共电穿孔到原代T细胞内。对增殖方法进行的唯一改变是从第14至35天加入100IU/mL IL-2而不是50IU/mL，以补充在经G418选择的T细胞中已经注意到的不良过生长。当G418和5-FU组合用于T细胞选择时，较高剂量的IL-2不足以挽救不良过生长(图4B-II)。通过将NeoR共转染到表达DHFRFS和/或TYMSSS的T细胞中，观察到接近100％的转基因选择在所有组中具有相同的转基因选择动力学(图3C-I)。
测试了TYMSSS对承受MTX的T细胞中的DHFRFS选择的影响。将表达DHFRFS的质粒与共表达TYMSSS的RFP或仅表达RFP的载体一起共电穿孔到T细胞内。本实验遵循针对图3B所述的相同策略。由于技术上的限制，电穿孔至相同数目的T细胞内的DHFRFS表达质粒DNA的总量减少。因此，在实验开始时较少的T细胞初始表达DHFRFS，并且在14天的时间段内通过添加MTX而不完全地选择DHFRFS(图3D-I)。第14天之后DHFRFS的逐渐丧失使人联想到图3B–I中的TYMSSS表达。这表明AThyR转基因必须选择大部分的T细胞群体来维持群体内的稳定表达。关于TYMSSS对DHFRFS选择的影响，看似TYMSSS钝化了T细胞中的DHFRFS选择，因为对表达[DHFRFS和RFP]的T细胞的选择比对表达[DHFRFS和TYMSSS]的T细胞的选择更稳健。这归因于在TYMSSS的存在下胸苷合成的恢复(图3D-I)。5-FU的存在阻止了在具有或不具有TYMSSS的情况下对DHFRFS的选择，并且这归因于对mRNA和rRNA的非TYMSSS依赖性抑制。
还应指出的是，在所有T细胞实验中，转基因选择倾向于到第35天增加CD4+T细胞群体，这在未改良的T细胞培养中未观察到。在涉及于细胞毒性药物存在下选择的一种或多种转基因的任何实验中也注意到了这一点(图3B–II，3C–II，3D–II，相应的流体图参见图6A、6B和6C)。图3D-II中的实验表明这不是由细胞毒性药物引起的，而是转基因与细胞毒性药物的组合存在导致了到第35天时CD4+T细胞占优势。在针对AThyR+T细胞的初始药物选择7天后，没有注意到偏向CD4+T细胞优势的选择(图4C)，这与先前公布的使用DHFRFS T细胞的发现一致(Jonnalagadda等人，Gene therapy 2013,20(8):853-860)。比先前实验更长的后续时段(period of follow-up)表现出以下先前未知的现象：CD8+T细胞在细胞毒性损伤后的长时段内无法持续，或被CD4+T细胞选择性地过生长。
C.MTX增加了DHFRFS+T细胞中的顺式转基因表达
MTX介导的转基因表达变化可用于体内控制动物和人类中的转基因表达。因此，根据本发明，临床可用的药物MTX用于介导T细胞中转基因表达的上调或下调。为了研究此规律的持续性，将在Jurkat中表达的DHFRFS、CoOp DHFRFS和[DHFRFS和TYMSSS]在1μM MTX中选择2周，并静息3至5周，然后测试对DHFRFS表达的MTX介导调节。选择用于在Jurkat T细胞系中均一表达的DHFRFS和密码子优化(CoOp)DHFRFS的表达如图5A中所示。CoOp DHFRFS既不有助于DHFRFS的显著更高表达，如由顺式表达的eGFP所指示，也不阻止MTX诱导的转基因表达增加，如图5B所示。这是出乎意料的。然而，当TYMSSS与DHFRFS共表达时，注意到了MTX诱导的DHFRFS表达增加的丧失，如图5A和图5B中所示。加入TYMSSS导致了在不存在MTX的情况下天然DHFRFS表达的不显著减少。MTX的加入不能诱发在任一DHFRFS型式的唯一表达期间观察到的相同DHFRFS表达增加。因此，TYMSSS在MTX可诱导的DHFRFS增加中起作用。在某些实验中，TYMSSS与DHFRFS在Jurkat中的共表达钝化了MTX诱导的eGFP MFI增加(图3B-I)。因此，DHFRFS维持MTX可诱导的顺式转基因表达，该表达依赖于MTX介导的对TYMS的抑制。
这些转基因在原代T细胞中的表达接着试图重现MTX可诱导的DHFRFS表达增加的发现，该MTX可诱导的DHFRFS表达增加被TYMSSS阻止。通过在含有新霉素抗性的选择载体被包括时于增殖的第2至14天使用相应药物MTX、5-氟尿嘧啶(5-FU)和G418进行选择，来实现具有稳定性和纯度的DHFRFS、TYMSSS或[DHFRFS和TYMSSS]表达。在图5C中对于DHFRFS、TYMSSS或[DHFRFS和TYMSSS]可以注意到DHFRFS关联的eGFP和TYMSSS关联的RFP的表达。此外注意到，DHFRFS表达在MTX存在下增加(图5D)，但是当TYMSSS与DHFRFS共表达时，这种增加被钝化并且不再显著，如同在Jurkat一样。值得注意的是，通过用5-FU进行选择和经G418选择的顺式新霉素抗性基因，成功地在原代T细胞中实现了在无DHFRFS的情况下的TYMSSS表达。当测试高剂量MTX存在下TYMSSS的可诱导变化(图5D)时，发现TYMSSS关联的RFP显著下降。在相同处理条件下，DHFRFS以及TYMSSS的存在阻止了这种减少。MTX诱导了抗MTX的DHFRFS所恢复的TYMSSS表达的降低。这些发现可以表明，TYMSSS因5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10CH2THF)的缺乏而被抑制。不受任何特定机制的限制，提出导致5,10CH2THF减少的MTX，导致TYMS蛋白结合TYMS和TYMSSS mRNA，从而阻止了表达。应该注意的是，除了点突变以外，TYMSSS等同于天然序列。
基于图5A-B中的发现，提出DHFRFS表达也受到胸苷合成的调节。同样，基于图5C和D中的发现，提出TYMSSS表达受到四氢叶酸(THF)合成的调节。当THF的衍生物被用于制备胸苷时，得出了以下符合逻辑的结论：DHFRFS调节TYMSSS的表达，并且TYMSSS调节DHFRFS的表达。因此，应注意单独细胞内的DHFRFS和TYMSSS的相关表达。当通过观察图5E中的Jurkat的流体图和图5F中的原代T细胞的流体图来测试DHFRFS和TYMSSS的相关表达时，应注意到这一点。与DHFRFS共表达但不由与TYMSSS的顺式表达调控的对照RFP载体似乎不具有相同的共表达模式(图5F)。为了量化此观测结果，将表达[DHFRFS和TYMSSS]的Jurkat用不同浓度的抗叶酸剂MTX、培美曲塞和雷替曲塞处理2周。然后将每个单独孔的DHFRFS关联的eGFP MFI和TYMSSS关联的RFP MFI作图并相关联。DHFRFS和TYMSSS之间的关联表达是显著的，并且符合线性回归(图5G)。这些发现支持用于调节DHFR和TYMS的一般机制，该机制导致DHFRFS和TYMSSS的线性共表达。此模型示于图5H中。
基于图5H中的上述模型，似乎TYMSSS表达将因DHFRFS而从MTX存在下的强表达变化稳定。这在图5I中通过施加增加剂量的MTX、使用表达DHFRFS连同RFP或与RFP关联的TYMSSS的原代T细胞进行了测试。如所预期的，通过增加MTX的浓度，DHFRFS关联的eGFP增加，并且此增加由于TYMSSS的存在而被钝化(图5I-J)。这保持了图5H中的模型，其中胸苷合成的恢复阻止了MTX诱导的DHFRFS增加。进一步保持该模型，与TYMSSS关联的RFP在所使用的任何MTX浓度下没有显著增加(图5I-J)。当DHFRFS关联的eGFP增加时，对照RFP也增加，并且仅RFP表达增加不是预期的。一种可能的解释是，这种增加在高于0.5μM MTX时被注意到，并且仅DHFRFS仅抗0.5μM MTX。9这表明较高剂量的MTX开始选择具有较高基因含量的DHFRFS和相关转基因的细胞。值得注意的是，与TYMSSS共表达的DHFRFS对高达1μM MTX浓度具有抗性。这进一步支持使用TYMSSS来调节转基因表达和阻止偏向与DHFRFS顺式或反式表达的基因的更高基因表达水平的不需要的选择。
接着，采用顺式表达可诱导的自杀基因-可诱导的半胱天冬酶9(iC9)的DHFRFS构建体。此构建体，被称为DFSiC9，其在MTX存在下选择表达DFSiC9的T细胞，并在活化iC9以诱导细胞凋亡的药物存在下消除DFSiC9+T细胞。基于上述发现，DFSiC9中的DHFRFS可用于调节并潜在地消除目标转基因的表达，该目标转基因否则在无调节的情况下毒性太大而不能表达。白细胞介素-12(IL-12)是此类转基因。IL-12是能够从肿瘤特异性T细胞诱导针对肿瘤的强免疫应答的细胞因子。然而，全身性IL-12具有高毒性和低效力。在此提出了一种替代方法，其中IL-12与TYMSSS顺式表达，以便降低和稳定化IL-12的表达水平。在图5K中，流体图显示与TYMSSS顺式表达的IL-12和与DHFRFS表达顺式表达的iC9的表达。供体细胞不经处理或用高剂量的MTX处理7天。此表达模式似乎表明IL-12即使在长时间毒性剂量的MTX中也能稳定表达。对类似操纵的供体的进一步分析(图5L)表明当与DHFRFS共表达时，TYMSSS稳定化潜在毒性的目标转基因—IL-12的表达的潜力。
来自图3D所示实验的T细胞也经受不同浓度的MTX。在第35天，T细胞接受抗CD3/CD28刺激并经受从0至1μM范围内的MTX72小时。在第35天，没有T细胞组显著表达DHFRFS，如共表达的eGFP所示，高于本底(图3D-I)。然而，仅使用MTX选择的DHFRFS+T细胞持续足够久以在高达0.5μM浓度的MTX重新引入MTX时显著提高存活(图7B)。图7A中的流体图展示了MTX依赖性的转基因表达增加以及一个供体的转基因表达T细胞的改善存活。应该注意的是，在[DHFRFS+和TYMSSS]+T细胞中添加TYMSSS允许转基因阴性细胞在1μM MTX下存活，这在经受MTX的TYMSSS-T细胞中未观察到(图7C)。
D.AThyR允许对目标转基因的非依赖性选择
AThyR是人蛋白质，并且因此在人中比NeoR或类似的耐药性转基因(通常来源于细菌)具有更低的免疫原性。因此，由于较低的免疫原性和体外易使用，使用AThyR来选择目标转基因是期望的。作为示范，通过将半胱天冬酶9(iC9)在称为DFSiC9的构建体中与DHFRFS共表达来选择自杀基因可诱导的iC9(图8A)。目前选择iC9的方法利用表面表达的抗原和通过磁珠进行的分离。然而，这种选择方法比添加药物更加劳动密集，并且不会增加AThy抗性的功能性。在7天的基于AaPC的刺激(包括第2至7天在0.1μM MTX中)后DFSiC9质粒经显著选择用于T细胞中存活的(图8B)。接着，将DFSiC9与CAR共电穿孔，以在T细胞中表达。将CAR用CAR胞外结构域结合配体(CARL)+K562AaPC特异地选择(Rushworth等人，同上)，而使用0.1μMMTX选择DFSiC9。在0.1μM MTX中2至14天后，将CAR+DFSiC9+T细胞从MTX中静息或在0.1μMMTX中再选择7天。相较于模拟电穿孔的T细胞，从第2至21天在0.1μM MTX中选择的T细胞示出于图8C中。如前所述，在到第21天MTX选择后，不存在偏向CD4+T细胞优势的选择。
这些细胞还表明了针对给定的5:1的靶标比效应物比率所预期水平的细胞毒性(图8D)。将DHFRFS与iC9而非CAR共表达增加了通过加入二聚化AP20187的iC9化学诱导剂来消除T细胞的潜力(图8E)。AP20187的加入不依赖于MTX地显著耗竭了静息CAR+T细胞。这表明DFSiC9可以根据需要有效地选择iC9表达和耗竭经遗传修饰的T细胞。使用DHFRFS具有在不依赖于抗原特异性和抗原表达的情况下在T细胞中选择转基因表达的优点。
实施例2
材料和方法
将来自德克萨斯州休斯敦的MDACC血库的健康供体来源的外周血进行密度梯度离心以分离单核细胞，将所述单核细胞如前所述地在完全培养基(CM)中静息或冷冻。下面概述了在每个实验中静息或冷冻的外周血来源单核细胞(PBMC)的使用。将来自PBMC的T细胞使用解冻的负载有OKT3抗体的K562克隆4号，即活化和增殖细胞(AaPC)进行刺激。参见Singh H等人，PloS one 2013,8(5)。在AaPC中测试支原体的存在，然后刺激T细胞。通过0.1％台盼蓝(Sigma-Aldrich,T8154)排斥，使用自动细胞计数(Nexcelcom,Lawrence,MA)来完成细胞计数。按照制造商的说明书使用CD4+、CD25+调节性T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec,San Diego,CA,130-091-301)，使用基于磁珠的分选来完成细胞分离。简言之，CD4+T细胞经负选择，之后用抗CD25珠粒分选一次用于在效应T细胞(CD25-)和Treg(CD25+)之间进行区分。
培养条件：非细胞刺激是如先前所述使用可溶的30ng/mL抗CD3、100ng/mL抗CD28以及50IU/mL人IL-2完成的，如先前所述。必要时，使用以下药物：5-FU、MTX、顺铂(CDDP)、培美曲塞、雷替曲塞、G418、潮霉素B、博莱霉素、雷帕霉素、二甲双胍、AICARtf/肌苷单磷酸(IMP)环化水解酶(ATIC)二聚抑制剂(iATIC)(表5)。非细胞刺激实验在刺激的同一天接受毒性药物或治疗剂的添加。
表5.化学试剂
Figure BDA0001386783750000551
Figure BDA0001386783750000561
DNA表达质粒：
选择载体：FLAG-DHFRFS-2A-eGFP pSBSO(被标注为DHFRFS-GFP(DG))、FLAG-TYMSSS-2A-eGFP pSBSO(被标注为TYMSSS-GF P(TSG))、NLS-mCherry pSBSO(RFP)、FLAG-TYMSSS-2A-NLS-m Cherry pSBSO(被标注为TYMSSS-RFP(TRG))、新霉素抗性(NeoR)-2A-eGFPpSBSO(被标注为NeoR-GFP(NRG))以及Myc-ffLuc-NeoR p SBSO(NRF)，被如前所述地设计构建和使用。睡美人(SB)间接/直接重复(IR/DR)位点存在于每个构建体中以诱导使用SB转座酶的基因组整合。每个转基因是通过延伸因子1α(EF1α)启动子表达的。
细胞的遗传转化与增殖：
利用Amaxa
Figure BDA0001386783750000562
II来转化人PBMC，其中如先前所述，使用程序U14将1-2×107个解冻的PBMC在Amaxa T细胞核转染溶液中电穿孔。在第二天，将PBMC用CM以及1:1比率的AaPC(包含50IU/mL IL-2)进行刺激。在每次后续刺激时，将T细胞和AaPC的共培养物维持在1×106个细胞/mL。通过每7天用IL-2和AaPC以所提及的浓度重新刺激共培养物来促进T细胞的过生长。当在各次刺激之间更换培养基时加入新鲜的IL-2。在转基因实验期间，在共培养开始后48小时加入药物，并将其保持在给定浓度直至第14天。在第14天后，不再将药物加入到T细胞培养物中。
蛋白质印迹：
如所示，将T细胞通过离心1×106个T细胞来从培养物中移出以用于蛋白质印迹，并在液氮中快速冷冻细胞沉淀物。将T细胞沉淀物裂解并使用50mM Tris、150mM NaCl、1mMEDTA、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸盐、1mM苯甲基磺酰氟、150mM对硝基苯磷酸盐和0.3μM抑肽酶，pH 7.4进行制备。使用SDS-PAGE分离的蛋白质和表6中记载的一抗来经由化学发光检测蛋白质的存在。
表6.蛋白质印迹抗体
Figure BDA0001386783750000571
流式细胞术：
将所培养的T细胞在FACS染色溶液[95]中洗涤，然后在4℃下在FACS染色溶液中用荧光染料缀合的抗体进行至少30分钟的表面抗体染色。细胞内转录因子和细胞因子染色利用按照制造商的方案(eBioscience,00-5523-00)设置的FoxP3/转录因子染色缓冲液，并且是在表面染色后进行的。BD FACSCalibur(BD Biosciences)分析了大多数表达FoxP3的样本。抗体靶标、浓度和制造商列出于表7中。流式细胞术数据分析利用FlowJo v 10.0.5(Tree Star Inc.,Ashland,OR)。使用具有以下方案的ImageStreamX Mark II(Amnis,Seattle,WA)来完成对经磷酸化抗原染色的细胞的流式细胞术成像；在表面染色后，将样本在4℃下在100％甲醇(Sigma)中固定1小时，然后在如按照制造商方案所述设置为洗涤缓冲液的FoxP3/转录因子染色缓冲液中洗涤和染色。利用Amnis IDEAS v 6.0来进行对图像细胞术数据的分析。
表7.流式细胞术抗体
Figure BDA0001386783750000581
胸苷掺入测定：
使用用于刺激含有2×105个活细胞的每个孔的抗CD3/CD28和IL-2来执行胸苷掺入测定。将不同比率的效应T细胞(Teff)比Treg在各孔中合并，并将所有孔一式三份地在U形底96孔板中运行。在48小时时，将1μCi[3H]胸苷(Perkin-Elmer,Waltham,MA)加入各孔中，并在24小时后在Top Count NXT(Perkin-Elmer)上评估细胞的放射性。通过以下等式来测定Treg介导的生长抑制：(无处理Teff[cpm]-(Treg和无处理Teff[cpm]))/无处理Teff[cpm]。
统计分析：
使用Prism v6.0(Graph Pad Software Inc.,La Jolla,Ca)来执行对数据的图形表示和统计分析。在适当时使用适用的图基或邓奈特多重比较检验进行单向ANOVA，非高斯分布通过鲁斯卡尔-沃利斯检验以及之后进行的邓恩多重比较检验进行评估。涉及TCD4,FoxP3的总细胞计数和表达数据趋向于呈非高斯分布。使用曼-惠特尼检验进行单变量检验(实验对比对照)。统计显著性被指定为α<0.05。
结果
用MTX对TCD4,FoxP3进行的药物选择部分地通过毒性发生。为了确定MTX如何有助于对TCD4,FoxP3的选择，将新鲜来源的PBMC在细胞毒性药物或致死γ辐射的存在下用抗CD3/CD28抗体和IL-2进行刺激。7天后，使用刺激而接受任何细胞毒性损害的受刺激的T细胞中存在显著的存活标记物膜联蛋白V和7-AAD差异(图1B-I)。对TCD4,FoxP3的选择与细胞毒性不一致。在7天的刺激后，2戈瑞(Grey)的γ辐射显著增加了存活群体中TCD4,FoxP3的量(图1B-II)。这种致死处理不靶向所考虑的共同途径，并且顺铂也不靶向所考虑的共同途径，然而均增加了TCD4,FoxP3。然而，由顺铂诱导的TCD4,FoxP3增加是不显著的。显著的增加来源于5-FU和MTX。除了核糖体延伸抑制剂G418外，每种细胞毒素处理似乎都增加了存活TCD4,FoxP3的百分比。参见Bar-Nun S.等人，Biochimica et biophysica acta 1983,741(1):123-127。这种在面对不同的细胞毒性损伤的情况下增加TCD4,FoxP3百分比的模式提出了一种可以用某些药物增强的共同途径。不希望被理论束缚，这种途径可能涉及降低Treg的增殖速率，并且看似为核糖体介导的，因为G418可以抑制此增加TCD4,FoxP3百分比的总趋势。参见Cao M.等人，International journal of radiation biology 2011,87(1):71-80。
使用G418进行Treg耗竭和用MTX进行Treg选择的所述发现还通过如前所述用抗CD3/CD28+IL-2刺激解冻的PBMC达7天而评价了剂量依赖性。G418在所有测试的剂量下都具有显著细胞毒性，但是在两个中等药物剂量时显著耗竭TCD4,FoxP3(图10C)。MTX也在所有测试的剂量下具有细胞毒性，但是在较低剂量时具有对TCD4,FoxP3的显著提升(图10D)。雷帕霉素(Rapa)被用作Treg选择对照[138]并且在中等药物浓度时表现出不依赖于细胞毒性的类似TCD4,FoxP3选择，其仅在最高剂量时发生(图10F)。在中等药物剂量而不是更高剂量时对Treg或针对Treg的选择表明Treg对于药物诱导的选择或耗竭具有狭窄的治疗窗口。ATIC的特异抑制剂[142]被用来测试MTX是否通过抑制ATIC来介导对TCD4,FoxP3的选择。不希望受理论束缚，对AICARtf或其中存在AICARtf的异二聚体复合物ATIC的抑制增加了AICAR。图10E表明仅ATIC抑制既无细胞毒性，也无对TCD4,FoxP3的选择性。对图10G中由相同供体代表的流体图的进一步分析显示了针对所使用的若干种药物的CD4和FoxP3的表达。iATIC的使用类似于Rapa地独特介导CD4+T细胞中增加的FoxP3表达，但是不会像MTX、G418或Rapa一样抑制FoxP3-T细胞的增殖。因此，iATIC增强了CD4+T细胞中的FoxP3表达，但是通过允许FoxP3-T细胞的增殖而稀释了这些细胞。看似MTX介导的对TCD4,FoxP3的选择通过以下方式发生：耗竭快速增殖的效应T细胞并经由类似于Rapa的途径(包括核糖体抑制)增强FoxP3表达。Treg对核糖体抑制剂G418增加的易感性巩固了增强的FoxP3表达与增加的核糖体抑制易感性之间的这种关系。
Treg优选在对MTX的抗叶酸和抗胸苷作用具有抗性的原代T细胞中扩增。假设调节性T细胞抑制药物选择后的CD8+T细胞增殖。为了测试这个假设，通过用DHFRFS、TYMSSS、NeoR或组合进行转化来获得耐药性T细胞，并如先前所述进行数值上的扩增。简言之，将转化的T细胞在第2至14天于如所指定的0.1μM MTX、5μM 5-FU或1.6mM G418的存在下进行选择，同时每7天用负载有OKT3的AaPC和50IU/mL IL-2进行刺激直至第35天。参见Singh H.等人，PloS one 2013,8(5)。通过提高CD4+T细胞群体中的FoxP3表达进行的对Tregs的初始测试表明，在表达DHFRFS的T细胞中存在显著的TCD4,FoxP3百分比增加。相较于模拟电穿孔的(无DNA)T细胞，在第21天使用MTX进行的选择表现出了这种增加(图11)，并且当在选择期间将5-FU与MTX组合时这种增加持续至第35天(图12A)。在选择后的每个实验群体中转基因T细胞几乎全部是CD4+，但是Tregs的优势似乎经常超过在未操纵的CD4+T细胞隔室中典型存在的5-10％。还评估了Treg功能的标记物。低IL-2表达[]是Tregs的已知性状，并用FoxP3表达进行评估。具有FoxP3+、IL-2-表达模式的T细胞群体的百分比示出于图12B中。潜伏相关肽(LAP)——TGF-β复合物一部分并且与活化的Treg强相关——的表达可见于图12C中。
将转基因DHFRFS和TYMSSS独立或组合地与对照选择载体NeoR和未处理的无DNA T细胞进行比较。在这个实验中偏向Treg的选择可见于图12A、B、C-I中。这个实验表明，当相较于模拟转化的T细胞时，在MTX+5-FU中选择的[DHFRFS-GFP(DG)和TYMSSS-RFP(TSR)]+T细胞具有增加的具Treg特征的细胞群体。为了进一步阐明DHFRFS和TYMSSS对Treg选择的贡献，将NeoR与DHFRFS、TYMSSS或组合一起共电穿孔。NeoR的加入允许在所有T细胞群体中进行对DHFRFS、TYMSSS以及组合的等效选择。当未转化的T细胞被移除时，变得清楚的是，仅DHFRFS，而不是仅TYMSSS可以选择具有Treg特征的细胞(图12A、B和12C–II)。[DG和TSR]+T细胞继续选择具有Treg特征的细胞。最终，通过TSR或对照载体-RFP的共电穿孔来评估TYMSSS对用DHFRFS选择Treg的贡献。来自这个实验的Tregs的特征示出于图12A、B和C–III中。这个实验表明使用MTX进行的对DHFRFS的选择可以增强Treg的外生长并且5-FU不依赖于TYMSSS地增强此选择。对Treg的选择受益于通过DHFRFS进行的叶酸挽救。这是所预期的，因为已知叶酸在Treg存活中发挥作用。参见Kunisawa J.等人，PloS one 2012,7(2):e32094。令人惊讶的是，对Treg的选择不需要如TYMSSS一样的从头胸苷合成，这缓解了MTX和5-FU对TYMS的抑制，是不必要的。
先前的发现表明，PBMC中5-FU的存活和毒性是由TYMS和一种替代机制介导的。参见Eisenthal A等人，Anticancer research 2009,29(10):3925-3930。组合Treg选择药物MTX、5-FU和雷帕霉素的已知机制产生了图13中的图式，该图式详细示出了每种药物如何与核糖体功能相互作用。在补充图1A中描述的实验中注意到，新霉素抗性基因从G418处理中挽救了TCD4,FoxP3。此发现表明，G418的特定作用负责TCD4,FoxP3耗竭，并且此现象被进一步探索。
通过氨基糖苷G418进行的核糖体抑制选择性地耗竭复制的TCD4,FoxP3。将解冻的PBMC在替代剂量的G418、潮霉素B—一种不同的氨基糖苷、博莱霉素—一种靶向DNA的抗生素和Rapa的存在下，用抗CD3/CD28+IL-2活化7天，以评估氨基糖苷对TCD4,FoxP3的剂量依赖性选择或耗竭(图14A)。在氨基糖苷G418的存在下再次注意到了对TCD4,FoxP3的耗竭。替代氨基糖苷-潮霉素-在0.2mM潮霉素时开发了TCD4,FoxP3的显著增加。这种增加在使用较高剂量的潮霉素-1.5和2.3mM时显著降低。潮霉素表现为相较于未处理的对照不显著耗竭TCD4,FoxP3。
通过氨基糖苷G418进行的核糖体抑制选择性地耗竭复制的TCD4,FoxP3。将解冻的PBMC在替代剂量的G418、潮霉素B-一种不同的氨基糖苷、[146]博莱霉素—一种靶向DNA的抗生素和Rapa的存在下，用抗CD3/CD28+IL-2活化7天，以评估氨基糖苷对TCD4,FoxP3的剂量依赖性选择或耗竭(图14A)。在氨基糖苷G418的存在下再次注意到了对TCD4,FoxP3的耗竭。替代氨基糖苷—潮霉素—在0.2mM潮霉素时开发了TCD4,FoxP3的显著增加。这种增加在使用较高剂量的潮霉素-1.5和2.3mM时显著降低。潮霉素表现为相较于未处理的对照不显著耗竭TCD4,FoxP3。
此对TCD4,FoxP3的剂量依赖性耗竭与对G418所观察到的耗竭相一致，并且在增加剂量的博莱霉素或Rapa时未注意到。当使用增加剂量的博莱霉素时注意到了TCD4,FoxP3的增加，但是此增加是不显著的，类似于对其他细胞毒性药物在图10B-II中所观察到的。来自相同供体的CD4和FoxP3表达的代表性流体图可见于图14B中。在此，所述趋势为可视化的。
据认为，多克隆刺激可能在G418对TCD4,FoxP3的耗竭中发挥一些作用。为了测试此，在解冻+/-G418后将PBMC在CM中静息9天并测试TCD4,FoxP3的存在。在静息条件下，G418对TCD4,FoxP3的显著耗竭持续(图14C—左小图)。这是复制依赖性的，因为CD4+,FoxP3+,Ki-67+细胞表现出显著的G418介导的耗竭，而CD4+,FoxP3+,Ki-67-细胞未被相同的事后措施显著耗竭(图14C—右小图)。在图14D—上部小图中的静息PBMC的代表性流体图示出了在用G418处理后CD4+T细胞的FoxP3表达损失。图14D—下部小图中Ki-67和FoxP3的替代图式表明，FoxP3-T细胞在G418的存在下继续增殖，从而进一步支持G418对此浓度的TCD4,FoxP3的选择性靶向。因此，在用氨基糖苷G418处理后，增殖的TCD4,FoxP3被耗竭。
当考虑到G418和潮霉素对活体动物有毒性时，庆大霉素-一种因其在人类和动物模型中的使用而众所周知的氨基糖苷-被测试用于选择性的TCD4,FoxP3耗竭。参见Lopez-Novoa JM.等人，Kidney international 2011,79(1):33-45。图3E描述了7天后在静息PBMC中对TCD4,FoxP3的这种耗竭并且表明了氨基糖苷类在耗竭TCD4,FoxP3方面的一致作用。接下来测试TCD4,FoxP3的耗竭是否对应于Treg标记物表达或选择性Treg毒性的损失。
分选的Treg区分MTX、5-FU和G418对大多数PBMC中的选择的影响。对表达CD4和CD25的PBMC的磁分选产生了被广泛地视为含有Treg的CD4+CD25+群体和效应T细胞(Teff)的CD25-群体。参见Miyara M.等人，Immunity 2009,30(6):899-911。在与AaPC共培养的前7天，如上用相同浓度的MTX、5-FU、G418处理这些群体或不进行处理。在这段时间之后，通过每7天用AaPC进行刺激直到第21天，来在不使用药物的情况下继续共培养。此时如前测定细胞的CD25、CTLA-4、LAP和IL-2表达。该实验概述可见于图15A中。还执行[3H]胸苷掺入测定来确定每种药物对增殖的Treg的功能性的影响。
当在第21天对存活的CD4+细胞进行测定时，发现没有药物在Teff隔室中显著地选择TCD4,FoxP3，MTX和5-FU也不改善在Treg隔室中对TCD4,FoxP3的选择(图15B)。最一致的发现是，G418在药物处理后持续减少存活的Treg。这是由存活TCD4,FoxP3的损失证明的(图15B)。在刺激后第21天时，Treg标记物如CD25(图15C-I)、CTLA-4(图15C–II)、减少的IL-2表达(图4C–III)或LAP(图15C–IV)结合FoxP3表达也减少。因此，Treg损失，可能是由于G418的毒性，而不是因为在G418处理后的2周生长促进性共培养条件无法充分恢复Treg而受到抑制。
MTX和5-FU的Treg促进特性似乎部分地依赖于Teff的存在，因为在从培养系统中移除Teff后不再能够注意到对TCD4,FoxP3的增强选择(图15B)。偏向Treg表型的改善选择可能已通过耗竭已知会污染Treg分选的Teff完成。[113]有可能相较于Teff，Treg在MTX或5-FU的细胞毒性损伤下存活的能力是增强选择的主要成因。虽然当使用MTX或5-FU时存在偏向对Treg表型的改善选择的趋势(图15C–I、II、III)，但是不存在CD25表达、CTLA-4表达或IL-2损失方面的显著差异。然而，Treg特异性标记物LAP通过用MTX或5-FU进行早期处理而显著增加(图15C–IV)。因为LAP是所测定的那些的唯一增加标记物，有可能LAP和TGF-β的相关表达[143]是高于对未处理的Treg的、对经MTX和5-FU处理的Treg的提高抑制的可能成因(图15D)。因此，MTX和5-FU似乎在增强对Treg的选择方面具有两个组成部分：1)Teff由MTX和5-FU选择性地耗竭，并且2)MTX和5-FU在处理后的数周增加了LAP的表达。
TCD4,FoxP3的刺激增强了AMPK活化并且导致对eEF2-一种在翻译延伸中起作用的因子-的抑制。AMPK被假设为在对TCD4,FoxP3的选择中发挥作用，如上所述(图13)。此外，对AMPK的增强活化可以导致对TCD4,FoxP3中的eEF2的抑制。参见Browne GJ.等人，The Journal ofbiological chemistry 2004,279(13):12220-12231。对翻译延伸的优先抑制可以解释在许多细胞毒性药物的存在下对TCD4,FoxP3的选择以及在翻译延伸抑制剂的存在下对TCD4,FoxP3的耗竭。这是通过在活化PBMC 24小时后使用流式细胞术(图16A和B)和成像细胞术(图16C)评估AMPK磷酸化来测试的。T172上的AMPK磷酸化指示活化并且在被刺激时相较于未刺激的TCD4,FoxP3被增强。参见Hardie DG等人，Diabetes 2013,62(7):2164-2172。此增强的AMPK活化也是在CD4+,FoxP3-T细胞中增加的(图16A-上部小图)，但是根据事后分析该显著的增加(t检验的p＝0.03)不持续。类似地，用FoxP3活化的AMPK的流体图显示了AMPK活化的这种增强在表达FoxP3的子集中更加显著(图16B—上部小图)。参见MacIver NJ等人，Journal ofimmunology2011,187(8):4187-4198。翻译起始标记物-S6-对mTOR调节易感，并且当具活性时是磷酸化的。参见Mahoney SJ等人，Progress in molecular biology andtranslational science 2009,90:53-107。S6的磷酸化(p-S6)在刺激后于TCD4,FoxP3中显著增强(图16A–下部小图)，这是先前由Cabone等人展示的。参见Carbone F.等人，Naturemedicine 2014,20(1):69-74。虽然p-S6在FoxP3-T细胞中增加(t检验的p＝0.01)，但是这种增加在事后分析后并不显著。在关于图16B-下部下图的代表性流体图中可观测到p-S6的增强。在活化后，FoxP3+和FoxP3-CD4+T细胞两者中的代谢调节剂AMPK和S6的活化都被增强，但是在使用事后Sidak检验的双向ANOVA中，该增强仅在TCD4,FoxP3中是显著的。在活化TCD4,FoxP3后AMPK和S6的增加活化可以使用图像细胞术分布图观察到，如图16D所示，使用抗CD3/CD28和IL-2刺激之前—顶部小图—和之后—底部小图。将相同的补偿和可视化应用于每个小图，以使顶部小图和底部小图可比较。
不希望受理论束缚，TCD4,FoxP3中增强的AMPK活化表明翻译延伸可能受到eEF2磷酸化的抑制并且可以解释TCD4,FoxP3在细胞毒性药物存在下的增加存活以及对翻译延伸抑制剂如氨基糖苷类的易感性。执行如图16A-C中所示的相同实验以评估T56处的磷酸化对eEF2的失活。[135]使用图像细胞术来定量和可视化所有事件。图16D表明在刺激后，T细胞的相同子集-TCD4,FoxP3-中的eEF2磷酸化显著增加。此外，eEF2的抑制性磷酸化显著增加到高于经刺激的FoxP3-T细胞，这在使用AMPK或S6磷酸化时未注意到。eEF2磷酸化仅在经刺激的TCD4,FoxP3中增加表明，TCD4,FoxP3将在刺激后具有降低的复制能力，如由Cao等人所展示的。抑制整个细胞周期中进展的活性eEF2的水平降低表明，eEF2的磷酸化增加可以解释TCD4,FoxP3在细胞毒性环境中的存活，这在图10中提及。类似地，降低的翻译能力将使TCD4,FoxP3对翻译延伸抑制剂(如示出为图14中的氨基糖苷类)增加地易感。因此，eEF2的活性可能是这些研究中影响Treg的选择和耗竭的主要因素。
***
根据本公开，可以在不进行过多实验的情况下实行和执行本文所公开和所要求保护的所有方法。虽然已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域的技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以对本文所述的方法和步骤或方法的步骤顺序施加改变。更具体地，显而易见的是，化学和生理相关的某些试剂可以在获得相同或相似结果时代替本文所述的试剂。对于本领域的技术人员显而易见的所有此类类似替代和修改被认为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和构思内。
本申请中提及的所有引用的专利和出版物全文以引用方式并入本文。
序列表
<110> 得克萨斯州大学系统董事会(BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OFTEXAS SYSTEM)
<120> 用于遗传修饰T细胞的选择方法
<130> UTFC.P1272WO
<150> US 62/120,329
<151> 2015-02-24
<150> US 62/120,790
<151> 2015-02-25
<150> US 62/175,794
<151> 2015-06-15
<160> 12
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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100 105 110
Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp Ala Leu
115 120 125
Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys Val Asp Met Val Trp
130 135 140
Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His Pro Gly
145 150 155 160
His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu Ser Asp
165 170 175
Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu Pro Glu
180 185 190
Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys Tyr
195 200 205
Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp Gly Thr Gly Glu Gly Arg Gly
210 215 220
Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Leu Gly
225 230 235 240
Leu Met Gly Leu Pro Phe Thr Ala Arg Phe Pro
245 250
<210> 11
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Asp Val Pro Val Ala Gly Ser Glu Leu Pro Arg Arg Pro Leu Pro Pro
1 5 10 15
Ala Ala Gln Glu Arg Asp Ala Glu Pro Arg Pro Pro His Gly Glu Leu
20 25 30
Gln Tyr Leu Gly Gln Ile Gln His Ile Leu Arg Cys Gly Val Arg Lys
35 40 45
Asp Asp Arg Ser Ser Thr Gly Thr Leu Ser Val Phe Gly Met Gln Ala
50 55 60
Arg Tyr Ser Leu Arg Asp Glu Phe Pro Leu Leu Thr Thr Lys Arg Val
65 70 75 80
Phe Trp Lys Gly Val Leu Glu Glu Leu Leu Trp Phe Ile Lys Gly Ser
85 90 95
Thr Asn Ala Lys Glu Leu Ser Ser Lys Gly Val Lys Ile Trp Asp Ala
100 105 110
Asn Gly Ser Arg Asp Phe Leu Asp Ser Leu Gly Phe Ser Thr Arg Glu
115 120 125
Glu Gly Asp Leu Gly Pro Val Tyr Gly Phe Gln Trp Arg His Phe Gly
130 135 140
Ala Glu Tyr Arg Asp Met Glu Ser Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Val Asp
145 150 155 160
Gln Leu Gln Arg Val Ile Asp Thr Ile Lys Thr Asn Pro Asp Asp Arg
165 170 175
Arg Ile Ile Met Cys Ala Trp Asn Pro Arg Asp Leu Pro Leu Met Ala
180 185 190
Leu Pro Pro Cys His Ala Leu Cys Gln Phe Tyr Val Val Asn Ser Glu
195 200 205
Leu Ser Cys Gln Leu Tyr Gln Arg Ser Gly Asp Met Gly Leu Gly Val
210 215 220
Pro Phe Asn Ile Ala Ser Tyr Ala Leu Leu Thr Tyr Met Ile Ala His
225 230 235 240
Ile Thr Gly Leu Lys Pro Gly Asp Phe Ile His Thr Leu Gly Asp Ala
245 250 255
His Ile Tyr Leu Asn His Ile Glu Pro Leu Lys Ile Gln Leu Gln Arg
260 265 270
Glu Pro Arg Pro Phe Pro Lys Leu Arg Ile Leu Arg Lys Val Glu Lys
275 280 285
Ile Asp Asp Phe Lys Ala Glu Asp Phe Gln Ile Glu Gly Tyr Asn Pro
290 295 300
His Pro Thr Ile Lys Met Glu Met Ala Val Gly Thr
305 310 315
<210> 12
<211> 186
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly Ile
1 5 10 15
Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser Arg
20 25 30
Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln Asn
35 40 45
Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys Asn
50 55 60
Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu Lys
65 70 75 80
Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp Ala
85 90 95
Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys Val Asp Met Val
100 105 110
Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His Pro
115 120 125
Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu Ser
130 135 140
Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu Pro
145 150 155 160
Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys
165 170 175
Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp
180 185

Claims (17)

1.一种分离的转基因哺乳动物T细胞，其包含或表达DHFRFS多肽和TYMSSS多肽，所述TYMSSS多肽如氨基酸序列SEQ ID NO:11所示。
2.如权利要求1所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，其还包含或表达转基因。
3.如权利要求1所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述分离的转基因哺乳动物T细胞选自由以下项组成的组：T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、效应T细胞、调节性T细胞、自然杀死T细胞、粘膜相关的不变T细胞、α-βT细胞，以及γ-δT细胞。
4.如权利要求1所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，包含含有可操作地连接至编码TYMSSS的核苷酸序列的第一转基因的核酸，所述细胞还包含编码DHFRFS的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述第一转基因和编码TYMSSS的核苷酸序列在表达后，被编码在同一mRNA上。
6.如权利要求4所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述第一转基因和所述编码TYMSSS的核苷酸序列由内部核糖体进入位点IRES或核糖体滑动序列分隔。
7.如权利要求4所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述第一转基因编码嵌合抗原受体CAR构建体。
8.如权利要求4所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述第一转基因编码多肽激素、趋化因子或细胞因子。
9.如权利要求8所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述细胞因子是IL-12。
10.如权利要求8所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述细胞因子是IL-15。
11.如权利要求4所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述编码DHFRFS的核苷酸序列可操作地连接至第二转基因。
12.如权利要求11所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述第二转基因和所述编码DHFRFS的核苷酸序列在表达后，被编码在同一mRNA上。
13.如权利要求11所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述第二转基因和编码DHFRFS的核苷酸序列由内部核糖体进入位点IRES或核糖体滑动序列分隔。
14.如权利要求11所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述第二转基因编码自杀基因、CAR、TCR、多肽激素、细胞因子、趋化因子或转录因子。
15.如权利要求14所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述自杀基因是可诱导的自杀基因。
16.如权利要求14所述的分离的转基因哺乳动物T细胞，其中所述自杀基因编码可诱导的半胱天冬酶9。
17.权利要求1至16中任一项所述的分离的转基因哺乳动物T细胞用于制造用于治疗患有癌症的患者的药物的用途。
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