CN105307725A - 治疗自身免疫疾病的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文所述多个方面的实施方式涉及用于生成耐受原性或免疫阻抑性树突状细胞的方法和组合物。具体而言，可通过将树突状细胞与刺激IL-27/外核苷酸酶CD39轴信号转导的试剂相接触，产生免疫阻抑性树突状细胞。在一些实施方式中，可利用本文所述的方法和/或组合物对自身免疫疾病或紊乱(例如但不限于多发性硬化(MS)和I型糖尿病)进行治疗。

Description

治疗自身免疫疾病的方法和组合物
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年4月11日提交的美国临时申请号61/853,745的优先权，以引用的方式将其内容全部并入本文。
技术领域
本文所述的内容一般地涉及用于生成耐受原性(tolerogenic)或免疫阻抑性(immunosuppressive)树突状细胞的方法和组合物。可利用本文所述的方法和/或组合物对自身免疫疾病或紊乱(例如但不限于多发性硬化(MS)、脑脊髓炎和I型糖尿病)进行治疗。
背景技术
辅助T细胞TH1和TH17子类的效应细胞的异常调节活性导致组织炎症和自身免疫性的发展。例如，髓鞘特异的TH1和TH17细胞有助于多发性硬化(MS)及其动物模型、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的疾病发病机制。Nylander和Hafler，J.Clin.Invest(2012)122：1180-188；以及Pierson等，Immunol.Rev.(2012)248：205-215。在EAE过程中，树突状细胞(DC)控制髓鞘特异的效应T细胞和调节性T细胞(Treg细胞)的活化和分化。Bailey等，Nat.Immunol.(2007)8：172-180；以及Yogev等，Immunity(2012)37：264-275。此外，从患有MS的患者分离的DC通常产生大量TH1极化细胞因子和TH17极化细胞因子。Comabella等，Nat.Rev.Nephrol.(2010)6：499-507。DC控制与中枢神经系统(CNS)自身免疫性相关的数种致病机制。DC促进T细胞进入CNS、致病性T细胞在CNS中的活化和分化、以及针对新CNS表位的自身免疫应答的传播。Greter等，Nat.Med.(2005)11：328-334；Bailey等，Nat.Immunol.(2007)8：172-180；以及McMahon等，Nat.Med.(2005)11：335-339。因此，需要识别在自身免疫性的过程中调节DC活性的通路、识别疾病的发病机制、并开发新的治疗性干预方法来治疗自身免疫疾病。
发明内容
本文所述多个方面的实施方式部分地基于如下发现：白介素27(IL-27)作用于树突状细胞(DC)，使得调节性T细胞(Treg)扩增和/或阻抑T细胞应答(包括例如通过对辅助T细胞Th1和/或Th17子类的效应细胞的产生进行限制)，从而抑制自身免疫应答的发展。发明人还发现，IL-27对DC的免疫阻抑效应至少部分地通过诱导免疫调节分子外核苷酸酶CD39在DC中表达来介导。此外，发明人发现，常规DC(cDC)表达的CD39降低了细胞外ATP(eATP)的浓度，并减少了ATP触发的NLRP3炎性体(inflammasome)的活化。发明人还发现，利用经IL-27调整的DC进行的治疗性疫苗接种(vaccination)可阻抑建立的复发-缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。因此，不仅能够将调制IL-27、IL-27RA、CD39(或外核苷酸酶CD39)和/或促炎性eATP的活性和/或表达/水平的试剂靶向至DC，以治疗免疫相关疾病或紊乱(例如自身免疫疾病)，还能够将经IL-27调整的DC给予至受试者，以治疗免疫相关疾病或紊乱。因此，本文所述的多个方面提供了用于生成免疫阻抑性树突状细胞的方法；以及用于对免疫相关疾病或紊乱(包括例如自身免疫疾病)进行治疗的方法和组合物。
本文提供的一个方面涉及生成免疫阻抑性树突状细胞的方法。所述方法包括：将树突状细胞与包含有效量的刺激或活化IL-27/外核苷酸酶CD39轴信号转导(axissignaling)的试剂的组合物相接触。树突状细胞可获取自或来源自任何来源。例如，树突状细胞可来源自脾、淋巴结、血液、单核细胞和/或造血祖细胞。
例如，通过对辅助T细胞Th1和Th17子类的效应细胞的产生进行限制，IL-27/外核苷酸酶CD39轴或IL-27/CD39轴阻抑促炎性免疫应答。如本文和申请文件全文中所定义的，在本文中可互换使用的术语“IL-27/外核苷酸酶CD39轴”和“IL-27/CD39轴”指的是DC调节其抗原提呈功能的免疫阻抑通路。该免疫阻抑通路包含IL-27和外核苷酸酶CD39(其中，术语“外核苷酸酶CD39”和“CD39”在本文中可互换使用)，其中IL-27对DC的免疫阻抑效应至少部分地通过诱导免疫调节分子外核苷酸酶CD39在DC中表达来介导。如上所述，发明人发现，DC表达的CD39降低了细胞外ATP(eATP)的浓度，并因此减少了ATP触发的NLRP3炎性体的活化。因此，在一些实施方式中，IL-27/外核苷酸酶CD39轴可进一步包含ATP降解酶，因此，“IL-27/外核苷酸酶CD39轴”可以指包含IL-27、CD39和ATP降解酶(包括例如腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase))的免疫阻抑通路。
在一些实施方式中，刺激或活化IL-27/外核苷酸酶CD39轴信号转导的试剂(本文中称为“IL-27/CD39激动性试剂(agonisticagent)”)为IL-27激动剂。例如，IL-27激动剂可包含重组IL-27蛋白或肽。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂为CD39激动剂。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂为ATP降解酶，包括例如腺苷三磷酸双磷酸酶。
IL-27/CD39激动性试剂能够以足以生成免疫阻抑性树突状细胞的任何量存在。例如，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可足以在DC中上调CD39的表达、磷酸化STAT3和/或表达一种或多种抗炎性基因(包括例如IDO1、IDO2、IL-10、IL-27、A20、TGFβ1、IL-10和/或IFN-β)。用于对这些生物分子或细胞因子进行检测和/或测量的方法为本领域所知晓。例如，可借助定量PCR和/或FACS对DC中CD39或抗炎性基因和/或蛋白的表达进行分析；可借助FACS和/或western印迹确定磷酸化的STAT3。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可处于约1ng/mL至约100ng/mL的范围。
在一些实施方式中，所述方法可进一步包含将树突状细胞与自身免疫抗原相接触。树突状细胞可与足以建立对特定抗原的耐受性的量的自身免疫抗原相接触。在一些实施方式中，待与树突状细胞相接触的自身免疫抗原可具有约1μg/mL至约100μg/mL的浓度。自身免疫抗原的非限制性实例包括：髓鞘碱性蛋白(MBP)；蛋白脂质蛋白(PLP)；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelinoligodendrocyteglycoprotein，MOG)，髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白心脏肌球蛋白(myelin-associatedoligodendrocyticbasicproteincardiacmyosin)；外表面蛋白(outersurfaceprotein，OSP)；髓鞘相关糖蛋白(MAG)；神经丝；干扰素ω；转谷氨酰胺酶；芳香酸羧化酶；17-羟化酶；21-羟化酶，心磷脂；丙酮酸脱氢酶；β2糖蛋白I；磷脂酰丝氨酸；apoH；膜联蛋白A5；LKM-1；可溶性肝抗原；碳酸酐酶(carbonicanhydrase)；gpIIb-IIIa或1b-IX；XVII型胶原；组织转谷氨酰胺酶；麦醇溶蛋白(gliadin)；GD1a；GQ1b；BP-1；BP-2；表皮转谷氨酰胺酶；组氨酸-tRNA；信号识别肽；Mi-2；Jo1；谷氨酸脱羧酶，HSP60；HSP70；HSP90；IGRP；胰岛素；羧肽酶H；胰岛素瘤抗原-2；IA-2β；ICA69；ZnT8；嗜铬粒蛋白A；IAPP；scl70；拓朴异构酶；组蛋白；基底膜IV型胶原；烯醇化酶(enolase)；甲状腺过氧化物酶；甲状腺球蛋白；补体成分3；电压门控钙通道；Q型钙通道，突触结合蛋白(synaptogagmin)，毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1；SMA；LKM-1；LKM-2；LKM-3；可溶性肝抗原；SLA；LP；主要外周髓鞘蛋白P0；髓过氧化物酶(myeloperoxidase)；GQ1b；U1-RNP；Kir4.1；烟碱型乙酰胆碱受体；MuSK蛋白；下丘脑分泌素(hypocretin)；食欲素(orexin)；角蛋白；AQP4；Yo；Hu；谷氨酸受体；桥粒芯蛋白(Desmoglein)3；p62；sp100；Ro；LA；糖蛋白IIb-IIIa或Ib-IX；ADAMTS13；心磷脂；β2糖蛋白I；HPA-1a；HPA-5b；IFN-γ，IL-1，TNF-α；GMCSF，上述抗原的部分以及它们的组合。
本文所述的生成免疫阻抑性树突状细胞的方法可在受试者体内、离体(exvivo)或体外(invitro)实施。因此，在一些实施方式中，可离体或在体外将树突状细胞与包含IL-27/CD39激动性试剂的组合物相接触。在替代的实施方式中，可在体内将树突状细胞与包含IL-27/CD39激动性试剂的组合物相接触。
由本文所述的方法生成的免疫阻抑性树突状细胞为独特的，可从未处理的树突状细胞或其它耐受原性树突状细胞识别出该免疫阻抑性树突状细胞。在一些实施方式中，与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)相接触的树突状细胞相比，本文所述的免疫阻抑性树突状细胞可包含表达增高的IL-27。在一些实施方式中，与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)相接触的树突状细胞相比，本文所述的免疫阻抑性树突状细胞可包含表达增高的CD39。在一些实施方式中，与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)相接触的树突状细胞相比，所述免疫阻抑性树突状细胞可包含产生减少的效应极化细胞因子(effectorpolarizingcytokine)和/或产生升高的抗炎性细胞因子。示例性的效应极化细胞因子包括但不限于IL-12和/或IL-6。示例性的抗炎性细胞因子包括但不限于TGFβ1、IL-10、IFN-β或它们的任意组合。
因此，另一方面，本文还提供了涉及IL-27/CD39激动性试剂、利用本文所述的方法生成的免疫阻抑性树突状细胞。
如前所指出的，发明人发现，除了其它方面以外，IL-27还在动物模型中作用于DC，使得Treg扩增、限制Teff并阻抑自身免疫疾病(例如但不限于I型糖尿病、多发性硬化(MS)和脑脊髓炎)。IL-27对DC的抗炎效应至少部分地通过外核苷酸酶CD39(由ENTPD1编码)的上调以及随后的促炎性细胞外ATP(eATP)水平的降低来介导。在一些免疫相关疾病或紊乱(例如但不限于自身免疫疾病)中，对于治疗效果而言，可期望对促炎性应答(例如经由Th1和/或Th17应答)进行阻抑。因此，可通过在DC中靶向IL-27/CD39轴而生成耐受原性或免疫阻抑性DC，从而对这些免疫相关疾病或紊乱进行治疗。
在一些方面，本文提供了对自身免疫疾病或紊乱进行治疗的方法。在一些实施方式中，所述方法可适于治疗多发性硬化。在一些实施方式中，所述方法可适于治疗脑脊髓炎。在一些实施方式中，所述方法可适于治疗I型糖尿病。该治疗方法包含向有需要的患者给予靶向树突状细胞(DC)的组合物，所述组合物包含(i)刺激或活化IL-27/外核苷酸酶39轴信号转导的试剂；以及(ii)DC结合剂。
在一些实施方式中，刺激或活化IL-27/外核苷酸酶CD39轴信号转导的试剂(本文称为“IL-27/CD39激动性试剂”)为IL-27激动剂。例如，IL-27激动剂可包含重组IL-27蛋白或肽。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂为CD39激动剂。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂为ATP降解酶，包括例如腺苷三磷酸双磷酸酶。
IL-27/CD39激动性试剂能够以足以生成免疫阻抑性树突状细胞的任何量存在。例如，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可足以在DC中上调CD39的表达、磷酸化STAT3和/或表达一种或多种抗炎性基因(包括例如IDO1、IDO2、IL-10、IL-27、A20、TGFβ1、IL-10和/或IFN-β)。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可处于约1ng/mL至约100ng/mL的范围。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可处于约1ng/kg至约100mg/kg，或者约0.1mg/kg至约50mg/kg的范围。
DC结合剂可为能够靶向或结合DC的任何试剂或部分(moiety)。在一些实施方式中，DC结合剂为特异性靶向或结合DC的试剂或部分。DC结合剂为本领域所知晓，包括例如结合DC表面蛋白或受体的试剂。示例性的DC结合剂包括但不限于针对Clec9A和/或DEC205的抗体。
在一些实施方式中，靶向DC的组合物可进一步包含至少一种以上的自身免疫抗原。存在于靶向DC的组合物中的自身免疫抗原的量可足以在有需要的受试者中建立对特定抗原的免疫耐受性。例如，靶向DC的组合物中的自身免疫抗原的量可处于约1μg/mL至约100μg/mL的范围。在一些实施方式中，靶向DC的组合物中的自身免疫抗原的量可处于约0.1μg/kg至约500mg/kg的范围，或者约0.5mg/kg至约250mg/kg的范围。自身免疫抗原的非限制性实例包括：髓鞘碱性蛋白(MBP)；蛋白脂质蛋白(PLP)；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)，髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白心脏肌球蛋白；外表面蛋白(OSP)；髓鞘相关糖蛋白(MAG)；神经丝；干扰素ω；转谷氨酰胺酶；芳香酸羧化酶；17-羟化酶；21-羟化酶，心磷脂；丙酮酸脱氢酶；β2糖蛋白I；磷脂酰丝氨酸；apoH；膜联蛋白A5；LKM-1；可溶性肝抗原；碳酸酐酶；gpIIb-IIIa或1b-IX；XVII型胶原；组织转谷氨酰胺酶；麦醇溶蛋白；GD1a；GQ1b；BP-1；BP-2；表皮转谷氨酰胺酶；组氨酸-tRNA；信号识别肽；Mi-2；Jo1；谷氨酸脱羧酶，HSP60；HSP70；HSP90；IGRP；胰岛素；羧肽酶H；胰岛素瘤抗原-2；IA-2β；ICA69；ZnT8；嗜铬粒蛋白A；IAPP；scl70；拓朴异构酶；组蛋白；基底膜IV型胶原；烯醇化酶；甲状腺过氧化物酶；甲状腺球蛋白；补体成分3；电压门控钙通道；Q型钙通道，突触结合蛋白，毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1；SMA；LKM-1；LKM-2；LKM-3；可溶性肝抗原；SLA；LP；主要外周髓鞘蛋白P0；髓过氧化物酶；GQ1b；U1-RNP；Kir4.1；烟碱型乙酰胆碱受体；MuSK蛋白；下丘脑分泌素；食欲素；角蛋白；AQP4；Yo；Hu；谷氨酸受体；桥粒芯蛋白3；p62；sp100；Ro；LA；糖蛋白IIb-IIIa或Ib-IX；ADAMTS13；心磷脂；β2糖蛋白I；HPA-1a；HPA-5b；IFN-γ，IL-1，TNF-α；GMCSF，上述抗原的部分以及它们的组合。
靶向DC的组合物作为优先或特异性靶向或结合DC的免疫调制剂起作用，并可以任何合适形式存在。例如，靶向DC的组合物可为包含DC结合剂以及本文所述的至少一种以上的IL-27/CD39激动性试剂的融合蛋白。
额外地或可替代地，可将靶向DC的组合物配制成纳米颗粒的形式。IL-27/CD39激动性试剂、DC结合剂和/或任选的自身免疫抗原可分布于纳米颗粒表面上、或被包封于纳米颗粒内。在一些实施方式中，DC结合剂可形成于纳米颗粒表面上，而一种或多种IL-27/CD39激动性试剂和任选的自身免疫抗原可被包封于纳米颗粒内，从而可从纳米颗粒释放至DC。
在一些实施方式中，纳米颗粒可进一步包含在其表面上的生物相容性层。生物相容性层可延长纳米颗粒在受试者中的半衰期。在一个实施方式中，纳米颗粒可进一步包含在其表面上的PEG层。
一般而言，给予至受试者的纳米颗粒可由任何生物相容性材料制成。在一个实施方式中，纳米颗粒为金纳米颗粒。
另一方面，可利用本文所述的一种或多种IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)对树突状细胞进行预处理，从而生成免疫阻抑性树突状细胞，随后可将所述免疫阻抑性树突状细胞给予或移植至有需要的受试者(例如诊断患有自身免疫疾病或紊乱的受试者)。因此，本文还提供了治疗自身免疫疾病或紊乱的方法，所述方法包含给予有需要的受试者或在有需要的受试者中放置包含免疫阻抑性树突状细胞群的组合物，所述免疫阻抑性树突状细胞为通过将树突状细胞与至少一种以上的IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)相接触而生成。
在一些实施方式中，免疫阻抑性树突状细胞群为自体树突状细胞。因此，在一些实施方式中，所述方法可进一步包含从受试者的样品获得树突状细胞。所述样品可为来自脾或淋巴结的组织活检(biopsy)样品，或为血液样品。随后可利用至少一种以上的IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)对自体树突状细胞进行离体预处理，随后移植入受试者。
在一些实施方式中，包含免疫阻抑性树突状细胞的组合物可进一步包含本文所述的自身免疫抗原。可在将包含免疫阻抑性树突状细胞的组合物给予或放置于受试者的靶组织位点或靶器官位点之前、同时或之后给予自身免疫抗原。
预期的是，在其它免疫相关疾病或紊乱(包括例如癌症)中，对于治疗效果而言，可期望在靶位点(例如肿瘤)诱导促炎性应答(例如Th1/Th17应答)。因此，可通过阻抑IL-27/CD39轴信号转导来治疗这些期望使免疫应答上调的免疫相关疾病或紊乱(例如但不限于癌症)。例如，在一些实施方式中，可向诊断患有癌症的受试者给予靶向DC的组合物，所述靶向DC的组合物包含DC结合剂和阻抑IL-27/CD39轴信号转导的试剂(也称为“IL-27/CD39拮抗性试剂(antagonisticagent)”)。
还预期的是，可通过下调或阻抑IL-27/CD39轴信号转导来对期望使Th2应答减弱的其它炎性疾病或紊乱(包括例如过敏和哮喘)进行治疗。
附图说明
图1示出DC的荧光-活化细胞分选。对脾DC进行F4/80、CD11b、CD11c、B220、MHCII和Ly6c染色，并利用流式细胞术将其分选为F4/80-CD11b-CD11c低B220+MHC-II-Ly6c+pDC和F4/80-CD11b+CD11c+B220-MHC-II+Ly6c-cDC。框出区域附近的数字表示阳性细胞的百分数。数据来自具有类似结果的超过三次独立实验中的一次。
图2A-图2C示出DC中的IL-27RA表达。在经分选的cDC和pDC中的IL-27RA表达的流式细胞术(图2A)、定量PCR(图2B)和免疫印迹分析(图2C)。线段上方的数字(图2A)表示IL-27RA+cDC(红色)和pDC(蓝色)的百分数；虚线，同种型匹配(isotype-matched)的对照抗体。肌动蛋白作为全部的加样对照。WT，野生型。*P<0.05(学生t检验)。数据代表具有类似结果的超过三次独立实验(误差棒(图2B)，s.e.m.)。
图3A-图3I示出IL-27调制cDC的抗原提呈功能。(图3A)未处理(无)、或利用IL-27(20ng/ml)或ecLPS(100ng/ml)单独处理或顺序处理的野生型cDC的流式细胞术，以平均荧光强度(MFI)表示。MHCII，II类MHC。(图3B)如a中处理的cDC培养上清液中的细胞因子的酶联免疫吸附测定。(图3C)如a中处理的cDC中IL27mRNA的定量PCR分析，相对于对照基因Gapdh示出。ND，未检出。(图3D-图3F)经MOG(35-55)和如图3A中处理的cDC刺激的初始型(naive)2D2CD4+T细胞中的增殖(图3D)、培养上清液中的细胞因子(图3E)以及CD4+IFN-γ+、IL-17+、IL-10+和Foxp3+细胞的频率(图3F)。(图3G-图3H)在促进TH1、TH17和Tr1细胞(图3G)或Foxp3+T细胞(图3H)分化的外源细胞因子存在下，经MOG(35-55)和如图3A中处理的cDC刺激的初始型2D2CD4+T细胞中的细胞因子分泌(图3G)以及Foxp3+CD4+T细胞的频率(图3H)。框出区域中的数字(图3H，左侧)表明Foxp3+CD4+T细胞的百分数。*P<0.05和**P<0.01(单因素方差分析(ANOVA))。数据来自3次独立实验(图3A-图3H，右侧；平均值和s.e.m.)或者数据代表3次独立实验(图3H，左侧)。(图3I)DC中的IL-27信号转导在DC中调制MHC-II和共刺激分子表达。存在或不存在IL-27下经ecLPS处理的cDC的流式细胞术分析。三次独立实验的代表柱状图，同种型对照抗体获得的染色以灰色示出。
图4A-图4E示出IL-27限制效应T细胞分化和EAE发展。(图4A)WT和Il-27ra-/-小鼠中EAE的发展，各组疾病的临床得分(左侧子图)和线性回归曲线(虚线表示95％置信区间)。(图4B)通过流式细胞术对CNS浸润CD4+T细胞的IFN-γ、IL-17、IL-10和Foxp3表达进行分析。(图4C)EAE诱导后21天从WT和Il-27ra-/-小鼠分离的脾细胞对MOG(35-55)的记忆应答。(图4D)EAE诱导后21天的WT和Il-27ra-/-小鼠中CD4+CD44+CD40L高脾IFN-γ+、IL-17+、IFN-γ+IL-17+(DP)、IL-10+和Foxp3+CD4+T细胞的频率。(图4E))利用MOG(35-55)和免疫后21天从WT和Il-27ra-/-小鼠分选的cDC对CFSE标记的初始型2D2+CD4+T细胞进行刺激，并对T细胞增殖进行分析。增殖细胞的频率在柱状图中示出，增殖指数在右侧示出(图4E)。柱状图内的数字示出阳性细胞的百分数。示出以n≥5只小鼠/组进行的(三次实验中的)代表实验。*P<0.05和**P<0.01(学生t检验)。
图5A-图5H示出DC中缺少IL-27RA表达的小鼠的生成。(图5A)利用来自表达白喉毒素受体(DTR)(所述白喉毒素受体处于CD11c(itgax)启动子的控制下)的小鼠(CD11c-DTR小鼠)的骨髓(BM)对经致死性辐照的WT小鼠进行再造(reconstituted)。再造后，通过给予白喉毒素(DTx)耗尽DC，利用来自WT小鼠(Cx3Cr1-GFP+/-WT)或Il-27ra-/-小鼠(Cx3Cr1-GFP+/-Il-27ra-/-)的DC前体对DC区室进行再造。(图5B)DC前体(CDP)的代表性流式细胞术分析。(图5C)来自于DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)小鼠的血清中针对白喉毒素(DT)的抗体。(图5D)利用qPCR对从初始型DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)小鼠分选的cDC、Ly6C低和Ly6C高单核细胞中IL27ra的表达进行的分析。(图5E)来自于DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)小鼠的脾中cDC和pDC的绝对数量和频率(左侧子图)。(图5F-图5H)DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)接受者中的被动转移EAE。用MOG(35-55)对2D2小鼠进行免疫；免疫7天后，在IL-12或IL-23存在下利用MOG(35-55)对T细胞进行培养；再刺激后48h，借助ELISA确定分泌至细胞培养基中的IL-17和IFN-γ(图5F)。在将TH1或TH17极化T细胞转移至DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)小鼠中后，在接受者小鼠中监控EAE的发展。各组疾病的临床得分(左侧子图)和线性回归曲线(虚线表明95％置信区间)(图5G)。借助流式细胞术对CNS浸润CD4+T细胞的IFN-γ和IL-17、IL-10表达进行分析(图5H)。**P<0.01(单因素ANOVA和学生t检验)，与DC(WT)相比。数据代表至少三次独立实验。
图6A-图6I示出cDC中的IL-27RA信号转导控制T细胞分化和EAE发展。(图6A)从初始型DC(WT)或DC(IL-27RA-KO)小鼠分选的脾cDC中IL-27RA的流式细胞术。线段上方的数字表示IL-27RA+DC(WT)cDC(黑色)或DC(IL-27RA-KO)cDC(红色)的百分数；虚线，同种型匹配的对照抗体。(图6B)DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)小鼠中EAE的发展，以临床得分(左)和线性回归曲线(右；较细的线表明95％置信区间)示出。(图6C)借助流式细胞术对CNS浸润CD4+T细胞中IFN-γ+、IL-17+、IL-10+和Foxp3+细胞的频率进行的分析。(图6D)EAE诱导后21天从DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)小鼠分离的脾细胞对MOG(35-55)(MOG)的记忆应答。(图6E)EAE诱导后21天的DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)小鼠中CD4+CD44+CD40L高脾IFN-γ+、IL-17+、IFN-γ+IL-17+(DP)、IL-10+和Foxp3+CD4+T细胞的频率。象限中或靠近框出区域的数字表示各情况细胞的百分数。(图6F)EAE诱导后21天从DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)小鼠分选的cDC中Il27ra、Il6、Il12a、Il23a、Il27、Ifnb1、Il10和Tgfb1mRNA的表达，相对于Gapdh表示。(图6G)EAE诱导后21天从DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)小鼠分离的cDC的定量表达谱，相对于内源对照基因表示。(图6H-图6I)用分裂示踪染料CFSE标记、并利用MOG(35-55)和EAE诱导后21天从DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)小鼠分选的cDC刺激的初始型2D2CD4+T细胞的增殖(图6H)和细胞因子分泌(图6I)。曲线上方的数字(图6H，左侧)表示CFSE+(增殖的)细胞的百分数；绿线(图6H)，未增殖的细胞。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001，与DC(WT)相比(学生t检验)。数据来自于代表以每组五只以上小鼠进行的三次实验的一次实验(误差棒(图6B-图6I)，s.e.m.)。
图7A-图7D示出IL-27对cDC的转录作用。(图7A-图7B)对DC中IL-27的转录作用进行的Ingenuity通路分析(IPA)识别出IL-27对NF-kB(图7A)和Toll样受体(图7B)信号转导通路的显著效果。在NF-kB和Toll样受体信号转导通路中，带有绿色阴影的区域表示基因的下调，带有红色阴影的区域表示基因的上调。(图7C)借助实时定量PCR测量的用IL-27处理0、2、6和24h的cDC中Ido1和Ido2、Entpd1、Il27、Il10、Tnip3、Tnfaip3、Ramp3和Esr1表达的时程(timecourse)。结果相对于编码Gapdh的mRNA的表达示出。(图7D)利用NetGenerator生成的IL-27对DC的作用的计算模型。示出与未处理cDC相比IL-27处理的脾cDC中的综合相互作用。黑色边表示没有现有知识情况下的推测联系，绿色边表示吻合，灰色虚线边表示现有知识未在推测的网络中重现。*P<0.05和**P<0.01(单因素ANOVA)，与未处理cDC(0时刻)相比。
图8A-图8J示出CD39对于IL-27对DC的抑制作用而言是必需的。(图8A-图8B)在存在针对IL-27、IL-10、IFN-γ或TGF-β的同种型匹配的对照抗体(IC)或阻断抗体(Ab)的情况下(图8A)，或者存在(+)或不存在(-)1-D-MT的情况下(图8B)，利用抗CD3与仅经ecLPS处理(-)或经IL-27预处理并经ecLPS处理(+)的野生型cDC刺激的初始型CD4+T细胞的增殖。(图8C)利用抗CD3与仅经ecLPS处理或经IL-27预处理并经ecLPS处理的DC(CD39-KO)cDC刺激的T细胞的增殖。(图8D)从初始型DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)小鼠分选的cDC中Entpd1mRNA的定量PCR分析(左)和CD39的流式细胞术(右)；mRNA结果为相对于Gapdh。线段上方的数字(右)表示CD39+细胞的百分数；虚线，同种型匹配的对照抗体。(图8E-图8F)暴露于IL-27(20ng/ml)不同时间的脾cDC中总STAT1和STAT3以及磷酸化的(p-)STAT1和STAT3的免疫印迹分析(图8E)和流式细胞术(图8F)。(图8G)Entpd1启动子中的STAT1-结合位点(绿色；IRF-1)、STAT3-结合位点(蓝色；SRE-1和SRE-2)以及STAT1-STAT3-结合位点(绿色-蓝色)。(图8H-图8I)STAT3(图8H)或STAT1(图8I)与未处理cDC(无)或经IL-27或ecLPS单独或顺序处理的cDC中的Entpd1启动子的多个结合位点(如图8G(上图))的相互作用的染色质免疫沉淀分析。(图8J)仅转染CD39萤光素酶报告子(对照)或共同转染CD39萤光素酶报告子和编码组成型活化的单独的STAT1(STAT1c)或单独的STAT3(STAT3c)或这二者(STAT1c+STAT3c)的构建体的HEK293细胞中的萤光素酶活性。*P<0.05和**P<0.01(单因素ANOVA)。数据代表具有类似结果的超过三次独立实验(误差棒(图8A-图8D、图8F和图8H-图8J)，s.e.m.))。
图9A-图9E示出ENTPD1对于IL-27对DC的作用而言是必需的。(图9A)存在或不存在ecLPS的情况下经IL-27处理的cDC中的PD-L1表达。框出区域附近的数字表示CD11cPD-L1阳性细胞的百分数。(图9B)利用抗CD3与经ecLPS处理或经ecLPS+IL-27处理的WT、Il27ra-、Il10-、CD274(PD-L1)-或Entpd1(CD39)缺陷的cDC对初始型CD4+T细胞进行刺激，并对增殖进行分析。(图9C)利用抗CD3与经ecLPS处理或经ecLPS+IL-27处理的Entpd1缺陷的cDC对初始型CD4+T细胞进行刺激，并借助流式细胞术对IFNγ+、IL-17+、IL-10+和Foxp3+T细胞的分化进行分析。(图9D)利用qPCR对从初始型DC(WT)和DC(CD39-KO)小鼠分选的cDC、Ly6C低和Ly6C高单核细胞中的Entpd1表达进行的分析。(图9E)来自于DC(WT)和DC(CD39-KO)小鼠的脾中cDC和pDC的频率(左侧子图)和绝对数量。*P<0.05；**P<0.01(单因素ANOVA)。数据代表至少三次独立实验。
图10A-图10F示出IL-27诱导的CD39控制细胞外ATP和NLRP3炎性体的活化。(图10A)经IL-27或ecLPS单独或顺序处理的野生型(WT)、IL-27RA缺陷(Il27ra-/-)或CD39缺陷(Entpd1-/-)cDC的培养上清液中的细胞外ATP浓度。(图10B)在用500μM外源ATP孵育后，存在(+)或不存在(-)LPS的情况下经ecLPS处理的cDC的培养上清液中的残余细胞外ATP。(图10C)如图10A的cDC中CD39的酶活性的薄层色谱测定。(图10D)AMP条带强度的定量，相对于如图10A处理的CD39缺陷cDC中的ADP以任意单位(arbitraryunits，AU)表示。(图10E)如图10A的cDC中的胱天蛋白酶-1(caspase-1)和IL-1β的免疫印迹分析(左)和密度测定(densitometry)(右)。(图10F)如图10A的cDC的培养上清液中IL-1β的定量。*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001(单因素ANOVA)。数据代表具有类似结果的两次独立实验(误差棒(图10A-图10B以及图10D-图10F)，s.e.m.)。
图11A-图11H示出DC中的CD39控制T细胞分化和EAE发展。(图11A)从初始型DC(WT)或DC(CD39-KO)小鼠分选的脾DC中CD39的流式细胞术。线段上方的数字(图11A)表示CD39+DC(WT)cDC(黑色)或DC(CD39-KO)cDC(红色)的百分数；虚线，同种型匹配的对照抗体。(图11B)DC(WT)和DC(CD39-KO)小鼠中EAE的发展(如图6B所示的来表示)。(图11C)利用流式细胞术对CNS浸润CD4+T细胞中IFN-γ+、IL-17+、IL-10+和Foxp3+细胞的频率进行的分析。(图11D)EAE诱导后21天从DC(WT)和DC(CD39-KO)小鼠分离的脾细胞对MOG(35-55)的记忆应答。(图11E)EAE诱导后21天的DC(WT)和DC(CD39-KO)小鼠中CD4+CD44+CD40L高脾IFN-γ+、IL-17+、IFN-γ+IL-17+(DP)、IL-10+和Foxp3+CD4+T细胞的频率。(图11F)EAE诱导后21天从DC(WT)和DC(CD39-KO)小鼠分选的cDC中Entpd1、Il6、Il12a、Il23a、Il27、Ifnb1、Il10和Tgfb1的表达，相对于Gapdh表示。(图11G-图11H)利用MOG(35-55)以及免疫后21天从DC(WT)和DC(CD39-KO)小鼠分选的cDC刺激的、CFSE标记的初始型2D2CD4+T细胞的增殖(图11G)和细胞因子分泌(图11H)(如图6H所示的表示g中的结果)。*P<0.05和**P<0.01，与DC(WT)相比(学生t检验)。数据来自代表以每组五只以上小鼠进行的三次实验中的一次实验(误差棒(图11B-图11H)，s.e.m.)。
图12A-图12D示出用经IL-27调整的DC进行疫苗接种阻抑了EAE。通过用PLP(131-159)对初始型SJL小鼠进行免疫来诱导EAE，i.v.给予DC4次，从第20天开始每4天一次。(图12A)EAE病程(course)以整个观测时段的平均EAE得分±SEM(每组小鼠n＝5)(左侧子图)以及从第20天至实验结束各组疾病的线性回归曲线示出。箭头表示DC疫苗给药。(图12B-图12D)通过用MOG(35-55)对初始型B6小鼠进行免疫来诱导EAE，i.v.给予DC4次，从EAE诱导后第10天开始每4天一次。(图12B)EAE病程以整个观测时段的平均EAE得分±SEM(每组小鼠n＝5)(左侧子图)以及各组疾病的线性回归曲线示出。箭头表示DC疫苗给药。(图12C)治疗性DC疫苗接种对B6EAE的作用。(图12D)EAE诱导后21天从DC处理的小鼠获取的脾细胞对MOG(35-55)的记忆增殖应答和细胞因子应答。数据代表至少三次独立实验。NS，不显著。*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001(单因素ANOVA)，相对于对照小鼠。
图13A-图13F示出用经IL-27调整的DC进行疫苗接种阻抑了EAE。(图13A)EAE病程以整个观测时段的临床得分(左侧)和从第20天至实验结束的线性回归曲线(右侧)示出；通过未处理(无)，或仅用PLP(131-151)(DC+PLP)、仅用IL-27(DC+IL-27)、或用PLP和IL-27这二者(DC+IL-27+PLP)对初始型SJL小鼠进行免疫来诱导EAE，随后静脉内给予DC(向下的箭头)4次，从第20天开始每4天一次。(图13B-图13E)如图13A的EAE诱导后55天从DC处理的小鼠获得的脾细胞对PLP(131-151)(图13B-图13C)或PLP(178-191)(图13D-图13E)的记忆增殖应答(图13B和图13D)和细胞因子应答(图13C和图13E)。(图13F)如图13A的EAE诱导后55天对髓鞘抗原(右侧空白)的抗体应答的热图(利用抗原微阵列进行评估)；各列表示免疫球蛋白G(IgG)对各处理条件(图例，下方)的平均血清反应性。*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001，相对于未处理的对照小鼠(单因素ANOVA)。数据代表至少三次独立实验(图13A中每组五只小鼠的平均值和s.e.m.；误差棒(图13B-图13E)，s.e.m.)。
图14A-图14C示出IL-27作用于DC，经由ENTPD1(CD39)上调控制Treg和Teff分化。(图14A)eATP活化DC中的NLRP3炎性体并促进Teff分化。(图14B)由IL-27诱导的ENTPD1(CD39)降解eATP，限制Teff分化并促进Treg生成。(图14C)融合至IL-27或腺苷三磷酸双磷酸酶的靶向DC的抗体的生物治疗剂促进Treg生成并限制Teff分化。
具体实施方式
本文所述多个方面的实施方式部分地基于如下发现：白介素27(IL-27)作用于树突状细胞(DC)，使得调节性T细胞(Treg)扩增和/或阻抑T细胞应答(包括例如通过对辅助T细胞Th1和/或Th17子类的效应细胞的产生进行限制)，从而抑制自身免疫应答的发展。发明人还发现，IL-27对DC的免疫阻抑效应至少部分地通过诱导免疫调节分子外核苷酸酶CD39在DC中表达来介导。此外，发明人发现，常规DC(cDC)表达的CD39降低了细胞外ATP(eATP)的浓度，并减少了ATP触发的NLRP3炎性体的活化。发明人还发现，利用经IL-27调整的或经IL-27处理的DC进行的治疗性疫苗接种可阻抑建立的复发-缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。因此，不仅能够将调制IL-27、IL-27RA、CD39(或外核苷酸酶CD39)和/或促炎性eATP的活性和/或表达/水平的试剂靶向至DC，以治疗免疫相关疾病或紊乱(例如自身免疫疾病)，还能够将经IL-27调整的或经IL-27处理的DC给予至受试者，以治疗免疫相关疾病或紊乱(例如自身免疫疾病或紊乱)。因此，本文所述的多个方面提供了用于生成免疫阻抑性树突状细胞的方法；以及用于对免疫相关疾病或紊乱(包括例如自身免疫疾病)进行治疗的方法和组合物。
免疫阻抑性树突状细胞和生成所述免疫阻抑性树突状细胞的方法
本文提供的一个方面涉及生成免疫阻抑性树突状细胞的方法。所述方法包括：将树突状细胞与包含有效量的刺激或活化IL-27/外核苷酸酶CD39轴信号转导的试剂的组合物相接触。树突状细胞可获取自或来源自任何来源。例如，树突状细胞可来源自脾、淋巴结、血液、单核细胞和/或造血祖细胞。
DC为控制T细胞活化和/或极化为特定谱系的抗原提呈细胞(APC)。T细胞谱系间的相互作用调节自身免疫疾病或紊乱(例如但不限于多发性硬化、自身免疫性脑脊髓炎和糖尿病)的发展。DC表达功能性IL-27受体(18)；然而，IL-27信号转导在DC中的生理相关性及其在控制T细胞应答和自身免疫性方面的作用未知。根据本文所述的多个方面，刺激或活化IL-27/CD39轴信号转导的试剂可作用于DC，从而阻抑T细胞应答和自身免疫性。
如在本文和整个申请文件中所使用的，本文中可互换使用的短语“刺激或活化IL-27/外核苷酸酶CD39轴信号转导的试剂”或“IL-27/CD39激动性试剂”指的是诱导出经由如上文定义的IL-27/CD39轴信号转导介导的免疫阻抑的试剂。例如，通过限制辅助T细胞Th1和Th17子类的效应细胞的生成，IL-27/CD39轴阻抑促炎性免疫应答或诱导免疫阻抑。如上所指出的，发明人发现，DC表达的CD39降低了细胞外ATP(eATP)的浓度，并因此减少了ATP触发的NLRP3炎性体的活化，并促进了Treg(调节性T细胞)生成和/或限制了Teff(效应T细胞)分化。
在一些实施方式中，待与树突状细胞相接触的IL-27/CD39激动性试剂可为IL-27激动剂。例如，IL-27激动剂可包含重组IL-27蛋白或肽。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂可为CD39激动剂。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂可为ATP降解酶，包括例如腺苷三磷酸双磷酸酶。
IL-27/CD39激动性试剂能够以足以生成免疫阻抑性树突状细胞的任何量存在。例如，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可足以在DC中上调CD39的表达、磷酸化STAT3和/或表达一种或多种抗炎性基因(包括例如IDO1、IDO2、IL-10、IL-27、A20、TGFβ1、IL-10和/或IFN-β)。例如，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为：与无该IL-27/CD39激动性试剂的DC相比，足以使得DC中一种或多种抗炎性基因(包括例如IDO1、IDO2、IL-10、IL-27、A20、TGFβ1、IL-10和/或IFN-β)的表达、STAT3的磷酸化和/或CD39的表达上调至少约10％以上(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％以上)。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为：与无该IL-27/CD39激动性试剂的DC相比，足以使得DC中一种或多种抗炎性基因(包括例如IDO1、IDO2、IL-10、IL-27、A20、TGFβ1、IL-10和/或IFN-β)的表达、STAT3的磷酸化和/或CD39的表达上调至少约1.1倍以上(包括例如至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍以上)。用于对这些生物分子或细胞因子进行检测和/或测量的方法为本领域所知晓。例如，可借助定量PCR、免疫测定法和/或FACS对DC中CD39或抗炎性基因和/或蛋白的表达进行分析；可借助FACS、免疫测定法和/或western印迹确定磷酸化的STAT3。
在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可处于约1ng/mL至约100ng/mL的范围。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可处于约5ng/mL至约50ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL的范围。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为约10ng/mL至约30ng/mL、或约15ng/mL至约25ng/mL。
在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为至少约1ng/mL、至少约5ng/mL、至少约10ng/mL、至少约15ng/mL、至少约20ng/mL、至少约25ng/mL、至少约30ng/mL、至少约40ng/mL、至少约50ng/mL、至少约60ng/mL、至少约70ng/mL、至少约80ng/mL、至少约90ng/mL、或至少约100ng/mL。
在一些实施方式中，IL-27激动剂的有效量可处于约1ng/mL至约100ng/mL的范围。在一些实施方式中，IL-27激动剂的有效量可处于约5ng/mL至约50ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL的范围。在一些实施方式中，IL-27激动剂的有效量可为约10ng/mL至约30ng/mL、或约15ng/mL至约25ng/mL。在一些实施方式中，IL-27激动剂的有效量可为至少约1ng/mL、至少约5ng/mL、至少约10ng/mL、至少约15ng/mL、至少约20ng/mL、至少约25ng/mL、至少约30ng/mL、至少约40ng/mL、至少约50ng/mL、至少约60ng/mL、至少约70ng/mL、至少约80ng/mL、至少约90ng/mL、或至少约100ng/mL。
在一些实施方式中，所述方法可进一步包含将树突状细胞与自身免疫抗原相接触。树突状细胞与至少一种以上的自身免疫抗原的接触可发生在树突状细胞与包含IL-27/CD39激动性试剂的组合物的接触之前、同时或之后。
本文使用的术语“抗原”意味着刺激免疫应答的物质、分子或化合物。虽然通常为蛋白或多糖，抗原可为任何类型的分子或微生物(例如细胞和/或病毒)，可包括任选地与载体蛋白偶联的小分子(半抗原)。
如本文所使用的，被调制的“免疫应答”是指免疫系统的细胞对刺激(stimulus)的应答，所述免疫系统的细胞例如为B细胞、T细胞(CD4或CD8)、调节性T细胞、抗原提呈细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、NKT细胞、NK细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性细胞或嗜中性细胞。在一些实施方式中，应答对具体抗原具有特异性(“抗原特异性应答”)，并指的是由CD4T细胞、CD8T细胞或B细胞经由它们的抗原特异性受体作出的应答。在一些实施方式中，免疫应答为T细胞应答，例如CD4+应答或CD8+应答。这些细胞作出的此类应答可包括例如细胞毒性、增殖、细胞因子或趋化因子的产生、输运(trafficking)或吞噬作用，并可取决于经历所述应答的免疫细胞的性质。
本文使用的术语“自身免疫抗原”是指作为自身免疫疾病的原因或靶标的任何自体蛋白或自体组分。自身免疫抗原的实例包括但不限于：髓鞘碱性蛋白(MBP)；蛋白脂质蛋白(PLP)；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)，髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白心脏肌球蛋白；外表面蛋白(OSP)；髓鞘相关糖蛋白(MAG)；神经丝；干扰素ω；转谷氨酰胺酶；芳香酸羧化酶；17-羟化酶；21-羟化酶，心磷脂；丙酮酸脱氢酶；β2糖蛋白I；磷脂酰丝氨酸；apoH；膜联蛋白A5；LKM-1；可溶性肝抗原；碳酸酐酶；gpIIb-IIIa或1b-IX；XVII型胶原；组织转谷氨酰胺酶；麦醇溶蛋白；GD1a；GQ1b；BP-1；BP-2；表皮转谷氨酰胺酶；组氨酸-tRNA；信号识别肽；Mi-2；Jo1；谷氨酸脱羧酶，HSP60；HSP70；HSP90；IGRP；胰岛素；羧肽酶H；胰岛素瘤抗原-2；IA-2β；ICA69；ZnT8；嗜铬粒蛋白A；IAPP；scl70；拓朴异构酶；组蛋白；基底膜IV型胶原；烯醇化酶；甲状腺过氧化物酶；甲状腺球蛋白；补体成分3；电压门控钙通道；Q型钙通道，突触结合蛋白，毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1；SMA；LKM-1；LKM-2；LKM-3；可溶性肝抗原；SLA；LP；主要外周髓鞘蛋白P0；髓过氧化物酶；GQ1b；U1-RNP；Kir4.1；烟碱型乙酰胆碱受体；MuSK蛋白；下丘脑分泌素；食欲素；角蛋白；AQP4；Yo；Hu；谷氨酸受体；桥粒芯蛋白3；p62；sp100；Ro；LA；糖蛋白IIb-IIIa或Ib-IX；ADAMTS13；心磷脂；β2糖蛋白I；HPA-1a；HPA-5b；IFN-γ，IL-1，TNF-α；GMCSF，上述抗原的部分以及它们的组合。自身免疫抗原的其它实例包括但不限于：外周髓鞘蛋白P0和P2(Guillain-Barre综合征)；乙酰胆碱受体(重症肌无力)；心脏肌球蛋白(风湿热/心肌炎)；胰岛β细胞的蛋白—GAD(谷氨酸脱羧酶)、胰岛素(I型自身免疫性糖尿病)、促甲状腺素受体(Grave's病)、血小板(血小板减少性紫癜)、神经肌肉接头(重症肌无力)、血红细胞(自身免疫性溶血性贫血)和细胞内抗原(在系统性红斑狼疮中的剪接体、核糖体、核酸等)，上述抗原的部分以及它们的组合。
在一些实施方式中，自身免疫抗原可包括神经抗原(neuroantigen)。本文使用的术语“神经抗原”(NAg)是指包含自身反应性表位的神经系统蛋白(中枢或外周)的自身免疫抗原类型。神经抗原可为髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOG)，或其它神经系统衍生的蛋白或蛋白部分，并进一步包括衍生自任何物种(包括例如人、大鼠和小鼠)的神经系统衍生的蛋白或蛋白部分。
可将树突状细胞与足以建立对特定抗原的耐受性的量的自身免疫抗原相接触。本文使用的术语“耐受性”是指免疫应答水平的降低、免疫应答启动或进展的延迟和/或免疫应答启动或进展风险的降低。当与其它抗原相比而言优先调用针对某些抗原的免疫耐受时，发生“特异性”免疫耐受。“活性(active)”免疫耐受是指由于生物过程的进行导致耐受效应的状态；例如，通过阻抑细胞对特定效应细胞的下调。“持续耐受性”是以可测的程度持续较长的一段时间的耐受性。
在一些实施方式中，待与树突状细胞相接触的自身免疫抗原的浓度可为约0.01μg/mL至约100μg/mL、约0.1μg/mL至约100μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约5μg/mL至约90μg/mL、约10μg/mL至约80μg/mL、约20μg/mL至约70μg/mL、约30μg/mL至约60μg/mL。在一些实施方式中，自身免疫抗原可具有约0.1μg/mL至约10μg/mL的浓度。
本文所述的生成免疫阻抑性树突状细胞的方法可在受试者体内、离体或体外实施。因此，在一些实施方式中，可离体或在体外将树突状细胞与包含IL-27/CD39激动性试剂的组合物相接触。在替代的实施方式中，可在体内将树突状细胞与包含IL-27/CD39激动性试剂的组合物相接触。
本文使用的术语“接触”是指用于将试剂(例如IL-27/CD39激动性试剂和/或自身免疫抗原)递送或暴露至细胞(例如树突状细胞)的任何适合的方式。示例性的递送方法包括但不限于直接递送至细胞培养基、递送至细胞培养物(例如通过灌注)，给予受试者(例如通过注射和/或植入)，或本领域技术人员熟知的其它递送方法。在一个实施方式中，可将IL-27/CD39激动性试剂和任选的自身免疫抗原加入至其中培养有树突状细胞的细胞培养基。在另一实施方式中，可将IL-27/CD39激动性试剂和任选的自身免疫抗原涂覆在其上培养有树突状细胞的固体支撑物上。在又一实施方式中，可将IL-27/CD39激动性试剂和任选的自身免疫抗原注射入其中包封有树突状细胞的生物相容性凝胶或基质(例如肽凝胶、水凝胶)。在一个实施方式中，将树突状细胞与加入至细胞培养基的IL-27/CD39激动性试剂和任选的自身免疫抗原相接触。在另一实施方式中，可将IL-27/CD39激动性试剂和任选的自身免疫抗原引入或靶向至受试者中的树突状细胞。就将细胞暴露至试剂而言(例如利用IL-27/CD39激动性试剂和任选的自身免疫抗原对树突状细胞进行处理)，本文所使用的术语“调整(conditioned)”或“处理”在本文中可与术语“接触”互换使用。
可将树突状细胞与包含IL-27/CD39激动性试剂和任选的自身免疫抗原的组合物接触任意一段时间、或用包含IL-27/CD39激动性试剂和任选的自身免疫抗原的组合物处理或调整任意一段时间，例如数分钟、数小时、数天或数周。在一些实施方式中，可将树突状细胞与包含IL-27/CD39激动性试剂和任选的自身免疫抗原的组合物接触至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约9小时、至少约12小时、至少约18小时、至少约24小时或更久。在一些实施方式中，可将树突状细胞与包含IL-27/CD39激动性试剂和任选的自身免疫抗原的组合物接触至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天或更久。在一些实施方式中，可将树突状细胞与包含IL-27/CD39激动性试剂和任选的自身免疫抗原的组合物相接触，直至它们已准备好给予至有需要的受试者(例如诊断患有自身免疫疾病的受试者)。
树突状细胞可获取自或来源自任何来源。例如，树突状细胞可来源自脾、淋巴结、血液、单核细胞和/或造血祖细胞。在一些实施方式中，树突状细胞包含常规(髓样)DC。在一些实施方式中，树突状细胞包含浆细胞样DC。分离树突状细胞的方法为本领域所知晓。参见例如CurrentProtocolsinImmunology(1998)补充材料25：3.7.1-3.7.15；Inaba等，CurrProtocImmunol(2001)第3章；第3.7单元；以及本文所描述的实施例。分离树突状细胞的试剂盒为商购可得的(例如来自STEMCELLTMTechnologies和/或LifeTechnologies)，并可用于分离树突状细胞。
免疫阻抑性树突状细胞：另一方面，本文还提供了涉及IL-27/CD39激动性试剂、借助本文所述的方法产生的免疫阻抑性树突状细胞。本文所述方法的多个实施方式生成的免疫阻抑性树突状细胞为独特的，可利用本领域已知的方法(包括但不限于FACS、western印迹、qPCR和/或免疫测定法)从未处理的树突状细胞识别出该免疫阻抑性树突状细胞。在一些实施方式中，可基于IL-27和/或CD39的表达、和/或STAT3的磷酸化、和/或抗炎性基因(包括例如IDO1、IDO2、IL-10、IL-27、A20和本文实施例中讨论的任何其它抗炎性基因)的表达，利用FACS分选从未处理的树突状细胞识别并分离本文所述方法生成的免疫阻抑性树突状细胞。
在一些实施方式中，与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)接触的树突状细胞相比，本文所述的免疫阻抑性树突状细胞可包含升高至少约10％以上(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％以上)的IL-27表达。在一些实施方式中，与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)接触的树突状细胞相比，本文所述的免疫阻抑性树突状细胞可包含升高至少约1.1倍以上(包括例如至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍以上)的IL-27表达。
在一些实施方式中，与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)接触的树突状细胞相比，本文所述的免疫阻抑性树突状细胞可包含升高至少约10％以上(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％以上)的CD39表达。在一些实施方式中，与未与包含IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)的组合物接触的树突状细胞相比，本文所述的免疫阻抑性树突状细胞可包含升高至少约1.1倍以上(包括例如至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍以上)的CD39表达。
在一些实施方式中，与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)接触的树突状细胞相比，本文所述的免疫阻抑性树突状细胞可包含升高至少约10％以上(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％以上)的STAT3磷酸化。在一些实施方式中，与未与包含IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)的组合物接触的树突状细胞相比，本文所述的免疫阻抑性树突状细胞可包含升高至少约1.1倍以上(包括例如至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍以上)的STAT3磷酸化。
在一些实施方式中，与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)接触的树突状细胞相比，所述免疫阻抑性树突状细胞可包含降低至少约10％以上(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或上至100％)的效应极化细胞因子产生。示例性的效应极化细胞因子包括但不限于IL-12和/或IL-6。
在一些实施方式中，与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)接触的树突状细胞相比，所述免疫阻抑性树突状细胞可包含升高至少约10％以上(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％以上)的抗炎性细胞因子产生和/或抗炎性基因表达。示例性的抗炎性细胞因子包括但不限于TGFβ1、IL-10、IFN-β或上述细胞因子的任意组合。示例性的抗炎性基因包括但不限于IDO1、IDO2、IL-10、IL-27、A20和本文实施例中讨论的任何其它抗炎性基因。
在一些实施方式中，免疫阻抑性树突状细胞可为耐受原性的。本文使用的术语“耐受原性的”意味着通过抗原或抗原性物质或导致诱导出针对抗原或抗原性物质的免疫耐受的活性诱导了免疫耐受性应答。
还预期的是，可通过阻抑IL-27/CD39轴信号转导来产生免疫活性树突状细胞。例如，可将树突状细胞与阻抑IL-27/CD39轴信号转导的一种或多种组分的试剂相接触。在一些实施方式中，此类试剂可为IL-27拮抗剂。在一些实施方式中，此类试剂可为CD39拮抗剂。
在一些实施方式中，可从受试者获取树突状细胞，并使用本文所述的方法使其变为免疫阻抑性树突状细胞。随后可将获得的自体免疫阻抑性细胞给予至所述受试者，用于例如自身免疫疾病的治疗性处理中。
治疗免疫相关疾病或紊乱(例如但不限于自身免疫疾病或紊乱)的方法
如前所指出的，发明人发现，除了其它方面以外，IL-27还在动物模型中作用于DC，使得Treg扩增、限制Teff并阻抑自身免疫疾病(例如但不限于I型糖尿病、多发性硬化(MS)和脑脊髓炎)。IL-27对DC的抗炎效应至少部分地通过外核苷酸酶CD39(由ENTPD1编码)的上调以及随后的促炎性细胞外ATP(eATP)水平的降低来介导。在一些免疫相关疾病或紊乱(例如但不限于自身免疫疾病)中，对于治疗效果而言，可期望对促炎性应答(例如经由Th1和/或Th17应答)进行阻抑，或者促进抗炎性应答(例如通过抗炎性细胞因子的表达和/或产生)。因此，可通过在DC中诱导IL-27/CD39轴信号转导而生成免疫阻抑性DC，从而对这些免疫相关疾病或紊乱进行治疗。
在一些方面，本文提供了对自身免疫疾病或紊乱进行治疗的方法。“自身免疫疾病或紊乱”是指受试者自身的抗体与宿主组织反应的一类疾病或紊乱、或者免疫效应T细胞对内源自体肽具有自体反应性并引起组织破坏的一类疾病或紊乱。因此，免疫应答针对受试者自身的抗原(称为自体抗原)而发动。本文使用的“自体抗原”是指正常宿主组织的抗原。正常宿主组织不包括癌细胞。
因此，在一些实施方式中，待利用本文所述的方法治疗或预防的自身免疫疾病包括但不限于：类风湿性关节炎、Crohn's病、多发性硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力(MG)、Hashimoto's甲状腺炎、Goodpasture's综合征、天疱疮(例如寻常天疱疮(pemphigusvulgaris))、Grave's病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、有抗胶原抗体的硬皮病、混合性结缔组织病、多发性肌炎、恶性贫血、特发性Addison's病、自身免疫相关不孕症、肾小球肾炎(例如新月体性肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎)、大疱性类天疱疮、Sjogren's综合征、胰岛素抗性以及自身免疫性糖尿病(I型糖尿病；胰岛素依赖性糖尿病)。已认可了自身免疫疾病还涵盖动脉粥样硬化和Alzheimer's病。在本文所述方面的一个实施方式中，自身免疫疾病选自于由下列疾病组成的组：多发性硬化、I型糖尿病、Hashinoto's甲状腺炎、Crohn's病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、胃炎、自身免疫性肝炎、溶血性贫血、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、肾小球肾炎、Guillain-Barre综合症、牛皮癣和重症肌无力。
该治疗方法包含向有需要的患者给予靶向树突状细胞(DC)的组合物，所述组合物包含(i)刺激或活化IL-27/外核苷酸酶39轴信号转导的试剂(或IL-27/CD39激动性试剂)；以及(ii)DC结合剂。
在一些实施方式中，所述方法可适于治疗I型糖尿病。
在一些实施方式中，所述方法可适于治疗多发性硬化。
在一些实施方式中，所述方法可适于治疗脑脊髓炎。
靶向DC的组合物：靶向DC的组合物包含至少一种以上(例如至少两种、至少三种以上)的IL-27/CD39激动性试剂。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂可为IL-27激动剂。例如，IL-27激动剂可包含重组IL-27蛋白或肽。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂可为CD39激动剂。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂可为ATP降解酶，包括例如腺苷三磷酸双磷酸酶。
可以足以生成免疫阻抑性树突状细胞的任何量给予IL-27/CD39激动性试剂。例如，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为：与未与IL-27/CD39激动性试剂接触的DC相比，足以使得DC中一种或多种抗炎性基因(包括例如IDO1、IDO2、IL-10、IL-27、A20、TGFβ1、IL-10和/或IFN-β)的表达、STAT3的磷酸化和/或CD39的表达上调。
在一些实施方式中，存在于靶向DC的组合物中的IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为：与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)接触的树突状细胞相比，足以使得DC中IL-27的表达上调至少约10％以上(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％以上)。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为：与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)接触的树突状细胞相比，足以使得DC中IL-27的表达上调至少约1.1倍以上(包括例如至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍以上)。
在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为：与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)接触的树突状细胞相比，足以使得DC中CD39的表达上调至少约10％以上(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％以上)。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为：与未与包含IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)的组合物接触的树突状细胞相比，足以使得DC中CD39的表达上调至少约1.1倍以上(包括例如至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍以上)。
在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为：与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)接触的树突状细胞相比，足以使得DC中STAT3的磷酸化上调至少约10％以上(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％以上)。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为：与未与包含IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)的组合物接触的树突状细胞相比，足以使得DC中STAT3的磷酸化上调至少约1.1倍以上(包括例如至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍以上)。
在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为：与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)接触的树突状细胞相比，足以使得DC中效应极化细胞因子的产生降低至少约10％以上(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或上至100％)。示例性的效应极化细胞因子包括但不限于IL-12和/或IL-6。
在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为：与未与IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)接触的树突状细胞相比，足以使得DC中至少一种以上的抗炎性细胞因子的产生和/或一种或多种抗炎性基因的表达升高至少约10％以上(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％以上)。示例性的抗炎性细胞因子包括但不限于TGFβ1、IL-10、IFN-β或上述细胞因子的任意组合。示例性的抗炎性基因包括但不限于IDO1、IDO2、IL-10、IL-27、A20和本文实施例中讨论的任何其它抗炎性基因。
在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可处于约1ng/mL至约100ng/mL的范围。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可处于约5ng/mL至约50ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL的范围。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为约10ng/mL至约30ng/mL、或约15ng/mL至约25ng/mL。
在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可为至少约1ng/mL、至少约5ng/mL、至少约10ng/mL、至少约15ng/mL、至少约20ng/mL、至少约25ng/mL、至少约30ng/mL、至少约40ng/mL、至少约50ng/mL、至少约60ng/mL、至少约70ng/mL、至少约80ng/mL、至少约90ng/mL、或至少约100ng/mL。
在一些实施方式中，IL-27激动剂的有效量可处于约1ng/mL至约100ng/mL的范围。在一些实施方式中，IL-27激动剂的有效量可处于约5ng/mL至约50ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL的范围。在一些实施方式中，IL-27激动剂的有效量可为约10ng/mL至约30ng/mL、或约15ng/mL至约25ng/mL。在一些实施方式中，IL-27激动剂的有效量可为至少约1ng/mL、至少约5ng/mL、至少约10ng/mL、至少约15ng/mL、至少约20ng/mL、至少约25ng/mL、至少约30ng/mL、至少约40ng/mL、至少约50ng/mL、至少约60ng/mL、至少约70ng/mL、至少约80ng/mL、至少约90ng/mL、或至少约100ng/mL。
IL-27/CD39激动性试剂的有效剂量可在组合物与组合物之间、患者与患者之间发生变化，并将取决于患者的身体状况和/或医疗状况和/或递送途径。在一些实施方式中，IL-27/CD39激动性试剂的有效量可随受试者的体重而变化，例如约1ng/kg至约200mg/kg、或约0.01mg/kg至约150mg/kg、或约0.1mg/kg至约100mg/kg、或约1mg/kg至约50mg/kg。可通过单个剂量或分开的多个剂量将所述有效剂量给予受试者。
DC结合剂：包含本文所述的IL-27/CD39激动性试剂的靶向DC的组合物适于优先或特异性地靶向DC。因此，给予至受试者的靶向DC的组合物包含一种或多种DC结合剂。本文使用的术语“DC结合剂”是指能够促进包含IL-27/CD39激动性试剂的组合物在体内和/或体外靶向至树突状细胞的任何材料、物质、试剂或部分(moiety)。DC结合剂可为合成、半合成或天然存在的。能够作为DC结合剂的材料或物质包括例如蛋白(包括抗体、抗体片段、激素、激素类似物、糖蛋白)、肽、多肽、氨基酸、糖(sugars)、糖类(saccharides)(包括单糖和多糖)、碳水化合物、维生素、类固醇、类固醇类似物、激素、辅因子以及遗传物质(包括核苷、核苷酸、核苷酸构建体、肽核酸(PNA)、适体以及多核苷酸)。本发明的其它DC结合剂包括细胞粘附分子(CAM)，其中包括例如细胞因子、整合素、钙粘蛋白、免疫球蛋白和选择素。靶向DC的组合物还可包含至少一种以上的DC结合剂前体。DC结合剂的前体是指能够转化为DC结合剂的任何材料或物质。此类转化可涉及例如锚定DC结合剂的前体。示例性的靶向前体部分包括马来酰亚胺基团、二硫化物基团(如邻二硫吡啶)、乙烯基砜基团和叠氮基团。DC结合剂可共价(例如交联)或非共价地连接至靶向DC的组合物和/或IL-27/CD39激动性试剂。
在一些实施方式中，DC结合剂为特异性或优先靶向或结合至DC、使得实质量的IL-27/CD39激动性试剂能够被递送至DC的试剂或部分。在一些实施方式中，DC结合剂特异性地仅靶向或结合DC。在一些实施方式中，DC结合剂优先靶向或结合DC，且不靶向任何T细胞。本文使用的术语“优先”是指递送至树突状细胞的存在于靶向DC的组合物中的IL-27/CD39激动性试剂的量大于递送至任何其它细胞的量。在一些实施方式中，至少50％以上(包括例如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％以上、以及上至100％)的存在于靶向DC的组合物中的IL-27/CD39激动性试剂被递送至树突状细胞。
靶向DC的组合物中可使用本领域已知的任何DC结合剂。DC结合剂的实例包括但不限于结合至DC表面蛋白或受体的试剂。示例性的DC结合剂包括但不限于针对Clec9A和/或DEC205的抗体。本文所述的靶向DC的组合物中可使用的DC结合剂(例如抗DC受体抗体和DC结合肽)的其它实例包括但不限于如下文献中描述的DC结合剂：Flamar等，Retrovirology(2009)6(补充材料3)：p286；Sioud等，FASEBJ.(2013)27：3272-83；以及Subramanya等，J.Virol(2010)84：2490-2501。
本文使用的术语“抗体”一般地指全长抗体或免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子，或它们的仅包含完整抗体一部分的蛋白部分，通常包含完整抗体的抗原结合位点并因此保留了与靶标(例如表位或抗原)结合的能力。由本定义涵盖的抗体部分或表位结合蛋白的实例包括：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab'片段，其为在CH1结构域的C末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1结构域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CH1结构域以及在CH1结构域的C末端处的一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体单臂的VL和VH结构域；(vi)dAb片段(Ward等，341Nature，544(1989))，其由结合抗原的VL结构域或VH结构域构成；(vii)分离的CDR区或存在于功能性框架中的分离的CDR区；(viii)F(ab')2片段，其为包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab'片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)(Bird等，242Science，423(1988)；及Huston等，85PNAS，5879(1988))；(x)带有两个抗原结合位点的“双功能抗体(diabodies)”，其包含在相同多肽链中与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)(参见例如EP404,097；WO93/11161；Hollinger等，90PNAS6444(1993))；(xi)“线性抗体”，其包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，所述Fd区段与互补轻链多肽一起形成抗原结合区域对(Zapata等，8ProteinEng.1057(1995)；及美国专利号5,641,870)。
“抗体”包括抗体的抗原结合部分，例如表位结合肽或抗原结合肽、互补位、功能性CDR；重组抗体；嵌合抗体；三功能抗体(tribodies)；midibodies；或它们的抗原结合衍生物、类似物、变体、部分或片段。
在一些实施方式中，DC结合剂可包含针对树突状细胞表面蛋白或受体(包括但不限于Clec9A和/或DEC205)的单链抗体。
靶向DC的融合蛋白：作为免疫调制剂起作用的靶向DC的组合物可以特异性或优先地靶向或结合DC的任何合适形式存在。例如，靶向DC的组合物可为包含本文所述的DC结合剂以及至少一种以上的本文所述的IL-27/CD39激动性试剂的融合蛋白。本文使用的术语“融合蛋白”是指包含靶多肽(例如IL-27/CD39激动性试剂)和至少一种第二异源融合伴侣多肽的融合多肽。融合伴侣例如可提高融合多肽的体内稳定性、调制其生物活性或定位、或者促进融合多肽的纯化。
在一些实施方式中，融合伴侣可促进包含至少一种以上(包括例如至少两种以上)的IL-27/CD39激动性试剂的本文所述的组合物靶向至树突状细胞。在一些实施方式中，融合伴侣可包含本文所述的DC结合剂，或者可为本文所述的DC结合剂。
可被进一步包含从而生成用于本文所述的方法和组合物的此类融合多肽的异源融合伴侣多肽的其它实例包括但不限于对于通过亲和层析分离融合多肽而言特别有用的多聚组氨酸(His或6His标签)、Glu-Glu标签、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、多肽A、多肽G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)以及麦芽糖结合多肽(MBP)。就亲和纯化的目的而言，使用用于亲和层析的相关基质，例如缀合有谷胱甘肽、淀粉酶和镍或钴的树脂。在一些实施方式中，融合多肽可具有蛋白酶切割位点，如Xa因子或凝血酶，其允许相关的蛋白酶部分地消化融合多肽，以从中释放重组多肽。然后可通过随后的色谱分离从融合多肽分离所释放的多肽。
靶向DC的纳米颗粒：在一些实施方式中，可将包含至少一种以上(包括例如至少两种、至少三种以上)的IL-27/CD39激动性试剂的靶向DC的组合物配制成纳米颗粒的形式。IL-27/CD39激动性试剂、DC结合剂和/或任选的自身免疫抗原可分布于纳米颗粒表面上、或被包封于纳米颗粒内。在一些实施方式中，DC结合剂可形成于纳米颗粒表面上，而一种或多种IL-27/CD39激动性试剂和任选的自身免疫抗原可被包封于纳米颗粒内，从而可从纳米颗粒释放至DC。
在一些实施方式中，纳米颗粒可包含在其表面上的生物相容性层或材料。本文使用的术语“生物相容性层或材料”是指当放置于受试者的生物组织附近时随时间推移不会明显劣化且不诱导显著副作用(例如毒性反应)、或者当与血液相接触时不会诱导血液结块或凝结的任何材料或层。合适的生物相容性材料可包括但不限于包含氨基基团的聚合物(例如基于碳水化合物的氨基聚合物、基于蛋白的氨基聚合物、或包含至少一个氨基基团的分子)；丝素蛋白；聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚乙烯胺、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚酰亚胺、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯、聚甲基戊烯、聚丙烯、聚偏二氟乙烯(polyvinylidinefluoride)、聚硅(polysilicon)、聚四氟乙烯、聚砜、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚(对苯二甲酸丁二醇酯)、聚(醚砜)、聚(醚醚酮)、聚乙二醇、苯乙烯-丙烯腈树脂、聚(对苯二甲酸丙二醇酯)、聚乙烯醇缩丁醛、聚偏氟乙烯(polyvinylidenedifluoride)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚酰亚胺的衍生物和共聚物；以及上述物质的任意组合。在一些实施方式中，纳米颗粒可包含在其表面上的聚乙二醇(PEG)层。在一些实施方式中，可选择生物相容性层，以延长纳米颗粒在受试者中的循环时间。在一些实施方式中，可选择生物相容性层，以诱导受试者中的抗原特异性免疫。在一些实施方式中，可选择生物相容性层，以减少或尽可能减少纳米颗粒材料暴露于受试者中的周围组织。在一个实施方式中，纳米颗粒可进一步包含在其表面上的PEG层。
一般而言，给予至受试者的纳米颗粒可由本文所述的任何生物相容性材料和/或惰性金属(例如但不限于金)制成。本文使用的术语“纳米颗粒”是指颗粒尺寸为约0.1nm至约1000nm的颗粒。此外，纳米颗粒可为任何形状或形式，例如球形、棒状、椭圆形、圆柱形、胶囊或圆盘(disc)。术语“纳米颗粒”包括纳米球、纳米棒、纳米壳和纳米棱柱，这些纳米颗粒可为纳米网络的一部分。不受限制地，本文使用的纳米颗粒可为本领域可得或本领域技术人员能够获得的任何纳米颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒的尺寸为约10nm至约750nm、约20nm至约500nm、约25nm至约250nm或约50nm至约150nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的尺寸为约5nm至约75nm、约10nm至约50nm、约15nm至约25nm。纳米颗粒可为例如单分散或多分散的，且给定分散度中颗粒直径的方差可改变。纳米颗粒可为中空或实心的。在一个实施方式中，纳米颗粒为金纳米颗粒。
在一个实施方式中，本文所述的靶向DC的组合物包含聚乙二醇化的金纳米颗粒，其中，至少一种以上(包括例如至少两种以上)的IL-27/CD39激动性试剂形成在金纳米颗粒表面上。可对Yeste等，PNAS(2012)109：1270-5中描述的聚乙二醇化的纳米颗粒进行修饰，从而将包含至少一种以上(包括例如至少两种以上)的IL-27/CD39激动性试剂的组合物递送至树突状细胞。
在一些实施方式中，本文所述的靶向DC的组合物可进一步包含至少一种以上(包括例如至少两种、至少三种以上)的本文所述的自身免疫抗原。在一些实施方式中，可将自身免疫抗原连接至本文所述的靶向DC的融合蛋白。在一些实施方式中，可将自身免疫抗原偶联至本文所述的靶向DC的纳米颗粒。存在于靶向DC的组合物中的自身免疫抗原的量可足以在有需要的受试者中建立对特定抗原的免疫耐受性。例如，靶向DC的组合物中自身免疫抗原的量可处于约0.01μg/mL至约100μg/mL、约0.1μg/mL至约100μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约5μg/mL至约90μg/mL、约10μg/mL至约80μg/mL、约20μg/mL至约70μg/mL、约30μg/mL至约60μg/mL的范围。在一些实施方式中，自身免疫抗原可具有约0.1μg/mL至约10μg/mL的浓度。
在一些实施方式中，靶向DC的组合物中自身免疫抗原的量可处于约0.01μg/kg至约1000μg/kg、或约0.1μg/kg至约500μg/kg、或约0.5μg/kg至约250μg/kg、或约1μg/kg至约100μg/kg的范围。在一些实施方式中，靶向DC的组合物中自身免疫抗原的量可处于约1mg/kg至约500mg/kg、或约5mg/kg至约250mg/kg、或约10mg/kg至约100mg/kg、或约20mg/kg至约50mg/kg的范围。
另一方面，可利用本文所述的一种或多种IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)对树突状细胞进行预处理，从而生成免疫阻抑性树突状细胞，随后可将所述免疫阻抑性树突状细胞给予或植入至有需要的受试者(例如诊断患有自身免疫疾病或紊乱的受试者)。因此，本文还提供了治疗自身免疫疾病或紊乱的方法，所述方法包含给予有需要的受试者或在有需要的受试者中放置包含免疫阻抑性树突状细胞群的组合物，所述免疫阻抑性树突状细胞为通过将树突状细胞与至少一种以上的IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)相接触而生成。
在一些实施方式中，免疫阻抑性树突状细胞群包含自体树突状细胞。因此，在一些实施方式中，所述方法可进一步包含从受试者的样品获得树突状细胞。例如，所述样品可为来自脾或淋巴结的组织活检样品，或为血液样品。随后可利用至少一种以上的IL-27/CD39激动性试剂(包括例如IL-27激动剂)对自体树突状细胞进行离体预处理，随后植入受试者。
在一些实施方式中，包含免疫阻抑性树突状细胞的组合物可进一步包含本文所述的自身免疫抗原。可在将包含免疫阻抑性树突状细胞的组合物给予或放置于受试者的靶组织位点或靶器官位点之前、同时或之后给予自身免疫抗原。
疫苗：在一些实施方式中，可将本文所述的靶向DC的组合物和/或包含本文所述的免疫阻抑性树突状细胞的组合物看作是用于治疗自身免疫疾病或紊乱的治疗性疫苗。
本文使用的术语“疫苗”一般地指给予动物以引发针对试剂的免疫应答的免疫组合物。本文使用的术语“疫苗”包括治疗性和预防性疫苗。本文中从广义上定义术语“疫苗”，以表示用于产生主动免疫(activeimmunity)的生物试剂。疫苗通常使用四类抗原中的一类：经由非天然途径给予的活微生物、活的减毒微生物、杀灭的微生物、以及微生物的部分或甚至单抗原或产物。在全部情况下，目标在于提呈抗原而不导致疾病。在一些实施方式中，抗原包含本文所述的自身免疫抗原。
在一些实施方式中，本文所述的疫苗可进一步包含佐剂。本文使用的术语“佐剂”是指能够使得免疫效应细胞活化增强或加强的、不同于靶抗原的物质。认为一些佐剂通过缓慢释放抗原来增强免疫应答，而其它佐剂具有强免疫原性并被认为起到协同作用。已知的疫苗佐剂包括但不限于油水乳剂(例如完全Freund's佐剂和不完全Freund's佐剂，以及MerialLimited持有的美国专利号US7371395公开的佐剂，以引用的方式将它们整体并入本文)、短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)、卡介苗(BacillusCalmetteGuerin)、氢氧化铝、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化铁、藻酸钠、Bacto佐剂、某些合成聚合物(如聚氨基酸和氨基酸共聚物)、皂苷、“REGRESSIN”(Vetrepharm，Athens，Ga.)、“AVRIDINE”(N,N-双十八烷基-N',N'-双(2-羟乙基)-丙二胺)、石蜡油、胞壁酰二肽等。
因此，另一方面，治疗自身免疫疾病或紊乱的方法包括用包含本文所述的靶向DC的组合物和/或包含免疫阻抑性细胞群的组合物的疫苗对受试者进行疫苗接种。术语“疫苗接种(vaccinating或vaccination)”为本领域所熟知。例如，术语“疫苗接种”可被理解为此类过程：提高受试者针对抗原的免疫反应，并因此提高抵抗或克服感染的能力。在本发明的情况下，疫苗接种或免疫可降低接受者针对自体抗原的免疫应答，因此降低自身免疫应答的可能。
预期的是，在其它免疫相关疾病或紊乱(包括例如癌症)中，对于治疗效果而言，可期望在靶位点(例如肿瘤)诱导促炎性应答(例如Th1/Th17应答)。因此，可通过阻抑IL-27/CD39轴信号转导来治疗这些期望使免疫应答上调的免疫相关疾病或紊乱(例如但不限于癌症)。例如，在一些实施方式中，可向诊断患有癌症的受试者给予靶向DC的组合物，所述靶向DC的组合物包含DC结合剂和阻抑IL-27/CD39轴信号转导的试剂(也称为“IL-27/CD39拮抗性试剂”)。
还预期的是，可通过下调或阻抑IL-27/CD39轴信号转导来对期望使Th2应答减弱的其它炎性疾病或紊乱(包括例如过敏和哮喘)进行治疗。刺激或活化IL-27/CD39轴信号转导的试剂(“IL-27/CD39激动性试剂”)
(I)IL-27及其激动剂
IL-27为与IL-12结构上相关的细胞因子，由p28亚基和Epstein-Barr病毒诱导基因3(Ebi3)的产物构成(8)。IL-27通过由共用的IL-6受体链gp130(由IL-6和IL-12家族的几种其它成员使用)和独特的IL-27受体α链(IL-27RA)(与IL-12受体的IL-12Rβ2链同源)组成的受体传递信号(8)。之前的报道表明，DC可借助涉及干扰素-β(IFN-β)自分泌效应的机制对经由Toll样受体的活化作出应答，从而产生IL-27(9)。然而，IL-27能够作用于DC以阻抑T细胞应答和自身免疫是未知的。
基于IL-27与IL-12的结构同源性及其触发IFN-γ产生的能力，最初认为IL-27是促炎性细胞因子(11)。然而，随后报道了IL-27在数种实验模型中阻抑TH1、TH2和TH17应答，并限制CNS炎症(8)。在EAE模型中，IL-27的给予抑制疾病发展(12)。相反地，缺少功能性IL-27受体导致TH17应答加重及EAE恶化(12、13)。之前报道了IL-27直接作用于T细胞，以抑制致病性TH17细胞的发育、并促进产生IL-10的I型Treg细胞(Tr1细胞)的分化(12-17)。因此，在发明人发现IL-27能够作用于树突状细胞，以通过诱导免疫调节分子CD39的表达来阻抑T细胞应答和自身免疫(如本文在实施例中所示出的)之前，一般认为由IL-27实现的EAE停滞反映的是IL-27对T细胞的直接作用。
本文使用的术语“IL-27”一般地指与野生型IL-27的序列类似或相同的IL-27多肽或IL-27多核苷酸。
在一些实施方式中，术语“IL-27”是指具有与野生型IL-27的氨基酸序列至少70％以上(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列、且能够作用于DC并阻抑T细胞应答的IL-27多肽。在一些实施方式中，IL-27多肽还可提高CD39的表达和/或活性，从而介导免疫阻抑。
在一些实施方式中，术语“IL-27”是指具有与野生型IL-27或其部分的核苷酸序列至少70％以上(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列、且编码本文所述的IL-27多肽的IL-27多核苷酸。
可在万维网上从NCBI获得多种物种的野生型IL-27序列，包括人、小鼠、猪、大鼠、狗和牛。例如，编码人IL-27的核苷酸序列可在NCBI登记号NM_145659获得，其对应的氨基酸序列为登记号NP_663634。
当术语“IL-27”指IL-27多肽时，术语“IL-27多肽”也涵盖保留了野生型IL-27多肽作用于DC以阻抑T细胞应答的活性的至少约70％以上(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)的此类IL-27多肽的部分或片段。本文使用的术语“IL-27多肽”还涵盖保留了野生型IL-27多肽作用于DC以阻抑T细胞应答的活性的至少约70％以上(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)的IL-27多肽的保守置换变体。因此，IL-27多肽是指任何免疫阻抑形式的IL-27，包括IL-27的功能性变体。例如，在一些实施方式中，IL-27多肽可为全长IL-27。在一些实施方式中，IL-27多肽是指作用于DC并诱导免疫阻抑以及CD39的表达和/或活性的IL-27的功能性结构域。
例如可通过首先利用比对算法(例如或本领域熟知的其它方法)对两条多肽序列进行比对，确定两条多肽间的氨基酸一致性。
类似地，术语“激动剂”以最广义使用，并包括模仿(mimics)本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。合适的激动剂分子特别包括激动剂型抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、有机小分子、重组蛋白或肽等。识别多肽的激动剂的方法可包括将多肽与候选激动剂分子相接触，并对通常与该多肽相关联的一种或多种生物活性的可检测改变进行测量。
本文使用的术语“IL-27激动剂”是指通过提高编码IL-27的核酸的转录或翻译、和/或通过抑制或阻断抑制IL-27表达或IL-27活性的分子的活性、和/或通过增强正常IL-27活性(包括但不限于增强IL-27的稳定性或增强IL-27与一种或多种靶受体(例如IL-27RA)的结合)来增强或刺激IL-27的正常功能的试剂。例如，IL-27激动剂可选自于抗体、抗原结合片段、适体、干扰RNA、小分子、肽、反义分子和另一结合多肽。在另一实例中，IL-27激动剂可为选自于如下多核苷酸的多核苷酸：干扰IL-27抑制性分子的转录和/或翻译的反义分子、适体或干扰RNA。本领域技术人员将理解的是，在某些情况下，IL-27激动剂可激发(agonize)一种IL-27活性、而不影响另一种IL-27活性。例如，期望用于本文某些方法的IL-27激动剂为激发IL-27作用于DC以诱导免疫阻抑的活性、同时例如不影响或最小限度地影响任何其它IL-27相互作用的IL-27激动剂。
在一些实施方式中，IL-27激动剂为直接或间接增强或刺激DC中IL-27介导的信号转导以诱导免疫阻抑的试剂。因此，IL-27激动剂可靶向IL-27受体或其相应配体、或IL-27的任何上游分子。IL-27激动剂的实例包括但不限于IL-27重组肽或蛋白和/或IL-27受体激动剂(例如IL-27RA激动剂)。IL-27激动剂可为蛋白、肽、拟肽、适体、核酸、抗体、小分子、疫苗、融合蛋白、重组分子，或它们的任意组合。
在一些实施方式中，IL-27激动剂为重组IL-27蛋白(例如重组人IL-27蛋白)。重组IL-27蛋白为商购可得的，例如来自Biolegend(Cat.No.589202)；AffymetrixeBioscience(Cat.No.34-8279-82)；和R&DSystems(Cat.No.2526-IL-010/CF)。
IL-27激动剂可由已知来源获得，或者利用已知技术(例如重组技术或合成技术)来制备。不同物种(例如但不限于人、小鼠、大鼠、狗和黑猩猩)的IL-27及其受体的核酸和蛋白序列为本领域所知，例如可在万维网上从NCBI获得。因此，本领域技术人员可基于这些序列，使用本领域公认的分子技术(例如克隆)和表达技术生成IL-27激动剂。例如，可基于人IL-27的核酸序列(可由NCBI登记号NM_145659获得)和/或其对应的氨基酸序列(登记号NP_663634)或它们的片段，生成人IL-27激动剂(例如IL-27重组蛋白)。
(II)CD39及其激动剂
CD39为外核苷三磷酸二磷酸水解酶(E-NTPDase)家族的细胞表面定位的原型酶，也称为ENTPD1、ATPDase或NTPDase-1。CD39为催化细胞外ATP和ADP降解的外核苷酸酶。细胞外ATP触发NLRP3炎性体的活化，显示该过程在EAE过程中控制致脑炎性Th1和Th17细胞的分化。
本文使用的术语“CD39”一般地指与野生型CD39的序列类似或相同的CD39多肽或CD39多核苷酸。
在一些实施方式中，术语“CD39”是指具有与野生型CD39的氨基酸序列至少70％以上(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列、且能够催化细胞外ATP(eATP)降解的CD39多肽。
在一些实施方式中，术语“CD39”是指具有与野生型CD39或其部分的核苷酸序列至少70％以上(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列、且编码本文所述的CD39多肽的CD39多核苷酸。
可在万维网上从NCBI获得多种物种的野生型CD39序列，包括人、小鼠、猪和大鼠。例如，编码人CD39的核苷酸序列可在NCBI登记号NM_001098175、NM_001164178、NM_001164179、NM_001164181、NM_001164182、NM_001164183或NM_001776获得，其对应的氨基酸序列为登记号NP_001091645、NP_001157650、NP_001157651、NP_001157653、NP_001157654、NP_001157655或NP_001767。
当术语“CD39”指CD39多肽时，术语“CD39多肽”也涵盖保留了野生型CD39多肽催化eATP降解的活性的至少约70％以上(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)的此类CD39多肽的部分或片段。本文使用的术语“CD39多肽”还涵盖保留了野生型CD39多肽催化eATP降解的活性的至少约70％以上(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)的CD39多肽的保守置换变体。因此，CD39多肽是指能够催化eATP降解的任何形式的CD39，包括CD39的功能性变体。例如，在一些实施方式中，CD39多肽可为全长CD39。在一些实施方式中，CD39多肽是指催化eATP降解的CD39的功能性结构域。
本文使用的术语“CD39激动剂”是指通过提高编码CD39的核酸的转录或翻译、和/或通过抑制或阻断抑制CD39表达或CD39活性的分子的活性、和/或通过增强正常CD39活性(包括但不限于增强CD39的稳定性或增强诱导CD39表达的IL-27信号转导)来增强或刺激CD39的正常功能的试剂。例如，CD39激动剂可选自于抗体、抗原结合片段、适体、干扰RNA、小分子、肽、反义分子和另一结合多肽。在另一实例中，CD39激动剂可为选自于如下多核苷酸的多核苷酸：干扰CD39抑制性分子的转录和/或翻译的反义分子、适体或干扰RNA。本领域技术人员将理解的是，在某些情况下，CD39激动剂可激发一种CD39活性、而不影响另一种CD39活性。例如，期望用于本文某些方法的CD39激动剂为激发CD39催化eATP降解的活性、同时例如不影响或最小限度地影响任何其它CD39相互作用的CD39激动剂。
在一些实施方式中，CD39激动剂为直接或间接增强或刺激CD39介导的eATP降解，从而下调NLRP3炎性体的活化的试剂。因此，CD39激动剂可靶向CD39自身、CD39配体或CD39的任何上游分子。CD39激动剂的实例包括但不限于CD39重组肽或蛋白和/或IL-27激动剂。CD39激动剂可为蛋白、肽、拟肽、适体、核酸、抗体、小分子、疫苗、融合蛋白、重组分子，或它们的任意组合。
在一些实施方式中，CD39激动剂为重组CD39蛋白(例如重组人CD39蛋白)。重组CD39蛋白为商购可得的，例如来自R&DSystems(Cat.No.4397-EN-010)。
CD39激动剂可由已知来源获得，或者利用已知技术(例如重组技术或合成技术)来制备。不同物种(例如但不限于人、小鼠和大鼠)的CD39及其受体的核酸和蛋白序列为本领域所知，例如可在万维网上从NCBI获得。因此，本领域技术人员可基于这些序列，使用本领域公认的分子技术(例如克隆)和表达技术生成CD39激动剂。例如，可基于人CD39的核酸序列(可由NCBI登记号NM_001098175、NM_001164178、NM_001164179、NM_001164181、NM_001164182、NM_001164183或NM_001776获得)及其对应的氨基酸序列(登记号NP_001091645、NP_001157650、NP_001157651、NP_001157653、NP_001157654、NP_001157655或NP_001767)或它们的片段，生成人CD39激动剂(例如CD39重组蛋白)。
(III)ATP降解剂(例如腺苷三磷酸双磷酸酶及其激动剂)
ATP降解剂为能够降解eATP和/或催化eATP降解/水解的分子或化合物。在一些实施方式中，ATP降解剂包括腺苷三磷酸双磷酸酶。腺苷三磷酸双磷酸酶(也称为ATP-双磷酸酶、腺苷双磷酸酶、ADPase、ATP二磷酸水解酶)为钙活化的质膜结合酶，它催化ATP水解，产生AMP和无机磷酸。在商购制剂中发现来自马铃薯(S.tuberosum)的两种同工酶。
本文使用的术语“腺苷三磷酸双磷酸酶”一般地指与野生型腺苷三磷酸双磷酸酶的序列类似或相同的腺苷三磷酸双磷酸酶多肽或腺苷三磷酸双磷酸酶多核苷酸。
在一些实施方式中，术语“腺苷三磷酸双磷酸酶”是指具有与野生型腺苷三磷酸双磷酸酶的氨基酸序列至少70％以上(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列、且能够催化细胞外ATP(eATP)降解/水解的腺苷三磷酸双磷酸酶多肽。
在一些实施方式中，术语“腺苷三磷酸双磷酸酶”是指具有与野生型腺苷三磷酸双磷酸酶或其部分的核苷酸序列至少70％以上(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列、且编码本文所述的腺苷三磷酸双磷酸酶多肽的腺苷三磷酸双磷酸酶多核苷酸。
可在万维网上从NCBI获得多种物种的野生型腺苷三磷酸双磷酸酶序列，包括人、小鼠、猪、大鼠和马铃薯。例如，编码人腺苷三磷酸双磷酸酶的核苷酸序列可在NCBI登记号NM_001159772、NM_001159773或NM_138793获得，其对应的氨基酸序列为登记号NP_001153244、NP_001153245或NP_620148。
当术语“腺苷三磷酸双磷酸酶”指腺苷三磷酸双磷酸酶多肽时，术语“腺苷三磷酸双磷酸酶多肽”也涵盖保留了野生型腺苷三磷酸双磷酸酶多肽催化eATP降解/水解的活性的至少约70％以上(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)的此类腺苷三磷酸双磷酸酶多肽的部分或片段。本文使用的术语“腺苷三磷酸双磷酸酶多肽”还涵盖保留了野生型腺苷三磷酸双磷酸酶多肽催化eATP降解/水解的活性的至少约70％以上(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)的腺苷三磷酸双磷酸酶多肽的保守置换变体。因此，腺苷三磷酸双磷酸酶多肽是指能够催化eATP降解/水解的任何形式的腺苷三磷酸双磷酸酶，包括腺苷三磷酸双磷酸酶的功能性变体。例如，在一些实施方式中，腺苷三磷酸双磷酸酶多肽可为全长腺苷三磷酸双磷酸酶。在一些实施方式中，腺苷三磷酸双磷酸酶多肽是指催化eATP降解/水解的腺苷三磷酸双磷酸酶的功能性结构域。
本文使用的术语“腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂”是指通过提高编码腺苷三磷酸双磷酸酶的核酸的转录或翻译、和/或通过抑制或阻断抑制腺苷三磷酸双磷酸酶表达或腺苷三磷酸双磷酸酶活性的分子的活性、和/或通过增强正常腺苷三磷酸双磷酸酶活性(包括但不限于增强腺苷三磷酸双磷酸酶的稳定性)来增强或刺激腺苷三磷酸双磷酸酶的正常功能的试剂。例如，腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂可选自于抗体、抗原结合片段、适体、干扰RNA、小分子、肽、反义分子和另一结合多肽。在另一实例中，腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂可为选自于如下多核苷酸的多核苷酸：干扰腺苷三磷酸双磷酸酶抑制性分子的转录和/或翻译的反义分子、适体或干扰RNA。本领域技术人员将理解的是，在某些情况下，腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂可激发一种腺苷三磷酸双磷酸酶活性、而不影响另一种腺苷三磷酸双磷酸酶活性。例如，期望用于本文某些方法的腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂为激发腺苷三磷酸双磷酸酶催化eATP降解/水解的活性、同时例如不影响或最小限度地影响任何其它腺苷三磷酸双磷酸酶相互作用的腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂。
在一些实施方式中，腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂为直接或间接增强或刺激腺苷三磷酸双磷酸酶介导的eATP降解/水解，从而下调NLRP3炎性体的活化的试剂。因此，腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂可靶向腺苷三磷酸双磷酸酶自身或腺苷三磷酸双磷酸酶的任何上游分子。腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂的实例包括但不限于重组腺苷三磷酸双磷酸酶、CD39激动剂和/或IL-27激动剂。腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂可为蛋白、肽、拟肽、适体、核酸、抗体、小分子、疫苗、融合蛋白、重组分子，或它们的任意组合。
在一些实施方式中，腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂为重组腺苷三磷酸双磷酸酶蛋白(例如重组人腺苷三磷酸双磷酸酶蛋白)。重组腺苷三磷酸双磷酸酶蛋白为商购可得的，例如来自Sigma-Aldrich(Cat.No.A6535)或NewEnglandBiolabs(Cat.No.M0393)。在一些实施方式中，本文所述的方法和/或组合物中使用来自于马铃薯的腺苷三磷酸双磷酸酶。
腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂可由已知来源获得，或者利用已知技术(例如重组技术或合成技术)来制备。不同物种(例如但不限于人、小鼠、猪、大鼠和马铃薯)的腺苷三磷酸双磷酸酶及其受体的核酸和蛋白序列为本领域所知，例如可在万维网上从NCBI获得。因此，本领域技术人员可基于这些序列，使用本领域公认的分子技术(例如克隆)和表达技术生成腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂。例如，可基于人腺苷三磷酸双磷酸酶的核酸序列(可由NCBI登记号NM_001159772、NM_001159773或NM_138793获得)及其对应的氨基酸序列(登记号NP_001153244、NP_001153245或NP_620148)或它们的片段，生成人腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂(例如重组腺苷三磷酸双磷酸酶)。在一些实施方式中，可基于马铃薯腺苷三磷酸双磷酸酶的核酸序列(可由NCBI登记号XM_006349845获得)或其对应的氨基酸序列(登记号XP_006349907)，生成腺苷三磷酸双磷酸酶激动剂。
药物组合物
本文还提供了用于治疗免疫相关疾病或紊乱(包括例如自身免疫疾病或紊乱)的药物组合物。更具体而言，所述药物组合物包含(i)药学上可接受的赋形剂；以及(ii)本文所述的靶向DC的组合物，所述靶向DC的组合物包含至少一种以上(包括例如至少两种以上)的IL-27/CD39激动性试剂和/或免疫阻抑性树突状细胞。
在一些实施方式中，所述药物组合物可进一步包含用于治疗自身免疫疾病或紊乱的试剂。例如，所述试剂可包含提高抗炎性T细胞应答的试剂和/或阻抑促炎性T细胞应答的试剂。
短语“药学上可接受的”是指在健全的(sound)医学判断范围内，适合用于与人类和动物组织相接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或者其它问题或并发症，具有合理的收益/风险比的化合物、材料、组合物和/或剂型。本文所使用的短语“药学上可接受的载体”是指参与维持本文所述的IL-27/CD39激动性试剂或免疫阻抑性树突状细胞的稳定性、溶解度或活性的药学上可接受的材料、组合物或辅料(例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质、包封材料、制造助剂(manufacturingaid，如润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂包封材料)。从与制剂的其它成分相容以及对患者无害的意义上来说，各载体必须是“可接受的”。一些可作为药学上可接受的载体的材料的实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)西黄蓍胶(tragacanth)粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)赋形剂，如可可脂和栓蜡；(8)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(9)二醇，如丙二醇；(10)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(11)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(12)琼脂；(13)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(14)藻酸；(15)无热原(pyrogen-free)的水；(16)等渗盐水；(17)林格氏溶液；(19)pH缓冲溶液；(20)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(21)膨胀剂(bulkingagents)，如多肽和氨基酸；(22)血清组分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(23)C2-C12醇，如乙醇；以及(24)其它用于药物制剂中的无毒相容物质。隔离剂(releaseagent)、包衣剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于制剂中。诸如“赋形剂”、“载体”或“药学上可接受的载体”等术语在本文中可互换使用。
本文所述的药物组合物可被具体配制为用于以固体、液体或凝胶形式将本文所述的靶向DC的组合物或免疫阻抑性树突状细胞给予受试者，包括适于以下给药途径的形式：(1)胃肠外给药，例如作为如无菌溶液剂或混悬剂或缓释制剂经皮下注射、肌内注射、静脉内注射或硬膜外注射(epiduralinjection)给药；(2)局部施用，例如作为霜剂、软膏剂或控释贴剂或喷雾剂施用于皮肤；(3)阴道内给药或直肠内给药，例如作为阴道栓剂(pessary)、霜剂或泡沫剂；(4)眼部给药；(5)经皮给药(transdermally)；(6)经粘膜给药(transmucosally)；或(79)鼻部给药(nasally)。此外，可使用药物递送系统将双特异性多肽试剂或多特异性多肽试剂植入患者或进行注射。参见例如Urquhart等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24:199-236(1984)；Lewis编著，“ControlledReleaseofPesticidesandPharmaceuticals”(PlenumPress，NewYork，1981)；美国专利No.3,773,919；以及美国专利No.353,270,960。
以下对可用于本文所述方法中的本文所述的药物组合物的制剂和给药模式的进一步实施方式进行说明。
胃肠外剂型。还可通过各种途径将本文所述的靶向DC的组合物(所述靶向DC的组合物包含至少一种以上(包括例如至少两种以上)的IL-27/CD39激动性试剂和/或免疫阻抑性树突状细胞)的胃肠外剂型给予受试者，所述途径包括但不限于：皮下给药、静脉内给药(包括快速浓注(bolusinjection))、肌内给药以及动脉内给药。由于胃肠外剂型的给药通常绕开患者对污染物的天然防御，胃肠外剂型优选是无菌的或能够在给予患者之前灭菌。胃肠外剂型的实例包括但不限于：准备用于注射的溶液剂、待溶解或悬浮于用于注射的药学上可接受的辅料中的干燥产品、准备用于注射的混悬剂、受控释放的胃肠外剂型、以及乳剂。
可用于提供所公开的胃肠外剂型的合适辅料是本领域技术人员公知的。实例包括但不限于：无菌水；USP注射用水；盐水溶液；葡萄糖溶液；水性辅料，例如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖(dextrose)注射液、右旋糖和氯化钠注射液、以及乳酸林格氏注射液；与水混溶的辅料，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性辅料，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
受控释放和延长释放剂型(ControlledandDelayedReleaseDosageForms)。在本文所述方法的一些实施方式中，可通过受控释放或延长释放的手段将本文所述的靶向DC的组合物(所述靶向DC的组合物包含至少一种以上(包括例如至少两种以上)的IL-27/CD39激动性试剂或免疫阻抑性树突状细胞)给予受试者。理想的是，在医学治疗中使用优化设计的受控释放制剂的特征在于使用最少的药物物质在最短时间内治愈或控制病情。受控释放制剂的优点包括：1)延长药物活性；2)降低剂量频率；3)提高患者依从性(compliance)；4)使用较少的总药物；5)减少局部或全身副作用；6)使药物累积最小化；7)减少血液水平波动；8)改善治疗功效；9)减少药物活性的增强作用(potentiation)或损失；以及10)改善疾病或病症的控制速度(Kim，Cherng-ju，ControlledReleaseDosageFormDesign，2(TechnomicPublishing，Lancaster，Pa：2000))。受控释放制剂可用于控制式(I)化合物的起效、作用持续时间、治疗窗内的血浆水平、以及峰值血液水平。特别是，受控释放或延长释放剂型或制剂可用于确保实现式(I)化合物的最大效果，同时使潜在的副作用和安全隐患最小化，这些问题可能在低于药物的给药剂量(即，低于最低治疗水平)时以及超过药物的毒性水平时发生。
多种已知的受控释放或延长释放剂型、制剂和装置可适于与本文所述的靶向DC的组合物(所述靶向DC的组合物包含至少一种以上(包括例如至少两种以上)的IL-27/CD39激动性试剂和/或免疫阻抑性树突状细胞)一起使用。实例包括但不限于在以下文献中描述的实例：美国专利No.3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556、5,733,566以及6,365,185B1；以引用的方式将以上每一文献整体并入本文。使用例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、可渗透膜、渗透系统(例如(AlzaCorporation，MountainView，Calif，USA))、多层包衣、微粒、脂质体或微球，或以上方式的组合来提供所需的不同比例的释放曲线，这些剂型可用于提供一种或多种活性成分的缓慢释放(slowrelease)或受控释放。此外，离子交换材料可用于制备所公开的化合物的固定的、吸附的盐形式，并从而影响药物的受控递送。具体的阴离子交换剂的实例包括但不限于：A568和AP143(Rohm&Haas，SpringHouse，Pa.，USA)。
在一些实施方式中，通过缓释(sustainedrelease)或以脉冲形式将用于本文所述方法中的本文所述的靶向DC的组合物(所述靶向DC的组合物包含至少一种以上(包括例如至少两种以上)的IL-27/CD39激动性试剂和/或免疫阻抑性树突状细胞)给予受试者。脉冲疗法(pulsetherapy)并不是在一段时间内不连续地给予相同量组合物的形式，而是包括以降低的频率给予相同剂量的组合物，或者给予减少的剂量。当受试者的紊乱连续发生时(例如，在受试者具有病毒感染的持续症状或慢性症状时)，特别优选缓释给药或脉冲给药。可减少各脉冲剂量，将在治疗过程中给予患者的本文所述的靶向DC的组合物(所述靶向DC的组合物包含至少一种以上(包括例如至少两种以上)的IL-27/CD39激动性试剂和/或免疫阻抑性树突状细胞)的总量最小化。
必要时，脉冲之间的间隔可由本领域普通技术人员确定。通常，可通过在递送下一次脉冲之前，在受试者中不再能检测到组合物或组合物的活性组分时，给予另一剂量的该组合物来计算脉冲之间的间隔。间隔也可由组合物的体内半衰期计算。间隔可计算为大于体内半衰期，或大于组合物半衰期的2倍、3倍、4倍、5倍甚至10倍。用于通过输注或其它递送形式将组合物脉冲至患者的各种方法和装置公开于美国专利No.4,747,825、4,723,958、4,948,592、4,965,251和5,403,590中。
本文所述多个方面的实施方式可由以下编号段落中的任一段定义：
1.一种生成免疫阻抑性树突状细胞的方法，所述方法包括将树突状细胞与包含有效量的IL-27激动剂的组合物相接触。
2.如段落1所述的方法，其中，所述IL-27激动剂的所述有效量处于约1ng/mL至约100ng/mL的范围。
3.如段落1或2所述的方法，所述方法进一步包括将所述树突状细胞与自身免疫抗原相接触。
4.如段落3所述的方法，其中，所述自身免疫抗原具有约1μg/mL至约100μg/mL的浓度。
5.如段落3或4所述的方法，其中，所述自身免疫抗原选自于由如下自身免疫抗原所组成的组：
髓鞘碱性蛋白(MBP)；蛋白脂质蛋白(PLP)；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)，髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白心脏肌球蛋白；外表面蛋白(OSP)；髓鞘相关糖蛋白(MAG)；神经丝；干扰素ω；转谷氨酰胺酶；芳香酸羧化酶；17-羟化酶；21-羟化酶，心磷脂；丙酮酸脱氢酶；β2糖蛋白I；磷脂酰丝氨酸；apoH；膜联蛋白A5；LKM-1；可溶性肝抗原；碳酸酐酶；gpIIb-IIIa或1b-IX；XVII型胶原；组织转谷氨酰胺酶；麦醇溶蛋白；GD1a；GQ1b；BP-1；BP-2；表皮转谷氨酰胺酶；组氨酸-tRNA；信号识别肽；Mi-2；Jo1；谷氨酸脱羧酶，HSP60；HSP70；HSP90；IGRP；胰岛素；羧肽酶H；胰岛素瘤抗原-2；IA-2β；ICA69；ZnT8；嗜铬粒蛋白A；IAPP；scl70；拓朴异构酶；组蛋白；基底膜IV型胶原；烯醇化酶；甲状腺过氧化物酶；甲状腺球蛋白；补体成分3；电压门控钙通道；Q型钙通道，突触结合蛋白，毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1；SMA；LKM-1；LKM-2；LKM-3；可溶性肝抗原；SLA；LP；主要外周髓鞘蛋白P0；髓过氧化物酶；GQ1b；U1-RNP；Kir4.1；烟碱型乙酰胆碱受体；MuSK蛋白；下丘脑分泌素；食欲素；角蛋白；AQP4；Yo；Hu；谷氨酸受体；桥粒芯蛋白3；p62；sp100；Ro；LA；糖蛋白IIb-IIIa或Ib-IX；ADAMTS13；心磷脂；β2糖蛋白I；HPA-1a；HPA-5b；IFN-γ，IL-1，TNF-α；GMCSF，上述抗原的部分以及它们的组合。
6.如段落1-5中任一项所述的方法，其中，所述接触离体或在体外进行。
7.如段落1-5中任一项所述的方法，其中，所述接触在体内进行。
8.如段落1-7中任一项所述的方法，其中，与未与所述IL-27激动剂相接触的树突状细胞相比，所述免疫阻抑性树突状细胞包含表达增高的IL-27。
9.如段落1-8中任一项所述的方法，其中，与未与所述IL-27激动剂相接触的树突状细胞相比，所述免疫阻抑性树突状细胞包含表达增高的CD39。
10.如段落1-9中任一项所述的方法，其中，与未与所述IL-27激动剂相接触的树突状细胞相比，所述免疫阻抑性树突状细胞包含产生减少的效应极化细胞因子和/或产生升高的抗炎性细胞因子。
11.如段落10所述的方法，其中，所述效应极化细胞因子包括IL-12和/或IL-6。
12.如段落10或11所述的方法，其中，所述抗炎性细胞因子包括TGFβ1、IL-10、IFN-β或它们的任意组合。
13.如段落1-12中任一项所述的方法，其中，所述IL-27激动剂包含重组IL-27蛋白或肽。
14.如段落1-13中任一项所述的方法，其中，所述树突状细胞来源自脾、淋巴结、血液、单核细胞和/或造血祖细胞。
15.由段落1-14中任一项所述的方法产生的免疫阻抑性树突状细胞。
16.一种治疗自身免疫疾病或紊乱的方法，所述方法包括向有需要的患者给予靶向树突状细胞(DC)的组合物，所述靶向DC的组合物包含(a)刺激IL-27/外核苷酸酶39轴信号转导的试剂；以及(b)DC结合剂。
17.如段落16所述的方法，其中，所述试剂包含IL-27激动剂。
18.如段落16或17所述的方法，其中，所述试剂包含CD39激动剂。
19.如段落16-18中任一项所述的方法，其中，所述试剂包含ATP降解激动剂。
20.如段落19所述的方法，其中，所述ATP降解激动剂包含腺苷三磷酸双磷酸酶。
21.如段落16-20中任一项所述的方法，其中，所述DC结合剂包含针对Clec9A和/或DEC205的抗体。
22.如段落16-21中任一项所述的方法，其中，所述靶向DC的组合物进一步包含自身免疫抗原。
23.如段落22所述的方法，其中，所述自身免疫抗原选自于由如下自身免疫抗原所组成的组：
髓鞘碱性蛋白(MBP)；蛋白脂质蛋白(PLP)；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)，髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白心脏肌球蛋白；外表面蛋白(OSP)；髓鞘相关糖蛋白(MAG)；神经丝；干扰素ω；转谷氨酰胺酶；芳香酸羧化酶；17-羟化酶；21-羟化酶，心磷脂；丙酮酸脱氢酶；β2糖蛋白I；磷脂酰丝氨酸；apoH；膜联蛋白A5；LKM-1；可溶性肝抗原；碳酸酐酶；gpIIb-IIIa或1b-IX；XVII型胶原；组织转谷氨酰胺酶；麦醇溶蛋白；GD1a；GQ1b；BP-1；BP-2；表皮转谷氨酰胺酶；组氨酸-tRNA；信号识别肽；Mi-2；Jo1；谷氨酸脱羧酶，HSP60；HSP70；HSP90；IGRP；胰岛素；羧肽酶H；胰岛素瘤抗原-2；IA-2β；ICA69；ZnT8；嗜铬粒蛋白A；IAPP；scl70；拓朴异构酶；组蛋白；基底膜IV型胶原；烯醇化酶；甲状腺过氧化物酶；甲状腺球蛋白；补体成分3；电压门控钙通道；Q型钙通道，突触结合蛋白，毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1；SMA；LKM-1；LKM-2；LKM-3；可溶性肝抗原；SLA；LP；主要外周髓鞘蛋白P0；髓过氧化物酶；GQ1b；U1-RNP；Kir4.1；烟碱型乙酰胆碱受体；MuSK蛋白；下丘脑分泌素；食欲素；角蛋白；AQP4；Yo；Hu；谷氨酸受体；桥粒芯蛋白3；p62；sp100；Ro；LA；糖蛋白IIb-IIIa或Ib-IX；ADAMTS13；心磷脂；β2糖蛋白I；HPA-1a；HPA-5b；IFN-γ，IL-1，TNF-α；GMCSF，上述抗原的部分以及它们的组合。
24如段落16-23中一项所述的方法，其中，所述DC结合剂和任选的自身免疫抗原融合至所述刺激IL-27/外核苷酸酶CD39轴信号转导的试剂。
25.如段落16-23中任一项所述的方法，其中，所述靶向DC的组合物包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包含所述刺激IL-27/外核苷酸酶CD39轴信号转导的试剂、所述DC结合剂和任选的自身免疫抗原。
26.如段落25所述的方法，其中，所述试剂和所述任选的自身免疫抗原分布于所述纳米颗粒的表面上。
27.如段落25或26所述的方法，其中，所述试剂和所述任选的自身免疫抗原被包封于所述纳米颗粒内。
28.如段落25-27中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒进一步包含在其表面上的PEG层。
29.如段落25-28中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒为金纳米颗粒。
30.如段落25-29中任一项所述的方法，其中，所述自身免疫疾病或紊乱为多发性硬化。
31.如段落25-30中任一项所述的方法，其中，所述自身免疫疾病或紊乱为脑脊髓炎。
32.如段落25-31中任一项所述的方法，其中，所述自身免疫疾病或紊乱为I型糖尿病。
33.一种治疗自身免疫疾病或紊乱的方法，所述方法包括给予包含段落15所述的免疫阻抑性树突状细胞的群的组合物。
34.如段落33所述的方法，其中，所述免疫阻抑性树突状细胞的群为自体树突状细胞。
35.如段落33或34所述的方法，其中，所述组合物进一步包含自身免疫抗原。
36.如段落35所述的方法，其中，所述自身免疫抗原选自于由如下自身免疫抗原所组成的组：
髓鞘碱性蛋白(MBP)；蛋白脂质蛋白(PLP)；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)，髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白心脏肌球蛋白；外表面蛋白(OSP)；髓鞘相关糖蛋白(MAG)；神经丝；干扰素ω；转谷氨酰胺酶；芳香酸羧化酶；17-羟化酶；21-羟化酶，心磷脂；丙酮酸脱氢酶；β2糖蛋白I；磷脂酰丝氨酸；apoH；膜联蛋白A5；LKM-1；可溶性肝抗原；碳酸酐酶；gpIIb-IIIa或1b-IX；XVII型胶原；组织转谷氨酰胺酶；麦醇溶蛋白；GD1a；GQ1b；BP-1；BP-2；表皮转谷氨酰胺酶；组氨酸-tRNA；信号识别肽；Mi-2；Jo1；谷氨酸脱羧酶，HSP60；HSP70；HSP90；IGRP；胰岛素；羧肽酶H；胰岛素瘤抗原-2；IA-2β；ICA69；ZnT8；嗜铬粒蛋白A；IAPP；scl70；拓朴异构酶；组蛋白；基底膜IV型胶原；烯醇化酶；甲状腺过氧化物酶；甲状腺球蛋白；补体成分3；电压门控钙通道；Q型钙通道，突触结合蛋白，毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1；SMA；LKM-1；LKM-2；LKM-3；可溶性肝抗原；SLA；LP；主要外周髓鞘蛋白P0；髓过氧化物酶；GQ1b；U1-RNP；Kir4.1；烟碱型乙酰胆碱受体；MuSK蛋白；下丘脑分泌素；食欲素；角蛋白；AQP4；Yo；Hu；谷氨酸受体；桥粒芯蛋白3；p62；sp100；Ro；LA；糖蛋白IIb-IIIa或Ib-IX；ADAMTS13；心磷脂；β2糖蛋白I；HPA-1a；HPA-5b；IFN-γ，IL-1，TNF-α；GMCSF，上述抗原的部分以及它们的组合。
一些选定的定义
为了方便起见，这里收集了在整个申请(包括说明书、实施例以及所附的权利要求书)中所使用到的某些术语。除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
应该理解的是，本发明并不限于本文所述的具体方法学、方案和试剂等，此类方法学、方案和试剂等可以变化。本文所使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，而并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
除了在操作实施例中或另有指示的地方，本文所用的表示成分的量或反应条件的全部数值在所有情况下都应被理解为被术语“约”修饰。当用于描述本发明时，与数值相连使用的术语“约”意味着±5％。
如本文和申请文件全文所使用的，术语“拮抗剂”以最广义使用，并包括部分或完全阻断、抑制或中和本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。类似地，术语“激动剂”以最广义使用，并包括模仿本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子特别包括激动剂型或拮抗剂型抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、有机小分子、重组蛋白或肽等。识别多肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括将多肽与候选激动剂或拮抗剂分子相接触，并对通常与该多肽相关联的一种或多种生物活性的可检测改变进行测量。
一方面，本发明涉及对本发明必要的本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，并且无论是否必要都仍然对未指定要素的纳入保持开放(“包含/包括”)。在一些实施方式中，待包含于所述组合物、方法及其各自的组成部分描述中的其它要素限于那些实质上不影响本发明的基础和新颖性特征的要素(“基本上由…组成”)。这同样适用于所述方法内的步骤以及组合物及其中的组成部分。在其它实施方式中，本文所述的发明、组合物、方法及其各自的组成部分旨在排除对于该组成部分、组合物或方法而言不被视为必需要素的任何要素(“由…组成”)。
为了描述和公开的目的，通过引用的方式将所标明的所有专利、专利申请以及出版物明确并入本文，例如，此类出版物中描述的可与本发明一起使用的方法学。这些出版物仅仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将该公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请人可得的信息，并且不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
本文所使用的“受试者”可意味着人或动物。受试者的实例包括灵长类动物(例如人和猴)。通常，所述动物为脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿动物、驯养动物或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(如恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭(woodchucks)、雪貂(ferrets)、兔和仓鼠。驯养动物和狩猎动物包括奶牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(如家猫)、犬科物种(如狗、狐狸、狼)、以及鸟类(如鸡、鸸鹋、鸵鸟)。患者或受试者包括前面所述的任何子集，例如上述的所有，或者包括一组或多组或者一种或多种物种，例如人、灵长类动物或啮齿动物。在本文描述方面的某些实施方式中，所述受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，如人类。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。受试者可为雄性或雌性。术语“患者”和“受试者”并不指定特定年龄。因此，旨在涵盖从成体至新生受试者以及胎儿的任何哺乳动物受试者。
在一个实施方式中，受试者或患者是哺乳动物。所述哺乳动物可为人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不仅限于这些实例。在一个实施方式中，受试者为人。在另一实施方式中，受试者可为驯养动物和/或宠物。
如本文和申请文件全文所使用的，术语“给予”或“给药”是指借助使得试剂至少部分地定位于期望位点(例如靶位点)从而产生期望效果的方法或途径，将该试剂或组合物(例如本文所述的靶向DC的组合物和/或包含本文所述的免疫阻抑性树突状细胞的组合物，所述靶向DC的组合物调制DC中IL-27、IL-27RA和/或CD39的表达和/或活性、和/或调制eATP的水平)置于受试者中。
在本文所述的这一方面和其它方面的一些实施方式中，可通过对试剂进行全身性递送、或将试剂递送至期望的表面、器官或靶标的任何给药模式，将靶向DC的组合物(所述靶向DC的组合物包含用于调制DC中IL-27、IL-27RA和/或CD39的表达和/或活性、和/或调制eATP的水平的试剂)和/或包含免疫阻抑性树突状细胞的组合物给予受试者，所述给药模式可包括但不限于：注射给予、输注给予、滴注给予和吸入给予。在可防止此类试剂在肠中失活这个意义上来讲，还考虑了口服给药形式。“注射”不受限制地包括：静脉内注射和输注、肌内注射和输注、动脉内注射和输注、鞘内注射和输注、心室内注射和输注、囊内注射和输注、眼眶内注射和输注、心内注射和输注、皮内注射和输注、腹膜内注射和输注、经气管注射和输注、皮下注射和输注、表皮下注射和输注、关节内注射和输注、囊下(subcapsular)注射和输注、蛛网膜下注射和输注、脊柱内(intraspinal)注射和输注、脑脊髓内(intracerebrospinal)注射和输注以及胸骨内注射和输注。在一些实施方式中，通过静脉内输注或注射给予本文所述方法中所使用的靶向DC的组合物(所述靶向DC的组合物包含用于调制DC中IL-27、IL-27RA和/或CD39的表达和/或活性、和/或调制eATP的水平的试剂)和/或包含免疫阻抑性树突状细胞的组合物。在一些实施方式中，本文所述方法中所使用的包含本文所述的免疫阻抑性树突状细胞的组合物可通过植入(例如经由导管)来给药。
本文使用的短语“胃肠外给药”和“胃肠外给予”是指除了肠内给药和局部给药以外的给药模式(通常通过注射进行)。本文所使用的短语“全身给药”、“全身给予”、“外周给药”和“外周给予”是指使得靶向DC的组合物(所述靶向DC的组合物包含用于调制DC中IL-27、IL-27RA和/或CD39的表达和/或活性、和/或调制eATP的水平的试剂)和/或包含免疫阻抑性树突状细胞的组合物进入受试者的循环系统内而非直接进入靶位点、组织、或器官，从而经历代谢及其它类似过程的给药。
本文使用的术语“拟肽”是指能够折叠成指定的与天然肽相似的三维结构的分子。
本文使用的术语“小分子”是指天然或合成分子，包括但不限于肽、拟肽、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、适体、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于约10,000克/摩尔的有机化合物或无机化合物(即，包括杂有机(heteroorganic)化合物和有机金属化合物)；分子量小于约5,000克/摩尔的有机化合物或无机化合物；分子量小于约1,000克/摩尔的有机化合物或无机化合物；分子量小于约500克/摩尔的有机化合物或无机化合物；以及此类化合物的盐、酯和其它药学上可接受的形式。
实施例
下列实施例阐明了本发明的一些实施方式和方面。对相关领域技术人员来说显而易见的是，可以在不改变本发明精神或范围的情况下进行各种修改、增加、替换等，这些修改和变化都涵盖于所附权利要求书中所限定的本发明的范围内。下述实施例不以任何方式对本发明进行限制。实施例1常规树突状细胞(cDC)和浆细胞样DC中IL-27受体α链(IL-27RA)的表达的比较
为了确定DC中IL-27信号转导对自身免疫的调节作用，首先利用流式细胞术对从初始型小鼠分离的浆细胞样DC(pDC；F4/80-CD11b-CD11c低B220+II类MHC低Ly6c+)和cDC(F4/80-CD11b+CD11c+B220-II类MHC+Ly6c-)中IL-27RA的表达进行分析(图1)。IL-27RA主要在cDC中表达，在pDC中仅低表达或不表达(图2A)。借助对分选的pDC和cDC进行的定量PCR和免疫印迹分析，在IL-27RA表达方面获得了类似结果(图2B-图2C)。因此，IL-27RA在cDC中的表达高于在浆细胞样DC中的表达。IL-27RA的表达模式表明，IL-27控制cDC的活性。
实施例2IL-27对cDC功能的影响
在DC成熟刺激的存在下摄取抗原后，DC上调它们的II类主要组织相容性复合体(MHC)和共刺激分子的表达21。为了确定IL-27对于DC活化的作用，用媒介物(vehicle)或IL-27对来自初始型小鼠的脾cDC进行预处理，并确定它们对利用大肠杆菌脂多糖(ecLPS)进行的活化的应答。与未经IL-27预处理而经ecLPS活化的cDC相比，利用IL-27对cDC进行预处理并随后用ecLPS活化使得II类MHC和共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达显著更低(图3A-图3I)。
DC通过极化细胞因子的分泌控制T细胞分化21。与未经IL-27预处理而经ecLPS活化的cDC相比，利用IL-27对脾cDC进行预处理并随后用ecLPS活化使得IL-12、IL-6和IL-23的产生显著更低(IL-12促进TH1细胞分化，IL-6和IL-23促进TH17细胞分化)(图3B)。利用IL-27对cDC进行预处理并随后用ecLPS活化还使得Il27的表达上调(图3C)，这表明了IL-27生成的正反馈回路。在这些情况下的确检测到IFN-β的生成增多(图3B)。之前已报道IFN-β的生成增多以自分泌方式起作用，触发IL-27产生9。在这些情况下检测到IL-10的生成增多；还检测到转化生长因子-β1(TGF-β1)生成的增多仅出于对IL-27处理的应答(图3B)。这些数据共同表明，IL-27使得促进效应TH1和TH17细胞分化的细胞因子的产生减少，但增强了由cDC进行的抗炎性细胞因子产生。
IL-27对II类MHC、共刺激分子和细胞因子的表达的作用表明，IL-27影响DC使得T细胞活化并极化为特定子类的能力。因此，利用IL-27对cDC进行预处理并用ecLPS将它们活化，随后充分洗涤，并在其同源(cognate)靶抗原的存在下对该cDC活化初始型2D2CD4+T细胞的能力进行评估，所述同源靶抗原为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的氨基酸35-55的表位(MOG(35-55))。与未经IL-27预处理而经ecLPS处理的cDC所引发的应答相比，用IL-27对cDC进行预处理并随后用ecLPS活化使得初始型2D2T细胞对MOG(35-55)的增殖应答明显降低(图3D)。此外，如酶联免疫吸附测定法和细胞内细胞因子染色所测定的，经IL-27预处理并经ecLPS活化的cDC诱导T细胞产生IFN-γ和IL-17的能力降低(图3E-图3F)。相反，在用ecLPS活化前利用IL-27对cDC进行预处理提高了其促进IL-10+和Foxp3+CD4+T细胞分化的能力(图3E-图3F)。对于经IL-27预处理并经ecLPS活化的骨髓衍生的DC，也观察到类似的效果(数据未示出)。
之前报道IL-27直接作用于T细胞，阻抑其分化为效应T细胞12、15-17。发明人发现，在存在外源加入的TH1-极化细胞因子和TH17-极化细胞因子的情况下，与未经IL-27预处理而经ecLPS活化的cDC相比，经IL-27预处理并经ecLPS活化的cDC显示出的触发T细胞产生IFN-γ和IL-17的能力减退(图3G)。相反地，当将Tr1-极化细胞因子或使得极化分化为Foxp3+Treg细胞的细胞因子加入至共培养物时，利用IL-27对cDC进行预处理增强了T细胞中IL-10的生成以及转录因子Foxp3的表达(图3G-图3H)，预期即使在炎症或产生极化细胞因子环境的其它生理条件下，DC中的IL-27信号转导也调制体内T细胞分化。这些数据共同表明，IL-27信号转导控制cDC的抗原提呈功能。
实施例3DC中的IL-27RA对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发展的影响
之前报道了在EAE过程中IL-27在对CNS炎症的控制中起作用12、13、15。发现IL-27RA缺陷(Il27ra-/-)小鼠中EAE明显恶化，其特征在于CNS浸润IFN-γ+和IL-17+CD4+T细胞的频率增加，而IL-10+CD4+T细胞的频率降低(图4A-图4B)。Il27ra-/-小鼠还显示出对MOG(35-55)的记忆应答提高、淋巴结和脾中CD4+CD44+CD40L高IFNγ+、IL-17+和IFN-γ+IL-17+CD4+T细胞的频率增加，并伴有Foxp3+和IL-10+CD4+T细胞的频率降低(图4C-图4D)。
之前报道的IL-27对致脑炎性细胞和Treg细胞的作用14、15、17表明Il27ra-/-小鼠中EAE的恶化是由于T细胞中缺少IL-27信号转导。IL-27是否能够作用于除T细胞外的其它细胞，从而限制EAE的发展是未知的。Il27ra-/-小鼠具有非细胞特异性的IL-27RA删除。为了确定DC中的IL-27信号转导在EAE过程中的作用，在疾病诱导后21天从野生型和Il27ra-/-小鼠分离cDC。发现在MOG(35-55)的存在下，来自Il27ra-/-小鼠的cDC显示出增强的活化初始型2D2T细胞的能力(图4E)，表明DC中IL-27信号转导的缺陷导致Il27ra-/-小鼠中EAE的恶化。
在体内，DC通常受到其与T细胞的相互作用以及细胞因子环境的影响。因此，从Il27ra-/-小鼠分离的cDC中增强的抗原提呈功能可能反映了DC暴露于更具炎性的细胞因子环境，而不是IL-27对DC的直接作用。为了确定DC中的IL-27信号转导在EAE过程中的功能，使用基于嵌合体的方法生成DC中缺少IL-27RA表达的小鼠(图5A)。为这一目的，利用来自表达白喉毒素受体(DTR)(所述白喉毒素受体处于编码CD11c的基因(Itgax)的启动子的控制下)的小鼠(本文中称为“CD11c-DTR”小鼠)的骨髓细胞对经致死性辐照的野生型小鼠进行再造。再造后，通过给予白喉毒素(DTx)，可使这些小鼠耗尽CD11c+DC22。由于具有不良副作用，不能将DTx长期给予CD11c-DTR小鼠；然而，对于利用来自CD11c-DTR小鼠的骨髓对野生型小鼠进行再造而生成的嵌合体(CD11c-DTR→WT)而言，没有与长期给予DTx相关的副作用4。因此，利用CD11c-DTR骨髓对野生型小鼠进行再造后两个月，通过长期给予DTx耗尽这些CD11c-DTR→WT嵌合体的DTR+DC，利用来自野生型小鼠(来产生“DC(WT)”小鼠)或Il27ra-/-小鼠(来产生“DC(IL-27RA-KO)”小鼠)的DC前体对它们的DC区室进行再造(图5B)。对于DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)小鼠，每隔一天给予一次DTx，直至实验完成，在给予DTx两个月后未检测到针对DTx的抗体(图5C)。
与DC(WT)小鼠相比，DC(IL-27RA-KO)小鼠在cDC中具有显著更低的IL-27RA表达，然而在其它抗原提呈细胞(APC)群中并非如此(图6A和图5D)。在DC的频率或绝对数量方面，DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)小鼠之间没有检测到差异(图5E)。与DC(WT)小鼠相比，利用MOG(35-55)处理导致DC(IL-27RA-KO)小鼠中EAE的发展更快；与它们的DC(WT)对应组(counterparts)相比，DC(IL-27RA-KO)小鼠还达到显著更高的疾病得分(图6B)。DC(IL-27RA-KO)小鼠中EAE的恶化与CNS中TH1和TH17细胞的频率高于DC(WT)小鼠以及IL-10+T细胞显著少于DC(WT)小鼠有关(图6C)。此外，对CD4+CD44+CD40L高脾T细胞区室的分析表明，与DC(WT)小鼠相比，DC(IL-27RA-KO)小鼠对MOG(35-55)的记忆增殖应答更高，IFN-γ+和IL-17+CD4+细胞的频率也更高，并伴随着如下情况：与DC(WT)小鼠相比，DC(IL-27RA-KO)小鼠中Foxp3+Treg细胞和IL-10+CD4+细胞的频率降低(图6D-图6E)。当通过转移MOG(35-55)反应性TH1或TH17细胞来诱导EAE时，获得类似的结果(图5F-图5H)。
为了研究DC中的IL-27信号转导在EAE过程中的作用，在EAE诱导后21天从DC(WT)和DC(IL-27RA-KO)小鼠分离cDC。与DC(WT)小鼠相比，在来自DC(IL-27RA-KO)小鼠的cDC中，促炎性细胞因子IL-6、IL-12和IL-23的表达更高，并伴有IL-10和IL-27较低的表达(图6F)。额外的定量谱分析确认了这些结果，该定量谱分析在从EAE过程中的DC(IL-27RA-KO)小鼠分离的cDC中检测到显著的促炎性转录谱(图6G)。此外，与它们的DC(WT)对应组相比，来自DC(IL-27RA-KO)小鼠的cDC显示出更强的活化2D2CD4+T细胞增殖与促进产生升高量的IFN-γ和IL-17及减少量的IL-10和TGF-β1的能力(图6H-图6I)。这些数据共同表明，IL-27在体内作用于cDC，限制致脑炎性T细胞和EAE的发展。实施例4IL-27对DC的转录作用
为了确定介导IL-27作用于DC的机制，利用微阵列对从初始型野生型小鼠分离并在体外利用IL-27处理的原代脾cDC的表达谱进行分析。利用Ingenuity通路分析对表达数据进行检查，识别出与未处理的cDC相比，在IL-27处理的cDC中编码与NF-κB和Toll样受体信号转导通路相关的促炎性分子的基因表达显著降低(P分别为P＝2.16×10-21和P＝4.55×10-27；图7A-图7B)。相反地，利用IL-27处理导致Tnip3和Tnfaip3(已知Tnip3和Tnfaip3编码抑制NF-κB活化的分子23)的表达随时间显著增加(图7C)。还发现编码抗炎性分子的Ido1、Ido2、Il27、Il10和Entpd1随时间显著上调(图7C)。
利用NetGenerator算法来分析DC对IL-27的转录应答。该算法利用处于研究下的基因以及它们的关联的现有“知识”将表达谱整合到模型中24。获得的模型表明，IL-27以依赖于转录因子STAT1和STAT3的方式控制上述抗炎性分子的表达(图7D)。这些数据共同表明，IL-27限制了cDC的炎性应答，并触发耐受原性分子的表达。
实施例5识别介导IL-27对DC的抑制作用的分子/配体
转录谱研究识别出可能介导cDC中的IL-27信号转导对T细胞活化的作用的数种候选分子。为了识别介导IL-27作用于cDC抗原提呈功能的机制，使用针对IL-27、IL-10、IFN-β或TGF-β的阻断抗体或者吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)特异性抑制剂1-甲基-d-色氨酸(1-D-MT)。将脾cDC用IL-27预处理并随后用ecLPS处理，充分洗涤，并用于在针对细胞因子的阻断抗体或1-D-MT的存在下与针对CD3(抗CD3)的抗体一起对初始型CD4+T细胞进行活化。利用IL-27预处理cDC的阻抑效应并未被抗体或1-D-MT阻断(图8A-图8B)，这表明IDO或细胞因子IL-27、IL-10、IFN-β或TGF-β均不介导经IL-27预处理的cDC的阻抑效应。
之前报道了利用IL-27处理小鼠pDC20或人单核细胞衍生的DC19后PD-L1(CD274)的表达上调，所述PD-L1(CD274)为T细胞抑制受体PD-1的配体。在利用IL-27对cDC进行处理后，未检测到PD-L1表达的实质上调(图9A)。此外，当我们利用PD-L1缺陷cDC或IL-10缺陷cDC时，也观察到经IL-27处理的cDC对T细胞活化的阻抑作用(图9B)。这些数据共同表明，IL-27对cDC抗原提呈功能的阻抑效应不依赖于PD-L1或IL-10。
之前曾将CD39与小鼠和人Treg细胞的阻抑活性相关联25、26，然而未将其与树突状细胞相关联。出于对在体外用IL-27处理的应答，DC中的Entpd1(其编码CD39)显著上调(P＝0.01；图7C)。因此，设法确定CD39在IL-27对cDC的作用中扮演的角色。Entpd1缺陷消除了用IL-27对DC进行预处理在T细胞活化和极化中的阻抑作用。利用IL-27对Entpd1缺陷cDC进行预处理并未显著降低增殖应答以及IFN-γ和IL-17的产生，并且对2D2T细胞中Foxp3的表达和IL-10的产生无显著影响(P＝0.2365；图8C和图9B-图9C)。因此，这些数据表明，CD39介导了cDC中的IL-27信号转导对T细胞活化的作用。
为进一步表征CD39在DC中IL-27的作用方面扮演的角色，评估了IL-27对CD39表达的调节作用。与它们的DC(WT)对应组相比，从DC(IL-27RA-KO)小鼠新鲜分离的cDC显示出Entpd1mRNA和CD39蛋白的表达均显著更低，反映为CD39+DC的显著减少(图8D)。因此，IL-27在体外和体内控制cDC中的Entpd1表达。
STAT1和STAT3介导T细胞中针对IL-27的应答17。用IL-27处理后5min，在cDC中检测到显著的STAT3磷酸化，并检测到STAT1磷酸化适度但显著的增高(图8E-图8F)。生物信息学分析识别出Entpd1启动子中的转录起始位点上游的一种推定的STAT1结合元件(IRF-1)、两种STAT3结合元件(SRE-1和SRE-2)以及共用的STAT1-STAT3结合元件(图8G)。染色质免疫沉淀(ChIP)测定法检测到作为对IL-27的应答的STAT3与Entpd1启动子中的SRE-1、SRE-2和STAT1-STAT3结合元件的结合(图8H)。然而，STAT1与Entpd1启动子的结合并不对IL-27作出应答，而是经由ecLPS活化触发(图8I)。
为了确定STAT1和STAT3与Entpd1启动子的相互作用的功能性结果，进行了报告子测定。与转染空载体的对照细胞相比，利用包含Entpd1启动子控制的编码萤火虫萤光素酶的基因的报告子构建体和编码组成型活化的STAT1或STAT3的构建体对HEK293人胚胎肾细胞进行共转染获得显著更高的萤光素酶活性；不过，在对组成型活化的STAT3作出应答时，该效果显著更强(图8J)。这些数据表明，在cDC中IL-27经由STAT3控制CD39表达。
实施例6CD39控制NLRP3炎性体的活化
CD39是催化细胞外ATP和ADP降解的外核苷酸酶28。细胞外ATP触发NLRP3炎性体的活化29，显示该过程在EAE过程中控制致脑炎性TH1和TH17细胞的分化30。如本文所展示的，CD39表达对于cDC中的IL-27信号转导对T细胞活化和分化的作用而言是必需的(图8C和图9A-图9E)。因此，评估了IL-27对细胞外ATP的浓度和NLRP3炎性体的活化的作用。利用IL-27进行预处理并用ecLPS进行处理导致在利用ecLPS活化野生型cDC后检测到细胞外ATP的浓度显著下降(图10A)。然而，利用IL-27进行预处理对在利用ecLPS处理的IL-27RA缺陷或CD39缺陷cDC的上清液中所测量到的细胞外ATP的浓度没有影响(图10A)。此外，与它们的野生型对应组相比，cDC中的IL-27RA或CD39缺陷导致在利用LPS活化后检测到显著更高的细胞外ATP浓度(图10A)。
为进一步研究与在利用IL-27处理的野生型cDC的组织培养上清液中检测到的减少量的细胞外ATP相关的机制，将外源ATP(500μM)加入至用LPS、媒介物或IL-27处理的cDC，并在孵育2小时后对上清液中残余的细胞外ATP进行定量。发现与经ecLPS处理的野生型cDC相比，经ecLPS和IL-27处理的野生型cDC的上清液中残余的细胞外ATP的浓度显著更低(图10B)。然而，IL-27不影响IL-27RA缺陷细胞或CD39缺陷细胞中残余细胞外ATP的量(图10B)，这表明经IL-27处理的野生型cDC的上清液中ATP丰度较低是由于其被CD39代谢得更多。此外，利用IL-27进行处理显著提高了核苷三磷酸二磷酸水解酶在野生型cDC中的活性，但未提高其在IL-27RA缺陷cDC或CD39缺陷cDC中的活性(图10C-图10D)。此外，与野生型cDC相比，在IL-27RA缺陷DC中检测到较低的核苷三磷酸二磷酸水解酶活性(显示为ATP残留量更大)(图10C-图10D)，这表明IL-27的自分泌作用控制cDC降解细胞外ATP的能力。
在某些APC(例如巨噬细胞)中，ATP活化NLRP3炎性体29。NLRP3炎性体的活化导致生成活性胱天蛋白酶-1，从而使得IL-18和IL-1β成熟并释放31。如活性胱天蛋白酶-1和成熟IL-1β的丰度较低(图10E)以及分泌到培养基中的IL-1β的量显著较低(图10F)所表明的，发现利用IL-27预处理显著阻抑了经ecLPS活化的野生型cDC中NLRP3炎性体的活化。根据本文展示的关于细胞外ATP浓度的发现，在经ecLPS处理的IL-27RA缺陷或CD39缺陷cDC中，未检测到IL-27对NLRP3炎性体活化以及IL-1β释放的抑制作用(图10E-图10F)。事实上，与野生型cDC相比，在ecLPS处理后，IL-27RA或CD39中的缺陷导致IL-1β的释放显著增多(图10F)。这些数据共同表明，不希望被理论所限地，由IL-27触发的CD39表达的上调限制了细胞外ATP浓度，并因此限制了cDC中NLRP3炎性体的活化。实施例7DC中的CD39对EAE发展的作用
为了确定DC中的CD39在EAE过程中的作用，利用CD39缺陷DC前体对CD11c-DTR→WT嵌合体进行再造，生成在DC中缺少Entpd1表达的小鼠(DC(CD39-KO)小鼠)。利用DC(WT)小鼠作为对照。发现与来自DC(WT)小鼠的cDC相比，来自DC(CD39-KO)小鼠的cDC中CD39蛋白的表达显著更低(图11A)，然而在其它APC群中并未获得该结果(图9D)。未检测到DC(WT)小鼠和DC(CD39-KO)小鼠在DC的频率或绝对数量方面的差别(图9E)。与DC(WT)小鼠相比，在DC(CD39-KO)小鼠中诱导EAE导致EAE更早地发作，并且EAE还在DC(CD39-KO)小鼠中达到显著更高的得分(图11B)。DC(CD39-KO)小鼠中EAE的恶化与CNS中TH1和TH17细胞的频率升高相关(图11C)。与本文示出的与DC中的CD39缺陷相关的EAE的恶化一致的是，DC(CD39-KO)脾T细胞对MOG(35-55)具有显著增强的增殖记忆应答，并且，DC(CD39-KO)小鼠具有显著更高的CD4+CD44+CD40L高脾IFN-γ+和IL-17+CD4+T细胞频率(图11D-图11E)。未观测到DC(WT)小鼠和DC(CD39-KO)小鼠在Foxp3+Treg细胞或IL-10+CD4+T细胞频率方面的差异(图11D-图11E)。
对EAE诱导后21天分离的cDC的分析表明，与DC(WT)细胞相比，DC(CD39-KO)小鼠中CD39的表达显著更低，并伴有编码促炎性细胞因子IL-6、IL-12和IL-23的mRNA的更高表达(图11F)。在编码IL-10、TGF-β、IFN-β或IL-27的mRNA的表达方面，在DC(WT)和DC(CD39-KO)小鼠之间未发现显著差异(图11F)。在体外，来自DC(CD39-KO)小鼠的cDC显示出在MOG(35-55)存在下触发初始型2D2CD4+T细胞增殖的能力增强、以及诱导IL-17和IFN-γ产生的能力增强，其代价为IL-10和TGF-β的分泌降低(图11G-图11H)。因此，DC中CD39的表达限制了致脑炎性TH1和TH17T细胞应答以及EAE的发展。实施例8用经IL-27调整的DC进行疫苗接种阻抑自身免疫疾病
IL-27信号转导在T细胞和DC中的耐受原性作用提供了在由免疫系统介导的紊乱中的治疗可能。然而，之前报道了IL-27作用于T细胞(而不是树突状细胞)，以增强细胞毒性CD8+T细胞应答11，表明直接给予IL-27可能对免疫介导的紊乱具有有害副作用。用DC进行疫苗接种可诱导针对肿瘤和病原体的免疫力32，然而已经显示用天然存在的耐受原性DC进行疫苗接种诱导抗原特异的耐受性33。因此，如本文所示出的，IL-27信号转导在DC中具有耐受原性作用，为了避免IL-27给药的潜在致病作用，接下来尝试确定用经IL-27调整的DC进行疫苗接种对CNS自身免疫性的治疗作用。
通过利用蛋白脂质蛋白第139-151位氨基酸的肽(PLP(139-151))进行免疫，评估了用经IL-27调整的骨髓衍生的DC进行疫苗接种对在SJL小鼠中诱导的复发-缓解型EAE模型的作用。EAE诱导后第20天，在疾病的缓解阶段中，将小鼠随机分为四组并进行如下处理：第1组，仅盐水；第2组，载有PLP(139-151)的DC；第3组，经IL-27处理的DC；第4组，经IL-27处理并载有PLP(139-151)的DC。额外的对照组接受未载有肽或未经细胞因子预处理的DC。将处理再重复三次，每4天一次。未载有肽或未经细胞因子预处理的DC对疾病发展无显著效果(P＝0.1487；图12A)。然而，相对于由未处理小鼠获得的结果，给予载有PLP(139-151)的经IL-27调整的DC使得EAE显著降低，并且针对PLP(139-151)的增殖记忆应答显著降低(以IFN-γ和IL-17的产生测量)，并伴有IL-10和TGF-β产生的增加(图13A-图13C)。
在该模型中，EAE的慢性阶段(chronicphase)的特征在于T细胞应答扩展至PLP第178-191位氨基酸的表位(PLP(178-191))7。因此，对用DC进行疫苗接种的小鼠中对PLP(178-191)的记忆应答进行分析。相对于由未处理小鼠获得的结果，给予载有PLP(139-151)的经IL-27处理的DC导致由PLP(178-191)触发的IFN-γ和IL-17的生成以及增殖应答被显著阻抑，并伴有IL-10和TGF-β产生的升高(图13D-图13E)。因此，用经IL-27处理的cDC进行疫苗接种还可降低该EAE模型中的表位扩展。
为了进一步研究经IL-27调整的DC对免疫应答的作用，使用能够检测EAE和MS中的表位扩展的髓鞘抗原阵列34、35。该微阵列由CNS相关的自体抗原集组成，包括涵盖了存在于中枢和外周神经系统中的髓鞘蛋白和脂质全序列的肽文库、组织裂解物以及重组蛋白34。与未处理小鼠相比，用DC进行疫苗接种对SJL小鼠中EAE的治疗作用伴有针对31种髓鞘抗原的免疫球蛋白G抗体的更低的血清浓度(图13F)。
随后试图对利用经IL-27调整的DC来阻抑EAE中涉及的机制进行评估；为此，使用由MOG(35-55)诱导的C57BL/6小鼠EAE模型。EAE诱导后10天开始给予经IL-27调整的DC。与未处理小鼠相比，用载有MOG(35-55)的经IL-27调整的野生型DC进行疫苗接种导致EAE明显减弱(图12B-图12D)。在给予载有MOG(35-55)的经IL-27调整的IL-10缺陷或PD-L1缺陷的DC后，观察到类似的EAE阻抑(图12B-图12D)，这表明在DC中的IL-27信号转导对致脑炎性应答的调节中，这些分子似乎不起作用。相反地，载有MOG(35-55)的经IL-27调整的IL-27RA缺陷或CD39缺陷的DC对EAE无明显作用(P分别为P＝0.7979、P＝0.5708和P＝0.5630；图12B-图12D)。这些数据共同表明，用经IL-27处理的DC进行疫苗接种控制致脑炎性应答，并且以CD39依赖性的方式建立了治疗范式(therapeuticparadigm)中的复发-缓解型EAE。
实施例1-8的讨论
之前报道了IL-27在多种情形下限制组织炎症和自身免疫性11。之前报道了IL-27受体的缺陷与动物实验模型中炎症恶化发展相关，之前还报道了IL-27的多态性与人类炎症性疾病相关11。然而，在这些之前的报道中，通常将IL-27的免疫调节行为归因于它对T细胞的直接作用，其中，借助涉及转录因子AhR的机制，IL-27使得TH17细胞发育停滞，并促进Tr1细胞分化26、36。因此，这些之前的报道并未就IL-27对DC的免疫阻抑作用给出教导或启示。本文的发现识别出IL-27信号转导在DC中控制T细胞应答和CNS自身免疫性的重要作用。
不希望被理论所限地，本文所展示的内容显示了在体外和体内CD39对于IL-27调制cDC的抗原提呈功能而言是必需的。然而，IL-27还上调其它免疫调节分子(例如IL-27自身、IFN-β、TGF-β和IDO)的表达。虽然在本文示出的实验条件下这些分子没有实质作用，然而它们可能以替代的方式促成IL-27对DC的阻抑作用。
还示出IL-10(已知其活化STAT3信号转导)诱导DC中的耐受原性表型37。相反地，限于DC的STAT3缺陷导致炎症的自发发展38。此外，小神经胶质细胞和组织巨噬细胞表达CD39，其功能也受到活化STAT3信号转导的细胞因子的调节39、40。因此，预期CD39表达的诱导可构成先天免疫系统的细胞中活化STAT3的细胞因子触发的共同免疫调节机制。
不希望被理论所限地，CD39可能经由腺苷的生成介导小鼠和人Treg细胞的阻抑活性25、26。APC中的CD39调节适应性免疫的机制尚不清楚。细胞外ATP触发此类活化28。之前在Entpd1缺陷小鼠中观察到接触性超敏反应的增强41。相反地，之前报道了Nlrp3缺陷导致接触性超敏反应的减弱42。后续研究确定了APC中NLRP3炎性体的活化控制TH1、TH2和TH17应答43、44。之前报道了NLRP3炎性体的活化对于致脑炎性TH1和TH17细胞的分化以及EAE的发展而言是必需的30，这可能是其作用于IL-1β和IL-18分泌的结果。
本文展示的这些发现表明，由IL-27诱导的DC中CD39的表达导致细胞外ATP的浓度显著降低，并伴有NLRP3炎性体活化的显著减少以及TH1和TH17细胞分化的减少。这些发现与如下的模型一致：借助CD39表达的上调，IL-27限制了DC中NLRP3炎性体的ATP依赖性活化及其促进致病性TH1和TH17细胞分化的能力。然而，不希望被理论所限地，除了对CD39表达的作用外，IL-27触发的信号转导还可直接干预NLRP3炎性体组分的表达及其在DC中的活化。
可将IL-27的免疫调节性质用于治疗人类自身免疫疾病。然而，IL-27可增强细胞毒性CD8+T细胞应答11，表明给予IL-27可能使得免疫系统介导的紊乱恶化。因此，为了评估IL-27的治疗潜力及避免其可能的有害副作用，对利用经IL-27调整的DC进行疫苗接种的效果进行评估。本文所展示的内容表明，利用经IL-27调整的DC进行疫苗接种阻抑致脑炎性TH1和TH17应答，并使得所建立的慢性EAE停滞。因此，利用经IL-27调整的耐受原性DC进行疫苗接种可提供对自身免疫疾病进行治疗的新路径。或者，之前开发了用于在体内递送抗原以诱导抗原特异性耐受性的纳米颗粒46。因此，在一些实施方式中，进行工程化以活化IL-27信号转导并递送髓鞘抗原(例如对于DC特异的抗原)的纳米颗粒能够在体内诱导耐受原性DC，并使得致病性T细胞应答停滞。该方式可开拓IL-27的免疫调节性质，并克服与临床环境下实施基于细胞的疗法相关的限制。本文展示的内容示出，DC中的IL-27信号转导借助至少部分依赖于CD39的机制限制了致病性TH1和TH17细胞的分化以及CNS自身免疫性的发展。该免疫调节通路可为MS和其它自身免疫紊乱提供新的治疗途径。实施例1-8中使用的示例性方法和材料
动物。之前在参考文献25和36中报道了IL-27RA缺陷和CD39缺陷小鼠。SJL、2D2、C57BL/6、CD11c-Cre:DTR以及IL-10缺陷小鼠来自于Jackson实验室。对于DC(CD11c-DTR→WT)的条件消融(conditionalablation)，每两天以16ngDTx/克体重对骨髓嵌合体进行腹膜内接种，持续两周。对于骨髓嵌合体的生成，以9.5Gy的剂量对接受者小鼠进行致死性辐照，并在1d后静脉内注射给予分离自供体股骨和胫骨的5×106个骨髓细胞。使用前使骨髓接受者休息8周。每次实验的每个实验组使用4-5只随机分配的小鼠。将小鼠保持在常规的无病原体设施中。全部实验均按照实验动物管理和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)的指南实施。
脾DC和CNS浸润物的分离。将脾与2mg/ml胶原酶D孵育20min，随后经由70μm细胞粗滤器将其捣碎。如之前所述(参考文献36)将DC分选为F4/80-CD11b-CD11c低B220+MHCII低Ly6C+pDC和F4/80-CD11b+CD11c+B220-MHCII+Ly6C-cDC(eBioscience)。利用IL-27(20ng/ml)或ecLPS(100ng/ml；大肠杆菌菌株0111:B4；Sigma)将cDC培养48h。将在无刺激物的情况下维持的平行培养物用作对照。根据制造商的方案(eBioscience)制备IL-27。
如之前在参考文献47中所述的分离CNS浸润物。利用冰冷却的PBS对小鼠进行灌注。移出脑和脊椎，并在含有III型胶原酶(2mg/ml；Worthington)和DNase(20单位/ml；Sigma-Aldrich)的PBS中孵育。随后将组织匀浆并加载至30％-37％-70％Percoll梯度，以富集CNS浸润物。
流式细胞术染色和采集(acquisition)。将如下抗体用于流式细胞术：缀合有多甲藻黄素叶绿素蛋白的抗LY6C(HK1.4)和缀合有别藻蓝蛋白的抗CD11b(M1/70；均来自BioLegend)；缀合有藻红蛋白的抗II类MHC抗体(M5/114.15.2)，缀合有异硫氰酸荧光素的抗F4/80(BM8)和AlexaFluora647-抗CD39(24DMS1；全部来自eBioscience)；缀合有别藻蓝蛋白-吲哚三羰花青的抗CD11c(HL3)和缀合有藻红蛋白的抗B220(RA3-6B2；全部来自BDPharmingen)；以及缀合有异硫氰酸荧光素的抗IL-27RA(263503；R&DSystems)。
就细胞内Foxp3的分析而言，利用缀合有别藻蓝蛋白-吲哚三羰花青的抗CD4(RM4-5；BioLegend)对细胞制备物的细胞表面标志物进行染色，随后固定并利用固定-透化缓冲液(eBioscience)使其透化，并利用如下抗体进行染色：缀合有多甲藻黄素叶绿素蛋白-花青素5.5的抗Foxp3(FJK-16s；eBioscience)。
就细胞内细胞因子的染色而言，在GolgiPlug(BDPharmingen)的存在下利用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(50ng/ml)和离子霉素(500ng/ml)将细胞刺激6h。随后，对细胞进行表面分子染色(上面指出的抗体)、固定并利用Cytofix/CytopermPlus试剂盒(BDBioscience)使其透化，并利用如下抗体进行染色：缀合有藻红蛋白-吲哚三羰花青的抗IFN-γ(XMG1.2；Biolegend)，缀合有藻红蛋白的抗IL-17(eBio17B7；eBioscience)和缀合有别藻蓝蛋白的抗IL-10(JES5-16E3；BDPharmingen)。利用LSRII或FACSAria(BDBiosciences)收集数据，随后用FlowJo软件(Treestar)进行分析。
增殖测定法。就体外实验而言，使用经IL-27(20ng/ml)预处理并经ecLPS(100ng/ml；大肠杆菌菌株0111:B4；Sigma)活化48h的cDC(以1:10的比例)对来自于野生型或2D2小鼠的初始型T细胞进行刺激。极化条件之前在参考文献48中描述：使用IL-12(30ng/ml)或IL-6(30ng/ml)生成TH1细胞；使用TGF-β1(3ng/ml)生成TH17细胞；分别使用TGF-β1(5ng/ml)和IL-27(30ng/ml)生成Treg细胞和Tr1细胞。小鼠IL-6、IL-12、IL-23和TGF-β1全部来自于R&DSystems。就体内实验而言，脾细胞获取自用MOG(35-55)免疫后21天的野生型、IL-27RA缺陷或CD39缺陷小鼠，并在MOG(35-55)的存在下在体外将所述脾细胞再刺激3天。利用PLP(139-151)对SJL小鼠进行免疫，在实验结束时收集脾细胞，并在PLP(139-151)或PLP(178-191)的存在下在体外将所述脾细胞再刺激3天。在孵育期间的最后24h将[3H]胸苷(1μCi/孔)脉冲给予细胞。利用流式细胞术评估产生IL-17(eBio17B7；eBioscience)、IFN-γ(XMG1.2；BioLegend)或IL-10(JES5-16E3；BDPharmingen)的T细胞以及Foxp3+T细胞(FJK-16s；eBioscience)的频率。对于基于CFSE的增殖测定法，用1μMCFSE(羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯；MolecularProbes)标记2D2CD4+T细胞。在LSRII(BDBiosciences)上采集数据，并用FlowJo软件(Treestar)进行分析。
细胞因子的测量。通过之前在参考文献49中所述的酶联免疫吸附测定法在48h后测量分泌的细胞因子。
定量PCR分析。利用RNAeasy柱(Qiagen，USA)提取RNA，随后根据制造商的说明(AppliedBiosystems)制备cDNA，将该cDNA用作实时PCR的模板。全部引物和探针均由AppliedBiosystems提供，并被用于ViiA7实时PCR系统(AppliedBiosystems)。利用看家基因Gapdh的表达将表达归一化。引物-探针混合物如下(来自AppliedBiosystems；识别符在括号中)：Il6(Mm00446190_m1)、Il10(Mm0043614_m1)、Il12a(Mm00434165_m1)、Il23a(Mm00518984_m1)、Il27(Mm00461162_m1)、Il27ra(Mm00497259_m1)、Entpd1(Mm00515447_m1)、Tgfb1(Mm01178820_m1)、Ifnb1(Mm00439552_s1)、Ido1(Mm0001218007_m1)、Ido2(Mm01218007_m1)、Tnip3(Mm01181626_m1)、Tnfaip3(Mm00437121_m1)、Ramp3(Mm00840142_m1)、Esr1(Mm00433151_m1)以及Gapdh(Mm99999915_g1)。
基因表达分析。利用Affymetrix微阵列MoGene_1_0_st对在利用LPS或者IL-27及LPS刺激后0、2和6h获得的样品的转录组进行分析。利用鲁棒多阵列平均算法(robustmultiarrayaveragealgorithm)将数据归一化。利用NetGenerator算法来确定网络活性，使用R项目中用于统计计算的软件(2.1-3版本)24输入随着时间点推移基因表达(倍数)的改变。借助开源软件集Graphviz，利用DOT纯文本图形描述语言生成网络图。
就基因表达的nCounter分析而言，按照制造商的方案(Nanostring)定制和使用146个炎症相关和免疫系统相关转录物的“多重”靶标谱分析(‘multiplexed’targetprofiling)。这一基因组合以及它们在DC中体内表达的差异允许利用EXPANDER工具(“表达分析器和展示器”)对EAE过程中免疫系统相关的通路进行研究。
免疫印迹分析。对于免疫印迹分析，利用补充有蛋白酶抑制剂“混合物”(Sigma)的放射免疫沉淀缓冲液将细胞裂解。借助4-12％Bis-TrisNupage凝胶(Invitrogen，USA)电泳对DC总裂解物(40μg)进行解析，并转移至PVDF膜(Millipore)上。使用如下一抗：抗IL-27RA(MAB21091；R&DSystems)；针对磷酸化STAT3的抗体(9134)，针对磷酸化STAT1的抗体(9167)，抗STAT3(9132)，抗STAT1(9172)和抗GAPDH(2111；全部来自CellSignalingTechnology)；抗胱天蛋白酶-1(ab17820)，抗IL-1β(ab9722)和抗β-肌动蛋白(ab20272；全部来自Abcam)。如之前在参考文献47中所述的进行免疫印迹分析，如制造商(Pierce)建议的，利用SuperSignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstrate对印迹进行显影。
染色质免疫沉淀。利用1％多聚甲醛使细胞中的DNA-蛋白复合物交联，利用含有1×蛋白酶抑制剂“混合物”(RocheMolecularBiochemicals)的0.35ml裂解缓冲液(1％SDS，10mMEDTA和50mMTris-HCl，pH8.1)进行裂解。利用超声处理对染色质进行剪切，在缓冲液(1％TritonX-100、2mMEDTA、150mMNaCl和20mMTris-HCl，pH8.1)中对离心后收集的上清液进行稀释。将5μg抗体预结合至蛋白A和蛋白GDynal磁珠(Invitrogen)至少4h，利用含有5％BSA的冰冷却的PBS将样品洗涤三次，随后加入至稀释的染色质，然后免疫沉淀过夜。随后在放射免疫沉淀缓冲液(50mMHEPES，pH7.6，1mMEDTA，0.7％脱氧胆酸钠，1％NP-40和0.5MLiCl)中将磁珠-染色质复合物洗涤三次，随后用Tris-EDTA缓冲液洗涤两次。随后用1％SDS和0.1MNaHCO3的溶液提取免疫沉淀的染色质，65℃加热至少6h以使得多聚甲醛交联逆转。利用QIAquickDNA纯化试剂盒(Qiagen)对DNA片段进行纯化，并利用SYBRGreen实时PCR(TakaraBio)进行分析。使用如下抗体进行染色质免疫沉淀：抗STAT3(9132；CellSignalingTechnology)以及抗STAT1(9172；CellSignalingTechnology)。使用如下引物对：Stat3(SRE-1)，正向，5′-GCTGGGCTTTAGAGACTTGTGGGC-3′以及反向，5′-ACCCATGCAAATGGTTTGGGCA-3′；Stat3(SRE-2)，正向，5′-TGAGGGCCAGCCCACACTTCA-3′以及反向，5′-GCTCACTGGGTACCTCTTGCCA-3′；Stat1(IRF-1)，正向，5′-GGAACAAAAATATAGAGAGAACTTGGGA-3′以及反向，5′-GTAGTTTGACCTAAGTGGACATAGG-3′；Stat1-Stat3，正向，5′-AGGCTCTTGTATCCTTGCCACCTCT-3′以及反向，5′-TGATGGTGGAGTGCTGTGTGCTG-3′。
转染和萤光素酶测定法。使HEK293细胞在补充有10％FBS的DMEM中生长，并根据制造商的说明(Roche)，利用FuGENEHD转染剂和2μg各质粒进行转染。用DualLuciferaseAssay试剂盒(Promega)在转染后48h对萤火虫和海肾(renilla)萤光素酶活性进行分析。
游离ATP测量。如上所述(脾DC和CNS浸润物的分离)，利用IL-27或LPS将cDC培养48h。随后利用无酚红的RPMI-1640培养基(Gibco)将细胞洗涤两次，剥夺血清24h。随后利用ENTILENrLuciferase/Luciferin试剂(Promega)对无细胞介质中的内源ATP进行分析。利用Infinite200Proluminometer(Tecan)测量生物发光活性。
外核苷酸酶酶活分析。如之前在参考文献25中所述的(进行了微小修改)实施薄层色谱。利用IL-27或LPS对1×105DC处理48h，随后将其与10mMCa2+和5mMMg2+中的2mCi/ml[14C]ADP(GEHealthcareLifeSciences)孵育。利用TLC对第1.5、3和6min收集的5μl等份中[14C]ADP的水解产物进行评估，并施加于硅凝胶基质板(Sigma-Aldrich)上。使用如之前在参考文献25和50中所述的适当的溶剂混合物分离[14C]ADP及其放射标记的衍生物。利用10μM双嘧达莫阻断腺苷摄取和脱氨基作用。将在PBS中孵育的[14C]ADP、[14C]AMP和[14C]ADO作为标准。
EAE诱导和用DC进行的疫苗接种。如之前在参考文献49中所述的，通过利用150μgMOG(35-55)或30μgPLP(139-151)(ANASPEC)对小鼠进行皮下免疫来诱导EAE。如之前在参考文献48中所述的(进行了一些修改)，诱导过继转移EAE(adoptivetransferEAE)。利用完全Freund’s佐剂中的150μgMOG(35-55)对2D2小鼠进行免疫，在免疫后7天收集引流淋巴结和脾，随后利用MOG(35-55)(20μg/ml)和无载体重组IL-12(20ng/ml；R&DSystems)或IL-23(20ng/ml；R&DSystems)将其培养48h。随后，将5×106个细胞静脉内转移至DC(WT)或DC(IL-27RA-KO)小鼠中。利用对处理条件“不知情”的研究者按照如下得分对EAE的临床迹象进行评估：0，无病；1，尾部张力(tailtone)丧失；1.5，扶正能力差；2，后肢无力；3，后肢瘫痪；4，四肢轻瘫；以及5，垂死。
就生成骨髓衍生的DC而言，在细胞因子GM-CSF(20ng/mL；Peprotech)的存在下将分离自初始型小鼠股骨的骨髓细胞培养7d。在第7天，利用CD11c+磁珠(Miltenyi)纯化细胞，随后利用IL-27(20ng/ml)培养18h，并在给药前最后3h，将20μgMOG(35-55)或PLP(139-151)加载至所述细胞。随后将DC(2×106个细胞/小鼠)充分洗涤，并静脉内给予四次，每四天一次。全部实验均按照实验动物管理和使用委员会规定的指南实施。
抗原微阵列。如所述的34将抗原点样至E玻片(TeleChem)上。利用1％牛血清白蛋白阻断微阵列上的非特异性结合，随后利用测试血清(1:100稀释，封闭缓冲液中)进行孵育。随后对阵列进行洗涤，并利用缀合有吲哚羰花青的山羊抗小鼠免疫球蛋白G抗体(检测抗体；115-166-072；JacksonImmunoResearchLabs)进行孵育。通过与微阵列上该抗原的副本结合的平均强度来定义抗原活性。利用GeneSpring软件(SiliconGenetics)对原始数据进行归一化和分析。
统计分析。利用Prism软件进行统计分析。根据Nature关于报告生命科学研究的推荐进行统计分析。就两组的比较而言，使用具有95％置信区间的线性回归以及非配对双尾学生t检验。使用针对配对数据的单因素ANOVA来确定时间应答曲线的显著性。认为P值<0.05为统计学显著的。就调整多重比较的显著性数值而言，施加修正显著性数值为0.017的Bonferroni修正。
实施例9靶向IL-27/外核苷酸酶轴的耐受原性生物治疗剂
数种Treg子类实现免疫耐受性，特别重要的是FoxP3+Treg和IL-10+I型调节性T细胞(Tr1细胞)2。已报道了T1D患者中胰FoxP3+Treg的缺陷，来自T1D患者的Teff可耐受由FoxP3+Treg进行的调节3。就IL-10+Tr1细胞而言，在新诊断的T1D患者中，由胰岛特异性T细胞分泌的IL-10减少4。相反，Tr1细胞在胰岛移植的临床前模型中实现耐受性5，并且，由Teplizumab(抗CD3)导致的糖尿病停滞与T细胞产生IL-10相关6。
免疫耐受性的重新建立对于I型糖尿病(T1D)的治疗是有益的。树突状细胞(DC)控制效应T细胞和调节性T细胞(分别为Teff和Treg)之间的平衡。如实施例1-8所述的，IL-27作用于DC以使Treg扩增，并因此能够限制Teff并对T1D和多发性硬化(MS)模型中的疾病进行阻抑(图14A-图14B)。此外，如前面所展示的，IL-27对DC的抗炎性作用由外核苷酸酶CD39(ENTPD1)的上调以及随后的促炎性细胞外ATP(eATP)水平的降低介导。因此，能够将包含靶向DC的抗体以及IL-27或ATP降解蛋白腺苷三磷酸双磷酸酶的融合蛋白开发为针对T1D的疗法(图14C)。在一些实施方式中，可将这些抗炎性生物治疗剂改作他用，以治疗广泛种类的免疫介导的疾病。
IL-27诱导由芳香烃受体介导的Tr1细胞的分化7、8。因此，特别是由于在发炎的组织中Teff对FoxP3+Treg的阻抑活性的耐受性，IL-27和Tr1细胞在对预先存在的炎症的阻抑中起到重要作用9。
IL-27受体(IL-27Ra)由T细胞表达，也由先天免疫细胞(例如DC)表达11、12。IL-27多态性与T1D相关12。然而，IL-27能够作用于DC或诱导对DC的免疫阻抑效应这一点是未知的。实际上，发明人发现IL-27作用于DC，以使Treg扩增、限制Teff，并使得实验性T1D和多发性硬化的发展停滞。IL-27对DC的这些耐受原性作用由外核苷酸酶CD39的上调以及随后的促炎性eATP的减少介导(图14A-图14B)。IL-27还诱导DC中其它耐受原性分子(例如IDO1)的表达。
虽然可给予IL-27来治疗自身免疫紊乱，然而非靶向的系统性细胞因子给药可能与限制其临床用途的副作用相关。因此，一方面，可将包含融合至IL-27或腺苷三磷酸双磷酸酶(ATP降解蛋白)的靶向DC的抗体的生物治疗剂用于在T1D和其它免疫介导的紊乱中靶向IL-27/外核苷酸酶轴并重新建立耐受性(图14C)。
CD39缺陷使得小鼠糖尿病恶化，并且，CD39限制肾损伤并促进β细胞再生13-16。因此，在一些实施方式中，靶向IL-27/外核苷酸酶轴可活化额外的组织保护机制，从而可增强T1D中的治疗效力，并支持将其改作他用以治疗其它炎症性紊乱(例如狼疮肾炎)。
示例性的生物治疗剂药物候选物：在一些实施方式中，生物治疗剂可包含融合至IL-27或ATP降解蛋白(例如腺苷三磷酸双磷酸酶，如马铃薯(S.tuberosum)腺苷三磷酸双磷酸酶)的靶向DC的抗体。在一些实施方式中，靶向DC的抗体可为靶向由人DC表达的Clec9A的单链抗体17。或者，虽然DEC205表达的特异性较低(特别是在人中)，靶向DC的抗体可为靶向DEC205的单链抗体。
虽然之前的报道显示NF-κB抑制剂的β细胞特异性递送阻抑实验性T1D18，然而，将抗炎性IL-27靶向递送至β细胞或肾是未知的。在一些实施方式中，可期望将腺苷三磷酸双磷酸酶或IL-27缀合至靶向β细胞或肾的抗体，从而能够用作针对T1D和肾炎的治疗方法。类似地，将腺苷三磷酸双磷酸酶局部递送至β细胞或肾可增强β细胞再生并限制肾损伤。在一些实施方式中，可将本文所述的生物治疗剂与T1D中的其它免疫疗法(例如IL-27Ra阻断抗体19)组合使用，以对糖尿病肾病进行治疗或促进β细胞存活，或者可转用于其它临床自身免疫适应症(例如狼疮肾炎)。
可在体外在鼠科动物T1D系统和细胞上对所述生物治疗剂进行分析，也可在来自对照和T1D患者的人细胞上进行分析。另外，可在T1D患者中对IL-27Ra和CD39表达进行分析，以评价IL-27/CD39通路在T1D中的相关性以及这些分子作为生物标志物用于患者分层和监测的效用。
为了研究本文所述的生物治疗剂在T1D临床前模型中的作用，使用生物治疗剂(例如靶向IL-27/外核苷酸酶通路的生物治疗剂)来评估它们对鼠科动物T1D模型的作用。在体外利用细胞、以及还通过体内给药分析了生物治疗剂的靶向特异性。还对融合有IL-27或腺苷三磷酸双磷酸酶的抗体在体外对DC的活性进行了测量，以确定IL-27或腺苷三磷酸双磷酸酶融合至抗体是否影响其生物活性。这些体内和体外功能测定法可在体内和体外分析所述生物治疗剂对DC存活和成熟以及T细胞活化并极化为Teff和Treg的影响。可将IL-27缺陷和CD39缺陷小鼠以及重组IL-27或腺苷三磷酸双磷酸酶作为对照。此外，可在预防性和治疗性范式中评估生物治疗剂对T1D鼠科动物模型的作用。
之前报道了T1D中调节异常(dysregulated)的T细胞应答以及IL-27和CD39(ENTPD1)多态性。为了研究本文所述的生物治疗剂对T1D样品和对照样品的作用，在对照样品和T1D样品中确定了IL-27Ra、CD39以及用生物治疗剂靶向IL-27/外核苷酸酶轴的功能效果。首先对来自对照样品和T1D样品的未处理的或生物治疗剂处理的DC和T细胞中的IL-27Ra和CD39表达进行了分析。这可确定这些分子是否能够用于对患者进行分层以及监测它们对疗法的应答。
为了评估本文所述的生物治疗剂对T1D的治疗效力，对新诊断的(诊断6周内)抗GAD65、抗ICA512或ICA阳性的T1D患者进行研究。在患者选择中利用ENTPD1多态性，并用安慰剂或本文所述的生物治疗剂对所述患者进行治疗。可在给药后的指定时间点测量平均C肽曲线下面积相较基线的改变、胰岛素使用和/或HbA1水平。为了研究生物治疗剂对IL-27/外核苷酸酶轴的作用，在血液DC中分析CD39表达(由IL-27引起上调)。由于DC对IL-27的应答存在转录标识(transcriptionalsignature)，还确定了mRNA的表达。随后，将这些参数与患者中生物治疗剂的细胞靶向和生物分布相关联。另外，分析了血液DC在体外活化T细胞的能力。此外，例如借助CyTOF对PBMC中的T细胞和DC的表面标志物和细胞内标志物(例如FoxP3、IL-10、IL-17等)的表达进行分析；例如利用四聚物并借助ELISPOT对胰岛素特异性T细胞进行分析。
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Claims (36)

1.一种生成免疫阻抑性树突状细胞的方法，所述方法包括将树突状细胞与包含有效量的IL-27激动剂的组合物相接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述IL-27激动剂的所述有效量处于约1ng/mL至约100ng/mL的范围。
3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法进一步包括将所述树突状细胞与自身免疫抗原相接触。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述自身免疫抗原具有约1μg/mL至约100μg/mL的浓度。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中，所述自身免疫抗原选自于由如下自身免疫抗原所组成的组：
髓鞘碱性蛋白(MBP)；蛋白脂质蛋白(PLP)；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)，髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白心脏肌球蛋白；外表面蛋白(OSP)；髓鞘相关糖蛋白(MAG)；神经丝；干扰素ω；转谷氨酰胺酶；芳香酸羧化酶；17-羟化酶；21-羟化酶，心磷脂；丙酮酸脱氢酶；β2糖蛋白I；磷脂酰丝氨酸；apoH；膜联蛋白A5；LKM-1；可溶性肝抗原；碳酸酐酶；gpIIb-IIIa或1b-IX；XVII型胶原；组织转谷氨酰胺酶；麦醇溶蛋白；GD1a；GQ1b；BP-1；BP-2；表皮转谷氨酰胺酶；组氨酸-tRNA；信号识别肽；Mi-2；Jo1；谷氨酸脱羧酶，HSP60；HSP70；HSP90；IGRP；胰岛素；羧肽酶H；胰岛素瘤抗原-2；IA-2β；ICA69；ZnT8；嗜铬粒蛋白A；IAPP；scl70；拓朴异构酶；组蛋白；基底膜IV型胶原；烯醇化酶；甲状腺过氧化物酶；甲状腺球蛋白；补体成分3；电压门控钙通道；Q型钙通道，突触结合蛋白，毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1；SMA；LKM-1；LKM-2；LKM-3；可溶性肝抗原；SLA；LP；主要外周髓鞘蛋白P0；髓过氧化物酶；GQ1b；U1-RNP；Kir4.1；烟碱型乙酰胆碱受体；MuSK蛋白；下丘脑分泌素；食欲素；角蛋白；AQP4；Yo；Hu；谷氨酸受体；桥粒芯蛋白3；p62；sp100；Ro；LA；糖蛋白IIb-IIIa或Ib-IX；ADAMTS13；心磷脂；β2糖蛋白I；HPA-1a；HPA-5b；IFN-γ，IL-1，TNF-α；GMCSF，上述抗原的部分以及它们的组合。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述接触离体或在体外进行。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述接触在体内进行。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，与未与所述IL-27激动剂相接触的树突状细胞相比，所述免疫阻抑性树突状细胞包含表达增高的IL-27。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，与未与所述IL-27激动剂相接触的树突状细胞相比，所述免疫阻抑性树突状细胞包含表达增高的CD39。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，与未与所述IL-27激动剂相接触的树突状细胞相比，所述免疫阻抑性树突状细胞包含产生减少的效应极化细胞因子和/或产生升高的抗炎性细胞因子。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述效应极化细胞因子包括IL-12和/或IL-6。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述抗炎性细胞因子包括TGFβ1、IL-10、IFN-β或它们的任意组合。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述IL-27激动剂包含重组IL-27蛋白或肽。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述树突状细胞来源自脾、淋巴结、血液、单核细胞和/或造血祖细胞。
15.由权利要求1-14中任一项所述的方法产生的免疫阻抑性树突状细胞。
16.一种治疗自身免疫疾病或紊乱的方法，所述方法包括向有需要的患者给予靶向树突状细胞(DC)的组合物，所述靶向DC的组合物包含(a)刺激IL-27/外核苷酸酶39轴信号转导的试剂；以及(b)DC结合剂。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述试剂包含IL-27激动剂。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中，所述试剂包含CD39激动剂。
19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中，所述试剂包含ATP降解激动剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述ATP降解激动剂包含腺苷三磷酸双磷酸酶。
21.如权利要求16-20中任一项所述的方法，其中，所述DC结合剂包含针对Clec9A和/或DEC205的抗体。
22.如权利要求16-21中任一项所述的方法，其中，所述靶向DC的组合物进一步包含自身免疫抗原。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述自身免疫抗原选自于由如下自身免疫抗原所组成的组：
髓鞘碱性蛋白(MBP)；蛋白脂质蛋白(PLP)；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)，髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白心脏肌球蛋白；外表面蛋白(OSP)；髓鞘相关糖蛋白(MAG)；神经丝；干扰素ω；转谷氨酰胺酶；芳香酸羧化酶；17-羟化酶；21-羟化酶，心磷脂；丙酮酸脱氢酶；β2糖蛋白I；磷脂酰丝氨酸；apoH；膜联蛋白A5；LKM-1；可溶性肝抗原；碳酸酐酶；gpIIb-IIIa或1b-IX；XVII型胶原；组织转谷氨酰胺酶；麦醇溶蛋白；GD1a；GQ1b；BP-1；BP-2；表皮转谷氨酰胺酶；组氨酸-tRNA；信号识别肽；Mi-2；Jo1；谷氨酸脱羧酶，HSP60；HSP70；HSP90；IGRP；胰岛素；羧肽酶H；胰岛素瘤抗原-2；IA-2β；ICA69；ZnT8；嗜铬粒蛋白A；IAPP；scl70；拓朴异构酶；组蛋白；基底膜IV型胶原；烯醇化酶；甲状腺过氧化物酶；甲状腺球蛋白；补体成分3；电压门控钙通道；Q型钙通道，突触结合蛋白，毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1；SMA；LKM-1；LKM-2；LKM-3；可溶性肝抗原；SLA；LP；主要外周髓鞘蛋白P0；髓过氧化物酶；GQ1b；U1-RNP；Kir4.1；烟碱型乙酰胆碱受体；MuSK蛋白；下丘脑分泌素；食欲素；角蛋白；AQP4；Yo；Hu；谷氨酸受体；桥粒芯蛋白3；p62；sp100；Ro；LA；糖蛋白IIb-IIIa或Ib-IX；ADAMTS13；心磷脂；β2糖蛋白I；HPA-1a；HPA-5b；IFN-γ，IL-1，TNF-α；GMCSF，上述抗原的部分以及它们的组合。
24.如权利要求16-23中一项所述的方法，其中，所述DC结合剂和任选的自身免疫抗原融合至所述刺激IL-27/外核苷酸酶CD39轴信号转导的试剂。
25.如权利要求16-23中任一项所述的方法，其中，所述靶向DC的组合物包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包含所述刺激IL-27/外核苷酸酶CD39轴信号转导的试剂、所述DC结合剂和任选的自身免疫抗原。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述试剂和所述任选的自身免疫抗原分布于所述纳米颗粒的表面上。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中，所述试剂和所述任选的自身免疫抗原被包封于所述纳米颗粒内。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒进一步包含在其表面上的PEG层。
29.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒为金纳米颗粒。
30.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中，所述自身免疫疾病或紊乱为多发性硬化。
31.如权利要求25-30中任一项所述的方法，其中，所述自身免疫疾病或紊乱为脑脊髓炎。
32.如权利要求25-31中任一项所述的方法，其中，所述自身免疫疾病或紊乱为I型糖尿病。
33.一种治疗自身免疫疾病或紊乱的方法，所述方法包括给予包含权利要求15所述的免疫阻抑性树突状细胞的群的组合物。
34.如权利要求33所述的方法，其中，所述免疫阻抑性树突状细胞的群为自体树突状细胞。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中，所述组合物进一步包含自身免疫抗原。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述自身免疫抗原选自于由如下自身免疫抗原所组成的组：
髓鞘碱性蛋白(MBP)；蛋白脂质蛋白(PLP)；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)，髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白心脏肌球蛋白；外表面蛋白(OSP)；髓鞘相关糖蛋白(MAG)；神经丝；干扰素ω；转谷氨酰胺酶；芳香酸羧化酶；17-羟化酶；21-羟化酶，心磷脂；丙酮酸脱氢酶；β2糖蛋白I；磷脂酰丝氨酸；apoH；膜联蛋白A5；LKM-1；可溶性肝抗原；碳酸酐酶；gpIIb-IIIa或1b-IX；XVII型胶原；组织转谷氨酰胺酶；麦醇溶蛋白；GD1a；GQ1b；BP-1；BP-2；表皮转谷氨酰胺酶；组氨酸-tRNA；信号识别肽；Mi-2；Jo1；谷氨酸脱羧酶，HSP60；HSP70；HSP90；IGRP；胰岛素；羧肽酶H；胰岛素瘤抗原-2；IA-2β；ICA69；ZnT8；嗜铬粒蛋白A；IAPP；scl70；拓朴异构酶；组蛋白；基底膜IV型胶原；烯醇化酶；甲状腺过氧化物酶；甲状腺球蛋白；补体成分3；电压门控钙通道；Q型钙通道，突触结合蛋白，毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1；SMA；LKM-1；LKM-2；LKM-3；可溶性肝抗原；SLA；LP；主要外周髓鞘蛋白P0；髓过氧化物酶；GQ1b；U1-RNP；Kir4.1；烟碱型乙酰胆碱受体；MuSK蛋白；下丘脑分泌素；食欲素；角蛋白；AQP4；Yo；Hu；谷氨酸受体；桥粒芯蛋白3；p62；sp100；Ro；LA；糖蛋白IIb-IIIa或Ib-IX；ADAMTS13；心磷脂；β2糖蛋白I；HPA-1a；HPA-5b；IFN-γ，IL-1，TNF-α；GMCSF，上述抗原的部分以及它们的组合。
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