CN101287483B - 用于加速伤口愈合的药物组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种用于诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法和药物组合物。所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的脂肪细胞素、脂肪细胞调节剂、脂肪细胞、能够分化为脂肪细胞的细胞、或者能够分泌脂肪细胞素的细胞，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。

Description

用于加速伤口愈合的药物组合物和方法
发明领域和背景
本发明涉及用于加速伤口愈合过程的方法和药物组合物。具体地说，本发明利用由脂肪细胞分泌的生物活性分子(脂肪细胞素(adipokine))、和调节脂肪细胞分化、增殖和/或活性的生物活性分子诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
伤口治疗的主要目标是使伤口得以闭合。开放性皮肤伤口是一种主要的伤口类型，包括烧伤、神经性溃疡、褥疮、静脉淤滞溃疡和糖尿病性溃疡。
开放性皮肤伤口通常通过包括下述六个主要环节的过程愈合：(i)发炎；(ii)纤维原细胞增生；(iii)血管增生；(iv)结缔组织生成；(v)上皮形成；(vi)伤口收缩。当这些环节个别或者整体没有正常运行时，就会影响伤口的愈合。很多因素都可能影响伤口愈合，包括营养不良、感染、药理学试剂(如放线菌素和甾族化合物)、高龄和糖尿病[参见Hunt和Goodson的Current Surgical Diagnosis&Treatment(Way；Appleton&Lange)，第86-98页(1988)]。在身体各部分接受外科手术之后也会出现伤口愈合的常见问题，即手术取得成功但开放性伤口未愈合。
皮肤是一种复层鳞状上皮，在其中进行生长和分化的细胞是有严格区分的。在生理状态中，增殖限于附着在基底膜的基底细胞上。分化是一种空间过程，其中基底细胞失去对基底膜的附着，中止DNA的合成并进行一系列的形态和生物化学变化。最终的发育成熟步骤是角质层的产生形成皮肤的防护屏障(1，2)。当基底细胞开始分化，可观测到的最早变化与基底细胞脱离和远离基底膜(3)的能力有关。类似的变化与伤口愈合过程有关，在该过程中细胞迁移入受伤区域和增殖的能力均得到增强。为了皮肤层的重构并诱导表皮层的适当分化，这些过程是必须遵循的。
随着用于小鼠和人体角质形成细胞(2，4)的培养体系的发展，极大地促进了对表皮细胞增长、分化和迁移的调节机制的分析。在体外，角质形成细胞能以高生长率作为基础增殖细胞运用。此外，分化可能在体内表皮的成熟模式之后在体外被引发出来。初期的现象包括半桥粒部分(3，5)的损失和α6β4整联蛋白与基质蛋白细胞附着的选择性损失。这表明，在整联蛋白表达方面的改变是在角质形成细胞分化中的早期现象。早期的半桥粒接触损失导致角质形成细胞的上基部迁移，并且与在培养的角质形成细胞中和在皮肤(1，3，6)中角蛋白1(K1)的诱导有关。此外，对粒层表型的分化与下述因素有关：β1和β4整联蛋白表达的负调节、对所有基质蛋白的附着潜力的损失以及继之以角质化包膜的形成和细胞死亡。分化细胞最终以成熟鳞屑(2，7)形式从培养皿中脱落。上述体外分化程序紧接着体内表皮的成熟模式。
伤口愈合可以通过体内各种直接或间接加速表皮细胞增殖、分化和/或迁移的生物活性试剂引发。因此，美国专利5,591,709和5,461,030中记载了通过利用如胰岛素、生长激素、三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的非甾族合成代谢激素诱导伤口闭合。美国专利5,145,679记载了通过利用胰岛素和胰酶诱导伤口闭合。美国专利6,541,447记载了通过利用生长因子和生长激素的混合物诱导伤口闭合，国际申请PCT/IL01/00675记载了通过利用PKC调节试剂诱导伤口闭合。然而，现有技术中没有关于利用脂肪细胞、脂肪细胞调节剂或脂肪细胞分泌的分子来诱导或加速与伤口愈合有关的过程的教导。
因此，广泛认识到需要有一种促进伤口愈合的新方法，这将是非常有益的。本发明提供了一种治疗伤口的新方法，所述方法利用脂肪细胞、能够分化为脂肪细胞的细胞、由脂肪细胞分泌的产物和脂肪细胞调节剂来诱导或加速与伤口愈合有关的过程。
发明概述
在进行伤口愈合研究的实验过程中，本发明的发明者发现，在早期愈合过程期间，脂肪细胞与在伤口缝(gap)迁移性角质形成细胞密切相关，这表明脂肪细胞、脂肪细胞调节剂和脂肪细胞素与伤口愈合过程有关，因而可能用来影响伤口愈合的过程。
在对本发明进行实践时，如优选方案以及下述实施例部分中进一步描述的那样，发现向伤口给药脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂确实实质上有效地促进了伤口的愈合。
因此，根据本发明的一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的脂肪细胞素，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的另一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的能够调节脂肪细胞素的表达和/或分泌的药剂，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的又一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的能够调节脂肪细胞分化的药剂，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的再一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的能够将脂肪细胞吸引至皮肤伤口的药剂，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的又一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的能够增强脂肪细胞在皮肤伤口中的增殖的药剂，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的又一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括在皮肤伤口中植入治疗有效量的脂肪细胞，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的又一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括在皮肤伤口中植入治疗有效量的前脂肪细胞，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的又一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括在皮肤伤口中植入治疗有效量的干细胞，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的再一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括将皮肤伤口细胞转化至表达和分泌脂肪细胞素，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
根据本发明的再一方面，提供了一种用于诱导或加速皮肤伤口愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的作为活性成分的脂肪细胞素、以及用于局部施用该药物组合物的可药用载体。
根据本发明的再一方面，提供了一种用于诱导或加速皮肤伤口愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的作为活性成分的能够调节脂肪细胞素表达和/或分泌的药剂、以及用于局部施用该药物组合物的可药用载体。
根据本发明的再一方面，提供了一种用于诱导或加速皮肤伤口愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的作为活性成分的能够调节脂肪细胞分化的药剂、以及用于局部施用该药物组合物的可药用载体。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于诱导或加速皮肤伤口愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的作为活性成分的能够将脂肪细胞吸引至皮肤伤口的药剂、以及用于局部施用该药物组合物的可药用载体。
根据本发明的再一方面，提供了一种用于诱导或加速皮肤伤口愈合过程的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的作为活性成分的能够增强脂肪细胞增殖的药剂、以及用于局部施用该药物组合物的可药用载体。
根据本发明的再一方面，提供了一种测量脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂诱导或加速伤口愈合过程的能力的方法，所述方法包括向伤口给药脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂，然后评价所述伤口的角质形成细胞迁移和/或表皮闭合，从而测量出所述脂肪细胞素或所述脂肪细胞调节剂诱导或加速伤口愈合的能力。
根据如下所述的本发明优选实施方案中的其它特征，所述脂肪细胞素选自降脂蛋白、脂连蛋白、抵抗素、瘦蛋白、脂蛋白脂肪酶、血管紧张素原、血管紧张素样物质4(angiotesin-like 4)、1-丁酰丙三醇、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、血管内皮细胞生长因子、白介素6和肿瘤坏死因子α。优选脂肪细胞素是降脂蛋白。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述脂肪细胞调节剂是PPAR调节剂，优选PPAR-γ拮抗剂，更优选GW9662。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述脂肪细胞是人类脂肪细胞。优选自体人类脂肪细胞。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述前脂肪细胞是人类前脂肪细胞。优选自体人类前脂肪细胞。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述干细胞是人类干细胞。优选自体人类干细胞。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述植入进一步包括调节脂肪细胞素的表达和/或分泌。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，通过分化而实现调节。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，通过将前脂肪细胞暴露于能够增强前脂肪细胞分化为脂肪细胞的物质下而实现分化。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，通过将干细胞暴露于能够增强干细胞分化为脂肪细胞的物质下而实现增强分化。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述伤口选自溃疡、烧伤、裂伤和外科切口。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述药物组合物载体选自水溶液、凝胶、乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分散液、油膏和软膏。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述药物组合物包括固体载体。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述脂肪细胞调节剂是脂肪细胞分化调节剂或脂肪细胞活性调节剂。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述伤口是在实验动物中造成的切口伤口。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂的给药在以一种或多种浓度完成的。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂的给药是以一或多次施用完成的。
本发明提供了用于治疗伤口的新药物组合物和方法，其利用脂肪细胞、能够分化为脂肪细胞的细胞、脂肪细胞调节剂以及由脂肪细胞分泌的分子来诱导或加速伤口的愈合。
除非另有描述，本文中使用的所有科技术语具有如本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然那些与本发明相类似或等价的方法和原料也可用于本发明的实践或实验中，但是这里仍然将适宜的方法和原料描述如下。如果不相符，可参照包括定义在内的专利说明书。此外，这些原料、方法和实施例仅仅是非限制性的说明。
附图简述
下面仅参照附图举例对本发明进行说明。下面对附图给予详细具体的说明，需要强调指出的是，附图详解仅仅是举例说明，并且仅仅是对本发明优选实施方案进行示例性的描述，以及对本发明提供在最大实用性和对本发明原理和概念的易理解方面的描述。关于这一点，对本发明的结构细节并未进行更详细的说明，更多的是对本发明基本思路的必要性说明，对本领域技术人员而言，根据对附图的描述，在实践中如何采取本发明的各种形式是显而易见的。
在附图中：
图1示例性说明了胰岛素对伤口区域脂肪细胞的募集和表皮细胞的迁移的影响。通过切割在C57BL小鼠背上得到一伤口。伤口按照每日局部施用促愈胰岛素(1μM)治疗六天，随后处死小鼠，分析其伤口的表皮细胞迁移和脂肪细胞募集。表皮细胞迁移通过K14抗体染色来测定，如果伤口沿着整个伤口缝为阳性染色，则认为为阳性。脂肪蛋白的募集通过H&E染色来测定，如果在肉芽组织内检测到脂肪细胞，则认为为阳性。暗柱代表胰岛素治疗，亮柱代表缓冲液处理的对照。结果以闭合(阳性)伤口的百分比表示，每个柱代表六组重复实验的平均值±标准误差。
图2A-B是说明脂肪细胞与伤口愈合过程关联的组织化学显微照片。通过切割在C57BL小鼠背上得到一伤口。受伤小鼠七天后处死，随后切片并用K14抗体染色以突出迁移的表皮细胞。显微照片说明在伤口愈合过程的早期，伤口缝存在大量募集的脂肪细胞(图2A，x20放大；图2B，x10放大)。
图3示例性说明了PPARγ拮抗剂(GW9662)对体外初级角质形成细胞迁移的影响。培养的角质形成细胞未经处理(对照)或用2μMGW9662处理。在光学显微镜下观察角质形成细胞的迁移。上栏表示处理前(pre-treated)(0天)培养物的显微图，左下图和表栏分别表示所得到的对照和经处理的培养物(第2天)。蓝线标记了迁移角质形成细胞的边缘，箭头指示出GW9662处理的培养物相对于未处理的对照品而言增强的迁移。
图4是示例性说明PPARγ拮抗剂(GW9662)和降脂蛋白对体内伤口愈合的影响的图表。通过切割在C57BL小鼠背上得到一伤口，随后测量该伤口(0天)。伤口区域按照每日局部施用PBS(对照)、降脂蛋白或2μM的GW9662治疗六天。小鼠随后处死，测量其伤口区域(第6天)。对每一处理计算六天内自最初伤口区域收缩的伤口区域部分(％伤口收缩)。该图表示出了相对于缓冲液处理的对照组而言，GW9662和降脂蛋白都实质上促进了伤口的收缩。
图5是示例性说明PPARγ拮抗剂(GW9662)和降脂蛋白对体内伤口闭合的影响的组织化学显微图。通过切割在C57BL小鼠背上得到一伤口。随后测量伤口区域(0天)。伤口按照每天局部施用PBS(对照)、1μM降脂蛋白或2μM的GW9662治疗六天。小鼠随后处死，其伤口以多聚甲醛固定，在x5放大的双目显微镜下观测。显微照片示出了用GW9662或降脂蛋白处理的伤口区域，其实质上小于缓冲液对照组的伤口区域。
图6示例性说明了降脂蛋白对表皮细胞迁移和伤口闭合的影响。通过切割在C57BL小鼠背上得到一伤口。每日按照1μM的降脂蛋白局部施用治疗七天，随后处死，切片并通过K14抗体染色分析表皮闭合和迁移。如果沿着整个伤口缝的伤口是阳性染色，则认为表皮闭合是阳性。如果伤口是阳性染色但并不是完全沿着伤口缝，则认为表皮迁移是阳性。柱状图表明降脂蛋白显著地增强了表皮闭合和表皮迁移。每个柱条代表六组重复实验的平均值。
图7是示例性说明PPARγ拮抗剂(GW9662)和降脂蛋白对伤口闭合(收缩)的影响的组织化学显微图。通过切割在C57BL小鼠背上得到一伤口。每日用降脂蛋白(1μM)、GW9662(2μM)治疗6天，或者不治疗(对照)。接受治疗的小鼠在伤害的六天后处死。进行组织化学的伤口切片，通过H&E(上栏)或K14抗体(下栏)染色，在x5放大的光学显微镜下观测。若皮肤伤口双侧(黑线标记)都能在单一视区内观察到，则认为是阳性收缩。在未治疗的对照切片(右)的开放性伤口区域太大，以至于不能被包含在单一视区中(因而认为是阴性的皮肤收缩)，当用降脂蛋白治疗的切片(左)、用GW9662治疗的切片(中间)则显示出阳性皮肤收缩。
图8示例性说明了PPARγ激动剂(曲格列酮)对体外初级角质形成细胞迁移的影响。培养的角质形成细胞未经处理(对照)，或者用100μM曲格列酮处理，在光学显微镜下观察其迁移。上栏表示处理前(0时间)培养物的显微图，左下图和右栏分别表示所得到的对照和经处理的培养物(48小时内)。线条标记了培养的角质形成细胞边缘，这表明，相对于未经处理的对照组而言，用曲格列酮处理后的培养角质形成细胞的迁移实质上得到抑制。
图9是示例性说明胰岛素和PPARγ激动剂(曲格列酮)对体内伤口闭合的影响的组织化学显微照片。通过切割在C57BL小鼠背上得到一伤口，每日按照局部施用PBS(对照)、胰岛素(10nM)、曲格列酮(100μM)或曲格列酮(100μM)+胰岛素(10nM)联合治疗6天。小鼠随后处死，其伤口用多聚甲醛固定，在x5倍放大的双目显微镜下观测。显微照片表明，用胰岛素治疗的伤口区域实质上小于缓冲液对照组，而用曲格列酮和曲格列酮+胰岛素治疗伤口则远远大于缓冲液对照组。
图10示例性说明了胰岛素和PPARγ激动剂(曲格列酮)对伤口闭合的影响。通过切割在C57BL小鼠背上得到一伤口。伤口每日按照局部施用PBS(对照)、胰岛素(10nM)、曲格列酮(100μM)或曲格列酮(100μM)+胰岛素(10nM)联合治疗6天，随后处死，切片并对伤口闭合进行分析。通过K14和K1抗体染色测量伤口闭合。如果沿着整个伤口缝的伤口是阳性染色，则认为伤口闭合是阳性。每个柱条代表六组重复实验的平均值。
优选实施方案说明
本发明涉及加速伤口愈合过程的方法和药物组合物。具体而言，本发明利用脂肪细胞、可分化为脂肪细胞的细胞、由脂肪细胞分泌的生物活性分子(脂肪细胞素)以及脂肪细胞调节剂来加速皮肤伤口的愈合过程。
在详述本发明的至少一个实施方案之前，应当理解在下面实施方案部分中的描述或说明中列举的构造详图和方案部分不对本发明的应用构成限制。本发明可以以其他的方案实施、或者以多种方式实际操作或完成。同样，应当理解在此使用的术语和专有名词是为了便于描述，并不对其构成限制。
成人皮肤包括两层，角质化分层上皮和提供支持和营养的下层厚富胶原皮肤结缔组织。皮肤是抵御外界的防护屏障。因此，任何皮肤上的损伤或破裂必须得到迅速有效的修复。如上文中背景部分所述，栓塞最初伤口的凝块的形成是实现皮肤修复的第一阶段。此后，炎性细胞、纤维原细胞和毛细管拥入凝块形成肉芽组织。接下来的阶段涉及伤口处上皮的再生，其中基础角质形成细胞必须失去其半桥粒联系并迁移入肉芽组织以覆盖伤口。在角质形成细胞迁移后，角质形成细胞进入增生性的增加阶段，这能够替代伤口形成期间损失的细胞。单层角质形成细胞覆盖伤口后(即表皮闭合)，形成新分层的表皮并重建新基底膜(8-11)。
当在伤口愈合研究中进行实验时，本发明者意外地发现在早期伤口愈合过程期间，脂肪细胞与受伤区域的迁移角质形成细胞密切相关。因此，下述实施方案部分的实施例1说明，伤口缝出现的迁移角质形成细胞与相同区域出现募集的脂肪细胞直接相关。此外，用胰岛素治疗的伤口为伤口缝募集了更多的脂肪细胞，接下来比对照组、不治疗的伤口愈合得更快。上述新发现的脂肪细胞和角质形成细胞迁移与伤口愈合的密切关系、以及募集的脂肪细胞和伤口愈合效率之间的直接相关性表明，脂肪细胞、脂肪细胞调节剂和脂肪细胞产物(脂肪细胞素)与伤口愈合过程有关，因而可用于影响伤口的愈合过程。
脂肪细胞分泌大量的生物活性分子，称为脂肪细胞素，其通过调节胰岛素的分泌、胰岛素活性、葡萄糖和脂类代谢、能量平衡、发炎和复制，在保持能量的动态平衡中起重要作用。
然而，关于伤口愈合可能涉及脂肪细胞分泌的生物活性分子，现有技术中并没有教导，也没有启示。
基于上述的最初发现，同时进一步对本发明进行实践，本发明的发明人预期并随后发现，一种典型的脂肪细胞素即自已知的脂肪细胞素中选出的降脂蛋白显著地加速了体外角质形成细胞迁移，并且有效地促进体内皮肤伤口的愈合(见下文实施方案部分实施例3)。
因而，根据本发明的一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的脂肪细胞素，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
在此使用的术语″伤口″概括性地包括以不同方式引发的对皮肤和皮下组织的损伤(如长期卧床休养引起的褥疮、外伤(trauma)引起的伤口、割伤、溃疡、烧伤、外科切口等)，并具有不定的特征。
一般伤口按照伤口的深度分为以下四个级别：(i)I级：限于表皮的伤口；(ii)II级：发展到真皮的伤口；(iii)III级：发展到皮下组织的伤口；(iv)IV级(或全皮层伤口(full-thickness wound))：伤口中暴露了骨骼(例如骨头外露的压迫点如更大的转节或骶骨)。
在此使用的术语″部分皮层伤口″(partial thickness wound)包括I-III级伤口；部分皮层伤口的实例包括烧伤、褥疮、静脉淤滞溃疡和糖尿病性溃疡。
在此使用的术语″深度伤口″意味着包括III级和IV级的伤口。
在此使用的术语″慢性伤口″指在三十天之内未愈合的伤口。
关于伤口的术语″愈合″指经瘢痕形成而修复伤口的过程。
预期本发明可治疗包括深度伤口和慢性伤口在内的所有伤口类型。
在此使用的术语″脂肪细胞素″指体内或体外脂肪细胞分泌的任何生物活性分子，包括但不限于脂肪细胞分泌的酶、生长因子、细胞因子和激素。优选本发明的脂肪细胞素选自补体D(降脂蛋白)、C3和B；血管内皮细胞生长因子(VGEF)、脂连蛋白(Acrp30)；抵抗素；瘦蛋白；脂蛋白脂肪酶(LPL)；血管紧张素原；血管紧张素样物质4；1-丁酰丙三醇(甘油一丁酸酯)；基质金属蛋白酶2和9；肿瘤坏死因子α(TNFα)、和白介素6。优选的脂肪细胞素是降脂蛋白。
除了向伤口给药脂肪细胞素外，根据本发明的某些实施方案，脂肪细胞调节剂可以诱导或加速伤口的愈合。
在此使用的用语″脂肪细胞调节剂″指任何能够调节脂肪细胞中的脂肪细胞素的表达和/或分泌、脂肪细胞的分化、脂肪细胞的增殖、脂肪细胞的迁移或者将脂肪细胞吸引至伤口的分子。
脂肪细胞在通常所说的脂肪生成过程中自前脂肪细胞分化而成。在培养物中，脂肪的生成完全依赖于胰岛素、地塞米松和异丁基甲基黄嘌呤，强调胰岛素、糖皮质激素和环磷腺苷路径的参与。
当此过程中许多信号和生化途径起必要作用时，脂肪生成期间的大多数已知变化是处于基因转录水平。与脂肪生成过程有关的关键转录因子包括属于CCAAT/增强子结合蛋白家族的蛋白、脂肪细胞决定和分化依赖因子1(亦称甾醇调节因子结合蛋白1)和过氧物酶体增殖物活化剂受体γ(Rangwala和Lazar，Ann.Rev.Nutt.20：535-539，2000)。
过氧物酶体增殖物活化受体(PPAR)包括三种类型：PPARα、PPARβ和PPARγ。它们是可受配体诱导的核受体，通过结合目标基因启动子区域中指定的核苷酸序列而直接调节基因的活性。PPARγ通过反式激活脂肪细胞特异性基因在终末分化中起决定性作用。最新研究结果表明，在表皮中PPAR和胆固醇代谢路径之间存在干扰。所有的PPAR同种型在未成熟和成熟的皮肤中表达。在胎儿成熟的后期，PPARγ表达显著增加。在出生后，以及在成人皮肤中，PPARγ表达减少。在表皮形成期间，角质形成细胞分化中的PPARβ和PPARα表现出重要作用(Wabli W.，Swiss Med.Wkly.132：83-91，2002)。同样证明，在受伤皮肤的边缘PPARβ和PPARα是增量调节的，并且这些同种型的空白样小鼠伤口愈合受到影响(Michalnik等，J.Cell Biol.154：799-814，2001)。现有技术中对伤口愈合过程中PPARγ的参与也无描述和暗示。
美国专利6,403,656描述了使用PPARγ活化剂来治疗与表皮细胞分化异常有关的皮肤病。此外，国际申请PCT/US99/28101记载了利用如前列腺素J2或D2的PPARγ活化剂来治疗肥胖症和糖尿病。然而，这些公开物没有教导或启示使用PPARγ活化剂或抑制剂来使伤口愈合。
在进一步对本发明进行实践的同时，本发明的发明人发现PPARγ活性对伤口愈合过程是逆向关联的。因此，下文实施方案部分的实施例2对给药曲格列酮即一种PPARγ激动剂抑制伤口收缩进行了示例性说明。另一方面，PPARγ拮抗剂GW9662的给药促进了伤口的收缩。
因而，根据本发明的另一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的能够调节脂肪细胞分化的药剂，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。根据本发明这一方面，所述药剂可以是参与脂肪细胞分化的任何因子如转录因子的激动剂或拮抗剂，所述转录因子包括但不限于属于CCAAT/增强子结合蛋白家族的蛋白质、脂肪细胞决定和分化依赖因子和PPARγ。所述药剂优选为PPARγ拮抗剂，更优选GW9662。
除脂肪细胞分化调节剂之外，其他脂肪细胞调节剂的使用也可以促进伤口愈合的过程。因此，根据本发明的教导，向皮肤伤口给药治疗有效量的如下药剂能够诱导或加速皮肤伤口的愈合过程，所述药剂能：(i)调节脂肪细胞中的脂肪细胞素的表达和/或分泌，(ii)增强脂肪细胞的增殖，(ii)增强脂肪细胞的迁移，(iii)将脂肪细胞吸引至伤口区域。
相关领域的普通技术人员可以方便地按照在本发明上下文中所提供的分析来确定具体的药剂，如脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂，以进行关于任一上述具体药剂是否确实是伤口愈合过程的诱导物或促进剂的测试。
因此，通过向皮肤伤口给药被考虑的脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂，然后评价被治疗伤口的角质形成细胞迁移和/或表皮闭合，可以测量出脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂诱导或加速皮肤伤口愈合过程的能力。
优选通过切割在C57BL小鼠背上得到皮肤伤口，然后以一或多次施用进行治疗，每次施用使用一种或多种浓度的脂肪细胞素。
在造成伤口后的理想时间，优选为约6天，对小鼠处死并对伤口活组织(wound biopsies)进行采样。随后按照本领域已知的方法，优选使用实施例部分描述的步骤对伤口活组织分析角质形成细胞向伤口缝的迁移和/或伤口缝的表皮闭合。
相对于未接受治疗的对照组而言，如果角质形成细胞迁移和/或表皮闭合的几率显著增加，则表明被测试的脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂能够诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
根据本发明的另一方面，将优选为自体脂肪细胞的脂肪细胞植入伤口，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
脂肪细胞可从任一动物来源的脂肪组织中获得，优选来自人类供体，最优选来自自体人类来源。按照公知流程，如外科手术、吸引术、脂肪去除抽吸法、腹壁成形术(penniculectomy)或经活组织切片，可以从皮下或肾周的位置采样脂肪组织，优选皮下的位置。优选使用破坏细胞的物理联系的酶(如胶原酶)或用机械搅拌、声波或超声波能量等从脂肪组织样本中分离脂肪细胞。分离脂肪细胞可以利用本领域已知的适当组织培养技术进行，例如详述在国际申请PCT/US00/30623中的技术。培养的脂肪细胞可以生长至达到接近汇合，随后从生长培养基中轻刮出并植入在伤口上。
也可从培养的前脂肪细胞生成脂肪细胞。在此使用的术语″前脂肪细胞″指能分化成脂肪细胞的任意一种细胞。前脂肪细胞优选为人类脂肪细胞，更优选为分离自病人自己的脂肪或其他组织的自体脂肪细胞。使用公知流程，如外科手术、吸引术、脂肪去除抽吸法、腹壁成形术或经活组织切片，可从皮下或肾周的位置采样脂肪组织。使用例如Rodbell等人描述的方法，可以从样品组织中分离出前脂肪细胞(Meth.Enzymol.31：103-114，1974)。用Hauner等(Journal Clin.Invest.，34：1663-1670，1989)、Digby等(Diabetes 5：138-141，1998)和国际申请PCT/US00/02208中描述的方法和步骤，可以将分离得到的前脂肪细胞在体外培养、扩增并分化为脂肪细胞，可以使用Freshney描述的培养法(Culture of Animal Cells第310-312页，第3版，1994)从培养基中获得分化脂肪细胞，并优选使用如国际申请PCT/US97/0061中描述的移植室将其植入在伤口上。至少1天后，从伤口去除移植室，优选在脂肪细胞移植至少1星期后进行。任选将植入的脂肪细胞暴露于脂肪细胞调节剂下，后者例如非限制性的PPARγ拮抗剂，优选GW9662。
根据本发明的另一方面，将前脂肪细胞植入伤口中诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。采用上述用于脂肪细胞的方法和步骤但省略分化步骤，能使前脂肪细胞在体外分离、培养并扩增。未分化的前脂肪细胞从培养基中收获，用如上文所述脂肪细胞的步骤植入伤口中。任选将植入的前脂肪细胞暴露于脂肪细胞调节剂下，后者例如非限制性的PPARγ拮抗剂，优选GW9662。
脂肪细胞和/或前脂肪细胞可以从培养干细胞中产生。在此使用的短语″干细胞″指未终末分化的未成熟或成熟细胞，其可以非限制性地分裂，分裂得到细胞，这些细胞为干细胞、或者不可逆地分化产生新类型的细胞例如前脂肪细胞或脂肪细胞。
使用本领域公知的方法可以完成干细胞的分离和体外扩增。例如，Van Epps等(Blood Cells 20：411，1994)和Emerson S.G.(Blood87：3082，1996)描述了分离培养的步骤和来自骨髓、周围血液或初生儿脐带血液的人类造血干细胞，及其在培养中的扩增。采用如美国专利5,843,780和Reubinoff等(Nature Biotech.18：399，2000)所述方法，人类胚胎干细胞(hESC)可以从人类胚泡细胞中制备得到，后者由人类体内移植前胚胎或在体外增殖的胚胎获得。采用美国专利5,197,985、5,486,359和6,214,369中所述方法，可以分离和扩增人体间质干细胞(hMSC)。在骨髓、血液、真皮和骨膜中发现的hMSC能分化成为任一特定类型的间质组织，如脂肪组织。
干细胞可以直接在皮肤伤口上给药，在体内分化为脂肪细胞，其中可包括或不包括促进上述分化的联合给药因素。换句话说，干细胞可以离体分化为前脂肪细胞或脂肪细胞，然后将其植入伤口。
采用美国专利6,322,784中所述方法，培养的hMSC可以被诱导进行脂肪形成的分化。因此，通过将这些细胞暴露于糖皮质激素以及能够增量调节cAMP生成的化合物下，或者通过抑制cAMP的降解，例如磷酸二酯酶抑制剂，可以由初级hMSC生成得到脂肪细胞。接着收获从干细胞中生成的脂肪细胞，并用如上所述的步骤植入伤口中，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明可供选择的实施方案是，将伤口细胞转化至表达并分泌脂肪细胞素，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
伤口细胞可以是伤口愈合过程中所涉及的任意细胞类型，如角质形成细胞、脂肪细胞或前脂肪细胞。可以用编码脂肪细胞素的多核苷酸转化细胞，脂肪细胞素例如降脂蛋白、脂连蛋白、抵抗素、瘦蛋白、脂蛋白脂肪酶、血管紧张素原、血管紧张素样物质4、1-丁酰丙三醇、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9和肿瘤坏死因子α。或者，可用编码具有脂肪细胞素活性的多肽的多核苷酸，例如美国专利5,223,425中所述的编码降脂蛋白/补体D活性的多核苷酸转化细胞。
通过本领域任一种已知方法，可以将适当的多核苷酸引入细胞。这类方法可以参见广泛描述在Sambrook等[Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1989，1992)]、Ausubel等[Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)]、Chang等[SomaticGene Therapy，CRC Press，Ann Arbor，MI(1995)]、Vega等[GeneTargeting，CRC Press，Ann Arbor MI(1995)]、Vectors[A Survey ofMolecular Cloning Vectors and Their Uses，Butterworths，Boston MA(1988)]和Gilboa等[Biotechniques 4(6)：504-512(1986)]，并且包括例如稳定的或瞬时转染、脂转染、电穿孔法和重组病毒载体的感染。此外，参见关于涉及中枢神经系统的载体的美国专利4,866,042，以及美国专利5,464,764和5,487,992，关于用正负选择法诱导同源重组。
引入编码脂肪细胞素的多核苷酸进入伤口细胞内的优选方法是利用病毒载体。病毒载体具有若干优势，其中包括在特殊细胞类型中更高效率的转化、靶向、和繁殖。病毒载体还可以为特殊受体或配体修饰，以通过特殊细胞受体改变靶特异性，如癌细胞受体。
逆转录病毒载体代表了一类适合本发明的载体。缺陷逆转录病毒通常用于进入哺乳动物细胞的基因转移[参见综述Miller，A.D.，Blood76：271(1990)。包括脂肪细胞素编码多核苷酸的重组逆转录病毒，可以利用公知的分子技术来构建。为了实现逆转录病毒复制缺陷，可以移除逆转录病毒基因组部分，随后将复制缺陷的逆转录病毒包装成病毒粒子，其中通过使用辅助病毒和使用标准技术，病毒粒子可用于感染靶细胞。制备重组逆转录病毒以及用这种病毒体外或体内感染细胞的流程可见例如Ausubul等[编辑，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates，(1989)]。逆转录病毒已经用于引入各种基因进入许多不同的细胞类型中，包括上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞和骨髓细胞。
其它适合的表达载体可以是腺病毒载体。对腺病毒已经进行了广泛的研究并且其已被常规地用作基因转移载体。腺病毒载体的关键优势包括相对高的分裂和休眠细胞转导效率、对各种上皮组织的天然定向和易产生的高滴定度[Russel，W.C.[J.Gen.Virol.81：57-63(2000)]。腺病毒DNA被转运至核，但不与其整合。因此，采用腺病毒载体的诱变风险被减到最小，而短期表达特别适合于治疗癌细胞，如多药耐药性癌细胞。Seth等记载了用于试验性癌症治疗的腺病毒载体[Adenoviral vectors for cancer gene therapy.于：P.Seth(ed.)Adenoviruses：Basic biology to Gene Therapy，Landes，Austin TX，(1999)第103-120页]。
也可以包括限制表达至特定细胞类型的特征。这种特征包括，例如特异性针对预期细胞类型的启动子和调控元件。病毒载体也可包括编码用于分泌抗体片段至细胞外部的信号的核苷酸序列。分泌信号通常包括疏水氨基酸的短序列(7-20个残基)。本发明中适合的分泌信号在本领域中普遍可得到并为大家所熟知，例如参见von Heijne[J.Mol.Biol.184：99-105(1985)]以及Lej等[J.Bacteriol.169：4379(1987)]。
重组载体可以通过多种方式给药。若使用病毒载体，则可以利用其靶向特异性，从而这种载体不必在肿瘤位置上局部给药。然而，局部给药能提供更快速和更有效的治疗。病毒载体的给药还可以通过例如静脉或皮下注射进入受试者来完成。注射之后，病毒载体可循环至其识别出对感染具有适当靶向特异性的寄主细胞。
根据本发明的脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂本身或者作为药物组合物中的活性成分可被用于治疗。
在此使用的短语″药物组合物″指在此记载的含有一种或多种活性成分和其它化学成分例如生理学上适合的载体和赋形剂的制备物。药物组合物的目的是促进化合物向有机体的给药。
在下文中，短语″生理学可接受的载体″和″可药用载体″可互换使用，指不对有机体引起显著刺激、不影响给药活性成分的生物活性和性质的载体或稀释剂。辅料包括在此短语中。
在此术语″赋形剂″指加入至药物组合物中的惰性物质以更进一步促进活性成分的给药。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
用于药物制剂和给药的方法可参见最新版″Remington′sPharmaceutical Sciences″Mack Publishing Co.，Easton，PA，在此将其引入作为参考。
本发明的药物组合物可通过本领域中公知的方法制备，例如通过常规的混合、溶解、成粒、做出糖衣丸、研细、乳化、装入胶囊、截留和/或冷冻干燥过程。
利用包括赋形剂和辅料在内的一种或多种生理学可接受的载体，可以以常规方式制备得到本发明的药物组合物，所述赋形剂和辅料改善了将活性成分加工成药用制剂。
根据本发明，所述可药用载体适于局部施用，例如但不局限于在下面进一步描述的凝胶、乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分散液、油膏和软膏。固体载体还可以用于延迟活性成分在伤口内的释放。
适用于本发明上下文的药物组合物包括如下组合物，其中包含对实现本发明目的有效量的活性成分。更具体地说，治疗有效量意指对诱导或加速伤口愈合有效的活性成分量。
治疗有效量的确定是在本领域技术人员能力范围之内的，特别是根据在此提供的现有技术的详述、在此公开的测定和下述部分的实施例。
用于本发明方法中的任一制剂，治疗有效量或剂量可以利用上文记载的实验动物，从皮肤的伤口最初估定。此类信息可用于更正确地确定人有效剂量。
在此记载的活性成分的毒性和治疗效能可以通过体外、细胞培养或实验动物中的标准制药步骤确定。从这些体外和细胞培养测定和动物研究获得的资料，可用于配制供人用的剂量范围。剂量可以随使用剂型和使用的给药途径变化而变化。可由医师个人根据病人情况选择精确的组成、给药途径和剂量(参见如Fingl等，1975，″ThePharmacological Basis of Therapeutics″，第1章，第1页)。
可分别将用药量和间隔调节至足以例如诱导伤口愈合的活性成分水平(最小有效浓度，MEC)。MEC应随各种不同制剂变化而变化，但其能从体外数据估计出。为实现MEC所必需的用药量取决于个体特征和给药途径。
根据需治疗伤口的严重程度和响应性，剂量可以单一或分多次给药，疗程持续多天至几周或至达到伤口缩小。
当然，给药组合物的量取决于接受治疗对象、伤口的严重程度、给药方式、处方医师的判断等。
如果需要的话，本发明的组合物可以以包装袋或分配装置的形式储存，如FDA许可的试剂盒，其中包括含有活性成分的一个或多个单位剂型。例如，包装袋可以包括金属或塑料薄膜、形成用于分配局部给药制剂的软管。包装袋或分配装置可以含有给药说明书。包装袋或分配装置也可附有与管理生产的政府机构所规定形式的容器、药品使用或销售有关的注意事项，其中注意事项是人用或兽用组合物形式通过政府机构批准的反映。例如，此类注意事项可以是有关于经美国食品与药物管理局批准的须医师处方才可买的药品的标签或有关于核准产品附件。包括在适当药物载体中配制的本发明制备物的组合物也可被制得、放入适当的容器中、标记用于指示病况的治疗，如上文中更进一步地详述。
可以理解，本发明活性成分优选的给药模式是局部-区域性给药，然而不排除经可接受给药途径的系统给药，如本领域中公知的、使用适当成分的口服、肌肉注射、静脉注射、皮下注射、经过皮肤给药、腹膜给药等。
因而，本发明提供一种用于治疗伤口的新方法和药物组合物，其使用脂肪细胞、能分化为脂肪细胞的细胞、脂肪细胞调节剂和脂肪细胞分泌的分子，来诱导或加速伤口安全和有效地愈合。
对本领域普通技术人员而言，本发明其它的目的、优势和新特征经研究下述非限制性实施例后将是显而易见的。另外，在本发明上文中描述的每一实施方案和方面以及下面权利要求部分所要求的部分，都可在下列实施方案中得到实验支持。
实施例
下面参考下述实施例、结合上述有关说明对本发明进行非限制性的说明。
通常，在这里使用的命名法和本发明的实验室步骤包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。下述文献对上述技术进行了充分解释。例如参见″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″Sambrook等.，(1989)；″Current Protocols in Molecular Biology″1-3卷Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel等.，″Current Protocols in MolecularBiology″，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″A Practical Guide to Molecular Cloning″，John Wiley&Sons，NewYork(1988)；Watson等.，″Recombinant DNA″，Scientific AmericanBooks，New York；Birren等.(eds)″Genome Analysis：A LaboratoryManual Series″，1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork(1998)；在下面的美国专利中陈述了方法论：4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057；″Cell Biology：ALaboratory Handbook″，1-3卷Cellis，J.E.，ed.(1994)；″Culture ofAnimal Cells-A Manual of Basic Technique″，Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，Third Edition；″Current Protocols in Immunology″1-3卷Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites等.(eds)，″Basic and ClinicalImmunology″(第八版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(eds)，″Selected Methods in Cellular Immunology″，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；在专利和科学文献中广泛地描述了可用的免疫测定，例如参见美国专利：3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；″Oligonucleotide Synthesis″Gait，M.J.，ed.(1984)；″Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，eds.(1985)；″Transcription and Translation″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，eds.(1984)；″Animal Cell Culture″Freshney，R.I.，ed.(1986)；″Immobilized Cells and Enzymes″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide to Molecular Cloning″Perbal，B.，(1984)和″Methods in Enzymology″1-317卷，Academic Press；″PCR Protocols：A Guide To Methods and Application″，Academic Press；San Diego，CA(1990)；Marshak等，″Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual″CSHL Press(1996)；所有参考文献在此以全文引入。此文中提供了其它的常用文献。其中所述的步骤是为了方便阅读在此提供出来，且是本领域公知的。其中包括的所有的信息都全部引入作为参考。
实验材料和方法
材料：所有的标准化学试剂来自Sigma-Aldrich，St.Louis，USA。副质包埋媒介(Paraplast Embedding Medium)也来自Sigma，抗角蛋白14和抗角蛋白1多克隆抗体来自于Bacto-Covance(Richmond，CAUSA)。生物素酰化山羊抗家兔抗体和链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(HRP)来自ZYMED实验有限公司(San Francisco，CA USA)。GW9662来自Cayman Chemicals(Ann Arbor Michigan USA)。降脂蛋白(补体因子D)来自Calibiochem(San Diego CA USA)。苏木精来自DAKO公司(Carpinteria CA USA)。曙红来自ICN生物医学有限公司(Aurora Ohaio USA)，entellan来自MERCK(DarmstadtGermany)。
鼠角质形成细胞的分离和培养：按照文献18所述，从新生皮肤分离初级角质形成细胞，角质形成细胞在包含8％的Chelex(Chelex-100，BioRad)已处理过的胎牛血清的Eagle’s极限必需培养基(EMEM)中培养。为了保持一个增殖性的基底细胞表型，最后的Ca2+浓度被调整到0.05mM。实验在平皿接种后5-7天进行。
角质形成细胞迁移分析：初级小鼠角质形成细胞用PPARγ拮抗剂GW9622(μM)或者PPARγ激动剂曲格列酮(μM)处理或不处理。伤口划线分析在处理后24小时进行，代表性视区在伤害后(0天)和48小时后(第2天)立即照相。伤口闭合的平均数用与初期的伤口划线宽度相比下的百分数表示。
伤口愈合分析：通过在C57BL小鼠背部的20mm切口产生伤口，每天用各种物质进行处理，为期6天。小鼠在伤害的六天后处死。伤口活组织取样检查、处理，在形态学和组织化学上对各种伤口愈合参数分析，所述参数也就是伤口收缩、脂肪细胞迁移和分化、表皮的迁移和闭合。
伤口收缩分析：伤口区域在处理前后测量，并且计算伤口区域的减少百分数。
石蜡包埋伤口切片的制备：在4％的多聚甲醛中固定伤口活组织，然后，进行脱水处理，使其乙醇的浓度增加(50-100％)。脱水制品首先浸入石蜡(50％)和二甲苯(50％)的溶液中，然后，再浸入纯的石蜡。石蜡块通过切片机切开，并且将切片装在Super Frost+TM载玻片上。
H&E染色：载入石蜡包埋伤口切片的载玻片在60℃温育60分钟，然后，用甲苯(100％)冲洗载玻片2次，共10分钟，用乙醇(100％)冲洗15分钟一次，用乙醇(100％)冲洗10分钟一次，进行去蜡处理。这些去蜡的载玻片用苏木精(备用溶液)染色10分钟，用水冲洗，再用曙红(0.5％于DDW中)染色5分钟，然后用70％的乙醇溶液洗涤1分钟。此后，载玻片用95％的乙醇溶液冲洗一次，为时5分钟，用100％的乙醇冲洗二次，为时5分钟，用100％的甲苯冲洗二次，为时10分钟，来进行脱水处理，最后用entellan(MERCK Darmstadt Germany)密封。
角蛋白4和角蛋白14染色：载入石蜡包埋伤口切片的载玻片的去蜡过程按照上述H&E染色的方法处理，并且在封闭溶液(5％BSA和5％Tween 20TM的PBS溶液)中温育1小时。然后，用抗角蛋白1抗体或用抗角蛋白14抗体(Babco-Covance)在(1∶1000)封闭溶液(5％BSA和5％Tween 20TM的PBS溶液)中在4℃下过夜温育载玻片。此后，这些载玻片用洗涤缓冲液(5％Tween 20TM的PBS溶液)洗涤5次，紧接着，用悬浮(1∶200)在封闭溶液(5％BSA和5％Tween 20TM的PBS溶液)的生物素酰化山羊抗家兔抗体(ZYMED LaboratoriesInc.)温育1小时。然后，载玻片用洗涤缓冲液洗涤3次，紧接着，用二级生物素酰化链霉抗生物素抗体在封闭溶液(1∶300)中在室温下，温育1小时。此后，这些载玻片用洗涤缓冲液洗涤2次，为时5分钟，用PBS洗涤一次，为时5分钟，用TRIS缓冲溶液(0.05M的PBS溶液)洗涤一次，随后，在DAB试剂(溶解在DDW中的2片剂，金银各一)中温育，用于显色。通过把载玻片浸入水中来终止此反应，紧接着，用曙红(ICN，0.5％的DDW溶液)来复染。
实验结果
实施例1
在伤口愈合过程中脂肪细胞与迁移角质形成细胞的关联
迁移表皮细胞(角质形成细胞)和募集的脂肪细胞在七天的伤口组织上观察(图2A-B)。被观察的募集的脂肪细胞基本上无储藏脂肪(也就是，早期脂肪细胞)。如图1所看到的一样，在约60％的未处理伤口组中，沿着整个伤口缝观察到迁移角质形成细胞，而募集的脂肪细胞也存在于约60％的未处理伤口组中。图1还显示，分别在约90％和80％的胰岛素处理伤口组中观察到迁移角质形成细胞和募集的脂肪细胞。
这些结果显示在伤口愈合的早期阶段，迁移到伤口缝区域的角质形成细胞与脂肪细胞募集到同一区域是密切相关的。因此结果证实，不完全分化为脂肪积累细胞的迁移脂肪细胞与伤口愈合过程有关。
实施例2
PPARγ调节剂对角质形成细胞迁移和伤口收缩的影响
在体外评估抑制或者增强过氧物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)的活性对角质形成细胞迁移的影响。如图3所示，用PPARγ拮抗剂GW9662处理培养的初级小鼠角质形成细胞，促进了角质形成细胞的迁移。另一方面，用PPARγ激动剂曲格列酮处理培养的角质形成细胞，抑制了角质形成细胞的迁移(图8)。
在体内也评估了分别使用PPARγ拮抗剂和激动剂抑制或者增强PPARγ的活性对伤口愈合的影响。相应地，在C57BL小鼠背部造成切口伤口，每天用PBS缓冲液(对照)或者不同的药剂处理6天。小鼠在伤害的6天后处死，之后对伤口进行分析。如图4，5和6中所见，与对照组相比，用GW9662(一种PPARγ拮抗剂)的处理促进了伤口的收缩。另一方面，用曲格列酮(PPARγ激动剂)的类似处理抑制了伤口收缩(图9)。此外，曲格列酮妨害了胰岛素诱导的伤口愈合(图9和10)。
因此上述结果清楚证明，PPARγ活性阻碍了伤口的愈合，PPARγ抑制能有效促进伤口的愈合过程。因此，结果表明如GW9662的PPARγ拮抗剂能用于有效加速伤口的愈合。
实施例3
降脂蛋白对角质形成细胞迁移和伤口收缩的影响
降脂蛋白(补体因子D，由脂肪细胞分泌)对伤口愈合的影响也在体内评估。相应地，在C57BL小鼠的背部造成切口伤口，每天用PBS缓冲液(对照)或者1μM的降脂蛋白处理6天。伤害的6天之后小鼠处死，于是对伤口进行分析。如图4，5和7中所见，降脂蛋白实质上促进了伤口收缩(图4，5和7)。另外，与缓冲液对照组相比(图6)，降脂蛋白把表皮闭合从大约15％增加到大约30％，并且把角质形成细胞迁移从大约30％增加到大约65％。
这些结果证明，如降脂蛋白的脂肪细胞素能有效地诱导或加速伤口的愈合。
应当理解，为清楚起见在不同实施例中描述的本发明某些特征也可以在一个实施例中加以组合。反过来，为简要起见在一个实施例中描述的本发明各特征也可以单独实施或者进行适当的次组合。
尽管本发明描述了各种具体实施方案，但是显然很多替代方案、改进以及变型方式对本领域技术人员而言均是显而易见的。因此，包含本发明的所有替代方案、改进和变型均落入所附权利要求书的内涵和范围之内。在说明书中提及到的所有出版物、专利、专利申请以及以其名称和/或数据库收录号标明的序列，都在此全文引入说明书作为参考，等同于在此明确的单独引入各出版物、专利、专利申请或序列作为参考。此外，本申请中对任何参考文献的引用或标注不应当被理解为承认这些参考文献对本发明而言是可获得的现有技术。
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Claims (9)

1.脂肪细胞素用于制备适合于局部施用以诱导或加速皮肤伤口愈合过程的药物组合物的用途，其中脂肪细胞素是降脂蛋白。
2.权利要求1的用途，其中所述皮肤伤口是由于长期卧床休养引起的褥疮、由外伤引起的伤口或溃疡。
3.权利要求2的用途，其中所述由外伤引起的伤口是割伤、烧伤或外科切口。
4.权利要求1或2或3的用途，其中所述药物组合物选自水溶液、凝胶、乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分散液、油膏和软膏。
5.权利要求4的用途，其中所述药物组合物包括固体载体。
6.含有编码脂肪细胞素的多核苷酸的病毒载体的用途，所述病毒载体用于制备将皮肤伤口的细胞转化至表达和分泌所述脂肪细胞素、从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程的药物组合物，其中所述脂肪细胞素是降脂蛋白。
7.权利要求6的用途，其中所述病毒载体是腺病毒载体。
8.权利要求6的用途，其中所述药物组合物适合于局部给药。
9.权利要求8的用途，其中所述局部给药是皮下给药。
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