ES2618899T3 - Zimógeno de proteína C y procedimientos de utilización del mismo para prevenir las metástasis del cáncer - Google Patents

Abstract

Zimógeno de proteína C en un portador biológicamente aceptable para la utilización en el tratamiento o la inhibición de la metástasis en un paciente de cáncer que lo/la necesita.

Description

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DESCRIPCION

Zimogeno de protefna C y procedimientos de utilizacion del mismo para prevenir las metastasis del cancer.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a los campos de la medicina y la oncologfa. Mas particularmente, la invencion proporciona composiciones y procedimientos utiles para inhibir o prevenir el crecimiento y la metastasis de una diversidad de diferentes tipos de cancer.

Antecedentes de la invencion

La protefna C activada (PCA) es una serina proteasa anticoagulante natural que ejerce como uno de los principales moduladores del sistema de coagulacion mediante el bloqueo de la amplificacion de la cascada de coagulacion mediante la inactivacion de los factores Va y Villa. La ruta de la PCA se inicia mediante la formacion del complejo de trombina, trombomodulina (TM) y receptor de la protefna C endotelial (RPCE), permitiendo la conversion del zimogeno de protefna C dependiente de vitamina K en su forma activada. La importancia de la PCA en la regulacion de la coagulacion sangufnea puede ilustrarse mediante la observacion de que una deficiencia heterocigotica de protefna C se asocia a un riesgo elevado de trombosis venosa y su deficiencia homocigotica provoca purpura fulminante, que es letal a menos que se trate con terapia de sustitucion de protefna C.

Ademas de su actividad anticoagulante, la PCA induce efectos celulares directos que regulan la respuesta inflamatoria mediante sus propiedades de senalizacion celular directa. En efecto, el tratamiento con la APC reduce significativamente la mortalidad en pacientes con sepsis severa. Algunos modelos animales experimentales posteriores utilizando mutantes de PCA con actividad anticoagulante disminuida pero propiedades de senalizacion celular normales han revelado que el efecto protector de la PCA en la inflamacion sistemica es dependiente de su actividad citoprotectora. Se ha conocido mejor la funcion protectora de la PCA en la enfermedad inflamatoria gracias a estudios animales que han demostrado que la PCA protege la barrera endotelial mediante la activacion cruzada de la esfingosina-1-fosfato-receptor-1 (S1P1). Los presentes inventores han demostrado recientemente que ademas de la enfermedad inflamatoria, la senalizacion dependiente de PCA endogena tambien desempena un papel clave en la metastasis experimental. En efecto, la senalizacion inducida por PCA endogena protegio contra la extravasacion de las celulas de cancer in vivo mediante la potenciacion de la barrera endotelial vascular dependiente de cadherina-VE y mediada por la activacion cruzada S1P1. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, la administracion repetida de PCA humana recombinante exogena (PCrha) redujo el numero de metastasis experimentales en ratones. Estos datos sugieren que la administracion de PCA podrfa limitar la progresion del cancer y que podrfa proporcionarse una proteccion mejorada mediante la administracion continua prolongada de PCA. Sin embargo, desde una perspectiva clfnica, la administracion de PCA en pacientes de cancer podrfa no resultar tan sencilla como se espera. Resulta importante que la PCA presente una semivida muy corta, de aproximadamente 15 a 30 minutos y por lo tanto requiere la infusion continua para obtener efectos optimos y la PCA se asocia con complicaciones hemorragicas graves. Ademas, los niveles elevados de PCA conducen a una alteracion de la barrera vascular de una manera dependiente de PAR-1 y, por lo tanto, podrfan resultar en la agravacion de la progresion del cancer. De esta manera, aunque la PCA aparentemente a primera vista es una opcion de tratamiento potencial para limitar la progresion del cancer, podrfa no resultar clfnicamente aplicable en el contexto del cancer.

Sumario de la invencion

Segun la presente invencion, se proporciona una utilizacion para el tratamiento o la prevencion de la metastasis en un paciente de cancer que lo necesita. Un procedimiento ejemplificativo implica la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de unzimogeno de protefna C en un portador biologicamente aceptable, resultando eficaz el zimogeno de protefna C para reducir el numero de focos tumorales metastasicos en dicho paciente. En un aspecto, el zimogeno de protefna C se infusiona en el paciente. El zimogeno de protefna C utilizado en dicho enfoque terapeutico puede modificarse para incrementar la semivida in vivo de la protefna. Entre dichas modificaciones se incluyen de manera no limitativa la fusion genetica con albumina, la pegilacion, la sialacion y las regiones constantes (Fc) de fusion genetica o fragmentos de IgG1.

En una forma de realizacion alternativa, el zimogeno de protefna C se administra en el paciente en un vector VAA que comprende acidos nucleicos codificantes de zimogeno de protefna C, la expresion de los cuales en la celula hospedadora resulta en la produccion de polipeptido zimogeno de protefna C. En una forma de realizacion particularmente preferida, el zimogeno de protefna C es una variante que no se encuentra activada in vivo, por ejemplo no requiere el receptor de senalizacion celular normal, PAR-1. El zimogeno de protefna C resulta eficaz para reducir la metastasis en una diversidad de sitios, incluyendo el pulmon, el hfgado y el cerebro. Claramente otros tipos de cancer con tendencia a metastasis pueden tratarse con el procedimiento dado a conocer en la presente memoria. Entre dichos canceres se incluyen de manera no limitativa, el cancer pancreatico, el cancer de mama, el cancer de colon, el cancer ovarico y el cancer esofagico. La utilizacion tambien puede implicar la administracion de por lo menos un agente quimioterapico.

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En todavfa otro aspecto de la invencion, se da a conocer un vector VAA recombinante que comprende PCA-L38D en un portador farmaceuticamente aceptable.

Descripcion detallada de los dibujos

La figura 1 muestra una representacion esquematica de los vectores vfricos adenoasociados (VAA) codificantes de formas murinas o humanas de protefna C (PC) o de protefna C activada (PCA).

La figura 2 es una serie de graficos que muestran la expresion de formas de PC humanas en ratones en los que se han inyectado vectores VAA PC o PCA. Se muestran las dosis de vector y el numero (n) de ratones en cada grupo.

La figura 3 es un grafico que representa el numero de metastasis pulmonares de celulas de melanoma B16F10 en ratones que expresan formas murinas de PC o PCA y solucion salina.

La figura 4 es un par de graficos que representan la actividad anticoagulante de PC y PCA para tanto protefna humana como murina determinada por el tiempo de tromboplastina activada (TPTa). Este efecto se restringe unicamente a PCA de una manera dependiente de la dosis para ambas especies.

La figura 5 es un par de graficos que representan la perdida de sangre tras el corte de la cola determinada mediante la medicion de la concentracion de hemoglobina a DO 575 nm. El riesgo incrementado de hemorragia correlaciona con niveles elevados de PCA funcional.

La figura 6 es un grafico que representa el recuento de tumores pulmonares B16F10 como funcion de diferentes tratamientos.

La figura 7 es un grafico que representa que el zimogeno de protefna C tambien resulta eficaz para inhibir la metastasis del cancer pulmonar en ausencia de su receptor de senalizacion celular principal.

Descripcion detallada de la invencion

La protefna C activada (PCA) es conocida mejor como un anticoagulante natural que tambien presenta propiedades citoprotectoras. Recientemente se ha demostrado que tanto la PCA endogena como exogena (PCA) pueden limitar las metastasis experimentales. Sin embargo, la PCA presenta una semivida corta (aproximadamente 15 minutos), requiere la administracion intravenosa y se asocia a complicaciones hemorragicas graves. Estas desventajas dificultan la potencial aplicacion clfnica de estos resultados. En contraste con la PCA, el zimogeno PC presenta una semivida mas larga y se asocia a un numero significativamente menor de complicaciones hemorragicas. Los presentes inventores plantearon la hipotesis de que el zimogeno PC tambien podrfa resultar eficaz en el contexto del cancer y que la PCA podrfa ser una opcion de tratamiento alternativo atractiva para la PCA. Por lo tanto, los presentes inventores compararon el efecto de la sobreexpresion continua de pCa y PC con vectores vfricos adenoasociados en un modelo de metastasis experimental. Resultan interesante que la sobreexpresion de PC resulte altamente eficaz en la limitacion de la metastasis experimental, mientras que la sobreexpresion de la PCA no limito la metastasis a niveles bajos (<10 ng/ml), mientras que a niveles superiores (25 a 100 ng/ml) la PCA-WT resulto protectora. Sin embargo, a estas dosis elevadas, se incrementa el riesgo de hemorragia. Una variante de la PCA (PCA-5A) sin propiedades anticoagulantes pero con propiedades de senalizacion normales no limito la metastasis experimental aunque en experimentos adicionales, los presentes inventores demostraron que la PCA- L38D resultaba protectora. Este mutante se describe en Harmon S. et al. (Journal Biological Chemistry 283:3053130539, 2008). Finalmente, el efecto de la sobreexpresion de la PC aparentemente era independiente de receptor 1 activado por proteasa, sugiriendo que el efecto se produce por las propiedades anticoagulantes de la PCA. En conclusion, el zimogeno PC presenta una utilidad en el tratamiento del cancer para limitar la progresion del cancer en pacientes que lo requieren.

Definiciones

El termino "tratar" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier tipo de tratamiento que proporciona un beneficio a un paciente que sufre una enfermedad, incluyendo la mejora del estado del paciente (por ejemplo en uno o mas sfntomas), retrasa la progresion de la enfermedad, etc.

La expresion "cantidad eficaz" se refiere a aquella cantidad de agente terapeutico que resulta en una mejora del estado del paciente.

El termino "administracion" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la administracion de un agente terapeutico en un paciente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "un medio portador farmaceuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, diluyentes, otros vehfculos lfquidos, adyuvantes de dispersion o suspension, principios activos

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en superficie, conservantes, ligantes solidos, lubricantes y similares, segun resulte adecuado a la forma de administracion particular deseada. Remingtons' Pharmaceutical Sciences, decimoquinta edicion, E.W. Martin (Mack Publishing Co., Easton PA, 1975) da a conocer diversos vehfculos o portadores utilizados en la formulacion de composiciones farmaceuticas y tecnicas conocidas para la preparacion de las mismas. Excepto en la medida en que cualquier medio portador convencional resulte incompatible con los compuestos de la invencion, tal como mediante la produccion de cualquier efecto biologico no deseable o que de otro modo interactua de manera perjudicial con cualquier otro componente o componentes de la composicion farmaceutica, su uso se encuentra comprendido dentro del alcance de la invencion.

En las composiciones de combinacion farmaceutica de la invencion, los agentes activos pueden encontrarse presentes en una cantidad de por lo menos aproximadamente 0,1% y no superior a aproximadamente 95% en peso, respecto al peso total de las composiciones, incluyendo el medio portador y el agente o agentes auxiliares. Preferentemente, la proporcion de agente activo varfa entre aproximadamente 1% y aproximadamente 75% en peso de la composicion. Pueden utilizarse medios farmaceuticos portadores solidos o lfquidos organicos o inorganicos para la administracion enterica o parenteral para constituir la composicion. Gelatina, lactosa, almidon, magnesio, estearato, talco, grasas y aceites vegetales y animales, goma, polialquilenglicol u otros excipientes o diluyentes conocidos para medicamentos pueden ser todos adecuados como medios portadores.

Las composiciones indicadas en la presente memoria se formulan preferentemente en forma de unidad de administracion para facilitar la administracion y uniformidad de las dosis. La expresion "forma de administracion unitaria" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una unidad ffsicamente discreta de la composicion para el paciente que debe tratarse. Cada dosis deberfa contener la cantidad de material activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado, sin modificacion o asociado a un medio potador farmaceutico seleccionado. Las composiciones de combinacion de la invencion pueden administrarse oralmente, parenteralmente, mediante inyeccion intramuscular, inyeccion intraperitoneal, infusion intravenosa o similar. La administracion intravenosa resulta particularmente preferida. Las composiciones de la invencion se administran tfpicamente mediante infusiones intravenosas de duracion variable, resultando preferidas las infusiones de entre 1 hora y 24 horas.

Las composiciones pueden administrarse con la frecuencia necesaria para obtener el efecto terapeutico deseado. En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, se administra el zimogeno de protefna C en los pacientes de cancer en forma de una inyeccion intravenosa de bolo.

Los agentes quimioterapicos son compuestos que muestran una actividad anticancerosa y/o resultan perjudiciales para una celula (por ejemplo una toxina). Entre los agentes quimioterapicos adecuados se incluyen de manera no limitativa toxinas (por ejemplo saporina, ricina, abrina, bromuro de etidio, toxina difterica, exotoxina de Pseudomonas y otras listadas anteriormente), agentes alquilantes (por ejemplo mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, ciclofosfamida, isofamida, mecloretamina, melfalan y mostaza uracilo; aziridinas tales como tiotepa; esteres de metanosulfonato, tales como busulfan; nitrosoureas, tales como carmustina, lomustina y estreptozocina; complejos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; alquilantes biorreductores, tales como mitomicina, procarbazina, dacarbazina y altretamina); agentes de rotura de la cadena de ADN (por ejemplo bleomicina); inhibidores de la topoisomerasa II (por ejemplo amsacrina, dactinomicina, daunorrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, doxorrubicina, etoposido y teniposido); agentes de union al surco menor del ADN (por ejemplo plicamidina); antimetabolitos (por ejemplo antagonistas del folato, tales como metotrexato y trimetrexato; antagonistas de pirimidina, tales como fluorouracilo, fluorodesoxiuridina, CB3717, azacitidina, citarabina y floxuridina; antagonistas de purina, tales como mercaptopurina, 6-tioguanina, fludarabina, pentostatina; asparginasa; e inhibidores de ribonucleotido reductasa, tales como hidroxiurea); agentes de interaccion con la tubulina (por ejemplo vincristina, vinblastina y paclitaxel (Taxol)); agentes hormonales (por ejemplo estrogenos, estrogenos conjugados; etinil-estradiol; dietilestilbesterol; clortrianisen; idenestrol; progestinas, tales como caproato de hidroxiprogesterona, medroxiprogesterona y megestrol; y androgenos, tales como testosterona, propionato de testosterona, fluoximesterona y metiltestosterona); corticoesteorides adrenales (por ejemplo prednisona, dexametasona, metilprednisolona y prednisolona); agentes liberadores de hormona luteinizante o antagonistas de hormona liberadora de gonadotropina (por ejemplo acetato de leuprolido y acetato de goserelina) y antfgenos antihormonales (por ejemplo tamoxifeno, agentes antiandrogeno, tales como flutamida; y agentes antiadrenales, tales como mitotano y aminoglutetimida). En una forma de realizacion particular, el agente quimioterapico se selecciona de entre el grupo que consiste en: paclitaxel (Taxol®), cisplatino, docetaxol, carboplatino, vincristina, vinblastina, metotrexato, ciclofosfamida, CPT-11, 5-fluorouracilo (5-FU), gemcitabina, estramustina, carmustina, adriamicina (doxorrubicina), etoposido, trioxido de arsenico, irinotecan y derivados de epotilon.

En referencia a los acidos nucleicos de la invencion, en ocasiones se utiliza la expresion "acido nucleico aislado". Esta expresion, aplicada al ADN, se refiere a una molecula de ADN que se separa de las secuencias que son inmediatamente contiguas a la misma (en los sentidos 5' y 3') en el genoma natural del organismo a partir del que se origina. Por ejemplo, el "acido nucleico aislado" puede comprender una molecula de ADN o ADNc insertada en el vector, tal como un plasmido o vector vfrico, o integrarse en el ADN de un procariota o eucariota.

Con respecto a las moleculas de ARN de la invencion, la expresion "acido nucleico aislado" se refiere principalmente a una molecula de ARN codificada por una molecula de ADN aislada tal como se ha definido anteriormente.

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Alternativamente, la expresion puede referirse a una molecula de ARN que ha sido suficientemente separada de las moleculas de ARN con las que se encontrana asociada en su estado natural (es decir, en celulas o tejidos), de manera que existe en una forma "sustancialmente pura" (la expresion "sustancialmente pura" se define a continuacion).

Con respecto a las protemas, en la presente memoria en ocasiones se utiliza la expresion "protema aislada" o "protema aislada y purificada". Esta expresion se refiere principalmente a una protema producida mediante la expresion de una molecula aislada de acidos nucleicos de la invencion. Alternativamente, dicha expresion puede referirse a una protema que ha sido suficientemente separada de otras protemas con las que se encontrana naturalmente asociada, de manera que exista en forma "sustancialmente pura".

La expresion "region promotora" se refiere a las regiones reguladoras de la transcripcion de un gen que pueden encontrarse en el lado 5' o 3' de la region codificante, o dentro de la region codificante, o dentro de intrones.

El termino "vector" se refiere a una molecula de ADN portador pequena en la que puede insertarse una secuencia de ADN para la introduccion en una celula hospedadora en la que se replicara. Un "vector de expresion" es un vector especializado que contiene una secuencia genica o de acidos nucleicos con las regiones reguladoras necesarias que se requieren para la expresion en una celula hospedadora.

La expresion "ligado funcionalmente" se refiere a que las secuencias reguladoras necesarias para la expresion de una secuencia codificante se introducen en la molecula de ADN en las posiciones apropiadas respecto a la secuencia codificante de manera que afecten a la expresion de la secuencia codificante. Esta misma definicion en ocasiones se aplica a la disposicion de las secuencias codificantes y elementos de control de la transcripcion (por ejemplo promotores, intensificadores y elementos de terminacion) en un vector de expresion. Esta definicion en ocasiones tambien se aplica a la disposicion de las secuencias de acidos nucleicos de una primera y una segunda moleculas de acidos nucleicos en las que se genera una molecula hfbrida de acidos nucleicos.

Las protemas de fusion o protemas quimericas son protemas creadas mediante la union de dos o mas genes que originalmente codificaban protemas separadas. La traduccion de dicho gen de fusion resulta en un unico polipeptido con propiedades funcionales derivadas de cada una de las protemas originales. Las protemas de fusion recombinantes se crean artificialmente mediante tecnologfa de ADN recombinante para la utilizacion en investigacion o terapeuticos biologicos. El zimogeno PC puede fusionarse con varios tipos diferentes de fracciones para incrementar la semivida de la protema in vivo. Entre dichas modificaciones se incluyen, por ejemplo, la fusion genetica con albumina, la pegilacion, la sialacion y la fusion genetica con regiones constantes (Fc) o fragmentos de IgG1. Dichos enfoque se describen en Schulte, Thrombosis Research 124:S6-S8, 2009; Peters et al. (2010) 115:2057-2064 y Mei et al. (2010) 116:270-279.

La expresion "porcentaje identico" se utiliza en la presente memoria en referencia a la comparacion entre secuencias de acidos nucleicos o de aminoacidos. Las secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos con frecuencia se comparan utilizando programas informaticos que alinean secuencias de acidos nucleicos o aminoacidos, definiendo de esta manera las diferentes entre las dos. En el contexto de la presente invencion, se llevan a cabo comparaciones de secuencias de acidos nucleicos utilizando el GCG Wisconsin Package version 9.1., disponible del Genetics Computer Group en Madison, Wisconsin. Por comodidad, los parametros por defecto (penalizacion por creacion de hueco=12, penalizacion por extension de hueco=4) especificados por dicho programa son los utilizados en la presente memoria para comparar las identidades de secuencias. Alternativamente, puede utilizarse el programa Blastn 2.0, proporcionado por el National Center for Biotechnology Information (en Internet en ncbi.nlm.nih.gov/blast/; Altschul, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990) utilizando una alineacion con huecos utilizando los parametros por defecto, con el fin de determinar el nivel de identidad y de similitud entre secuencias de acidos nucleicos y entre secuencias de aminoacidos.

II. Preparacion de polipeptidos y moleculas de acidos nucleicos codificantes de zimogeno de protema C

A. Moleculas de acidos nucleicos

Las moleculas de acidos nucleicos codificantes de moleculas de zimogeno de protema C de la invencion pueden prepararse mediante la utilizacion de metodos de tecnologfa de ADN recombinante. La disponibilidad de informacion de secuencia de nucleotidos permite la preparacion de moleculas aisladas de acidos nucleicos de la invencion mediante una diversidad de medios. Por ejemplo, pueden aislarse secuencias de acidos nucleicos codificantes de un polipeptido zimogeno de protema C a partir de fuentes biologicas apropiadas utilizando protocolos estandares bien conocidos en la tecnica. El n° de acceso de GenBank NM_000312 proporciona la secuencia codificante del zimogeno de protema C. La expresion y purificacion de dichas secuencias se encuentra perfectamente comprendida dentro de los conocimientos del experto en la materia. El zimogeno de protema C variante contiene una mutacion PC(R15Q) que evita la activacion de la molecula. Ver Lu G., Chhum S., Krishnaswamy K. La afinidad de la protema C para el complejo trombina-trombomodulina se determina de manera principal mediante interacciones dependientes del sitio activo (Journal Biological Chemistry 280:15471-15478, 2005).

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Los acidos nucleicos de la presente invencion pueden mantenerse como ADN en cualquier vector de clonacion conveniente. En una forma de realizacion preferida, los clones se mantienen en un plasmido vector de clonacion/expresion, tal como pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), que se propaga en una celula hospedadora de E. coli adecuada. Alternativamente, los acidos nucleicos pueden mantenerse en un vector adecuado para la expresion en celulas de mamffero. En los casos en que la modificacion postraduccional afecta a la funcion de la coagulacion, resulta preferido expresar la molecula en celulas de mamffero.

Entre las moleculas de acidos nucleicos codificantes de zimogeno de protefna C de la invencion se incluyen ADNc, ADN genomico, ARN y fragmentos de los mismos que pueden ser de cadena sencilla o de doble cadena. De esta manera, la presente invencion proporciona oligonucleotidos (cadenas de sentido o antisentido de ADN o ARN) que presentan secuencias que pueden hibridarse con por lo menos una secuencia de una molecula de acidos nucleicos de la presente invencion. Dichos oligonucleotidos resultan utiles como sondas para detectar la expresion de zimogeno de protefna C.

B. Protefnas

Puede prepararse un polipeptido zimogeno de protefna C de la presente invencion de una diversidad de maneras, segun metodos conocidos. La protefna puede purificarse a partir de fuentes apropiadas, por ejemplo celulas o tejidos en cultivo bacterianos o animales transformados que expresan zimogeno de protefna C manipulado mediante purificacion mediante inmunoafinidad.

La disponibilidad de moleculas de acidos nucleicos codificantes de un polipeptido zimogeno de protefna C permite la produccion del mismo utilizando metodos de expresion in vitro conocidos en la tecnica. Por ejemplo, puede clonarse un ADNc o gen en un vector de transcripcion in vitro apropiado, tal como pSP64 o pSP65 para la transcripcion in vitro, seguido de la traduccion sin celulas en un sistema de traduccion sin celulas adecuado, tal como lisados de germen de trigo o de reticulocitos de conejo. Los sistemas de transcripcion y traduccion in vitro se encuentran comercializados, por ejemplo por Promega Biotech, Madison, Wisconsin o BRL, Rockville, Maryland.

Alternativamente, segun una forma de realizacion preferida, pueden producirse mayores cantidades de zimogeno de protefna C mediante la expresion en un sistema de expresion procariotico o eucariotico adecuado. Por ejemplo, parte o la totalidad de una molecula de ADN codificante de zimogeno de protefna C variante por ejemplo puede insertarse en un vector plasmido adaptado para la expresion en una celula bacteriana, tal como E. coli, o una celula de mamffero, tal como celulas CHO o HeLa. Alternativamente, en una forma de realizacion preferida, pueden generarse protefnas de fusion etiquetadas que comprenden zimogeno de protefna C. Dichas protefnas de fusion de zimogeno de protefna C etiquetadas estan codificadas por parte o la totalidad de una molecula de ADN, ligada en el marco de lectura de codones correcto con una secuencia de nucleotidos codificante de una parte o la totalidad de una etiqueta polipeptido deseada que se inserta en un vector plasmido adaptado para la expresion en una celula bacteriana, tal como E. coli o una celula eucariotica, tal como, aunque sin limitacion, celulas de levadura y de mamffero. Algunos vectores tales como los indicados anteriormente comprenden los elementos reguladores necesarios para la expresion del ADN en la celula hospedadora posicionado de manera que permita la expresion del ADN en la celula hospedadora. Entre dichos elementos reguladores requeridos para la expresion se incluyen de manera no limitativa, secuencias de promotor, secuencias de inicio de transcripcion y secuencias de intensificador.

Las protefnas de zimogeno de protefna C, producidas mediante la expresion genica en un sistema procariotico o eucariotico recombinante pueden purificarse segun metodos conocidos en la tecnica. En una forma de realizacion preferida, puede utilizarse un sistema de expresion/secrecion disponible comercialmente, en el que la protefna recombinante se expresa y despues se secreta a partir de la celula hospedadora, para la facil purificacion a partir del medio circundante. En el caso de que no se utilicen vectores de expresion/secrecion, un enfoque alternativo implica purificar la protefna recombinante mediante separacion por afinidad, tal como mediante interaccion inmunitaria con anticuerpos que se unen especfficamente a la protefna recombinante o columnas de nfquel para el aislamiento de protefnas recombinantes etiquetadas con 6 a 8 residuos de histidina en sus extremos N-terminal o C-terminal. Las etiquetas alternativas pueden comprender el epftopo FLAG, GST o el epftopo hemaglutinina. Dichos metodos son utilizados comunmente por el experto en la materia.

Las protefnas zimogeno de protefna C, preparadas mediante los metodos anteriormente indicados, pueden analizarse segun procedimientos estandares. Por ejemplo, dichas protefnas pueden evaluarse para propiedades de coagulacion alteradas segun metodos conocidos.

Tal como se ha expuesto anteriormente, un modo conveniente de producir un polipeptido segun la presente invencion es expresar acidos nucleicos codificantes del mismo, mediante la utilizacion de los acidos nucleicos en un sistema de expresion. Una diversidad de sistemas de expresion de utilidad para los metodos de la presente invencion es conocida por el experto en la materia.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invencion comprende ademas un procedimiento de preparacion de un polipeptido (tal como se da a conocer), incluyendo el procedimiento la expresion a partir de acidos nucleicos codificantes del polipeptido (generalmente acidos nucleicos). Esto puede llevarse a cabo

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convenientemente mediante el cultivo de una celula hospedadora, que contiene dicho vector, bajo unas condiciones apropiadas que provocan o permiten la produccion del polipeptido. Tambien pueden producirse polipeptidos en sistemas in vitro.

III. Utilizaciones de zimogenos de proteina C y acidos nucleicos codificantes de zimogeno de proteina C

Los polipeptidos zimogenos de proteina C y los acidos nucleicos codificantes de variantes de zimogeno de proteina C que presentan actividades alteradas pueden utilizarse segun la presente invencion, por ejemplo como agentes terapeuticos y/o profilacticos (protefnas o acidos nucleicos) para el tratamiento del cancer y/o en estrategias con celulas para la expresion continua de zimogeno de proteina C en pacientes de cancer.

A. Polipeptidos zimogenos de proteina C

En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, pueden administrarse polipeptidos zimogenos de proteina C en un paciente mediante infusion en un portador biologicamente compatible, preferentemente mediante inyeccion intravenosa. Los zimogenos proteina C de la invencion pueden fusionarse opcionalmente con otras fracciones proteicas o qufmicas que confieren estabilidad, encapsulados en liposomas o mezclados con otros fosfolfpidos o micelas para incrementar la estabilidad y/o biodisponibilidad de la molecula. El zimogeno de proteina C puede administrarse solo o en combinacion con otros agentes conocidos para modular el crecimiento y progresion del cancer (por ejemplo agentes quimioterapicos, radiacion, anticuerpos que inhiben o bloquean el crecimiento de las celulas de cancer, etc.). Una composicion apropiada en la que administrar polipeptidos zimogenos de proteina C puede ser determinada por el profesional medico tras considerar una diversidad de variables fisiologicas, entre ellas, aunque de manera no limitativa, el estado del paciente y el estadio del cancer. Son bien conocidas en la tecnica una diversidad de composiciones perfectamente adecuadas para diferentes aplicaciones y vfas de administracion y se mencionan a continuacion en la presente memoria.

La preparacion que contiene el zimogeno de proteina C purificado contiene una matriz fisiologicamente aceptable y preferentemente se formula como preparacion farmaceutica. La preparacion puede formularse utilizando metodos de la tecnica anterior sustancialmente conocidos, puede mezclarse con un tampon que contiene sales, tales como NaCl, CaCl2 y aminoacidos, tales como glicina y/o lisina, y en un intervalo de pH de entre 6 y 8. Hasta que se requiera, la preparacion purificada que contiene el zimogeno de proteina C puede almacenarse en forma de una solucion acabada o en forma liofilizada o ultracongelada. Preferentemente, la preparacion se almacena en forma liofilizada y se disuelve en una solucion visualmente transparente utilizando una solucion de reconstitucion apropiada.

Antes del procesamiento de la proteina purificada para generar una preparacion farmaceutica, la proteina purificada se somete a los controles de calidad convencionales y se prepara en una forma terapeutica de presentacion. En particular, durante la preparacion recombinante, la preparacion purificada se somete a ensayo para la ausencia de acidos nucleicos celulares, asf como acidos nucleicos que se derivan del vector de expresion, preferentemente utilizando un metodo tal como se indica en el documento Ep 0 714 987.

B. Acidos nucleicos codificantes de zimogeno de proteina C

Los acidos nucleicos codificantes de zimogeno de proteina C pueden utilizarse para una diversidad de fines segun la presente invencion. En una forma de realizacion preferida de la invencion, se proporciona un vehfculo de administracion de acidos nucleicos (es decir, un vector de expresion) para modular la metastasis tumoral, en el que el vector de expresion comprende una secuencia de acidos nucleicos codificante de un polipeptido zimogeno de proteina C, o un fragmento funcional del mismo tal como se indica en la presente memoria. La administracion de vectores de expresion codificantes de zimogeno de proteina C en un paciente resulta en la expresion de polipeptido zimogeno de proteina C, que sirve para inhibir el crecimiento metastasico. Segun la presente invencion, una secuencia de acidos nucleicos codificante de zimogeno de proteina C codifica un polipeptido zimogeno de proteina C tal como se indica en la presente memoria cuya expresion reduce las metastasis. En una forma de realizacion preferida, una secuencia de acidos nucleicos de zimogeno de proteina C codifica una variante de zimogeno de proteina C humana que no puede ser activada.

Los vectores de expresion que comprenden secuencias de acidos nucleicos de zimogeno de proteina C pueden administrarse solos o en combinacion con otras moleculas utiles para el tratamiento del cancer. Segun la presente invencion, los vectores de expresion o combinacion de agentes terapeuticos pueden administrarse en el paciente solos o en una composicion farmaceuticamente aceptable o biologicamente aceptable.

En una forma de realizacion preferida de la invencion, el vector de expresion comprende secuencias de acidos nucleicos codificantes de la variante de zimogeno de proteina C es un vector vfrico. Entre los vectores vfricos que pueden utilizarse en la presente invencion se incluyen de manera no limitativa, vectores adenovfricos, virus adenoasociados (VAA) de multiples serotipos (por ejemplo VAA-1 a VAA-12 y otros) y vectores VAA hfbridos, vectores lentivirus y vectores lentivirus pseudotipados [por ejemplo el virus del ebola, el virus de la estomatitis vesicular (VEV) y el virus de la inmunodeficiencia felina (VlF)], los vectores virus del herpes simplex, los vectores del

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virus Vaccinia, los vectores retrovfricos, los vectores lentivfricos, los vectores no vfricos y otros con o sin promotores/intensificadores especfficos de tejido.

En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, se proporcionan unos procedimientos para la administracion de un vector vfrico que comprende secuencias de acidos nucleicos codificantes de un zimogeno de protefna C, o un fragmento funcional de las mismas. Los vectores VAA y los vectores lentivfricos presentan una amplia utilidad en los procedimientos de la presente invencion y preferentemente no incluyen cualesquiera genes vfricos asociados a patogenesis. Mas preferentemente, se incluyen unicamente las partes esenciales del vector, por ejemplo los elementos ITR y LTR, respectivamente. La administracion directa de vectores o la transduccion ex vivo de las celulas humanas y seguida de la infusion en el cuerpo resulta en la expresion de zimogenos de protefna C, ejerciendo de esta manera un efecto terapeutico beneficioso mediante la inhibicion de la metastasis tumoral. Los vectores VAA y lentivfricos recombinantes han encontrado una amplia utilidad en una diversidad de aplicaciones de terapia genica. Su utilidad para dichas aplicaciones se debe en gran medida a la elevada eficiencia de la transferencia genica in vivo que se consigue en una diversidad de contextos organicos.

Pueden utilizarse partfculas de VAA o lentivfricas ventajosamente como vehfculos para la administracion genica eficaz. Dichos viriones presentan varias caracterfsticas deseables para dichas aplicaciones, entre ellas el tropismo para celulas que se dividen y celulas que no se dividen. La experiencia clfnica inicial con estos vectores tambien demostro la falta de toxicidad sostenida y las respuestas inmunitarias eran mfnimas o indetectables. Es conocido que las VAA infectan una amplia diversidad de tipos celulares in vivo e in vitro mediante endocitosis mediada por receptores o mediante transcitosis. Estos sistemas de vector han sido sometidos a ensayo en seres humanos con diana en el epitelio retiniano, hfgado, musculo esqueletico, vfas respiratorias, cerebro, articulaciones y celulas madre hematopoyeticas. Es probable que los vectores no vfricos basados en ADN plasmfdico o minicfrculos tambien resulten ser vectores de transferencia genica adecuados para genes codificantes de zimogeno de protefna C.

Resulta deseable introducir un vector que pueda proporcionar, por ejemplo, multiples copias de un gen deseado y, por lo tanto, unas mayores cantidades del producto de dicho gen. Los vectores VAA y lentivfricos mejorados y los metodos para producirlos se han descrito en detalle en varias referencias, patentes y solicitudes de patente, incluyendo: Wright J.F. (Hum. Gene Ther. 20:698-706, 2009), que es la tecnologfa utilizada para la produccion de vector de grado clfnico en las instalaciones de los presentes inventores, en el Children's Hospital of Philadelphia (CHOP). El vector lentivfrico puede producirse en el CHOP y los demas vectores se encuentran disponibles en el laboratorio central de produccion de vectores lentivfricos, NHLBI Gene Therapy Resource Program (GTRP) - Lentivirus Vector Production Core Laboratory. Para algunas aplicaciones, un constructo de expresion puede comprender ademas elementos reguladores que sirven para controlar la expresion en un tipo celular o tisular particular. Dichos elementos reguladores son conocidos por el experto en la materia y se exponen en profundidad en Sambrook et al. (1989) y en Ausubel et al. (1992). La incorporacion de elementos reguladores especfficos de tejido en los constructos de expresion de la presente invencion proporciona un tropismo tisular por lo menos parcial para la expresion de los zimogenos de protefna C o fragmentos funcionales de los mismos. Por ejemplo, pueden utilizarse secuencias de acidos nucleicos codificantes de zimogeno de protefna C bajo el control de un promotor especffico de tejido o de tipo celular para la expresion en celulas pulmonares o AATh-ApoE y otros para la expresion especffica de hfgado. Notablemente, la expresion especffica de hfgado deberfa resultar adecuada para el tratamiento de una diversidad de canceres de diferentes tipos celulares. Los promotores especfficos hematopoyeticos en vectores lentivfricos tambien pueden utilizarse ventajosamente en los procedimientos de la presente invencion.

Procedimientos ejemplificativos para producir vectores VAA

Se ha producido VAA para la expresion genica recombinante en la lfnea celular renal embrionaria humana 293 y recientemente ha sido revisada exhaustivamente por el director del Clinical Vector Core del CHOP, el Dr. J.F. Wright (Hum. Gene Ther. 20:698-706, 2009). Brevemente, los vectores VAA se construyen a partir del VAA de tipo salvaje, un virus de ADN de cadena sencilla que es no patogeno. El virus parental es no patogeno, los vectores presentan una amplia gama de hospedadores y pueden infectar celulas tanto que se dividen como que no se dividen. El vector se construye a partir del virus eliminando los genes rep y cap y sustituyendolos por el transgen de interes bajo el control de un promotor especffico de tejido o de celula. Para la preparacion de VAA recombinante, el lfmite superior de tamano de la secuencia que puede insertarse entre las dos ITR es de ~5,0 kb. Los plasmidos que expresan FIX en la presente revision bajo el control del promotor/intensificador apropiado y un segundo plasmido que proporciona las funciones de adenovirus ayudante conjuntamente con un tercer plasmido que contiene los genes rep y cap de VAA-2 se utilizaron para producir vectores VAA-2, mientras que se utilizo un plasmido que contenfa los genes cap de VAA-1, VAA-6 o VAA-8 y el gen rep de VAA-2 y las iTr para producir los vectores de serotipo alternativo respectivos (Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11854-11859, 2002; Xiao et al., J. Virol. 73:3994-4003, 1999; Arruda et al., Blood 103:85-92, 2004). En la presente invencion, la region codificante para el zimogeno de protefna C o variantes funcionales del mismo se utilizarfan en lugar de los acidos nucleicos codificantes de FIX. Los vectores VAA se purificaron mediante centrifugacion repetida en gradiente de densidad de CsCl y se determino el valor de los vectores purificados mediante hibridacion de transferencia por puntos cuantitativa. Los vectores utilizados para los experimentos en perros y ratones presentados en la presente memoria fueron preparados por el Vector Core del The Children's Hospital of Philadelphia.

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A partir de lo expuesto anteriormente, puede apreciarse que los polipeptidos zimogenos de protefna C y los vectores de acidos nucleicos que expresan polipeptido zimogeno de protefna C pueden utilizarse en el tratamiento y la prevencion del cancer.

C. Composiciones farmaceuticas

Los vectores de expresion de la presente invencion pueden incorporarse en composiciones farmaceuticas que pueden administrarse a un sujeto, permitiendo la produccion de una protefna biologicamente activa (por ejemplo un polipeptido zimogeno de protefna C o fragmento funcional o derivado del mismo) o mediante induccion de la expresion continua del transgen de zimogeno de protefna C in vivo mediante terapias genicas o celulares o mediante modificacion ex vivo de las celulas del paciente o del donante. En una forma de realizacion particular de la presente invencion, las composiciones farmaceuticas que comprenden suficiente material genetico para permitir a un receptor producir una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido zimogeno de protefna C pueden inhibir la progresion tumoral metastasica en el sujeto. Alternativamente, tal como se ha expuesto anteriormente, una cantidad eficaz del polipeptido zimogeno de protefna C variante puede infusionarse directamente en un paciente que lo necesita. Las composiciones pueden administrarse solas o en combinacion con por lo menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, que puede administrarse en cualquier portador farmaceutico biocompatible esteril, incluyendo, aunque de manera no limitativa, solucion salina, solucion salina tamponada, dextrosa y agua. Las composiciones pueden administrarse en el paciente solas o en combinacion con otros agentes (por ejemplo cofactores) que influyen sobre la progresion del cancer.

Las formulaciones farmaceuticas adecuadas para la administracion parenteral pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiologicamente compatibles, tales como solucion de Hanks, solucion de Ringer o solucion salina tamponada fisiologicamente. Las suspensiones para inyeccion acuosas pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspension, tal como carboximetilcelulosa sodica, sorbitol o dextrano. Ademas, pueden prepararse suspensiones de los compuestos activos en forma de suspensiones para inyeccion aceitosas adecuadas. Entre los solventes o vehfculos lipofilos adecuados se incluyen aceites grasos, tales como el aceite de sesamo o esteres de acido graso sinteticos, tales como oleato de etilo o trigliceridos, o liposomas. Opcionalmente, la suspension tambien puede contener estabilizadores adecuados o agentes que incrementen la solubilidad de los compuestos, permitiendo la preparacion de soluciones altamente concentradas.

La composicion farmaceutica pueden proporcionarse en forma de una sal y puede formarse con muchos acidos, incluyendo, aunque de manera no limitativa, los acidos clorhfdrico, sulfurico, acetico, lactico, tartarico, malico, succfnico, etc. Las sales tienden a ser mas solubles en solventes acuosos u otros solventes protonicos que las formas de base libre correspondientes. En otros casos, la preparacion preferida puede ser unos polvos liofilizados que pueden contener cualquier o la totalidad de los siguientes: histidina 1-50 mM, sacarosa al 0,1%-2% y manitol al 2%-7%, en un intervalo de pH de entre 4,5 y 5,5, que se combina con tampon antes de la utilizacion.

Tras la preparacion de las composiciones farmaceuticas, pueden introducirse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento. Para la administracion de vectores codificantes o polipeptidos de zimogeno de protefna C, dicho etiquetado incluirfa la cantidad, la frecuencia y el metodo de administracion.

D. Administracion

Los polipeptidos zimogeno de protefna C variantes, solos o en combinacion con otros agentes, pueden infusionarse directamente en un paciente en un portador biologico apropiado tal como se ha mencionado anteriormente en la presente memoria. Los vectores de expresion de la presente invencion que comprenden secuencias de acidos nucleicos codificantes de zimogeno de protefna C, o fragmentos funcionales de los mismos, pueden administrarse en un paciente mediante una diversidad de medios (ver a continuacion) para conseguir y mantener un nivel profilactica y/o terapeuticamente eficaz del polipeptido zimogeno de protefna C. El experto en la materia podra determinar facilmente protocolos especfficos para utilizar los vectores de expresion codificantes de zimogeno de protefna C de la presente invencion para el tratamiento terapeutico de un paciente particular. Los protocolos para la generacion de vectores adenovfricos y la administracion en pacientes han sido descritos en las patentes US n° 5.998.205, n° 6.228.646, n° 6.093.699, n° 6.100.242 y la solicitud de patente internacional n° WO 94/17810 y n° WO 94/23744, que se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad.

Los vectores adenovfricos codificantes de zimogeno de protefna C de la presente invencion pueden administrarse en el paciente mediante cualquier medio conocido. La administracion directa de las composiciones farmaceuticas in vivo pueden llevarse a cabo generalmente mediante inyeccion utilizando una jeringa convencional, aunque se encuentran comprendidos otros metodos de administracion, tales como la administracion incrementada mediante conveccion (ver, por ejemplo, la patente US n° 5.720.720). A este respecto, las composiciones pueden administrarse por via subcutanea, epidermica, intradermica, intratecal, intraorbital, intramucosal, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, oral, intrahepatica o intramuscular. Entre otros modos de administracion se incluyen la administracion oral y pulmonar, los supositorios y las aplicaciones transdermicas. Un clfnico especializado en el tratamiento de pacientes con cancer puede determinar la via optima para la administracion de los vectores adenovfricos que comprenden secuencias de acidos nucleicos de zimogeno de protefna C basandose en varios criterios, entre ellos,

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aunque de manera no limitativa: el estado del paciente y el estadio del tumor.

La presente invencion comprende ademas unos vectores VAA que comprenden una secuencia de acidos nucleicos codificante de un polipeptido zimogeno de protefna C.

Se proporcionan ademas unos vectores lentivirus o lentivirus pseudotipados que comprenden una secuencia de acidos nucleicos codificante de un polipeptido zimogeno de protefna C.

Tambien se encuentran comprendidos unos plasmidos desnudos o vectores de expresion que comprenden una secuencia de acidos nucleicos codificante de un polipeptido zimogeno de protefna C.

Se proporcionan los metodos y materiales siguientes para facilitar la puesta en practica del ejemplo I.

Celulas y cultivo celular

Se obtuvieron celulas de melanoma B16F10 murinas de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las celulas se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F-12, Invitrogen, Carlsbad, USA) complementado con suero de feto bovino al 10% (HyClone, Logan), solucion de antibiotico antimicotico al 1% (Invitrogen, Carlsbad, USA) y L-glutamina a 37°C. Se prepararon suspensiones de celulas individuales a partir de monocapas tratadas con EDTA 2 mM que se lavaron y se diluyeron en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) antes del recuento y la inoculacion. Las celulas se lavaron sobre hielo hasta la inyeccion.

Animales

Se mantuvieron unos ratones C57Bl/6 de tipo salvaje de diez semanas de edad (Charles River, Wilmington, USA) y ratones deficientes PAR-l (proporcionados por Patricia Andrade-Gordon, Johnson & Johnson, Langhorne, USA) en las instalaciones de cuidado animal del Children's Hospital of Philadelphia, Pennsylvania, Estados Unidos de America, siguiendo directrices institucionales. Todos los ratones eran macho, solo los ratones deficientes PAR-1 eran hembra. Los procedimientos en los animales se llevaron a cabo cumpliendo los Institutional Standards for Humane Care and Use of Laboratory Animals. El Institutional Animal Care and Use Committee autorizo todos los experimentos.

Produccion y administracion de vectores vfricos adenoasociados (VAA)

La preparacion de vector se llevo a cabo mediante transfeccion transitoria libre de virus ayudante de celulas HEK- 293 mediante un sistema de triple transfeccion; el plasmido de expresion de protefna C era un constructo de ~4,5 pb que contenfa un promotor especffico de hfgado compuesto del promotor a1-antitripsina humana (AATh), el intensificador ApoE y la region de control hepatico, acoplado con el ADNc de la protefna C murina despues de una secuencia de intron de gen B-globina sintetico. Se purifico un segundo plasmido que proporcionaba las funciones de adenovirus ayudante y un tercer plasmido que contenfa los vectores VAA VAA-2 rep y VAA-8 cap mediante hibridacion cuantitativa de transferencia de puntos. La purificacion se realizo mediante centrifugacion en gradiente de densidad. En los ratones se inyectaron, antes de la inyeccion de celulas de cancer en la vena de la cola, vectores VAA8 a dosis comprendidas entre 1x1012 y 1x1013 genomas de vector/kg. Los ratones hembra se indujeron con 2x1013, ya que respondfan menos a la inyeccion de vector. En los ratones se inyecto solucion salina (sorbitol al 5%) o formas murinas de PC(A) tales como: zimogeno PC (AATh-PC), PCA (mediante la insercion de una doble secuencia RKR para un enzima intracelular de corte proteasa, PACE/furina, AATh-PCA) o mutante PCA-5A (RR229/230AA y KKK191-193AAA) con actividad anticoagulante mfnimamente retenida y propiedades citoprotectoras normales (AATh-mPCA-5A). Se introdujeron estas mutaciones con el kit de mutagenesis dirigida a sitio QuickChange™ (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando cebadores oligonucleotidos mutantes constituidos de 10 a 16 nucleotidos correspondientes en cada lado del codon mutante. Todos los fragmentos de ADNc que contenfan mutaciones se secuenciaron antes de la construccion del vector.

Muestreo de sangre, ELISA de PCA murina y ensayo de actividad de protefna C

Se determinaron los niveles de actividad de PCA plasmatica o PC mediante recoleccion de sangre a traves de sangrado de la cola o puncion de la vena cava (en el momento del sacrificio) en citrato 1:10 o citrato complementado con benzamidina 10 nM. Se determinaron los niveles de PCA murina utilizado anticuerpos proporcionados por el Dr.

C.T. Esmon (Howard Hughes Medical Institute, Oklahoma). Brevemente, las placas se recubrieron durante la noche a 4°C con el anticuerpo monoclonal AMGDPC 1587 a una concentracion de 5 pg/ml en tampon de recubrimiento (Tris 0,02 M, NaCl 0,1 M, pH 7,5). Posteriormente, las placas se bloquearon con tampon de bloqueo (Tris 0,02 M, NaCl 0,1 M, albumina de suero bovino al 1%, pH 7,5). Se cargaron muestras de plasma murino y diluciones estandares de PCA murino (0,3 a 150 ng/ml) en la placa y se incubaron a temperatura ambiente en un agitador basculante de 300 rpm durante 2 h. Las placas se lavaron con tampon de lavado (Tris 0,02 M, NaCl 0,1 M, Tween al 0,05%, pH 7,5). Se anadio espectrozima PCa (American Diagnostica, Stamford, USA) (1 mM) diluido en tampon de recubrimiento y se incubo a 37°C durante 24 h. Se midio la absorbancia a 405 nm y se obtuvieron los niveles de

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PCA a partir de la curva estandar. Se midio la actividad de protefna C utilizando el ensayo de PC Actichrome (American Diagnostica, Stamford, USA). Brevemente, se incubaron 50 pl de plasma murino o diluciones estandares de PC murina en la placa de microensayo a 37°C durante 5 minutos. A continuacion, se anadieron 75 pl de activador (PROTACtm) (o solucion salina como control negativo) y las muestras se incubaron a 37°C durante 20 minutos. Se anadio espectrozima aPC (75 pl) y la placa se incubo a 37°C durante 15 minutos. Tras la adicion posterior de 50 pl de acido acetico glacial, se midio la absorbancia a 405 nm y se obtuvieron los niveles de PC a partir de la curva estandar.

Modelo experimental de metastasis pulmonar

Se inyectaron celulas de cancer (2,5x105) suspendidas en 200 pl de PBS en la vena lateral de la cola. Veintiun dfas despues de la inyeccion de celulas de cancer, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se sacrificaron mediante puncion de la vena cava. Los pulmones se fijaron directamente con paraformaldehfdo al 4% administrados a traves de la traquea y se extirparon despues. Los pulmones se mantuvieron en solucion de formaldehfdo hasta la sustitucion del mismo tras 24 h por alcohol al 70%. Los focos tumorales sobre la superficie de los pulmones se contaron macroscopicamente de manera ciega con respecto a la intervencion. Los experimentos se llevaron a cabo con 8 a 10 ratones en cada grupo.

Analisis estadfstico

Se llevo a cabo el analisis estadfstico en GraphPad Prism version 4.03. Los datos se expresan como medias +/- SEM. Se evaluaron las diferencias entre grupos utilizando la prueba de Mann-Whitney y la de Spearman para las correlaciones. Se considero que la diferencia era estadfsticamente significativa cuando el valor de p era <0,05.

Se proporciona el ejemplo siguiente con el fin de ilustrar determinadas formas de realizacion de la invencion. No se pretende que sea limitativo de la invencion en modo alguno.

Ejemplo 1

La administracion de zimogeno de protefna C inhibe la progresion metastasica del cancer de pulmon

La sobreexpresion de la PCA no limita la metastasis experimental, mientras que la sobreexpresion de zimogeno PC resulta altamente eficiente en la reduccion de los focos tumorales pulmonares a dosis de vector VAA iguales. Con el fin de determinar el efecto de la sobreexpresion continua de PC(A) sobre la extravasacion de las celulas de cancer en un modelo murino de metastasis experimental, en ratones CS7Bl/6 se inyecto solucion salina o vectores VAA para el zimogeno PC o PCA a una dosis de vector igual de 1x1013 vg/kg. La fig. 1 muestra un diagrama esquematico de los constructos utilizados para expresar protefna C activada y zimogeno PC. La figura 2 muestra los niveles de PCA y los niveles de actividad de PC en ratones sobreexpresantes de PCA y de PC, antes de la inoculacion de celulas de cancer. La inyeccion de VAA-PC indujo niveles de actividad de PC en un factor de aproximadamente 3-4 en comparacion con los ratones que recibieron inyecciones de solucion salina, mientras que VAA-PCA indujo niveles de PCA aproximadamente 10 veces mayores, conduciendo a un nivel plasmatico medio de aproximadamente 40 ng/ml. En los ratones tratados con VAA-PCA, la actividad de PC tambien se incremento moderada, aunque no significativamente, en comparacion con los animales que recibieron inyecciones de solucion salina.

La PCA presenta actividades anticoagulante y antiinflamatoria. Actualmente la PCA recombinante es el foco de amplios estudios para el tratamiento de la sepsis y determinados trastornos inflamatorios. Actualmente el farmaco solo ha sido autorizado por la FDA para el tratamiento de la sepsis severa. Sin embargo, tal como se ha indicado anteriormente, el riesgo de sangrado se incrementa significativamente con dosis crecientes de PCA, por lo que la seguridad de este enfoque resulta cuestionable. Debido a que el efecto protector de la PCA en la sepsis es independiente de la coagulacion, se han creado mutantes que muestran una actividad anticoagulante reducida pero conservan propiedades antiinflamatorias.

Aunque los resultados de los presentes inventores demuestran que los ratones que expresan PCA administrada mediante un vector VAA mostraron reducciones de los sucesos de cancer pulmonar metastasico, los datos presentados en la figura 3 muestran que la PC resulto significativamente mas eficaz para este fin. Una serie de retos hemostaticos demuestran que el riesgo de hemorragia con la PCA se incrementa de manera dependiente de la dosis. Ver las figuras 4 y 5. Ademas, el control de la metastasis tumoral con la PCA solo se consiguio utilizando niveles de dosis elevados. Los presentes inventores tambien observaron que la utilizacion de VAA-PCA-5A no mostro ningun efecto beneficioso y probablemente es peor que el grupo coinyeccion de solucion salina. Estos datos sugieren que la PCA requiere propiedades tanto de anticoagulante como de citoproteccion para inhibir la metastasis tumoral. En experimentos adicionales los inventores demuestran que PCA-L38D, que no puede ser activada, tambien es protectora. Ver las figuras 6 y 7. Este mutante ha sido descrito en Harmon S. et al. (Journal Biological Chemistry 283:30531-30539, 2008). Tambien es significativa la observacion de que el riesgo de hemorragia en ratones que expresan PC no diferfa respecto a la de ratones con inyeccion de solucion salina. Ver la figura 5. De esta manera, la PC muestra una eficacia y perfil de seguridad superiores.

Muchos canceres (por ejemplo el melanoma, de mama, de pulmon y pancreatico) muestran una morbilidad y mortalidad incrementadas debido a las elevadas tasas de metastasis. Los presentes inventores compararon los efectos del zimogeno PC sobre la metastasis experimental con el fin de discriminar entre los efectos anticoagulante y de senalizacion celular de la PC(A). Con este fin, los ratones que sobreexpresaban protefna C (activada) o 5 mutantes de senalizacion de PCA se sometieron a un modelo de metastasis experimental establecido de inoculacion intravenosa de celulas de cancer de melanoma. Los presentes inventores optaron por la sobreexpresion continua de PC(A) por vectores vfricos adenoasociados (VAA) ya que este enfoque evita los problemas de las protefnas recombinantes en estudios a largo plazo, es decir, semivida corta, multiples inyecciones, niveles plasmaticos fluctuantes y costes elevados.

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Resulta interesante que el presente estudio demuestra que la sobreexpresion de zimogeno PC limita la extravasacion de las celulas de cancer eficientemente con independencia del nivel plasmatico actual de PC. En contraste, la sobreexpresion de la PCA limita la extravasacion de celulas de cancer de una manera dependiente de la dosis y resulta eficaz solo a niveles moderadamente elevados, de aproximadamente 25 ng/ml. Ademas, el

15 mutante de senalizacion de PCA (PCASA, que no presenta actividad anticoagulante sino propiedades citoprotectoras normales) no limito la metastasis experimental a niveles plasmaticos moderados (15 ng/ml) o elevados (30 ng/ml). Concordando con estos ultimos resultados, el efecto protector del zimogeno PC aparentemente es independiente de la senalizacion mediada por PAR-1.

20 Claramente la administracion de zimogeno de protefna C proporciona una herramienta eficaz, utilizada sola o en combinacion con otros agentes quimioterapicos, para el tratamiento y la inhibicion de la progresion de las neoplasias malignas metastasicas.

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   REIVINDICACIONES

   1. Zimogeno de protefna C en un portador biologicamente aceptable para la utilizacion en el tratamiento o la inhibicion de la metastasis en un paciente de cancer que lo/la necesita.
2. 2. Zimogeno de protefna C para la utilizacion segun la reivindicacion 1, en el que dicho zimogeno de protefna C es infundido en un paciente.
3. 3. Zimogeno de protefna C para la utilizacion segun la reivindicacion 1, en el que dicho zimogeno de protefna C se administra a dicho paciente en un vector VAA que comprende un acido nucleico que codifica zimogeno de protefna C.
4. 4. Zimogeno de protefna C para la utilizacion segun la reivindicacion 1, en el que dicho zimogeno de protefna C es una variante que no esta activada in vivo y dicho cancer se selecciona de entre el grupo que consiste en cancer de pulmon, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer de colon y cancer esofagico.
5. 5. Zimogeno de protefna C para la utilizacion segun la reivindicacion 1, que comprende ademas administrar por lo menos un agente quimioterapico.
6. 6. Zimogeno de protefna C para la utilizacion segun la reivindicacion 4, en el que dicha variante es PCA-L38D.
7. 7. Zimogeno de protefna C para la utilizacion segun la reivindicacion 6, en el que dicha variante se administra por via intravenosa por lo menos una vez al dfa a una dosis entre aproximadamente 10 y 500 pg/kg.
8. 8. Zimogeno de protefna C para la utilizacion segun la reivindicacion 7, en el que dicha variante se administra por via intravenosa por lo menos una vez al dfa a una dosis entre aproximadamente 10 y 250 pg/kg.
9. 9. Zimogeno de protefna C para la utilizacion segun la reivindicacion 6, en el que dicha variante se encuentra encapsulada en un liposoma o mezclada con fosfolfpidos o micelas.
10. 10. Zimogeno de protefna C para la utilizacion segun la reivindicacion 2, en el que dicha protefna C zimogena es parte de una protefna de fusion.
11. 11. Zimogeno de protefna C para la utilizacion segun la reivindicacion 10, en el que dicha protefna C zimogena se fusiona con un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste en albumina, un fragmento Fc y un fragmento de IgG.
12. 12. Zimogeno de protefna C para la utilizacion segun la reivindicacion 1, en el que dicha protefna C zimogena se encuentra pegilada.
13. 13. Zimogeno de protefna C para la utilizacion segun la reivindicacion 1, en el que dicha protefna C zimogena se encuentra sialilada.
14. 14. Vector VAA que comprende un acido nucleico que codifica un zimogeno de protefna C para la utilizacion en el tratamiento o la inhibicion de la metastasis en un paciente de cancer que lo/la necesita.
15. 15. Vector VAA recombinante que comprende un acido nucleico que codifica PCA-L38D.
16. 16. Celula que comprende el vector VAA segun la reivindicacion 15.