ES2837475T3 - Composiciones y métodos de factor VIII mutante - Google Patents

Abstract

Un mutante polipeptídico aislado del factor VIII humano que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en I86V, I86L, I86M, Y105F, Y105W, A108S, A108G, A108T, A108P, D115E, D115N, D115H, D115Q, D115R, D115K, Q117H, Q117N, Q117E, Q117D, Q117R, Q117K, F129L, F129V, F129I, F129M, F129P, F129T, F129K, G132K, G132E, G132D, G132R, G132T, G132M, G132N, G132S, G132W, H134Q, H134G, H134Y, H134N, H134E, H134D, H134R, H134K, M147T, M147A, M147G, M147S, M147P, L152P, L152S, L152G y L152T.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos de factor VIII mutante

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. Serie N° 61/838,867, presentada el 24 de junio de 2013.

Campo

La presente invención se refiere a mutantes de factor VIII humano recombinante que exhiben niveles de expresión más altos que el factor VIII humano de tipo salvaje correspondiente. La presente invención también se refiere a métodos para preparar y usar los mutantes del factor VIII humano recombinante.

Derechos de licencia del gobierno

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno con el número de concesión HL084381 otorgado por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

Antecedentes

La hemofilia A, el más común de los trastornos hemorrágicos hereditarios graves, es el resultado de una deficiencia o defecto en la proteína plasmática factor VIII. En pacientes con hemofilia A, la sangre no se coagula correctamente, lo que provoca un sangrado excesivo cuando el hemofílico se lesiona. El tratamiento consiste en una terapia de reemplazo con preparaciones de plasma (purificado) o la proteína recombinante.

La coagulación de la sangre comienza cuando las plaquetas se adhieren a la pared cortada de un vaso sanguíneo lesionado en el sitio de la lesión. Posteriormente, en una cascada de reacciones reguladas enzimáticamente, las moléculas de fibrinógeno solubles son convertidas por la enzima trombina en cadenas insolubles de fibrina que mantienen unidas las plaquetas en un trombo. En cada paso de la cascada, un precursor de proteína se convierte en una proteasa que escinde el siguiente precursor de proteína de la serie. Se requieren cofactores en la mayoría de los pasos.

El factor VIII circula como un precursor heterodímero dependiente de iones metálicos inactivo, no covalente en la sangre, unido de forma estrecha y no covalente al factor von Willebrand. Esta forma procofactor de la proteína contiene una cadena pesada (HC) compuesta por dominios A1 (a1 )A2(a2)B y una cadena ligera (LC) compuesta por dominios (a3)A3C1C2, con la minúscula a representando dominios cortos (~30-40 residuos) segmentos ricos en residuos ácidos. El factor VIII se activa proteolíticamente mediante escisiones proteolíticas en las uniones A1A2, A2B y A3A3 catalizadas por la trombina o el factor Xa, que sirve para disociarlo del factor von Willebrand y activar su función procoagulante en la cascada. En su forma activa, el factor proteico VIIIa es un cofactor que aumenta la eficacia catalítica del factor de serina proteasa IXa en la conversión dependiente de la membrana del factor de zimógeno X en la serina proteasa, factor Xa, en varios órdenes de magnitud.

Se ha propuesto la terapia génica como modalidad de tratamiento para complementar las deficiencias en los factores de coagulación en hemofílicos y ha habido intentos de diseñar construcciones de FVIII que sean adecuadas para el tratamiento de humanos. Por ejemplo, Connelly, et al. informaron que el tratamiento de ratones deficientes en FVIII con vectores adenovirales que codifican para FVIII humano dio como resultado la expresión de FVIII humano biológicamente activo (Connelly, et al., Blood, Vol. 91, N° 9 (1998), págs. 3273-3281). Sarkar et al. informaron que el uso del serotipo AAV8 en combinación con FVIII corrigió la actividad plasmática del FVIII en modelos de ratón (Sarkar et al., Blood, Vol. 103, N° 4 (2004), pp. 1253-1260).

Sin embargo, como en muchas áreas de la terapia génica, la teoría es mucho más sencilla que la implementación exitosa y efectiva. Las dificultades en la implementación de técnicas de terapia génica incluyen problemas encontrados en el uso de virus como vectores génicos y niveles de expresión insuficientes de FVIII. Por ejemplo, el FVIII humano secreta de manera muy ineficiente y el rendimiento es logarítmico más bajo en comparación con proteínas similares como el factor V. Además, aunque los virus son eficaces como vectores genéticos porque pueden usarse para transducir células que conducen a la expresión de proteínas in vivo, las proteínas que recubren la partícula del virus pueden activar el sistema inmunológico del cuerpo.

Por tanto, en vista de lo anterior, existe la necesidad de enfoques que puedan expresar eficazmente la proteína FVIII objetivo en cantidad suficiente para reducir la dosis requerida de vector viral a niveles tolerables.

Características de la invención

La presente invención proporciona proteínas de factor VIII modificado (FVIII), ácidos nucleicos que codifican FVIII y vectores de expresión de FVIII, así como composiciones para su uso en el tratamiento de deficiencias de FVIII, como la hemofilia A.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un mutante de polipéptido de factor VIII humano aislado que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en I86V, I86L, I86M, Y105f , Y105W, A108S, A108G, A108T, A108P, D115E, D115N, D115H, D115Q, D115R, D115K, Q117H, Q117N, Q117E, Q117D, Q117R, Q117K, F129L, F129V, F129I, F129M, F129P, F129T, F129K, G132K, G132E, G132D, G132R, G132T, G132M, G132N, G132S, G132W, H134Q, H134G, H134Y, H134N, H134E, H134D, H134R, H134K, M147T, M147A, M147G, M147S, M147P, L152P, L152S, L152G y L152T.

También se analiza en el presente documento un factor VIII humano mutante que tiene mayor expresión o secreción en comparación con el factor VIII de tipo salvaje.

En otra realización, el factor VIII humano mutante recombinante incluye una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en I86V, Y105F, A108S, D115E, Q117H, F129L, G132K, H134Q, M147T, L152P y combinaciones de los mismos.

En una realización, el factor VIII humano mutante recombinante incluye sustituciones de aminoácidos en cada uno de los aminoácidos I86, Y105, A108, D115, Q117, F129, G132, H134, M147 y L152.

En otra realización, el factor VIII humano mutante recombinante incluye las sustituciones de aminoácidos I86V, Y105F, A108S, D115E, Q117H, F129L, G132K, H134Q, M147T y L152P.

En otra realización, el factor VIII humano mutante recombinante incluye una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en I86, A108, G132, M147, E152 y combinaciones de los mismos.

En otra realización, el factor VIII humano mutante recombinante incluye una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en I86V, A108S, G132K, M147T, L152P y combinaciones de los mismos. En otra realización, el factor VIII humano mutante recombinante incluye sustituciones de aminoácidos en cada uno de los aminoácidos I86, A108, G132, M147 y L152.

En otra realización, el factor VIII humano mutante recombinante incluye las sustituciones de aminoácidos en cada uno de los aminoácidos I86V, A108S, G132K, M147T y L152P.

En otras realizaciones, los mutantes del factor VIII humano incluyen además una supresión en el dominio B del factor VIII humano.

En otras realizaciones, los mutantes del factor VIII humano incluyen además los dominios a2 y/o a3 del factor VIII humano.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica los mutantes del factor VIII humano descritos en el presente documento.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende los polinucleótidos que codifican los mutantes del factor VIII humano descritos en el presente documento.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión que comprende los polinucleótidos que codifican los mutantes del factor VIII humano descritos en el presente documento.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión que comprende los polinucleótidos que codifican los mutantes del factor VIII humano descritos en el presente documento para su uso en el tratamiento de una deficiencia de factor VIII.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para expresar un mutante de polipéptido de factor VIII humano que comprende: (a) transformar una célula huésped con un vector de expresión que comprende los polinucleótidos que codifican un mutante de factor VIII humano según la presente invención; (b) hacer crecer la célula huésped en condiciones adecuadas para expresar el polipéptido mutante del factor VIII humano; y (c) purificar el polipéptido mutante del factor VIII humano a partir de células huésped que expresan dicho mutante.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 ilustra los dominios estructurales de las cadenas pesada y ligera del factor VIII humano, incluidas varias construcciones de cadena pesada utilizadas en la presente invención.

La FIG. 2 es un gráfico que muestra un alineamiento de los primeros 200 aminoácidos de la cadena pesada del factor VIII humano secretado junto con un factor VIII modificado con 10 sustituciones ejemplares para una secreción mejorada.

La FIG. 3 es un gráfico que muestra el alineamiento de los primeros 200 aminoácidos de la cadena pesada del factor VIII humano secretado junto con un mutante de factor VIII humano modificado con 5 sustituciones ejemplares para una secreción mejorada.

La FIG. 4 resume los ejemplos de aminoácidos que se determinó que afectan la secreción del factor VIII humano. Las FIGS. 5 y 6 representan ejemplos de vectores de AAV para expresar mutantes de factor VIII humano con el dominio B eliminado o cadena pesada de factor VIII humano.

La FIG. 7 muestra una comparación de la secreción de diferentes mutantes del factor VIII humano en células BHK (panel A) o células 293 (panel B).

La FIG. 8 muestra una comparación de la secreción de diferentes mutantes del factor VIII humano en la secreción in vivo. Plásmidos pAAV-CB-hBDDF8 (que llevan el factor VIII humano con el dominio B eliminado), pAAV-CB-hBDDF8-X10 (que llevan hF8-BDD con 10 sustituciones), pAAV-CB-hBDD-F8-X5 (que llevan hBDDF8 con 5 sustituciones) o pAAV-CB-hBDD-F8-G312K (hF8 con sustituciones de G132K) se inyectaron en ratones Blab/c con doble inactivación de factor VIII.

La FIG. 9 muestran una comparación de la secreción de diferentes mutantes del factor VIII humano en células 293. Los aminoácidos en hBDD-F8-X10 se volvieron a convertir en sus correspondientes aminoácidos de tipo salvaje. En hBDD-F8-X10-6p, 6 de 10 aminoácidos en hBDD-F8-X10 que difieren del F8 de tipo salvaje se revertieron a sus aminoácidos de tipo salvaje.

La FIG. 10 muestra una comparación de la expresión y secreción de una cadena pesada del factor VIII (F8) mutante (HC1690-X10) en una construcción de vector AAV con una construcción de vector AAV hF8-HC1690 de tipo salvaje (AAV/hF8HC1690) in vivo.

La FIG. 11 muestra una comparación de la secreción de diferentes mutantes de la cadena pesada del factor VIII G132 en células 293.

La FIG. 12 muestra una comparación de la secreción de diferentes mutantes de la cadena pesada del factor VIII en la expresión/secreción en ratones Blab/c con doble desactivación del factor VIII.

La FIG. 13 muestra una comparación de la secreción de diferentes mutantes de la cadena pesada del factor VIII LI52 en células 293.

La FIG. 14 muestra una comparación de la secreción de diferentes mutantes de la cadena pesada del factor VIII A108 en células 293.

La FIG. 15 muestra una comparación de la secreción de diferentes mutantes de la cadena pesada del factor VIII M147 en células 293.

La FIG. 16 muestra que no hubo formación de anticuerpos neutralizantes contra 5 aminoácidos mutados en el modelo de rata F8 -/-.

Descripción detallada

Se utilizan varios términos relacionados con las moléculas biológicas de la presente invención anteriormente y también a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones.

La frase “factor VIII mejorado en la secreción (seFVIII, seF8)” se refiere a un FVIII modificado (F8) que ha sido alterado genéticamente de manera que la proteína codificada exhibe al menos un 10% o 20% o 50% o 100% de aumento en la secreción en comparación con el FVIII sin modificar. Las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento se pueden obtener fácilmente de GenBank. Para el FVIII humano, consulte el N° de Acceso NG-011403.1.

La frase “BDD” se refiere a un mutante del factor VIII (F8 o FVIII) “sin dominio B” que carece del dominio B.

La frase “uno o más” seguida de una lista de elementos o especies pretende abarcar cualquier permutación de elementos o especies en la lista. Así, p. ej., la frase “una o más mutaciones de sustitución seleccionadas del grupo que consta de A, B, C, D, E y F” puede incluir cualquier combinación de mutaciones de sustitución que contengan A, B, C, D, E y/o F.

Como se usa en el presente documento, los rangos se pueden expresar desde un valor entero particular a otro valor entero particular. Cuando se expresa un rango de este tipo, debe comprender que todos y cada uno de los valores enteros dentro de ese rango definen realizaciones separadas de acuerdo con la presente invención y que el alcance completo de las realizaciones incluye dentro del rango además todos y cada uno de los subrangos entre cualquier par de valores enteros en el rango inicial.

Con referencia a los ácidos nucleicos de la invención, el término “ácido nucleico aislado”, cuando se aplica al ADN, se refiere a una molécula de ADN que está separada de secuencias con las que es inmediatamente contigua (en las direcciones 5' y 3') en el genoma natural del organismo del que se origina. Por ejemplo, el “ácido nucleico aislado” puede comprender una molécula de ADN o ADNc insertada en un vector, tal como un vector plasmídico o viral, o integrada en el ADN de un procariota o eucariota. Los codones de ácido nucleico se pueden optimizar para mejorar la expresión en las células de mamífero.

Con respecto a las moléculas de ARN de la invención, el término “ácido nucleico aislado” se refiere principalmente a una molécula de ARN codificada por una molécula de ADN aislada como se define anteriormente. Alternativamente, el término puede referirse a una molécula de ARN que ha sido suficientemente separada de las moléculas de ARN con las que estaría asociada en su estado natural (es decir, en células o tejidos), de modo que exista en una forma “sustancialmente pura” (el término “sustancialmente puro” se define a continuación).

Con respecto a la proteína, el término “proteína aislada” o “proteína aislada y purificada” se usa a veces en el presente documento. Este término se refiere principalmente a una proteína producida por expresión de una molécula de ácido nucleico aislada de la invención. Alternativamente, este término puede referirse a una proteína que se ha separado suficientemente de otras proteínas con las que estaría asociada de forma natural, de modo que exista en forma “sustancialmente pura”.

El término “región promotora” se refiere a las regiones reguladoras de la transcripción de un gen, que pueden encontrarse en el lado 5' o 3' de la región codificante, o dentro de la región codificante, o dentro de los intrones.

El término “vector” se refiere a una pequeña molécula de ADN portadora en la que se puede insertar una secuencia de ADN para introducirla en una célula huésped donde se replicará. Un “vector de expresión” es un vector especializado que contiene un gen o secuencia de ácido nucleico con las regiones reguladoras necesarias para la expresión en una célula huésped.

El término “unido operativamente” significa que las secuencias reguladoras necesarias para la expresión de una secuencia codificante se colocan en la molécula de ADN en las posiciones apropiadas con respecto a la secuencia codificante para efectuar la expresión de la secuencia codificante. Esta misma definición se aplica a veces a la disposición de secuencias codificantes y elementos de control de la transcripción (p. ej., Promotores, potenciadores y elementos de terminación) en un vector de expresión. Esta definición también se aplica a veces a la disposición de secuencias de ácido nucleico de una primera y una segunda molécula de ácido nucleico en la que se genera una molécula de ácido nucleico híbrida.

El término “sustancialmente puro” se refiere a una preparación que comprende al menos el 50-60% en peso del compuesto de interés (p. ej., ácido nucleico, oligonucleótido, proteína, etc.). Más preferiblemente, la preparación comprende al menos el 75% en peso, y lo más preferiblemente un 90-99% en peso, del compuesto de interés. La pureza se mide mediante métodos apropiados para el compuesto de interés (p. ej., métodos cromatográficos, electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida, análisis por HPLC y similares).

La frase “que consiste esencialmente en” cuando se refiere a una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos particular significa una secuencia que tiene las propiedades de una SEQ ID NO. Por ejemplo, cuando se usa en referencia a una secuencia de aminoácidos, la frase incluye la secuencia per se y modificaciones moleculares que no afectarían las características básicas y novedosas de la secuencia.

El término “oligonucleótido”, como se usa en el presente documento, se refiere a cebadores y sondas de la presente invención y se define como una molécula de ácido nucleico compuesta por dos o más ribo o desoxirribonucleótidos, preferiblemente más de tres. El tamaño exacto del oligonucleótido dependerá de varios factores y de la aplicación particular para la que se usa el oligonucleótido. El término “sonda”, como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido, polinucleótido o ácido nucleico, ya sea ARN o ADN, ya sea de origen natural como en una digestión de enzima de restricción purificada o producido sintéticamente, que es capaz de hibridar o hibridar específicamente con un ácido nucleico con secuencias complementarias a la sonda. Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria. La longitud exacta de la sonda dependerá de muchos factores, incluida la temperatura, la fuente de la sonda y el método de uso. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia objetivo, la sonda de oligonucleótidos normalmente contiene de 15 a 25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos.

El término “porcentaje idéntico” se usa en el presente documento con referencia a comparaciones entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos a menudo se comparan usando programas informáticos que alinean secuencias de aminoácidos o nucleicos definiendo así las diferencias entre los dos. Las comparaciones de secuencias de ácidos nucleicos se pueden realizar utilizando el paquete GCG Wisconsin versión 9.1, disponible en Genetics Computer Group en Madison, Wisconsin. Para mayor comodidad, los parámetros predeterminados (penalización por creación de espacios=12, penalización por extensión de espacios=4) especificados por ese programa están destinados para su uso en el presente documento para comparar la identidad de secuencia. Alternativamente, el programa Blastn 2.0 proporcionado por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (que se encuentra en la red mundial en ncbi.nlm.nih.gov/blast/; Altschul, et al., 1990, J Mol Biol 215:403-410) usando una alineación con huecos con parámetros predeterminados, se puede usar para determinar el nivel de identidad y similitud entre secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos.

Un ácido nucleico o aminoácido o secuencia “correspondiente”, como se usa en el presente documento, es uno presente en un sitio en una molécula de factor VIII o factor VIII híbrido o fragmento del mismo que tiene la misma estructura y/o función que un sitio en la molécula de factor VIII de otra especie, aunque el número de ácidos nucleicos o aminoácidos puede no ser idéntico. Una secuencia “correspondiente a” otra secuencia de factor VIII corresponde sustancialmente a dicha secuencia y se hibrida con la secuencia de ADN del factor VIII humano designada SEQ ID NO:1 en condiciones rigurosas. Una secuencia “correspondiente a” otra secuencia de factor VIII también incluye una secuencia que da como resultado la expresión de un factor VIII o un factor VIII híbrido procoagulante reivindicado o un fragmento del mismo y se hibridaría con una molécula nucleica que comprende la SEQ ID NO:1 pero por la redundancia del código genético.

Un residuo o secuencia de aminoácidos “único”, como se utiliza aquí, se refiere a una secuencia o residuo de aminoácidos en la molécula de factor VIII de una especie que es diferente del residuo o secuencia homóloga en la molécula de factor VIII de otra especie.

“Actividad específica”, como se usa en el presente documento, se refiere a la actividad que corregirá el defecto de coagulación del plasma deficiente en factor VIII humano. La actividad específica se mide en unidades de actividad de coagulación por miligramo de proteína de factor VIII total en un ensayo estándar en el que el tiempo de coagulación del plasma deficiente en factor VIII humano se compara con el del plasma humano normal. Una unidad de actividad del factor VIII es la actividad presente en un mililitro de plasma humano normal. En el ensayo, cuanto menor sea el tiempo de formación del coágulo, mayor será la actividad del factor VIII que se esté ensayando. El factor VIII híbrido humano/porcino tiene actividad de coagulación en un ensayo de factor VIII humano. Esta actividad, así como la de otras moléculas de factor VIII híbridas o híbridas equivalentes o fragmentos de las mismas, puede ser menor, igual o mayor que la del factor VIII humano recombinante o derivado de plasma.

“Subunidades” del factor VIII humano o animal, como se usa en el presente documento, son las cadenas pesada y ligera de la proteína. La cadena pesada del factor VIII contiene tres dominios, A1, A2 y B. La cadena ligera del factor VIII también contiene tres dominios, A3, C1 y C2.

Los términos “epítopo”, “sitio antigénico” y “determinante antigénico”, como se usan en el presente documento, se usan como sinónimos y se definen como una porción del factor VIII humano, animal, híbrido o híbrido equivalente o fragmento del mismo que se reconoce específicamente por un anticuerpo. Puede constar de cualquier número de residuos de aminoácidos y puede depender de la estructura primaria, secundaria o terciaria de la proteína. De acuerdo con esta divulgación, un factor VIII híbrido, un equivalente de factor VIII híbrido o un fragmento de cualquiera de los dos que incluye al menos un epítopo puede usarse como reactivo en los ensayos de diagnóstico descritos a continuación. En algunas realizaciones, el factor VIII híbrido o equivalente híbrido o fragmento del mismo no tiene reactividad cruzada o es menos reactivo cruzado con todos los anticuerpos de factor VIII inhibidor de origen natural que el factor VIII humano o porcino.

El término “sitio inmunogénico”, como se usa en el presente documento, se define como una región del factor VIII humano o animal, factor VIII híbrido o equivalente híbrido, o fragmento del mismo que provoca específicamente la producción de anticuerpo contra el factor VIII, híbrido, equivalente híbrido, o fragmento en un ser humano o animal, medido mediante protocolos de rutina, tales como inmunoensayo, p. ej., ELISA, o el ensayo Bethesda, descrito en el presente documento. Puede constar de cualquier número de residuos de aminoácidos y puede depender de la estructura primaria, secundaria o terciaria de la proteína. En algunas realizaciones, el factor VIII híbrido o híbrido equivalente o fragmento del mismo es no inmunogénico o menos inmunogénico en un animal o humano que el factor VIII humano o porcino.

“Deficiencia de factor VIII”, como se usa aquí, incluye deficiencia en la actividad de coagulación causada por la producción de factor VIII defectuoso, por producción inadecuada o nula de factor VIII, o por inhibición parcial o total del factor VIII por inhibidores. La hemofilia A es un tipo de deficiencia de factor VIII resultante de un defecto en un gen ligado al X y la ausencia o deficiencia de la proteína del factor VIII que codifica.

También se discute en el presente documento una molécula mutante de factor VIII recombinante (p. ej., proteína o ácido nucleico) caracterizada por una expresión y/o secreción aumentada en comparación con el factor VIII de tipo salvaje.

El ADNc (nucleótido) del factor VIII humano ejemplar y las secuencias de aminoácidos predichas se muestran en las SEQ ID NO:1 y 2, respectivamente. El factor VIII humano se sintetiza y secreta como una proteína de cadena sencilla de aproximadamente 300 kDa de 2332 aminoácidos con homologías de secuencia interna que definen una serie de “dominios” estructurales como sigue: NH2-A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2-COOH (FIG. 4). Como se usa en el presente documento, un “dominio” de factor VIII se define por una secuencia continua de aminoácidos caracterizada por, p. ej., identidad de secuencia de aminoácidos interna con dominios estructuralmente relacionados y por sitios de escisión proteolítica por trombina. Además, los términos “sin dominio” o “con falta de un dominio” deben entenderse en el sentido de que se ha eliminado al menos el 95% o el 100% del dominio. A menos que se especifique lo contrario, los dominios del factor VIII se definen por los siguientes residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del factor VIII humano establecida en SEQ ID NO:2:

A1, residuos Ala1-Arg372

A2, residuos Ser373-Arg740

B, residuos Ser741-Arg1648;

a3, residuos P1640-Arg1649;

A3, residuos Ser1690-Ile2032;

C1, residuos Arg2033-Asn2172; y

C2, residuos Ser2173-Tyr2332

La secuencia A3-C1-C2 incluye los residuos Ser1690-Tyr2332. La secuencia restante, residuos Glu1649-Arg1689, se denomina habitualmente péptido de activación de la cadena ligera del factor VIII (FIG. 1). El factor VIII es activado proteolíticamente por la trombina o el factor Xa, que lo disocia del factor von Willebrand, formando el factor VIIIa, que tiene función procoagulante. La función biológica del factor VIIIa es aumentar la eficiencia catalítica del factor IXa hacia la activación del factor X en varios órdenes de magnitud. El factor VIIIa activado por trombina es un heterotrímero A1/A2/A3-C1-C2 de 160 kDa que forma un complejo con el factor IXa y el factor X en la superficie de las plaquetas o monocitos.

Una secuencia de ADNc que codifica el factor VIII humano de tipo salvaje tiene la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO:1. En SEQ ID NO:1, los primeros 57 nucleótidos del marco de lectura abierto del factor VIII codifican una secuencia de péptido señal que típicamente se escindió de la proteína del factor VIII maduro representada por SEQ ID NO:2.

Los mutantes de factor VIII recombinante preferidos incluyen o codifican una o más sustituciones de aminoácidos en la región del aa 86 al aa 152 de la secuencia de aminoácidos del factor VIII humano de tipo salvaje expuesta en la SEQ ID NO:2. Las sustituciones dentro de cualquiera de estas posiciones pueden emplear cualquiera de los otros 19 aminoácidos.

Con referencia a los mutantes descritos en el presente documento, la noción representada por “(aminoácido a) -(SEQ ID NO:2 aminoácido #b) -(aminoácido c)” debe entenderse que significa que el aminoácido de tipo salvaje a (unocódigo de letra) en el aminoácido número b de SEQ ID NO:2 se ha mutado al aminoácido c.

En la FIG. 4 se describen mutantes ejemplares del factor VIII humano.

Un ejemplo de factor VIII recombinante de esta invención incluye una mutación puntual que implica una sustitución en 186 de Se Q ID NO:2, que se selecciona de valina (es decir, I86V), leucina (I86L) y metionina (I86M).

Otro factor VIII recombinante ejemplar incluye una mutación puntual que implica una sustitución en Y105 de la SEQ ID NO:2, que se selecciona entre Y105F e Y105W.

Otro factor VIII recombinante ejemplar incluye una mutación puntual que implica una sustitución en las posiciones A108 de la SEQ ID NO:2, que se selecciona entre A108S, A108G, A108t y a 108P.

Otro factor VIII recombinante ejemplar incluye una mutación puntual que implica una sustitución en las posiciones D115 de la SEQ ID NO:2, que se selecciona de D115E, D115N, D115H, D115Q, D115R y D115K.

Otro factor VIII recombinante ejemplar incluye una mutación puntual que implica una sustitución en las posiciones Q117 de la SEQ ID NO:2, que se selecciona entre Q117H, Q117N, Q117E, Q117D, Q117R y Q117K.

Otro factor VIII recombinante ejemplar incluye una mutación puntual que implica una sustitución en las posiciones F129 de SEQ ID NO:2, que se selecciona entre F129L, F129V, F129I, F129M, F129P, F129T y F129K.

Otro factor VIII recombinante ejemplar incluye una mutación puntual que implica una sustitución en las posiciones G132 de la SEQ ID NO:2, que se selecciona entre G132K, G132E, G132D, G132R, G132T, G132M, G132N, G132S y G132W.

Otro factor VIII recombinante ejemplar incluye una mutación puntual que implica una sustitución en las posiciones H134 de la SEQ ID NO:2, que se selecciona entre H134Q, H134G, H134Y, H134N, H134E, H134D, H134R y H134K.

Otro factor VIII recombinante ejemplar incluye una mutación puntual que implica una sustitución en las posiciones M147 de la SEQ ID NO:2, que se selecciona entre M147T, M147A, M147G, M147S y M147P.

Otro factor VIII recombinante ejemplar incluye una mutación puntual que implica una sustitución en las posiciones L152 de la SEQ ID NO:2, que se selecciona entre L152P, L152S, L152G y L152T.

Otro factor VIII recombinante ejemplar incluye múltiples sustituciones de uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones I86, A108, G132, M147, L152 de Se Q ID NO:2. La(s) sustitución(es) puede(n) incluir cualquier permutación de mutaciones que abarque estos cinco sitios de aminoácidos. Las realizaciones específicas pueden incluir mutaciones en una o más mutaciones de sustitución seleccionadas del grupo que consiste en I86V, A108S, G132K, M147T, L152P. Realizaciones preferidas adicionales incluyen 2, 3, 4 o 5 sustituciones, incluyendo cualquier combinación (o permutación) de sustituciones seleccionadas entre I86V, A108S, G132K, M147T y L152P.

Los mutantes de factor VIII recombinante ejemplares incluyen mutaciones puntuales que implican sustituciones en uno o más residuos de aminoácidos en SEQ ID NO:2 seleccionados del grupo que consiste en I86, Y105, A108, D115, Q117, F129, G132, H134, M147 y L152.

La(s) sustitución(es) puede(n) incluir cualquier permutación de mutaciones que abarque estos diez sitios de aminoácidos. Las realizaciones específicas pueden incluir mutaciones en una o más mutaciones de sustitución seleccionadas del grupo que consiste en I86V, Y105F, A108S, D115E, Q117H, F129L, G132K, H134Q, M147T y L152P. Las realizaciones preferidas adicionales incluyen 2, 3, 4 o hasta 9 sustituciones, incluyendo cualquier combinación (o permutación) de sustituciones seleccionadas entre I86V, Y105F, A108S, D115E, Q117H, F129L, G132K, H134Q, M147T y L152P.

Los ácidos nucleicos que codifican las sustituciones de factor VIII mencionadas anteriormente se incluyen en esta invención e incluyen todos los ácidos nucleicos posibles que codifican la amplitud de mutantes de sustitución descritos en el presente documento.

En comparación con el factor VIII de tipo salvaje en producción (en líneas celulares o in vivo), los mutantes del factor VIII descritos anteriormente pueden exhibir aumentos en la secreción de factor VIII de entre el 5% a 10.000 veces, 10% a 2.000 veces, 50% hasta 500 veces, 2 a 200 veces, 5 a 100 veces, 10 a 50 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 200 veces, al menos 500 veces, al menos 2.000 veces o al menos 10.000 veces.

En determinadas realizaciones, las secuencias de factor VIII mutantes adecuadas pueden modificarse adicionalmente para incluir, eliminar o modificar otras secuencias de factor VIII para conferir propiedades con respecto a otros atributos, que incluyen, sin limitación, antigenicidad, vida media circulante, secreción de proteínas, afinidad por factor IXa y/o factor X, sitios de escisión de inactivación del factor VIII alterados, estabilidad de la forma de factor VIII activado, inmunogenicidad y vida útil.

En determinadas realizaciones específicas, el factor VIII mutante puede modificarse para producir un producto de factor VIII con dominio B eliminado (BDD) o “sin dominio B”. FIG. 1 muestra una realización ejemplar de factor VIII de BDD que contiene los residuos de aminoácidos 1-740 y 1690-2332 de la SEQ ID NO:2. Preferiblemente, el factor VIII sin dominio B recombinante contiene una o múltiples sustituciones en las posiciones I86, Y105, A108, D115, Q117, F129, G132, H134, M147, LI52 como se describe en el presente documento.

En una realización, se produce un factor VIII recombinante sin dominio B, mediante el cual el dominio B se reemplaza con un segmento enlazador de ADN y al menos un codón se reemplaza con un codón que codifica un residuo de aminoácido que tiene la misma carga que un residuo correspondiente de factor VIII porcino (ver, p. ej., la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2004/0197875 de 2004/0197875 de Hauser, et al.).

En otra realización, se produce un factor VIII recombinante sin dominio B que tiene un intrón 1 de factor IX truncado insertado en una o más ubicaciones (ver, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 6.800.461 de Negrier y la Patente de EE.UU. N° 6.780.614 de Negrier). Este factor VIII recombinante puede usarse para producir una mayor producción del factor VIII recombinante in vitro así como en un vector de transferencia para terapia génica (ver, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 6.800.461 de Negrier). En una realización particular, el factor VIII recombinante puede estar codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene un intrón 1 del factor IX truncado insertado en dos ubicaciones y que tiene un promotor que es adecuado para conducir la expresión en líneas celulares hematopoyéticas, y específicamente en plaquetas (ver, p. ej., Patente de EE.UU. N° 6.780.614 de Negrier).

Un segundo ejemplo de un factor VIII mutante adecuado que puede modificarse de acuerdo con la presente invención es un factor VIII humano/animal quimérico que contiene uno o más residuos de aminoácidos animales como sustitución(es) de residuos de aminoácidos humanos que son responsables de la antigenicidad del factor VIII humano. En particular, las sustituciones de residuos de animales (p. ej., porcino) pueden incluir, sin limitación, uno o más de los siguientes: R484A, R488G, P485A, L486S, Y487L, Y487A, S488A, S488L, R489A, R489S, R490G, L491S, P492L, P492A, K493A, G494S, V495A, K496M, H497L, L498S, K499M, D500A, F501A, P502L, 1503M, L504M, P505A, G506A, E507G, 1508M, 1508A, M2199I, F2200L, L2252F, V2223A, K2227E y/o L2251 (Patente de EE.UU. N° 5.859.204 de Lollar, Patente de EE.UU. N° 6.770.744 de Lollar y Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2003/0166536 de Lollar). Preferiblemente, el factor VIII quimérico recombinante contiene una o múltiples sustituciones en las posiciones I86, Y105, A108, D115, Q117, F129, G132, H134, M147 y L152 como se describe en el presente documento.

En una realización adicional, el factor VIII mutante se modifica para conferir una mayor estabilidad del factor VIII activado en virtud de los dominios A2 y A3 fusionados. En particular, un factor VIII se puede modificar sustituyendo residuos de cisteína en las posiciones 664 y 1826 (es decir, Y664C, T1826C), lo que da como resultado un factor VIII mutante que forma un enlace disulfuro Cys664-Cysl826 que une covalentemente los dominios A2 y A3 (Gale, et al., “An Engineered Interdomain Disulfide Bond Stabilizes Human Blood Coagulation Factor VIIIa,” J. Thrombosis and Haemostasis 1(9):1966-1971 (2003)). Preferiblemente, el factor VIII de dominio fusionado recombinante (A2-A3) contiene una o múltiples sustituciones en las posiciones I86, Y105, A108, D115, Q117, F129, G132, H134, M147 y L152 como se describe en el presente documento.

En una realización adicional, un factor VIII mutante de acuerdo con la presente invención se modifica adicionalmente para conferir sitios de escisión por inactivación alterados. Por ejemplo, Arg336 o Arg562 se pueden sustituir para disminuir la susceptibilidad del factor VIIF mutante a las enzimas de escisión que normalmente inactivan el factor VIII de tipo salvaje (ver, p. ej., Amano, et al., “Mutation at Either Arg336 or Arg562 in Factor VIII is Insufficient for Complete Resistance to Activated Protein C (APC)-Mediated Inactivation: implications for the APC Resistance Test,” Thrombosis & Haemostasis 79(3):557-63 (1998)).

En una realización adicional, un factor VIII mutante de acuerdo con la presente invención se modifica adicionalmente para conferir una mayor afinidad por el factor IXa (ver, p. ej., Fay, et al., “Factor VIIIa A2 Subunit Residues 558-565 Represent a Factor IXa Interactive Site,” J. Biol. Chem. 269 (32):20522-7 (1994); Bajaj, et al., “Factor IXa: Factor VIIIa Interaction. Helix 330-338 of Factor IXa Interacts with Residues 558-565 and Spatially Adjacent Regions of the A2 Subunit of Factor VIIIa,” J. Biol. Chem. 276 (19):16302-9 (2001); y Lenting, et al., “The Sequence Glul811-Lysl818 of Human Blood Coagulation Factor VIII Comprises a Binding Site for Activated Factor IX,” J. Biol. Chem. 271 (4):1935-40 (1996)) y/o factor X (ver, p. ej., Lapan, et al., “Localization of a Factor X Interactive Site in the A1 Subunit of Factor VIIIa,” J. Biol. Chem. 272:2082-88 (1997)).

En otra realización adicional, un factor VIII mutante de acuerdo con la presente invención se modifica adicionalmente para mejorar aún más la secreción de factor VIII (ver, p. ej., Swaroop, et al., “Mutagenesis of a Potential Immunoglobulin-Binding Protein-Binding Site Enhances Secretion of Coagulation Factor VIII,” J. Biol. Chem.

272(39):24121-4 (1997)).

En una realización adicional, un factor VIII mutante de acuerdo con la presente invención se modifica adicionalmente para conferir una vida media circulante aumentada. Esto se puede lograr a través de varios enfoques, que incluyen, entre otros, reduciendo las interacciones con el heparán sulfato (Sarafanov, et al., “Cell Surface Heparan Sulfate Proteoglycans Participate in Factor VIII Catabolism Mediated by Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein,” J. Biol. Chem. 276 (15): 11970-9 (2001)) y/o proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (“LRP”) (Saenko, et al., “Role of the Low Density Lipoprotein-Related Protein Receptor in Mediation of Factor VIII Catabolism,” J. Biol. Chem. 274 (53): 37685-92 (1999); y” The Light Chain of Factor VIII Comprises a Binding Site for Low Density Lipoprotein Receptor- Related Protein,” J. Biol. Chem. 274(34):23734-9 (1999)).

Un octavo ejemplo de un factor VIII mutante adecuado que puede modificarse de acuerdo con la presente invención es un factor VIII modificado codificado por una secuencia de nucleótidos modificada para codificar aminoácidos dentro de epítopos existentes conocidos para producir una secuencia de reconocimiento para la glicosilación en residuos de asparagina. (ver, p. ej., la Patente de Ee .UU. N° 6.759.216 de Lollar). Dicha modificación puede ser útil evitando la detección por anticuerpos inhibidores existentes (factor VIII de baja antigenicidad) y disminuyendo la probabilidad de desarrollar anticuerpos inhibidores (factor VIII de baja inmunogenicidad). En una realización representativa, el factor VIII modificado se muta para incorporar una secuencia de aminoácidos consenso para la glicosilación ligada a N, tal como N-X-S/T (ver la Patente de EE.UU. N° 6.759.216 de Lollar).

Un noveno ejemplo de un factor VIII mutante adecuado que puede modificarse de acuerdo con la presente invención es un factor VIII modificado que es un factor VIII activo como procoagulante que tiene varias mutaciones (ver, p. ej., la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2004/0092442 para Kaufman et al.). Un ejemplo de esta realización se refiere a un factor VIII modificado que ha sido modificado para (i) eliminar el sitio de unión del factor von Willebrand, (ii) agregar una mutación en Arg 740 y (iii) agregar un espaciador de secuencia de aminoácidos entre el A2- y dominios A3-, en los que el espaciador de aminoácidos tiene una longitud suficiente para que, tras la activación, la proteína del factor VIII activo como procoagulante se convierta en un heterodímero (ver la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2004/0092442 de Kaufman, et al).

Además, el factor VIII mutante se puede modificar para aprovechar varios avances relacionados con los factores de coagulación recombinantes en general (ver, p. ej., Saenko, et al., “The Future of Recombinant Coagulation Factors,” J. Thrombosis and Haemostasis 1:922-930 (2003)).

El factor VIII recombinante de la presente invención puede modificarse en la posición I86, Y105, A108, D115, Q117, F129, G132, H134, M147, L152, así como modificarse para que no tenga dominio B, para ser quimérico, han fusionado dominios A2-A3, han alterado los sitios de escisión de inactivación, han aumentado la afinidad del factor IXa y/o el factor X, han aumentado la actividad específica, han aumentado la vida media circulante, han tenido sitios de glicosilación mutantes o poseer dos o más de dichas modificaciones además de las modificaciones en las posiciones I86, Y105, A108, D115, Q117, F129, G132, H134, M147 y/o L152.

También se discute en el presente documento un método para preparar un factor VIII recombinante que tiene una actividad específica incrementada en comparación con la de un factor VIII de tipo salvaje. Este método implica alterar la secuencia de aminoácidos de un factor VIII de tipo salvaje para producir un factor VIII recombinante. La alteración de la secuencia de aminoácidos del factor VIII de tipo salvaje puede incluir, p. ej., introducir al menos una mutación puntual en o cerca de al menos un sitio de unión al calcio del factor VIII de tipo salvaje. Posteriormente, utilizando técnicas de análisis de proteínas bien conocidas en la técnica, se puede determinar si el factor VIII recombinante tiene una actividad específica aumentada en comparación con la del factor VIII de tipo salvaje.

El factor VIII recombinante se produce preferiblemente en una forma sustancialmente pura. En una disposición particular, el factor VIII recombinante sustancialmente puro es al menos aproximadamente un 80% puro, más preferiblemente al menos un 90% puro, más preferiblemente al menos un 95% puro, 98% puro, 99% puro o 99,9% puro. Puede obtenerse un factor VIII recombinante sustancialmente puro mediante técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. Normalmente, el factor VIII recombinante sustancialmente puro se secreta en el medio de crecimiento de las células huésped recombinantes. Alternativamente, el factor VIII recombinante sustancialmente puro se produce, pero no se secreta al medio de crecimiento. En tales casos, para aislar el factor VIII recombinante sustancialmente puro, la célula hospedante que lleva el plásmido recombinante se propaga, se lisa por sonicación, calor o tratamiento químico, y el homogeneizado se centrifuga para eliminar los restos celulares. A continuación, el sobrenadante se somete a una precipitación secuencial con sulfato de amonio. La fracción que contiene el factor VIII recombinante sustancialmente puro se somete a filtración en gel en una columna de dextrano o poliacrilamida de tamaño apropiado para separar el factor VIII recombinante. Si es necesario, una fracción de proteína (que contiene el factor VIII recombinante sustancialmente puro) puede purificarse adicionalmente mediante cromatografía líquida de alta resolución (“HPLC”).

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un factor VIII mutante recombinante como se describe en el presente documento. La molécula de ácido nucleico aislada que codifica el factor VIII mutante recombinante puede ser un ARN o ADN. Los codones de ácido nucleico se pueden optimizar aún más para mejorar la expresión.

En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada puede tener una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 modificada con una de las sustituciones en las posiciones identificadas en esta invención. La molécula de ácido nucleico aislada puede tener uno o múltiples cambios en estas posiciones en cualquier combinación.

En otra realización, la molécula de ácido nucleico aislada puede tener una secuencia de nucleótidos que codifica un factor VIII sin dominio B del tipo descrito anteriormente, modificado con una o múltiples sustituciones de la presente invención.

En otra realización, la molécula de ácido nucleico aislada puede tener una secuencia de nucleótidos que codifica un humano/porcino quimérico del tipo descrito anteriormente, modificado con una o múltiples sustituciones de la presente invención.

En una realización adicional, la molécula de ácido nucleico aislada puede tener una secuencia de nucleótidos que codifica un factor VIII de dominio A2-A3 fusionado del tipo descrito anteriormente, modificado con una o múltiples sustituciones de la presente invención.

En otra realización, la molécula de ácido nucleico aislada puede tener una secuencia de nucleótidos que codifica un factor VIII cuyos sitios de inactivación se han modificado como se describió anteriormente, modificado adicionalmente con una o múltiples sustituciones de la presente invención.

En otra realización más, la molécula de ácido nucleico aislada puede tener una secuencia de nucleótidos que codifica un factor VIII cuya afinidad por el factor IXa y/o el factor X se ha mejorado, junto con una o múltiples sustituciones de la presente invención.

En otra realización más, la molécula de ácido nucleico aislada puede tener una secuencia de nucleótidos que codifica un factor VIII cuya afinidad por diversas proteínas de unión al suero se ha alterado para aumentar su vida media circulante y se ha modificado adicionalmente con una o múltiples sustituciones de la presente invención.

En una realización adicional, la molécula de ácido nucleico aislada puede tener una secuencia de nucleótidos que codifica un factor VIII que tiene una secreción aumentada en cultivo, modificada adicionalmente con una o múltiples sustituciones de la presente invención.

En una realización adicional, la molécula de ácido nucleico aislada puede tener una secuencia de nucleótidos que codifica un factor VIII que posee uno o más sitios de glicosilación de origen no natural junto con una o múltiples sustituciones de la presente invención.

En otra realización más, la molécula de ácido nucleico aislada codifica un factor VIII recombinante que se modifica con una o más sustituciones de la presente invención y se modifica adicionalmente para poseer cualquier combinación de la siguiente modificación: modificado para que no tenga dominio B, modificado para ser quimérico, modificado para tener dominios A2-A3 fusionados, modificado para tener uno o más sitios de escisión de inactivación alterados, modificado para tener una mayor afinidad de factor IXa y/o factor X, modificado para tener una secreción mejorada, modificado para tener una mayor circulación semivida, y modificada para poseer uno o más sitios de glicosilación no naturales.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector de expresión para expresar los polinucleótidos mutantes del factor VIII descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término “vector de expresión” se refiere a un vector viral o no viral que comprende un polinucleótido que codifica el péptido novedoso de la presente invención en una forma adecuada para la expresión del polinucleótido en una célula huésped. Un tipo de vector no viral es un “plásmido”, que incluye un bucle circular de ADN de doble hebra en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. En la presente especificación, “plásmido” y “vector” se pueden usar indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada.

Cuando se prepara un vector de expresión, las secuencias transgénicas se pueden insertar en un plásmido que contiene secuencias bacterianas adecuadas para la replicación en células bacterianas y eucariotas. Puede emplearse cualquier plásmido conveniente, que puede incluir marcadores que permitan la selección en una bacteria y generalmente uno o más sitios de restricción únicos convenientemente ubicados. La selección de un vector dependerá de la técnica de transformación preferida y del huésped objetivo para la transformación.

Los vectores de expresión para expresar polipéptidos de factor VIII mutantes incluyen una o más secuencias reguladoras unidas operativamente a la secuencia polinucleotídica que se va a expresar. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, y similares. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células huésped para producir de ese modo las proteínas mutantes del factor VIII descritas en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término “secuencias de control” o “secuencias reguladoras” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. El término “secuencia de control/reguladora” pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de poliadenilación). Las secuencias de control/reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células huésped (p. ej., secuencias reguladoras específicas de tejido).

Una secuencia de ácido nucleico está “operativamente enlazada” a otra secuencia de ácido nucleico cuando la primera se coloca en una relación funcional con la última. Por ejemplo, un ADN para una presecuencia o péptido líder secretor está operativamente ligado al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está operativamente ligado a una secuencia codificante si está posicionado para facilitar la traducción. Generalmente, “operativamente enlazado” significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La vinculación se realiza mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se utilizan adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Los vectores de expresión adecuados para dirigir la expresión en células de mamíferos generalmente incluyen un promotor, así como otras secuencias de control de la transcripción y la traducción conocidas en la técnica. En ciertas realizaciones, el vector de expresión de mamífero es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido preferentemente en un tipo de célula particular (p. ej., se usan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el polinucleótido). Los elementos reguladores específicos de tejido son conocidos en la técnica y pueden incluir, p. ej., promotores y/o potenciadores específicos de células hepáticas (p. ej., promotor de albúmina, promotor de antitripsina a-1, potenciador de apoE). Alternativamente, puede usarse un promotor constitutivo (p. ej., HCMV) activo en prácticamente cualquier tipo de célula.

En determinadas realizaciones preferidas, los vectores de expresión son vectores virales. Los vectores virales típicamente tienen uno o más genes virales eliminados e incluyen un casete gen/promotor insertado en un sitio de inserción del genoma viral para la inserción de transgenes exógenos, incluidos los genes del factor VIII mutante descritos en el presente documento. Las funciones necesarias de los genes eliminados pueden ser suministradas por líneas celulares que han sido diseñadas para expresar los productos génicos de los genes tempranos en trans. Los vectores virales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, vectores virales adenoasociados (AAV), vectores retrovirales, que incluyen vectores lentivirales, vectores adenovirales, vectores virales de herpes y vectores de alfavirus. Otros vectores virales incluyen astrovirus, coronavirus, ortomixovirus, virus de papova, paramixovirus, parvovirus, picomavirus, poxvirus, vectores virales de togavirus y similares. El vector viral puede comprender cualquier construcción de ácido nucleico adecuada, tal como una construcción de ADN o ARN y puede ser monocatenario, bicatenario o dúplex.

Una vez que se ha preparado la construcción de ADN de la presente invención, está lista para incorporarse a una célula huésped. También se discute en el presente documento un método para preparar una célula recombinante que comprende un ácido nucleico de factor VIII. Básicamente, esto implica introducir la construcción de ADN en las células mediante transformación, transducción, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, liposomas y similares y seleccionar las células que han incorporado el ADN de forma episómica o integrado en el genoma del huésped.

Por tanto, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una célula huésped que incluye una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el factor VIII recombinante de la presente invención. La célula huésped puede contener la molécula de ácido nucleico aislada como una molécula de ADN en forma de un plásmido episomal o integrada de forma estable en el genoma de la célula huésped. Además, la célula huésped puede constituir un sistema de expresión para producir la proteína recombinante del factor VIII mutante. Las células huésped adecuadas pueden ser, sin limitación, células animales (p. ej., Células de riñón de hámster bebé (“BHK”)), células de ovario de hámster chino (“CHO”), células bacterianas (p. ej., E. coli), células de insectos (p. ej., Células Sf9), células fúngicas, células de levadura (p. ej., Saccharomyces o Schizosaccharomyces), células vegetales (p. ej., células de Arabidopsis o de tabaco), células de algas y similares.

También se discute en el presente documento un método para preparar un factor VIII recombinante de la presente invención. Este método implica el cultivo de una célula huésped de la presente invención en condiciones en las que la célula huésped expresa el factor VIII recombinante. A continuación, se aísla el factor VIII recombinante. En una disposición, la célula huésped se cultiva in vitro en un medio de crecimiento. En una disposición particular, los medios de crecimiento adecuados pueden incluir, sin limitación, un medio de crecimiento que contiene un factor de von Willebrand (denominado en el presente documento “VWF”). En esta disposición, la célula huésped puede contener un transgén que codifica un VWF o el VWF puede introducirse en el medio de crecimiento como suplemento. El VWF en el medio de crecimiento permitirá mayores niveles de expresión del factor VIII recombinante. Una vez que el factor VIII recombinante se secreta en el medio de crecimiento, puede aislarse del medio de crecimiento utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en las técnicas relevantes de ADN recombinante y proteínas (incluidas las descritas en el presente documento). En otra disposición, el método para preparar el factor VIII recombinante de la presente invención implica además romper la célula huésped antes del aislamiento del factor VIII recombinante. En esta disposición, el factor VIII recombinante se aísla de los restos celulares.

Cuando se produce de forma recombinante, la proteína o polipéptido del factor VIII (o fragmento o mutante del mismo) se expresa en una célula huésped recombinante, típicamente, aunque no exclusivamente, un eucariota. En determinadas disposiciones preferidas, las células huésped eucariotas, como las células de mamífero, se utilizan para producir polipéptidos de factor VIII mutantes como se describe en el presente documento. Las células de mamífero adecuadas para llevar a cabo la presente invención incluyen, entre otras: COS (p. ej., ATCC N° CRL 1650 o 1651), BHK (p. ej., ATCC N° CRL 6281), CHO (ATCC N° CCL 61), HeLa (p. ej., ATCC N° CCL 2), 293 (ATCC N° 1573), CHOP, y células NS-1.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica según la invención para su uso en el tratamiento de una deficiencia de factor VIII. En una realización, se administra un factor VIII mutante recombinante (como se describe en el presente documento) a un paciente que lo necesita en una cantidad eficaz para tratar la deficiencia de factor VIII.

En una realización particular, el factor VIII recombinante, solo o en forma de una composición farmacéutica (es decir, en combinación con estabilizadores, vehículos de administración y/o vehículos) se infunde en pacientes por vía intravenosa de acuerdo con el mismo procedimiento que se usa para infusión de factor VIII humano o animal. Una cantidad eficaz adecuada del factor VIII recombinante puede incluir, sin limitación, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 500 unidades/kg de peso corporal del paciente.

En otra realización, se puede administrar una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión que codifica un factor VIII mutante, o fragmentos funcionales del mismo, a un paciente que lo necesite en una cantidad eficaz para tratar la deficiencia de factor VIII. En determinadas realizaciones, el factor VIII recombinante puede administrarse trasplantando células modificadas genéticamente para producir el factor VIII recombinante, típicamente mediante la implantación de un dispositivo que contiene tales células. Dicho trasplante típicamente implica el uso de fibroblastos dérmicos recombinantes, un enfoque no viral (Roth, et al., New Engl. J. Med. 344:1735-1742 (2001)).

La administración de vectores de expresión que codifican FVIII a pacientes con deficiencia de factor VIII puede dar como resultado una expresión suficiente del polipéptido de FVIII para reconstituir funcionalmente la cascada de coagulación. El vector o los vectores de expresión pueden administrarse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos en una composición farmacéuticamente aceptable o biológicamente compatible.

El polinucleótido que codifica el FVIII puede emplearse como una molécula de cadena única que contiene porciones de cadena pesada y ligera (FIG. 10) o dividirse en dos o múltiples moléculas (p. ej., Cadena pesada y ligera; FIG. 11) en forma viral o no viral. vectores para el suministro a las células huésped del paciente.

En una realización preferida de la invención, el vector de expresión que comprende las secuencias de ácido nucleico que codifican los mutantes del FVIII mutante es un vector viral. Los vectores virales que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales (con o sin promotores/potenciadores específicos de tejido), vectores de virus adenoasociados (AAV) de múltiples serotipos (p. ej., AAV-1 a AAV -12 y otros) y vectores híbridos de AAV, vectores de lentivirus y vectores de lentivirus pseudo-tipificados [p. ej., virus del Ébola, virus de la estomatitis vesicular (VSV) y virus de la inmunodeficiencia felina (VIF)], vectores del virus del herpes simple, vectores del virus de la vacuna, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores no virales y otros.

Se proporcionan métodos para la administración de un vector viral que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un FVIII mutante, o un fragmento funcional del mismo implican el uso de vectores AAV o vectores lentivi rales. Lo más preferiblemente, solo se incluyen las partes esenciales del vector, p. ej., los elementos ITR y LTR, respectivamente. El suministro directo de vectores o la transducción ex vivo de células humanas y seguido de la infusión en el cuerpo dará como resultado la expresión de FVIII mutantes ejerciendo de ese modo un efecto terapéutico beneficioso sobre la hemostasis al potenciar la actividad pro-coagulación.

Los vectores lentivirales y AAV recombinantes han encontrado una amplia utilidad para una variedad de aplicaciones de terapia génica. Su utilidad para tales aplicaciones se debe en gran parte a la alta eficiencia de la transferencia de genes in vivo lograda en una variedad de contextos de órganos. Se pueden usar AAV y partículas lentivirales con ventaja como vehículos para el suministro de genes eficaz. Dichos viriones poseen una serie de características deseables para tales aplicaciones, incluido el tropismo para células en división y no en división. La experiencia clínica temprana con estos vectores tampoco demostró toxicidad sostenida y las respuestas inmunitarias fueron mínimas o indetectables. Se sabe que los v Aa infectan una amplia variedad de tipos de células in vivo e in vitro por endocitosis mediada por receptores o por transcitosis. Estos sistemas de vectores se han probado en seres humanos dirigidos al epitelio retiniano, hígado, músculo esquelético, vías respiratorias, cerebro, articulaciones y células madre hematopoyéticas. Es probable que los vectores no virales basados en ADN plasmídico o en minicírculos también sean vectores de transferencia génica adecuados para un gen grande como el que codifica el FVIII.

Es deseable introducir un vector que pueda proporcionar, p. ej., suficiente expresión de un gen deseado y mínima inmunogenicidad. Los vectores lentivirales y AAV mejorados y los métodos para producir dichos vectores se han descrito en detalle en una serie de referencias, patentes y solicitudes de patente, incluyendo Wright JF (Hum Gene Ther 20: 698-706, 2009) que describe la producción de grado clínico vectores. El vector lentiviral se puede producir en CHOP y los otros vectores están disponibles a través del laboratorio central de producción de vectores de Lentivirus por el Programa de Recursos de Terapia Genética del NHLBI (GTRP)-Lentivirus Vector Production Core Laboratory.

Para algunas aplicaciones, una construcción de expresión puede comprender además elementos reguladores que sirven para impulsar la expresión en un tipo de tejido o célula particular. Dichos elementos reguladores son conocidos por los expertos en la técnica y se analizan en profundidad en Sambrook, et al. (1989) y Ausubel, et al. (1992). La incorporación de elementos reguladores específicos de tejido en las construcciones de expresión de la presente invención proporciona al menos un tropismo tisular parcial para la expresión de los FVIII mutantes o fragmentos funcionales de los mismos. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican el FVIII mutante bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV) se pueden emplear para la expresión del músculo esquelético o la hAAT-ApoE y otras para la expresión específica del hígado. Los promotores específicos hematopoyéticos en vectores lentivirales también se pueden usar con ventaja en los métodos de la presente invención.

En una realización preferida, la secuencia de FVIII mutante se proporciona como un componente de un vector viral empaquetado en una cápside. En una realización particularmente preferida, se usa un vector AAV para el suministro in vivo de los FVIII mutantes (Gnatenko, et al., Br. J. Haematol. 104: 27-36 (1999)). En este caso, el vector AAV incluye al menos un FVIII mutante y secuencias de control de expresión asociadas para controlar la expresión de la secuencia de FVIII mutante. Como se muestra en las FIGS. 10 y 11, los vectores de AAV ejemplares para expresar secuencias de FVIII mutante pueden incluir regiones reguladoras de promotor-potenciador para la expresión de FVIII e ITR que actúan en cis que funcionan para promover la replicación y empaquetamiento de los ácidos nucleicos de FVIII mutante en las cápsides de AAV y la integración del nucleico de FVIII mutante. ácido en el genoma de una célula objetivo. Preferiblemente, el vector AAV tiene sus genes rep y cap eliminados y reemplazados por la secuencia de hFVIII mutante y sus secuencias de control de expresión asociadas. Como se muestra en las FIGS. 10 y 11, la secuencia de FVIII mutante se inserta típicamente junto a uno o dos (es decir, flanqueados por) elementos de TR o TR de AAV adecuados para la replicación viral. También pueden incluirse otras secuencias reguladoras adecuadas para facilitar la expresión específica de tejido de la secuencia de hFVIII mutante en la célula objetivo.

El componente de la cápside viral de los vectores virales empaquetados puede ser una cápside de parvovirus. Se prefieren la tapa de AAV y las cápsides quiméricas. Ejemplos de componentes de cápside viral de parvovirus adecuados son componentes de cápside de la familia Parvoviridae, tales como un parvovirus autónomo o un dependovirus. Por ejemplo, la cápside viral puede ser una cápside AAV (p. ej., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV 9, AAV10, AAV 11 o AAV 12 cápside; un experto en la técnica sabría son probablemente otras variantes aún no identificadas que realizan la misma función o una función similar), o pueden incluir componentes de dos o más cápsides de AAV. Un complemento completo de proteínas Cap de AAV incluye VP1, VP2 y VP3. El ORF que comprende secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de la cápside de VP de AAV puede comprender menos de un complemento completo de proteínas Cap de AAV o puede proporcionarse el complemento completo de proteínas Cap de AAV.

Una o más de las proteínas Cap de AAV pueden ser una proteína quimérica, incluidas las secuencias de aminoácidos Caps de AAV de dos o más virus, preferiblemente dos o más AAV, como se describe en Rabinowitz et al., Patente de EE.UU. N° 6.491.907. Por ejemplo, la cápside del virus quimérico puede incluir una proteína o subunidad Cap de AAV1 y al menos una subunidad o una Cap de AAV2. La cápside quimérica puede incluir, p. ej., una cápside de AAV con una o más subunidades Cap de B19, p. ej., una proteína o subunidad Cap de AAV puede ser reemplazada por una proteína o subunidad Cap de B19. Por ejemplo, la subunidad Vp3 de la cápside a Av se puede reemplazar por la subunidad Vp2 de B19.

Pueden cultivarse células empaquetadas para producir vectores virales empaquetados de la invención. Las células de empaquetamiento pueden incluir (1) función (es) de vector viral heterólogas, (2) función (es) de empaquetamiento y (3) función (es) auxiliar. Las funciones del vector viral incluyen típicamente una porción de un genoma de parvovirus, tal como un genoma de AAV, con rep y cap eliminados y reemplazados por la secuencia de FVIII mutante y sus secuencias de control de expresión asociadas como se describió anteriormente.

En determinadas realizaciones, las funciones del vector viral pueden proporcionarse adecuadamente como plantillas de vector duplicado, como se describe en la Publicación de Patente de Ee .UU. N° 2004/0029106 de Samulski et al. Los vectores duplicados son polinucleótidos diméricos autocomplementarios (sc) (típicamente, ADN). Por ejemplo, el ADN de los vectores duplicados puede seleccionarse para formar una estructura de horquilla de doble hebra debido al apareamiento de bases intracadena. Ambas cadenas de los vectores de ADN duplicados pueden empaquetarse dentro de una cápside viral. El vector duplicado proporciona una función comparable a los vectores de virus de ADN de doble hebra y puede aliviar la necesidad de la célula objetivo de sintetizar ADN complementario al genoma de hebra sencilla normalmente encapsidado por el virus.

Los TR (resolubles y no resolubles) seleccionados para su uso en los vectores virales son preferiblemente secuencias de AAV (de cualquier serotipo de AAV). Las ITR de AAV resolubles no necesitan tener una secuencia de TR de tipo salvaje (p. ej., una secuencia de tipo salvaje puede ser alterada por inserción, supresión, truncamiento o mutaciones sin sentido), siempre que la TR medie las funciones deseadas, p. ej., empaquetamiento de virus, integración, y/o rescate de provirus, y similares. Los TR pueden ser secuencias sintéticas que funcionan como repeticiones terminales invertidas de AAV, tales como la “secuencia de doble D” como se describe en la Patente de EE.UU. N° 5.478.745 de Samulski et al. Normalmente, pero no necesariamente, las TR son del mismo parvovirus, p. ej., ambas secuencias de TR son de AAV2.

Las funciones de envasado incluyen componentes de cápside. Los componentes de la cápside son preferiblemente de una cápside parvoviral, tal como una cápside de AAV o una función de cápside de AAV quimérica. Ejemplos de componentes de la cápside viral de parvovirus adecuados son componentes de la cápside de la familia Parvoviridae, tales como un parvovirus autónomo o un Dependovirus. Por ejemplo, los componentes de la cápside pueden seleccionarse de las cápsides de AAV, p. ej., AAV1-AAV12 y otras cápsides nuevas aún no identificadas o de fuentes de primates no humanos. Los componentes de la cápside pueden incluir componentes de dos o más cápsides de AAV.

En determinadas realizaciones, una o más de las proteínas de la cápside VP pueden comprender proteínas quiméricas, que comprenden secuencias de aminoácidos de dos o más virus, preferiblemente dos o más AAV, como se describe en Rabinowitz et al., Patente de EE.UU. N° 6.491.907. Por ejemplo, la cápside del virus quimérico puede incluir una región de la cápside de un virus adenoasociado (AAV) y al menos una región de la cápside de un virus B19. La cápside quimérica puede incluir, p. ej., una cápside de AAV con una o más subunidades de la cápside B19, p. ej., una subunidad de la cápside de a Av puede reemplazarse por una subunidad de la cápside B19. Por ejemplo, la subunidad VP1, VP2 o VP3 de la cápside AAV se puede reemplazar por la subunidad VP1, VP2 o VP3 de B19. Como otro ejemplo, la cápside quimérica puede incluir una cápside de AAV de tipo 2 en la que la subunidad de VP1 de tipo 2 ha sido reemplazada por la subunidad de VP1 de una cápside de AAV de tipo 1, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente una cápside de tipo 3, 4 o 5. Alternativamente, el parvovirus quimérico tiene una cápside de AAV de tipo 2 en la que la subunidad de VP2 de tipo 2 ha sido reemplazada por la subunidad de VP2 de una cápside de AAV de tipo 1, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente una cápside de tipo 3, 4 o 5. Asimismo, se prefieren los parvovirus quiméricos en los que la subunidad VP3 de un AAV de tipo 1, 3, 4, 5 o 6 (más preferiblemente, de tipo 3, 4 o 5) se sustituye por la subunidad VP3 de una cápside de AAV de tipo 2. Como alternativa adicional, se prefieren los parvovirus quiméricos en los que dos de las subunidades de AAV tipo 2 se reemplazan por las subunidades de un AAV de un serotipo diferente (p. ej., AAV tipo 1, 3, 4, 5 o 6). En parvovirus quiméricos ejemplares de acuerdo con esta realización, las subunidades VP1 y VP2, o VP1 y VP3, o VP2 y VP3 de una cápside de AAV tipo 2 se reemplazan por las subunidades correspondientes de un AAV de un serotipo diferente (p. ej., AAV tipo 1, 3, 4, 5 o 6). Asimismo, en otras realizaciones preferidas, el parvovirus quimérico tiene una cápside de AAV de tipo 1, 3, 4, 5 o 6 (preferiblemente la cápside de tipo 2, 3 o 5) en la que una o dos subunidades han sido reemplazadas por las de un AAV de un serotipo diferente, como se describió anteriormente para AAV tipo 2.

El vector viral empaquetado generalmente incluye la secuencia de FVIII mutante y las secuencias de control de expresión flanqueadas por elementos TR suficientes para dar como resultado el empaquetamiento del ADN del vector y la expresión subsiguiente de la secuencia de FVIII mutante en la célula transducida. Las funciones del vector viral pueden, p. ej., suministrarse a la célula como un componente de un plásmido o un amplicón. Las funciones del vector viral pueden existir extracromosómicamente dentro de la línea celular y/o pueden integrarse en el ADN cromosómico de las células.

En una realización preferida, el FVIII mutante descrito en el presente documento se usa para la terapia génica de trastornos asociados con el FVIII, como la hemofilia A. En este caso, la expresión del transgén del FVIII mutante puede mejorar la coagulación en un sujeto que de otro modo sería vulnerable a hemorragias incontroladas debido al factor VIII deficiencia (p. ej., hemorragia intraarticular, intracraneal o gastrointestinal), incluidos los hemofílicos que han desarrollado anticuerpos contra el factor VIII humano. Las células objetivo de los vectores son células capaces de expresar polipéptidos con actividad de FVIII, como las del sistema hepático de un mamífero, células endoteliales y otras células con la maquinaria celular adecuada para procesar el precursor para producir proteína con actividad de FVIII.

En realizaciones particulares, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un vector de la presente invención que incluye un gen modificado de FVIII en un vehículo farmacéuticamente aceptable y/u otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, vehículos, adyuvantes, diluyentes, etc.

Las dosis de tratamiento de factor VIII recombinante que deben administrarse a un paciente que necesite dicho tratamiento variarán dependiendo de la gravedad de la deficiencia de factor VIII. Generalmente, el nivel de dosis se ajusta en frecuencia, duración y unidades de acuerdo con la gravedad y duración del episodio hemorrágico de cada paciente. Por consiguiente, el factor VIII recombinante se incluye en un portador, vehículo de administración o estabilizador farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína para detener la hemorragia, medida mediante ensayos de coagulación estándar.

El factor VIII se define clásicamente como la sustancia presente en el plasma sanguíneo normal que corrige el defecto de coagulación en el plasma derivado de individuos con hemofilia A. La actividad coagulante in vitro de las formas purificadas y parcialmente purificadas de factor VIII se utiliza para calcular la dosis de recombinante. factor VIII para infusiones en pacientes humanos y es un indicador fiable de la actividad recuperada del plasma del paciente y de la corrección del defecto hemorrágico in vivo. No se han informado discrepancias entre el ensayo estándar de nuevas moléculas de factor VIII in vitro y su comportamiento en el modelo de infusión de perros o en pacientes humanos, según Lusher, et al., New Engl. J. Med. 328:453-459 (1993); Pittman, et al., Blood 79:389-397 (1992); y Brinkhous, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 82:8752-8755 (1985).

Por lo general, el nivel de actividad del factor VIII en plasma deseado que se debe lograr en el paciente mediante la administración del factor VIII recombinante está en el rango de 30-200% de lo normal. En una realización, la administración del factor VIII recombinante terapéutico se administra por vía intravenosa en una dosis preferida en el rango de aproximadamente 5 a 500 unidades/kg de peso corporal, y particularmente en un rango de 10-100 unidades/kg de peso corporal, y además particularmente a una dosis de 20 a 40 unidades/kg de peso corporal; la frecuencia del intervalo está en el rango de aproximadamente 8 a 24 horas (en hemofílicos severamente afectados); y la duración del tratamiento en días está en el rango de 1 a 10 días o hasta que se resuelva el episodio hemorrágico. Ver, p. ej., Roberts, H. R. y M. R. Jones, “Hemophilia and Related Conditions— Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII to XII),” cap. 153, 1453-1474, 1460, en Hematology, Williams, W. J., et al., Ed. (1990). Los pacientes con inhibidores pueden requerir una cantidad diferente de factor VIII recombinante que su forma anterior de factor VIII. Por ejemplo, los pacientes pueden requerir menos factor VIII recombinante debido a su mayor actividad específica que el VIII de tipo salvaje y su menor reactividad de anticuerpos. Como en el tratamiento con factor VIII humano o derivado de plasma, la cantidad de factor VIII recombinante terapéutico infundido se define mediante el ensayo de coagulación de factor VIII en una etapa y, en casos seleccionados, la recuperación in vivo se determina midiendo el factor VIII en el paciente plasma después de la infusión. Debe entenderse que, para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los rangos de concentración establecidos en el presente documento son ejemplares. únicamente y no pretenden limitar el alcance o la práctica del factor VIII recombinante reivindicado.

El tratamiento puede tomar la forma de una única administración intravenosa del factor VIII recombinante o una administración periódica o continua durante un período de tiempo prolongado, según sea necesario. Alternativamente, el factor VIII recombinante terapéutico puede administrarse por vía subcutánea u oral con liposomas en una o varias dosis a intervalos de tiempo variables.

Para la inyección, el vehículo normalmente será un líquido. Para otros métodos de administración, el vehículo puede ser sólido o líquido. Para la administración por inhalación, el vehículo será respirable y preferiblemente estará en forma de partículas sólidas o líquidas. Como medio de inyección, se prefiere utilizar agua que contenga los aditivos habituales para las soluciones inyectables, tales como agentes estabilizantes, sales o solución salina y/o tampones.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares incluyen agua estéril sin pirógenos y solución salina tamponada con fosfato estéril y libre de pirógenos. Los vehículos fisiológicamente aceptables incluyen vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son aquellos que no son biológicamente o de otro modo indeseables, es decir, el material se puede administrar a un sujeto sin causar efectos biológicos indeseables que superen los efectos biológicos ventajosos del material. Se puede usar una composición farmacéutica, p. ej., en la transfección de una célula ex vivo o en la administración de un vector viral o una célula directamente a un sujeto.

Los vectores de virus recombinantes que comprenden el gen modificado de FVIII se administran preferiblemente a la célula en una cantidad biológicamente eficaz. Si el vector viral se administra a una célula in vivo (p. ej., El virus se administra a un sujeto como se describe a continuación), una cantidad biológicamente eficaz del vector viral es una cantidad que es suficiente para producir la transducción y expresión del transgén. en una célula objetivo.

Las células transducidas con un vector viral se administran preferiblemente al sujeto en una “cantidad terapéuticamente eficaz” en combinación con un vehículo farmacéutico. Los expertos en la técnica apreciarán que los efectos terapéuticos no necesitan ser completos o curativos, siempre que se proporcione algún beneficio al sujeto.

Las dosis de las células para administrar a un sujeto variarán según la edad, el estado y la especie del sujeto, el tipo de célula, el ácido nucleico expresado por la célula, el modo de administración y similares. Normalmente, se administrarán por dosis al menos de aproximadamente 102 a aproximadamente 108, preferiblemente de aproximadamente 103 a aproximadamente 108 células. Preferiblemente, las células se administrarán en una cantidad terapéuticamente eficaz.

La administración del vector a un sujeto humano o un animal que lo necesite puede ser por cualquier medio conocido en la técnica para administrar vectores de virus. Los modos de administración ejemplares incluyen administración rectal, transmucosa, tópica, transdérmica, por inhalación, parenteral (p. ej., Intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular e intraarticular) y similares, así como inyección directa en tejidos u órganos, alternativamente, intratecal, directa, inyecciones intramusculares, intraventriculares, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Alternativamente, se puede administrar el virus de forma local en lugar de sistémica, p. ej., en una formulación de liberación prolongada o de depósito.

En otras realizaciones preferidas, el vector de la invención que comprende el gen del FVIII mutante se administra por vía intramuscular, más preferiblemente por inyección intramuscular o por administración local. Los vectores descritos en el presente documento pueden administrarse a los pulmones de un sujeto por cualquier medio adecuado, pero preferiblemente se administran administrando una suspensión en aerosol de partículas respirables compuestas por los vectores de parvovirus de la invención, que el sujeto inhala. Las partículas respirables pueden ser líquidas o sólidas. Los aerosoles de partículas líquidas que comprenden los vectores de parvovirus de la invención se pueden producir por cualquier medio adecuado, tal como con un nebulizador de aerosol impulsado por presión o un nebulizador ultrasónico, como es conocido por los expertos en la técnica. Ver, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 4,501,729.

Las dosis del vector viral con el gen del FVIII mutante dependerán del modo de administración, la enfermedad o afección a tratar, la afección del sujeto individual, el vector viral particular y el gen que se administrará, y se pueden determinar de forma rutinaria. conducta. Dosis ejemplares para lograr efectos terapéuticos son títulos de virus de al menos aproximadamente 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015 unidades transductoras o más, preferiblemente aproximadamente 108-1013 unidades transductoras, aún más preferiblemente 1012 unidades transductoras. Los genes de FVIII mutantes pueden administrarse como componentes de una molécula de ADN que tiene elementos reguladores apropiados para la expresión en las células objetivo. Los genes mutantes del FVIII se pueden administrar como componentes de plásmidos virales, como los vectores rAAV. Las partículas virales pueden administrarse como partículas virales solas, ya sea como un suministro directo in vivo a la vasculatura portal o como un tratamiento ex vivo que comprende administrar las partículas virales del vector in vitro a las células del animal que recibe el tratamiento seguido de la introducción de las células transducidas de nuevo en el donante.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes.

Ejemplo 1: construcción, expresión y purificación de mutantes del factor viii sin dom inio b

El plásmido pAAV-CB-F8 lleva un ADNc del factor VIII humano (hF8) sin dominio B bajo el control de un promotor CB (promotor de beta-actina con un potenciador de CMV). Este plásmido, de acuerdo con la construcción mostrada en la FIG. 10, se utilizó como molde para fabricar varios mutantes de hF8. Se sintetizó químicamente un fragmento de ADNc de hF8 que codifica las mutaciones de sustitución I86V, Y105F, A108S, D115E, Q117H, F129L, G132K, H134Q, M147T y L152P y se usó para reemplazar la región correspondiente de pAAV-CB-F8. El plásmido resultante (pAAV-CB-F8-X10) expresa una proteína de factor VIII mutante con las 10 mutaciones anteriores (F8-X10; SEQ ID NO:3).

Un fragmento de ADNc del factor VIII que codifica las mutaciones de sustitución I86V, A108S, G132K, M147T, L152P se sintetizó químicamente y se usó para reemplazar la región correspondiente de pAAV-CB-F8. El plásmido resultante (pAAV-CB-F8-X5) expresa una proteína del factor VIII mutante con las 5 mutaciones anteriores (F8-X5; SEQ ID NO:4).

Se utilizó mutagénesis dirigida al sitio para introducir mutaciones individuales correspondientes a I86, Y105, A108, D115, Q117, F129, G132, H134, M147, L152 del factor VIII humano en el plásmido pAAV-CB-F8. Los plásmidos resultantes incluyen pAAV-CB-F8-I86V, pAAV-CB-F8-Y 105F, pAAV-CB-F8-A108S, pAAV-CB-F8-D115E, pAAV-CB F8-Q117H, pAAV-CB-F8-F129L, pAAV-CB-F8-G132K, pAAV-CB-F8-H134Q y pAAV-CB-F8- M147T, pAAV-CB-F8-L152P.

La mutagénesis dirigida al sitio también se utilizó para revertir mutaciones individuales en los aminoácidos 86, 105, 108, 115, 117, 129, 132, 134, 147, 152 de hF8-X10 en el plásmido pAAV-CB-F8-X10 a aminoácidos humanos de tipo salvaje. Los plásmidos resultantes incluyen pAAV-CB- F8-X10-V86I, pAAV-CB-F8-X10- F105Y, pAAV-CB-F8-X10-S108A, pAAV-CB-F8-X10- E115D, pAAV-CB-F8-X10-H117Q, pAAV-CB-F8-X10-L129F, pAAV-CB-F8-X10-K132G, pAAV-CB-F8-X10-Q134H, pAAV-CB-F8-X10-T147M, pAAV-CB-F8-X10-P152L. Estos mutantes se probaron como se describe en el Ejemplo 4 (Fig. 7) a continuación.

Se utilizó un conjunto de oligonucleótidos degenerados con NNN correspondiente a la posición G132 para crear las 19 mutaciones correspondientes a G132. Los plásmidos mutantes del factor VIII resultantes incluyen pAAV-CB-F8-G132A, pAAV-CB-F8-G132I, .... pAAV-CB-F8-G132V, etc. La última letra indica la sustitución de aminoácidos en esa posición particular. Puede usarse una estrategia similar para generar otras sustituciones de acuerdo con la presente invención.

Los plásmidos descritos anteriormente contienen un AAV-ITR y se pueden usar para generar vectores AAV. Puede usarse un promotor específico del hígado para reemplazar el promotor CB para reducir el tamaño del casete de expresión y mejorar el empaquetamiento y la expresión del vector en el hígado. También se pueden usar otros promotores específicos de tejido.

Las secuencias entre la cadena pesada de FVIII y el codón de terminación de FVIII se eliminaron de los vectores de expresión de FVIII. Los mutantes de cadena pesada (HC) resultantes contienen los primeros 745 aminoácidos de FVIII y carecen de secuencias de dominio B (BDD) y cadena ligera (LC). El plásmido pAAV-CB-HC-X10 contiene mutaciones correspondientes a I86V, Y105F, A108S, D115E, Q117H, F129L, G132K, H134Q, M147T y L152P en la cadena pesada. El plásmido pAAV-CB-HC-X5 contiene mutaciones correspondientes a I86V, A108S, G132K, M147T, L152P en la cadena pesada. El plásmido pAAV-CB-HC-G132K contiene la mutación G132K en la cadena pesada. Alternativamente, se puede añadir la región ácida 3 (a3) a estas construcciones para obtener mutantes de HC en un fondo de HC1690.

Ejemplo 2: comparación de diferentes mutantes del factor viii para la secreción en células de cultivo de tejidos

Los plásmidos pAAV-CB-hBDD-F8 (wt), pAAV-CB-hBDD-F8-X10, pAAV-CB- hBDD-F8-X5 y pAAV-CB-hBDD-F8-G312K se transfectaron por separado en células BHK (panel A) o 293 celdas (panel B). El F8 secretado en el medio se recogió y se analizó mediante un ensayo de aPTT a las 48 horas después de la transfección. La expresión/secreción del BDD-F8 humano de tipo salvaje (hBDD) se estableció como un 100%. Como se muestra en la FIG. 7, los mutantes de hF8 se secretaron a niveles de expresión aproximadamente 2-8,5 veces más altos que el hF8 de tipo salvaje.

Ejemplo 3: comparación de la secreción del mutante del factor viii humano in vivo

Plásmidos pAAV-CB-hBDDF8 (dominio B eliminado (BDD) con hF8), pAAV-CB-hBDDF8-X10 (hF8-BDD con 10 sustituciones; SEQ ID NO:3), pAAV-CB-hBDD-F8-X5 (hF8 con 5 sustituciones; SEQ ID NO:4) y pAAV-CB-hBDD-F8-G312K (hF8 con sustitución G132K) se inyectaron por separado a ratones Blab/cy F8 con doble knock-out. El F8 secretado en la sangre se recogió y analizó mediante un ensayo de aPTT a las 48 horas después de la inyección. La expresión/secreción por F8 humano de tipo salvaje (hBDD-F8) se estableció como 100%. Todos los mutantes descritos aquí superan al factor VIII de tipo salvaje. Como se muestra en la FIG. 8, los mutantes de hF8 se secretaron a niveles de expresión aproximadamente 1,2-5,2 veces más altos que el hF8 de tipo salvaje.

Ejemplo 4: comparación de diferentes mutantes del factor viii en secreción

Los plásmidos que codifican aminoácidos en hBDD-F8-X10 se modificaron para revertir las sustituciones mutantes a sus correspondientes aminoácidos de tipo salvaje como se indica en la tabla. Por ejemplo, hBDD-F8-X10-V86I significa que “V86” en hBDD-F8-X10 se cambió de nuevo a “I”. En hBDD-F8-X10-6p, 6 de 10 aminoácidos mutantes en hBDD-F8-X10 se volvieron a convertir en sus correspondientes aminoácidos de tipo salvaje. Los plásmidos anteriores se transfectaron por separado en células 293. El F8 secretado en el medio se recogió y se analizó mediante un ensayo de aPTT a las 48 horas después de la transfección. La expresión/secreción por hBDD-F8-X10 se estableció como 100%. Como se muestra en la FIG. 9, todos los revertientes exhibieron expresión y secreción reducidas en comparación con el mutante hBDD-F8-X10.

Ejemplo 5: comparación de diferentes mutantes del factor viii en secreción

Vector AAV8 AAV-apoEhAAT-hF8HC1690 (que lleva la cadena pesada aa1-745 del factor VIII humano y la secuencia a3, apoEhAAT: promotor de antitripsina alfa uno humana con potenciador de apo E) y AAV-apoEhAAT-hF8-HC-X10 (hF8HC con 10 sustituciones) se inyectaron cada uno por separado en ratones knock-out F8 con un vector de expresión de cadena ligera (dosis: cada vector partículas 1E11/ratón). El F8 secretado en la sangre se recogió y se analizó mediante un ensayo de aPTT en los tiempos indicados. La expresión/secreción por la cadena pesada de F8 humana de tipo salvaje (hF8-HC1690) se estableció como 100%. El mutante hF8-HC1690-X10 descrito aquí supera la expresión de cadena pesada de tipo salvaje. Como se muestra en la FIG. 10, el mutante hF8-HC1690-XI0 se secretó a niveles de expresión aproximadamente 6-20 veces superiores en comparación con el hF8HC de tipo salvaje.

Ejemplo 6: comparación de mutantes de cadena pesada del factor v iii g132 en secreción en células 293

El plásmido pAAV-CB-hF8-HC1690 (que lleva la cadena pesada aa#1-745 del factor VIII humano y la secuencia a3; ver FIG. 1) o los plásmidos con las sustituciones indicadas en G132 se transfectaron en células 293 con una expresión de cadena ligera (LC) de F8 plásmido. El F8 secretado en el medio se recogió y se analizó mediante un ensayo de aPTT a las 48 horas después de la transfección. La expresión/secreción por la cadena pesada de F8 humana de tipo salvaje (hF8-HC1690) se estableció como 100%. Como se muestra en la FIG. 11, los mutantes F8 G132HC1690 se secretaron a niveles de expresión aproximadamente 1,4-3,4 veces superiores en comparación con el hF8HC de tipo salvaje.

Ejemplo 7: comparación de diferentes mutantes de la cadena pesada del factor viii en expresión/secreción in vivo

Plásmidos pAAV-CB-hF8-HC1690 (que llevan la cadena pesada aa#1-745 del factor VIII humano y la secuencia de la región ácida 3 (a3); ver las FIGS. 1, 6), pAAV-CB-hF8-HC1690-X10 (cadena pesada de hF8 con 10 sustituciones; SEQ ID NO:5), pAAV-CB-hF8-HC1690-X5 (hF8 cadena pesada con 5 sustituciones junto con la secuencia a3; SEQ ID NO:6) y pAAV-CB-hF8-HC1690-G312K (hF8 cadena pesada con sustitución de G132K y secuencia a3) se inyectaron por separado en ratones con doble knock-out Blab/cy F8 junto con un plásmido de expresión de cadena ligera. El f 8 secretado en la sangre se recogió y analizó mediante un ensayo de aPTT a las 48 horas después de la inyección. La expresión/secreción por la cadena pesada de F8 humana de tipo salvaje (hF8-HC1690) se estableció como 100%. Como se muestra en la FIG. 12, los mutantes de hF8 se secretaron a niveles de expresión de aproximadamente 2,5 a 4,5 veces más altos que el hF8HC de tipo salvaje.

Ejemplo 8: comparación de mutantes de cadena pesada del factor v iii l152 en secreción en células 293

El plásmido pAAV-CB-hF8-HC1690 (que lleva la cadena pesada aa#1-745 del factor VIII humano y la secuencia a3; ver las FIGS. 1, 6) o los plásmidos con las sustituciones indicadas en L152 se transfectaron por separado en células 293 con una expresión de cadena ligera de hF8 plásmido. La hF8 secretada en el medio se recogió y se analizó mediante un ensayo de aPTT a las 48 horas después de la transfección. La expresión/secreción por la cadena pesada de F8 humana de tipo salvaje (hF8-HC1690) se estableció como 100%. Los mutantes de hF8-L152HC se identifican por sus sustituciones de aminoácidos específicas en la Figura. Como se muestra en la FIG. 13, los mutantes de hF8-L152HC se secretaron a niveles de expresión aproximadamente 1,4-3,5 veces superiores en comparación con hF8HC de tipo salvaje.

Ejemplo 9: comparación de mutantes de cadena pesada del factor v iii a108 en secreción en células 293

El plásmido pAAV-CB-hF8-HC1690 (que lleva la cadena pesada aa#1-745 del factor VIII humano y la secuencia a3; ver la FIG. 1) o los plásmidos con las sustituciones indicadas en A108 se transfectaron por separado en células 293 con un plásmido de expresión de la cadena ligera de hF8. La hF8 secretada en el medio se recogió y se analizó mediante un ensayo de aPTT a las 48 horas después de la transfección. Los mutantes de hF8-A108HC se identifican por sus sustituciones de aminoácidos específicas en la Figura. La expresión/secreción por la cadena pesada de F8 humana de tipo salvaje (hF8-HC1690) se estableció como 100%. Como se muestra en la FIG. 14, la mayoría de los mutantes de hF8-A108HC se secretaron a niveles de expresión más altos en comparación con el hF8HC de tipo salvaje.

Ejemplo 10: comparación de mutantes de cadena pesada del factor v iii m147 en secreción en células 293

El plásmido pAAV-CB-hF8-HC1690 (que lleva la cadena pesada aa#1-745 del factor VIII humano y la secuencia a3; ver la FIG. 1) o los plásmidos con las sustituciones indicadas en M147 se transfectaron por separado en células 293 con un plásmido de expresión de la cadena ligera de hF8. La hF8 secretada en el medio se recogió y se ensayó mediante ELISA de hF8 a las 48 horas después de la transfección. Los mutantes de hF8-M147HC se identifican por sus sustituciones de aminoácidos específicas en la Figura. La expresión/secreción por la cadena pesada de F8 humana de tipo salvaje (hF8-HC1690) se estableció como 100%. Como se muestra en la FIG. 15, la mayoría de los mutantes de hF8-M147HC se secretaron a niveles de expresión más altos en comparación con el hF8HC de tipo salvaje.

Ejemplo 11: no se detectaron anticuerpos neutralizantes contra 5 aminoácidos mutados en el modelo de rata f8 -/­

A ratas F8 -/- en un fondo WAG/RijYcb con una sola mutación en el dominio A1 (Leul76Pro) se les administró AAV-TTR-hF8-X10 a 1x1012 partículas virales/por rata. De 3 ratas inyectadas, se confirmó que dos desarrollaron anticuerpos inhibidores del factor VIII antihumano de rata contra el factor VIII, según se determinó mediante un ensayo de

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. - Un muíante polipeptídico aislado del factor VIII humano que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en I86V, I86L, I86M, Y105F, Y105W, A108S, A108G, A108T, A108P, D115E, D115N, D115H, D115Q, D115R, D115K, Q117H, Q117N, Q117E, Q117D, Q117R, Q117K, F129L, F129V, F129I, F129M, F129P, F129T, F129K, G132K, G132E, G132D, G132R, G132T, G132M, G132N, G132S, G132W, H134Q, H134G, H134Y, H134N, H134E, H134D, H134R, H134K, M147T, M147A, M147G, M147S, M147P, L152P, L152S, L152G y L152T.

2. - El mutante según la Reivindicación 1, donde la(s) sustitución(es) de aminoácidos se selecciona(n) del grupo que consiste en I86V, Y105F, A108S, D115E, Q117H, F129L, G132K, H134Q, M147T y L152P.

3. - El mutante según la Reivindicación 1, que comprende sustituciones de aminoácidos en cada uno de los aminoácidos I86, Y105, A108, D115, Q117, f 129, G132, H134, M147 y L152, que comprende opcionalmente cada una de las sustituciones de aminoácidos I86V, Y105F, A108S, D115E, Q117H, F129L, G132K, H134Q, M147T y L152P.

4. - El mutante según la Reivindicación 1, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en uno o más aminoácidos seleccionados del grupo formado por I86, A108, G132, M147 and L152.

5. - El mutante según la Reivindicación 4, en el que la o las sustituciones de uno o más aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en I86V, A108S, G132K, M147T and L152P.

6. - El mutante según la Reivindicación 4, que comprende sustituciones de aminoácidos en cada uno de los aminoácidos I86, A108, G132, M147 and L152, que comprende opcionalmente sustituciones de aminoácidos en cada uno de los aminoácidos I86V, A108S, G132K, M147T and L152P.

7. - El mutante según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, que además comprende una supresión en el dominio B del factor VIII humano, que opcionalmente comprende además el/los dominio(s) a2 y/o a3 del factor VIII humano.

8. - Un polinucleótido aislado que codifica el mutante según cualquiera de las Reivindicaciones de 1 a 7.

9. - Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según la Reivindicación 8.

10. - Una célula huésped que comprende el polinucleótido según la Reivindicación 8.

11. - Célula huésped que comprende el vector de expresión según la Reivindicación 9.

12. - Una composición farmacéutica que comprende el vector de expresión según la Reivindicación 11.

13. - La composición farmacéutica según la Reivindicación 12 para su uso en el tratamiento de una deficiencia de factor VIII.

14. - Un método para expresar un mutante polipeptídico del factor VIII humano que comprende:

(a) - transformar una célula huésped con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico según la Reivindicación 9;

(b) - hacer crecer la célula huésped en condiciones adecuadas para expresar el mutante del polipéptido del factor VIII humano; and

(c) - purificar el polipéptido mutante del factor VIII humano a partir de células huésped que expresan dicho mutante.