JP2012507286A - オメガ9品質カラシナ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2008年11月4日に出願された「Omega-9 Quality Brassica Juncea」についての米国特許仮出願番号第61/198,442号の出願日の利益を主張するものである。
1309746082250_0.com
)、又は一本鎖高次構造多形(single strand conformational polymorphisms:SSCP)に基づくアッセイ(Orita et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A.86:2766-2770, 1989)を挙げることができる。
図1を参照して、カラシナ遺伝的背景を完全に回復させるための、高オレイン酸−低リノレン酸選択物とカラシナ親(Zem1、Zem2及びZEスコロスペルカ)間の1回又はそれ以上の戻し交配(BC3及びBC4)。ゼロエルカ酸カラシナ系統のみを、戻し交配プログラムで使用した。これは、FAE遺伝子(単数又は複数)と非競合状態でfad2及びfad3突然変異体アレルの完全発現が可能であるだろうからである。
FAD2bに関係があるBBゲノムDNA並びに(BBゲノムを代表する)クロガラシ及びカラシナからの他の利用可能な配列の存在を検出することができるDNAマーカーを開発する。マーカー開発のために、二重半数体地図作成用集団を開発する。加えて、公知B−ゲノム配列からDNA(SSR及びSNP)マーカーを開発する。これらのマーカーによって、前記変換系統におけるカラシナのバックグラウンドの回復度を確認することができる。
前述のような、高オレイン酸及び低リノレン酸の種子油プロフィールを示す自家受粉及び倍加半数体植物を、BBゲノムについて選択されたマーカーを使用してスクリーニングした。前記変換系統に存在するBBゲノムを確認する。これらの突然変異体カラシナ系統は、セイヨウアブラナについて選択された陽性Cゲノムマーカー数の減少(又は完全な不在)も示す。これらのプロフィールを、前記系統の農業実用面(agronomics)を改良する、例えば、イールド・ドラッグを低減する、裂莢を低減する、様々な成長ゾーンについての成熟度を改変する、ストレス抵抗性を増大させる、耐病性を増大させる、及びこれらに類する、当該分野において公知の追加の戻し交配及び自家受粉技術によってさらに改良する。
セイヨウアブラナ系統とカラシナ系統の間の遺伝的多型を判定することができる分子マーカーを特定する。合計1931のセイヨウアブラナSSRマーカーをスクリーニングして、カラシナゲノムとセイヨウアブラナとを区別することができるSSRのコアセットを特定した。加えて、実施例2において説明したように、公共データベースを検索して、親スクリーニングのための追加のマーカーを特定した。従って、2,300より多くのSSRマーカーを、セイヨウアブラナに対してカラシナを区別するそれらの能力について調査した。このスクリーニングからの1セットのマーカーを、後代におけるカラシナゲノムの濃縮又はセイヨウアブラナゲノムの消失若しくは不在の判定に用いる。もう1つのマーカーシステムは、SNPマーカーセットの使用を含む。3,000を超えるSNPがコンソーシアームによって開発された。2つのハイスループット・イルミナ(Illumina)アッセイを生成する(すなわち、1つの1536プレックスSNP OPA(Ligo Pool All))。これらのOPAの両方(合計3,072のSNPアッセイ)を、全部で3つの四倍体セイヨウアブラナ、カラシナ及びアビシニアガラシ系統、並びにアブラナ属の全部で3つの二倍体先祖「Uの三角形」(1935)−クロガラシ、B.オレラセア及びアブラナ −からなる親パネルを用いてスクリーニングする。後代においてカラシナフラグメントを明白に追跡できる1セットのSNPを特定する。具体的には、後代においてBゲノムの存在を確認することができるSNPをそのセットに含める。このように、後代植物のスクリーニングに多数の情報価値のあるSSR及びSNPを使用することにより、高いBゲノム百分率を有する植物を特定する。自家受粉及びDH後代を特性づけした後、分離後代を用いて比較地図を構築することにより、セイヨウアブラナ及びカラシナ系統群に対するマーカー遺伝子座の遺伝地図作製位置を妥当性評価する。比較地図により、種間マッチングに従って可能性のあるマーカー遺伝子座の再配列、付加又は欠失を特定することができる。
蛍光インサイチュー・ハイブリダイゼーション(FISH)技術を用いて、後代におけるBゲノムの存在及び濃縮を判定する。マーカー分析のためにも、細胞学的研究、例えば染色体数、異数体の出現の特定、のためにも、関心のあるゲノムセグメントの判定のためにも、後代植物を用いる。FISHは、分子マーカーによって得た情報をさらに強化することができる強力なツールである。このために、Bゲノムの存在を明白に判定することができる候補SSR及びSNPマーカー配列を使用して、大きなBACクローンを抜き出し、その後、それらを、高いBゲノム百分率を有するものとして特定された候補後代植物の分裂中期伸展標本(spreads)に対してプローブとして用いる。BAC配列は、コンピュータを利用する方法を用いて特定されもするが、BAC配列がそのデータベースにおいて入手できることを条件とする。そうである場合には、インシリコ(in silico)で特定されたBACをそれぞれの源から得、FISH実験において使用することができる。
競合非標識プローブとして全カラシナDNAを使用して全核BBゲノムDNAで候補後代植物の染色体をプローブ化することができるゲノムインサイチューハイブリダイゼーション(GISH)技術を用いる。カラシナにおけるBBゲノム染色体への強いハイブリダイゼーションが、その後代におけるBBゲノムの存在を示す。
公開番号US2008/0168587に開示されているB−ゲノムfad2、fad3突然変異又はクロガラシにおいて若しくはカラシナ種子において新たに引き起こされた突然変異を組み合わせることにより、脂肪種子に対するさらなる改良を果たす。一例では、様々な系統間で交配を行い、選択物を特定し、これらの選択物を組み合わせることにより、匹敵する農業実用収量を有するさらなる安定した高オレイン酸及び低リノレン酸選択物が生産される。
HOLL油プロフィールは、細胞質雄性不稔系(例えば、オグラ型セイヨウアブラナCMS126−1を参照のこと)とそれらの対応する稔性回復バックグラウンドとを含むHOLL親系統を作出することによって生産されたハイブリッドにおいて表される。
除草剤耐性形質(イミダゾリノン耐性):セイヨウアブラナにおけるイミダゾリノン耐性形質(BASF)は、LG01(AAゲノム、グリホサート耐性挿入部位からおおよそ20cM)に位置するPM2突然変異部位を含み、PM1突然変異部位は、LG11(CCゲノム)に位置する。ahas3がAAゲノムに対応し、一方、AHAS1がCCゲノムに対応すると考えられる。Swansonら(Theor. Appl Genet. 78:525-530, 1989)は、ahas3遺伝子のみがイミダゾリノン除草剤に対する耐性をもたらすことを示している。AAゲノムに位置する2つの他のAHASゲノム:ahas2及びahas4、が存在する。2つのahas遺伝子がイミダゾリノン除草剤に対する耐性に必要とされる場合、BBゲノム上に位置するAHAS遺伝子を突然変異誘発のために特定することができる。カラシナにおけるPM2だけでは、十分な耐性が得られないことが判明した。従って、カラシナにおいて2つ又はそれ以上の遺伝子を発生させて、十分なイミダゾリノン耐性をもたらす。
特定のタンパク質産物をコードする遺伝子の単離及び特性づけを可能にした分子生物学技術の登場により、植物生物学の分野の科学者は、外来若しくは追加の遺伝子を含有し、発現するように又は(おそらく異なるプロモータによって誘導された)天然遺伝子の修飾変種を発現するように植物ゲノムを遺伝子操作して、植物の形質を特異的に改変することに強い関心を抱いた。そのような外来のさらなる及び/又は修飾された遺伝子を本明細書では総称して「トランスジーン(transgene)」と呼ぶ。ここ20年にわたり、トランスジェニック植物を生産するための幾つかの方法が様々な作物について開発されており、それらの方法としては、アグロバクテリウム媒介形質転換及びパーティクルボンバードメント(particle bombardment)が挙げられる。具体的なアブラナ属形質転換プロトコルについては、参考のために特許(1993年2月23日、Moloneyらに発行された米国特許第5,188,958号;2000年4月18日、Chenらに発行された米国特許第6,051,756号;2001年10月2日、Tulsieramらに発行された米国特許第6,297,056号)を参照のこと。本発明は、特定の実施形態において、特許請求の範囲に記載する品種又は系統の形質転換変種にも関する。
本発明によるトランスジェニック植物を用いて、外来タンパク質を大量生産することができる。例えば、当該分野において十分に理解されている形質転換植物の選択及び繁殖技術によって多数のトランスジェニック植物が得られ、それらを従来の様式で収穫し、その後、関心のある組織から又は全バイオマスから外来タンパク質を抽出することができる。植物バイオマスからのタンパク質の抽出は、例えば、Heney and Orr, Anal. Biochem. 114:92-6 (1981)により論じられている公知の方法によって、果たすことができる。
A.植物耐病性遺伝子。植物防御は、植物中の耐病性遺伝子(R)と病原体中の対応する非病原性(Avr)遺伝子の産物との特異的相互作用によって活性化されることが多い。クローニングされた耐性遺伝子で植物品種を形質転換させて、特定の病原株に対して耐性である植物を遺伝子工学で作ることができる。例えば、Jones et al., Science 266:789 (1994) (cloning of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum);Martin et al., Science 262:1432 (1993) (tomato Pto gene for resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato encodes a protein kinase);Mindrinos et al., Cell 78:1089 (1994) (Arabidopsis RSP2 gene for resistance to Pseudomonas syringae)を参照のこと。
A.成長点又は分裂組織を阻害する除草剤、例えばイミダゾリノン又はスルホニル尿素。このカテゴリーの中の例示的遺伝子は、例えば、Lee et al., EMBOJ. 7:1241 (1988)及び Miki et al., Theor. Appl. Genet. 80:449 (1990)によってそれぞれ記載されているような突然変異体ALS及びAHASをコードする。
A.例えばステアリル−ACPデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子で植物を形質転換させてその植物のステアリン酸含有量を増加させることによる、修飾脂肪酸代謝。Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 89:2624 (1992)を参照のこと。
Claims (24)
- 種子が、少なくとも70.0重量%オレイン酸及び5.0重量%未満リノレン酸を含む内因性脂肪酸含有量を有する、カラシナ(Brassica juncea)植物。
- 種子が、3.0重量%未満のリノレン酸を含む内因性脂肪酸含有量を有する、請求項1に記載のカラシナ植物。
- 種子が、70.0重量%から85.0重量%オレイン酸を含む内因性脂肪酸含有量を有する、請求項1に記載のカラシナ植物。
- 種子が、70.0重量%から85.0重量%オレイン酸及び3.0重量%未満のリノレン酸を含む内因性脂肪酸含有量を有する、請求項1に記載のカラシナ植物。
- 請求項1に記載のカラシナ植物の種子から抽出される内因性の油であって、前記種子が、少なくとも70.0重量%オレイン酸及び5.0重量%未満リノレン酸を含む内因性脂肪酸含有量を有するものである油。
- 70.0%から85.0%オレイン酸を含む脂肪酸含有量を有する、請求項5に記載の油。
- 3.0重量%未満リノレン酸を含む内因性脂肪酸含有量を有する、請求項5に記載の油。
- 70.0重量%から85.0重量%オレイン酸を含む内因性脂肪酸含有量を有する、請求項5に記載の油。
- 70.0重量%から85.0重量%オレイン酸及び3.0重量%未満リノレン酸を含む内因性脂肪酸含有量を有する、請求項5に記載の油。
- 少なくとも70.0重量%オレイン酸及び5.0重量%未満リノレン酸の脂肪酸含有量を含む全抽出可能油を有する、請求項1に記載の種子。
- 70.0重量%から85.0重量%のオレイン酸含有量及び0.1重量%から3.0重量%のリノレン酸含有量を含む全抽出可能油を有する、請求項10に記載の種子。
- 突然変異fad2遺伝子を含有する、請求項1に記載のカラシナ植物。
- 突然変異fad3遺伝子を含有する、請求項1に記載のカラシナ植物。
- 少なくとも70,0重量%オレイン酸及び5.0重量%未満リノレン酸を含む脂肪酸含有量を有する、カラシナ品種の種子中の油。
- 種子が、少なくとも70,0重量%オレイン酸及び5.0重量%未満リノレン酸を含む内因性脂肪酸含有量を有する、カラシナ植物を生産する方法であって、
突然変異fad2a核酸配列、突然変異fad2b核酸配列、突然変異fad3a核酸配列、突然変異fad3a核酸配列及び突然変異fad3b核酸配列からなる群より選択される1つ又はそれ以上の核酸配列を、従来の交配法により、前記カラシナ植物に導入することを含む方法。 - 少なくとも70,0重量%オレイン酸及び5.0重量%未満リノレン酸を含む内因性脂肪酸含有量を有するカラシナ植物の種子からのミール。
- 粉砕種子、プレスケーキ、ホワイトフレーク、又は従来の粉砕及び溶媒抽出プロセスからのミールの形態のものである、請求項16に記載のカノーラミール。
- カラシナ植物からの種子であって、従来の育種法によって前記カラシナ植物に導入した遺伝子である、Brassica aa及び/又はBrassica bbゲノムの1つ又はそれ以上のゲノム成分からの1つ又はそれ以上の非組換えfad2及びfad3遺伝子が組み込まれているものであり、少なくとも70.0重量%オレイン酸及び5.0重量%未満リノレン酸を含む脂肪酸含有量を有する油を生産するものである種子。
- 前記1つ又はそれ以上の非組換えfad2及びfad3遺伝子が組み込まれている種子であって、少なくとも70.0重量%オレイン酸及び5.0重量%未満リノレン酸を含む脂肪酸含有量を有する油を生産するものである種子を生産する後代植物である、請求項20に記載の種子の少なくとも1つから生産される後代植物の一又はそれ以上の世代。
- 少なくとも70.0重量%オレイン酸及び5.0重量%未満リノレン酸を含む脂肪酸含有量を有する種子油である、非トランスジェニックカラシナ植物の作物の種子において生産される種子油。
- カラシナの作物であって、該作物全体を通して、平均して、少なくとも70.0重量%オレイン酸及び5.0重量%未満リノレン酸である内因性油含有量を有する種子を生産するものであるカラシナの作物。
- 請求項21に記載の作物の種子の少なくとも1つから得られる後代作物の一又はそれ以上の世代。
- カラシナ栽培品種であって、該作物全体を通して、平均して、少なくとも70.0重量%オレイン酸及び5.0重量%未満リノレン酸である内因性油含有量を有する種子を生産するものであるカラシナ栽培品種。
- 請求項23に記載のカラシナ栽培品種をアブラナ属(Brassica)種の植物と交配することによって生産される脂肪種子植物。
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