CN102281755B

CN102281755B - Omega-9级芥菜

Info

Publication number: CN102281755B
Application number: CN200980153703.5A
Authority: CN
Inventors: 万.L.里普雷; 史蒂文.A.汤普森; 佐伊.C.厄勒特
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2008-11-04
Filing date: 2009-11-04
Publication date: 2016-12-14
Anticipated expiration: 2029-11-04

Abstract

本发明涉及改进的芸薹属(Brassica species)物种包括芥菜(Brassica juncea)，改进的来自芥菜的油和粕，生成此类改进的芸薹属物种的方法，和选择芸薹属种系的方法。其他实施方案涉及包含相对于芥菜现存的商业栽培种具有增加的油酸含量和减少的亚麻酸含量的内源油的芥菜的种子，以及具有稳定包含于其中使种子油中油酸含量增加且亚麻酸含量减少的特征的芥菜的种子，以及一个或多个世代的从所述种子产生的后代植物。

Description

OMEGA-9级芥菜

优先权要求

本发明要求2008年11月4日提交的题为“OMEGA-9级芥菜”的美国临时专利申请流水号61/198,422的权益。

技术领域

本发明涉及下述领域：改进的芸薹属(Brassica)物种，包括芥菜(Brassicajuncea)，改进的来自芥菜的油和粕(meal)，生成此类改进的芸薹属物种的方法，和选择芸薹属种系的方法。其他实施方案涉及包含相对于现存商业芥菜栽培种具有增加的油酸含量和减少的亚麻酸含量的内源油的芥菜的种子，以及具有稳定并入其中使种子油中油酸含量增加且亚麻酸含量减少的特征的芥菜的种子。

背景技术

双低菜(Canola)是由加拿大植物育种者专门针对其油和粕的特性，尤其是其低饱和脂肪水平而开发的菜籽的基因变型。“双低菜”通常指在种子油中按重量计具有少于2%芥酸(Δ13-22:1)和每克不含油的粕少于30微摩尔的硫代葡萄糖酸盐(glucosinolate)的芸薹属物种的植物。通常，双低菜油可包含称为棕榈酸和硬脂酸的饱和脂肪酸，称作油酸的单不饱和脂肪酸，和称作亚油酸和亚麻酸的多不饱和脂肪酸。这些脂肪酸有时根据其碳链长度和链中双键的数量来指称。举例而言，油酸有时称作C18:1，因为其具有18个碳的碳链和一个双键，亚油酸有时称作C18:2，因为其具有18个碳的碳链和两个双键，而亚麻酸有时称作C18:3，因为其具有18个碳的碳链和三个双键。双低菜油可含有少于约7%的总饱和脂肪酸(主要为棕榈酸和硬脂酸)和大于60%的油酸(按照占总脂肪酸的百分比)。传统上，双低菜油作物包括欧洲油菜(Brassica napus)和芜菁(Brassica rapa)的品种(variety)。近来，已将与其他双低菜类型具有类似的油和粕质量的双低级芥菜品种加入双低菜作物家族(2001年10月16日授予Potts等的美国专利6,303,849号；授予Yao等的美国专利7,423,198号；Potts和Males,1999)。

植物油的脂肪酸组成影响该油的质量、稳定性和健康特性。举例而言，已发现油酸(一种C18:1单不饱和脂肪酸)具有某些健康益处，包括减少血浆胆固醇水平的有效性，使得种子油中较高水平的油酸含量(>70%)成为期望的性状。此外，并非植物油中所有的脂肪酸均同等程度地易受高温和氧化影响。相反，各个脂肪酸对氧化的易感性取决于其不饱和程度。举例而言，具有三个碳-碳双键的亚麻酸(C18:3)氧化比仅具有一个碳-碳双键的油酸快98倍，而具有两个碳-碳双键的亚油酸氧化比油酸快41倍(R.T.Holman和O.C.Elmer,“Therates of oxidation of unsaturated fatty acid esters,”J.Am.Oil Chem.Soc.24,127-1291947)。关于油酸、亚油酸和亚麻酸脂肪酸相对氧化速率的进一步信息，参见Hawrysh,“Stability of Canola Oil,”Chap.7,pp.99-122,Canola and Rapeseed:Production,Chemistry,Nutrition,and Processing Technology,Shahidi,ed.,VanNostrand Reinhold,NY,1990。

植物油的“稳定性”可定义为油对氧化及因此由于造成酸败并降低食物质量的产物生成而导致的变质的抗性。在相同的加工、配制、包装和储藏条件下，不同植物油之间稳定性的差距主要是由于其不同的脂肪酸分布(profile)。因此在烹饪用途中优选高油酸含量的植物油，因为其在热量存在下对氧化的抗性增加。不良的氧化稳定性造成例如在使用所述油作为煎炒用油(fry oil)时缩短的操作时间，因为氧化产生会严重减少油的市场价值的异臭(off-flavor)和味道。出于这些原因，植物油中的高油酸和低亚麻酸可为期望的。

植物在其质体中以棕榈酰ACP(16:0-ACP)和硬脂酰ACP来合成脂肪酸。硬脂酰ACP向油酰ACP(18:1-ACP)的转化由可溶性酶硬脂酰-ACPΔ9去饱和酶催化(Shanklin和Somerville,1991)。这些酰基ACP或者在叶绿体中用于糖脂合成，或作为酰基CoA转运出叶绿体进入细胞质。油酸的进一步去饱和仅发生在其用于甘油脂类的合成并掺入膜之后，这导致多不饱和脂肪酸的合成。

广为本领域技术人员所知的是，油料种子作物中脂肪酸的不饱和度一部分是由脂肪酸去饱和酶(FAD)控制的。FAD酶通过从脂肪酰基链上限定的碳去除氢原子生成碳-碳双键来调节脂肪酸如硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)的不饱和度。多不饱和脂肪酸亚油酸(Δ9,12-18:2)和α-亚麻酸(Δ9,12,15-18:3)的合成以油酸(Δ9-18:1)转化为亚油酸起始，该酶步骤由微粒体ω-6油酸去饱和酶(FAD2)催化。然后亚油酸通过由ω-3亚油酸去饱和酶(FAD3)进行的进一步去饱和转化为ω-亚麻酸。有报道称通过基因工程改造操纵FAD2基因可改变脂肪酸分布。举例而言，大豆fad2基因在拟南芥(Arabidopsis)突变体种系中的异源表达导致多不饱和脂肪酸累积的急剧增加(Heppard等,1996)。与之相反，在拟南芥突变体种系fad2-5中，当由于T-DNA插入造成fad2基因的转录显著减少时，显示油酸累积的急剧增加以及亚油酸和亚麻酸水平的显著减少(Okuley等,1994)。这些发现提示FAD2基因在控制种子储藏脂质中油酸转化为亚油酸中起重要作用。

已投入了大量精力操纵用于大规模生产商用油脂的植物尤其是油料种子品种如芸薹属物种的脂肪酸分布(参见，例如1997年4月29日授予的美国专利5,625,130号，1997年9月16日授予的5,668,299号，1998年6月16日授予的5,767,338号，1998年11月24日授予的5,840,946号，1998年12月15日授予的5,850,026号，1999年1月19日授予的5,861,187号，2000年5月16日授予的6,063,947号，2000年7月4日授予的6,084,157号，2001年1月2日授予的6,169,190号，2001年11月27日授予的6,323,392号，和1997年11月27日公开的国际专利申请WO97/43907和2000年9月8日公开的WO00/51415)。

芥菜(AA BB基因组；n=18)(在本文中也称作“芥菜”(B.juncea))为芸薹属的双二倍体植物，其通常认为是来自芜菁(AA基因组；n=10)和黑芥(Brassica nigra)(BB基因组；n=8)的杂交。欧洲油菜(AA CC基因组；n=19)(在本文中也称作“欧洲油菜”(B.napus))亦为芸薹属的双二倍体植物，但其认为是来自芜菁和甘蓝(Brassica oleracea)(CC基因组；n=9)的杂交。在一些生长条件下，芥菜可具有某些比欧洲油菜优越的性状。这些优越的性状可包括更高的产量，更好的干旱和热耐受性以及更好的疾病抗性。大量的育种努力产生了其种子含有少于2%芥酸且其去脂肪的粕每克含有少于30微摩尔硫代葡萄糖酸盐的芸薹属物种植物。术语“双低菜”用来描述芸薹属物种含有低芥酸(Δ13-22:1)以及低硫代葡萄糖酸盐的品种。通常，双低菜油可含有少于约7%的总饱和脂肪酸以及大于60%的油酸(按照占总脂肪酸的百分比)。举例而言，在美国，根据21CFR184.1555，来源于欧洲油菜或芜菁的低芥酸菜籽油，当其芥酸含量为不多于组分脂肪酸的2%，油酸(C18:1)含量按重量计超过50.0%，亚油酸(C18:2)含量按重量计少于40.0%，且亚麻酸(C18:3)含量按重量计少于14.0%时，承认其为双低菜油。在加拿大，Canola Council of Canada将芥菜加入双低菜定义设定了如下的附加要求，即芥菜双低菜品种必须产生具有包含等于或大于种子中总脂肪酸55%的油酸含量的油的种子，且来源于芥菜双低菜种子的粕必须为每克不含油的粕含有少于1微摩尔的烯丙基(2-丙烯基)硫代葡萄糖酸盐。

芥菜和欧洲油菜的油组成之间的差异在本领域是周知的。举例而言，已知芥菜在多种组分上具有差异，包括但不限于酚类(例如生育酚)、甾醇类、硫化物、脂肪酸组分、矿物质和异硫氰酸盐/酯。芥菜还含有具有强抗微生物(细菌和真菌)性质的挥发物。

植物育种者还选择了具有低硫代葡萄糖酸盐如3-丁烯基、4-戊烯基、2-羟基-3-丁烯基或2-羟基-4-戊烯基硫代葡萄糖酸盐的双低菜品种。双低级粕可例如定义为每克不含油的粕具有少于30微摩尔脂族硫代葡萄糖酸盐的硫代葡萄糖酸盐含量。目前，主要的商用双低菜作物包含欧洲油菜和芜菁(campestris)品种。2001年10月16日授予Potts等的美国专利6,303,849号公开了具有性质类似于双低菜的食用油的芥菜种系。该文中公开的芥菜种系具有包括芥菜种系J90-3450和J90-4316的谱系(lineage)，其分别以ATCC登录号203389和203390保藏(两者皆由Agriculture and Agri-Food Canada根据布达佩斯条约的条款于1998年10月23日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801University Blvd.,Manassas,Va.USA20110-2209)。

前述相关技术的实例及其相关的限定旨在为说明性的而并不是排他的。其他相关技术的限定对于本领域技术人员在阅读了本说明书并研究了附图之后会是显而易见的。

发明内容

下述实施方案及其多个方面是连同意为示例性和说明性而非限制保护范围的系统、工具和方法一起进行描述和阐明。在多种实施方案中，上述问题中的一个或多个已得到削减或消除，而其他实施方案涉及其他改进。

在多个方面，本发明提供芥菜植物、种子、细胞、核酸序列的等位变异(allelicvariation)和油。本发明植物种子中的食用油与见于其他芥菜植物种子中的相比可具有显著更高的油酸含量和更低的亚麻酸含量。在本发明中公开了多种高油酸/低亚麻酸(“HOLL”)芥菜种系。在一个实施方案中，芥菜种系包含FAD2和FAD3基因，如公开于国际公开号WO2006/0248611A1，例示于其所附的图1和3以及SEQ ID NO:7、9、12和13中。所得的突变体等位基因编码delta-12脂肪酸去饱和酶蛋白，其例示于所附的图2以及SEQ IDNO:8、10和11。在其他实施方案中，所述芥菜种系可在fad2-a和fad3-a基因座含有突变，且所得的突变体等位基因可在预测的BjFAD2-A和BjFAD3-A蛋白的序列中编码一个或多个突变。适用于本发明的fad2-a和fad3-a突变基因和蛋白的代表性实例还包括但不限于：公开于国际公开WO2006/079567A3号(例如，图1和2，以及SEQ ID NO:3和4)；国际公开WO2005/107590A2号(例如SEQ ID NO:1至12)；美国专利6,967,243B2号(例如图2和3，以及SEQ ID NO:11、12、15、16、17和18)；以及欧洲公开1862551A1号(例如图1至10，以及SEQ ID NO:22至33)中的那些。在其他实施方案中，BNfad2-a和Bnfad23-a转化的种系可用于在芸薹属植物中寻找BJFAD2B和BJFAD3B中的天然变异，因为可检测含有BnFad2A、BnFad3A的芥菜植物中脂肪酸分布的显著变异。

在本发明的一个方面，令人意想不到地发现芸薹属植物中FAD2和/或FAD3酶活性的取代、缺失或沉默得到了能够产生具有按重量计大于约70%的油酸含量和按重量计少于约5%的亚麻酸含量的油的植物。在另一个实施方案中，令人意想不到地发现在芸薹属植物中移动或转移修饰FAD2和/或FAD3酶活性的基因得到了能够产生具有按重量计大于约70%的油酸含量和按重量计少于约5%的亚麻酸含量的油的植物。此类植物可例如为四倍体植物或双二倍体植物，如芥菜或欧洲油菜。在一个方面，本发明相应地提供在植物如在芥菜种系中对选定FAD2和FAD3编码序列的缺失或沉默。来源于本发明植物的食用油可具有下述一个或多个特征：按重量计至少70%的油酸含量，按重量计少于约5%的亚麻酸含量，以及按重量计少于约7%的总饱和脂肪酸含量。

本发明的其他方面包括植物和植物部分。如本文中所用的“植物部分”包括携带本发明核的酸或具有本发明的fad2/fad3编码序列或具有调节序列，如表达来自欧洲油菜的FAD2和/或FAD3酶的FAD2/FAD3编码区上游的序列的植物细胞、种子、花粉。提供了使用本发明植物包括通过本发明的标记选择的后代植物以获得植物产品的方法。如本文中所用的“植物产品”包括任何来源于本发明植物之物，包括植物部分如种子、粕、脂肪或油，包括具有改变的油酸和亚麻酸浓度的植物产品。提供了修饰植物从而使得其具有能够表达活性FAD2酶和/或FAD3酶的自欧洲油菜转移的fad2/fad3编码序列的方法。此类方法可例如涉及将一种或多种来自欧洲油菜的fad2-a和/或fad3-a编码序列通过种间杂交转移至植物，从而使得该植物具有取代的fad2和/或fad3编码序列。此类方法使得所衍生的突变能够得到鉴定并且准确掺入芥菜。

提供了用于鉴定本发明的fad2/fad3编码序列一部分的扩增引物，其可用于例如区分选定的FAD2和/或FAD基因座的不同等位基因。提供了使用本发明的fad2/fad3编码序列，或本发明的fad2/fad3编码序列的上游区获得植物的方法。举例而言，本发明的序列可用于指导或靶向可下调或改变选定FAD2和/或FAD3编码序列表达的位点特异性突变，如通过下调或改变来自选定FAD2或FAD3基因座的FAD2和/或FAD3基因的表达，或通过截短由FAD2和/或FAD3基因编码的FAD2和/或FAD3蛋白。常规植物育种技术如杂交和回交以及其他育种技术可用于将本发明的fad2和/或fad3编码序列引入本发明的植物的后代中。

一种其他实施方案包括芥菜品种的种子中的油，其具有包含按重量计至少68.0%油酸和按重量计少于4.0%亚麻酸的脂肪酸含量。

本发明进一步包括从本文所述的芥菜植物的种子获得的粕，其中此种粕可为压碎的种子、压滤饼(press cake)、白色薄片(white flake)或来自常规压碎和溶剂提取工艺的粕的形式。

除了上述示例性的方面和实施方案之外，其他方面和实施方案通过参照附图和通过研究下述描述对于本领域技术人员会是显而易见的。

附图说明

图1图示了从DMS100和Quantum克隆的fad2基因的部分基因组核苷酸序列。上部是DMS100序列而下部是Quantum序列。箭头指示C至T的单核苷酸突变，其产生终止密码子(TAG)(带阴影)。用于基于PCR的突变体等位基因特异性标记的正向和反向引物为粗体和带下划线的。

图2提供了fad2基因的氨基酸序列，其为从克隆自DMS100、Quantum的基因组核苷酸序列以及从公开的欧洲油菜FAD2基因(BNFAD2)简并所得。箭头指示DMS100中由单核苷酸突变(C至T)造成的终止密码子的位置。

图3显示从DMS100和Quantum克隆的fad3c基因的基因组核苷酸序列。上部是DMS100序列而下部是Quantum序列。外显子标以方框，内含子未标以方框，其对应于芜菁和拟南芥中的fad3基因的外显子4、5、6和7以及内含子4、5和6。箭头指示G至A的单核苷酸突变。用于基于PCR的突变体等位基因特异性标记的正向和反向引物为粗体和带下划线的。

图4图示根据本发明的原理，高油酸-低亚麻酸选择个体(selection)和芥菜亲本(Zem1、Zem2和ZE Skorospelka)之间的一个或多个回交(BC3和BC4)。

具体实施方式

为了清楚地加以描述，对本文中使用的一些术语解释如下。

术语“种系”指在共享该命名的个体之间显示非常小的总体差异的一组植物。“种系”通常指个体之间对于至少一个性状显示很小或无遗传差异的一组植物。如本申请中使用的“DH(加倍单倍体，doubled haploid)种系”指如下产生的一组植物，即通过培养单倍体组织然后不伴随细胞分裂而加倍其染色体量以产生具有双倍体数量的染色体的植物，其中每个染色体对由两个复制的染色体组成。因此，DH种系通常显示很小或无遗传差异。

“品种”或“栽培种”为用于商业生产的植物种系，当其繁殖时，其特征是明显的、稳定的和均一的。

“加倍单倍体”(DH)种系指通过小孢子胚胎发生(microspore embryogenesis)方法产生的种系，其中从单个小孢子产生植物。通过该方法，产生了同质的种系，即该种系内的所有植物具有相同的遗传构成(genetic makeup)。原始DH植物称作DH1，而后续世代称作DH2、DH3等。加倍单倍体过程是周知的，且对于几种作物已经确立。针对芥菜的过程描述于Thiagrarajah和Stringham(1993)(A comparison of genetic segregation intraditional and microspore-derived populations of Brassica juncea in:L.Czernand Coss.Plant Breeding111:330-334)。

术语“高油酸”指根据上下文所指的芥菜或其他芸薹属物种，其油酸含量比野生型或其他参照品种或种系的高，更一般而言，其表明按重量计包含至少70.0%油酸的脂肪酸组成。

“总饱和脂肪酸(saturate)”指棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、花生酸(C20：0)、山萮酸(behenic)(C22:0)和二十四烷酸(C24:0)脂肪酸的组合百分比。本文中讨论的脂肪酸浓度根据本领域技术人员周知的标准过程确定。具体过程在实施例中阐述。脂肪酸浓度表示为按总脂肪酸含量的重量计的百分比。

“半粒种子(half-seed)”分析指其中对一个子叶(半粒种子)进行脂肪酸分析，并且如果分析结果是阳性，则使用剩下的半粒种子来生成植物的过程。

“诱变”为其中将已知在遗传物质中引起突变的药剂施于植物材料的方法。在实验工作中，使用的诱变剂为甲磺酸乙酯(EMS)。其目的是为了在物种中造成新的遗传变异性，并通常是以具体的性状为目的进行的。用于单倍体以诱导新颖变异的诱变的实例已由Swanson等(Plant Cell Rep.7:83-87,1988)描述。应理解的是，多种其他技术如与外源核酸片段重组可适用于生成突变体，且通过使用某些技术，可将突变体的生成导向特定的核苷酸或氨基酸变化而非完全随机的。所有此类引入核酸序列变化的方法理解为包含于本文中使用的术语“诱变”中。

“再生”涉及从选定的植物或品种选择能够再生的细胞(例如，种子、小孢子、胚珠、花粉、营养部分)。可任选地对这些细胞进行诱变，之后基于诱变细胞的类型使用再生、受精和/或生长技术来从这些细胞发育植物。适用的再生技术对本领域技术人员是已知的，例如：Pua等,Bio/Technology5:815-817(1987);Jain等,Euphytica40:75-81(1989);Szarejko等,Proceedings of an International Symposium on the Contribution ofPlant Mutation Breeding to Crop Improvement,2:355-378(1991);Cegielska-Taras和 Oleiste–Oilseed Crops,XVIII,21-30(1997);Ferrie和Keller,Proc.9thInternational Rapeseed Congr.,Cambridge,3:807–809(1995);Martini等,Vortr.Pflanzenzüchtg.45:133-154(1999);Swanson等,Theoretical and Applied Genetics.78:525-530(1989);以及Kirti and Chopra,Plant Breeding102:1,73-78(1988)。在此上下文中，“M0”指未处理的种子；“M1”指暴露于诱变剂的种子及所得的植物；“M2”为自花授粉的M1植物的后代(种子和植物)；“M3”为自花授粉的M2植物的后代(种子和植物)；“M4”为自花授粉的M3植物的后代(种子和植物)；“M5”为自花授粉的M4植物的后代(种子和植物)；余此类推。

本文中使用的术语“稳定性”或“稳定”用于给定受遗传控制的脂肪酸组分时意指该脂肪酸组分在世代间维持基本上相同的水平(例如优选±5%)至少两个世代并优选至少三个世代。本发明的方法能够产生具有在世代间高达±5%稳定的改进的脂肪酸组成的芥菜种系。本领域技术人员理解上述提及的稳定性可受温度、位置、应激和种植时机影响。因此，双低菜种系之间脂肪酸分布的比较应使用在类似生长条件下产生的种子进行。

当术语“芸薹属植物”用于本发明的上下文中时，这还包括该组的任何单基因转变型(single gene conversion)。术语“单基因转变的植物(single gene convertedplant)”用于本文指那些通过称为回交的植物育种技术发育成的芸薹属植物，在该技术中，通过回交技术除了将单基因转移入某个品种，还回收了该品种基本上所有所需的形态和生理特性。回交方法可用于本发明以改善特征或将其引入所述品种。术语“回交”用于本文指将杂种后代往回与回归亲本重复杂交，即与回归亲本(鉴定为“BC1”、“BC2”等)回交一次或多次。贡献具有所需特征的基因的亲本芸薹属植物植物称为“非回归的”或“供体亲本”。该术语涉及下述事实，即非回归亲本在回交实验方案中仅用一次，因此并不再次出现。来自非回归亲本的一个或多个基因所转移至的芸薹属植物称作回归亲本，因为其在回交实验方案中使用了数轮(Poehiman&Sleper,1994;Fehr,1987)。在典型的回交实验方案中，将目标原始品种(回归亲本)与携带待转移的目标单基因的第二品种(非回归亲本)杂交。然后将从该杂交所得的后代再次与回归亲本杂交，并重复该过程直至获得下述芸薹属植物，其中当在相同环境条件下生长时，按照5%显著水平确定，除了来自非回归亲本的单一转移基因，在转变的植物中还基本上回收了所述回归亲本所有所需的形态和生理特性。

合适的回归亲本的选择是成功回交过程的重要步骤。回交实验方案的目标是改变或取代原始品种中的单个性状或特征。为实现这点，对回归品种的单基因进行修饰或用来自非回归亲本的所需基因取代，同时保留原始品种的基本上所有其他所需的遗传物质，并因此保留所需的原始品种的生理和形态组成。具体非回归亲本的选取会取决于回交的目的。一个主要目的是将一些商业上所需的、农学上重要的性状加入所述植物。准确的回交实验方案会取决于进行改变的特征或性状以确定适当的测试实验方案。尽管当进行转移的特征是显性等位基因时，回交方法得到简化，但也可转移隐性等位基因。在此情况下，可能必需引入对后代的测试以确定所需的特征是否已成功地转移。

已经鉴定了许多按常规并不选用于新品种开发，但是可通过回交技术来改进的单基因性状。单基因性状可以是或可以不是转基因的，这些性状的实例包括但不限于雄性不育，蜡状淀粉，除草剂抗性，对细菌、真菌或病毒疾病的抗性，昆虫抗性，增强的营养质量，工业应用，产量稳定性和产量提高。这些基因通常通过核来遗传。这些单个基因性状中的几种描述于美国专利5,959,185、5,973,234和5,977,445号。

在一些实施方案中，针对任何本文所述或可由本文推导的多肽的抗体可应用于确定公开的等位基因之一的存在或表达，并区分突变型和野生型蛋白或其他突变体。

在本申请中“改进的特征”意指所述特征与参照值或特性相比以所需和/或有益的方式改变，所述参照可涉及芥菜野生型株或任意其他所考虑的芸薹属种系的等同特征。一种其特征可作为参照(或对照)的合适的(possible)野生型芥菜株为J96D-4830，但也可用许多其他的，且其可由本领域技术人员方便地鉴定。

在本申请中“后代”意指所有的后裔(descendant)，包括植物的子代(offspring)和衍生物，且包括第一、第二、第三和后续世代，且可通过自花授粉或通过与具有相同或不同基因型的植物杂交来产生，且可通过一系列合适的基因工程技术来修饰。

在本申请中“育种”包括所有发育或繁殖植物的方法，且包括种内和种间以及种系内和种系间杂交以及所有合适的常规育种和人工育种技术。所需的性状可通过常规育种方法转移至其他芥菜种系，且还可通过种间杂交转移至其他芸薹属物种，如欧洲油菜和芜菁。常规育种方法和种间杂交方法以及其他在植物之间转移遗传物质的方法均充分记载于文献中。

在本申请中“分子生物学技术”意指所有形式的对核酸序列的操作以改变其序列和表达，并包括插入、缺失或修饰序列或序列片段，以及直接将新序列通过定向或随机重组使用任何合适的载体和/或技术引入生物的基因组。

在本申请中“遗传衍生的”当用于例如短语“从亲本种系遗传衍生的”时意指所述特征完全或部分由所述植物遗传构成的一个方面所决定。

在本申请中术语“芸薹属”可包含任何或所有属于芸薹属的物种，包括欧洲油菜、芥菜、黑芥、Brassica carinata、甘蓝和芜菁。

用于本申请的双低芥菜(Canola Brassica juncea)指产生具有下述油和粕质量的种子的芥菜，所述油和粕质量分别符合商业命名为“双低菜”油或粕的要求(即，具有在种子油中按重量计少于2%的芥酸(Δ13-22:1)和在每克不含油的粕中少于30微摩尔的硫代葡萄糖酸盐的芥菜物种植物)。

本发明的多种基因和核酸序列可为重组序列。术语“重组”意指经重组之物，因此当提及核酸构建体时，该术语指由连接在一起或通过分子生物学技术手段产生的核酸序列组成的分子。当提及蛋白或多肽时，术语“重组”指使用通过分子生物学技术手段产生的重组核酸构建体表达的蛋白或多肽分子。当提及遗传组成时，术语“重组”指具有亲本基因组中未出现的新的等位基因组合的配子或后代。重组核酸构建体可包括连接于或经操作才连接于天然与其不连接的核酸序列或天然与其在不同位置连接的核酸序列的核苷酸序列。因此提及核酸构建体为“重组”表明对该核酸分子使用遗传工程即通过人工介入进行了操作。例如重组核酸构建体可通过转化引入宿主细胞。此类重组核酸构建体可包含来源于相同宿主细胞物种的序列，或来源于不同宿主细胞物种，而经分离并重新引入宿主物种的序列。重组核酸构建体序列可变为整合入宿主细胞基因组，无论是作为宿主细胞原始转化的结果，还是作为后续重组和/或修复事件的结果。

本文中所有的脂肪酸百分比指按其中所述脂肪酸为一组分的油的总脂肪酸重量计的百分比。举例而言，提及植物具有70%油酸含量表明油的脂肪酸组分包含70%的油酸。

种群中的“多态性”指其中在特定基因座最常见的变体(或等位基因)具有不超过99%的种群频率的情况。

术语“杂合性”(H)用于当种群中一部分个体在特定基因座具有不同等位基因时(与相同等位基因的两个拷贝相对)。杂合性是种群中的个体在该基因座为杂合的概率。杂合性通常表示为百分比(%)，范围为0至100%，或为0至1的尺度。

“纯合性”或“纯合”表明种群中的一部分个体在特定基因座具有同一等位基因的两个拷贝。当植物为加倍单倍体时，假定除非在单倍体复制过程中发生任何自发突变，否则所有基因座均为纯合的。根据上下文所指，植物可在一个、几个或所有基因座为纯合的。

“引物”为聚合酶链式反应所需的短的多核苷酸或寡核苷酸，其与待扩增的多核苷酸的一部分互补。举例而言，引物可为不超过50个核苷酸长，优选少于约30个核苷酸长，且最优选少于约24个核苷酸长。

本文中使用的“分离的”核酸或多核苷酸指从其原始环境(例如，如果其为天然存在的，则从其天然环境)移出的组分。分离的核酸或多肽可含有少于50%、少于75%、少于90%和少于99.9%或少于任何50至99.9%之间的整数值的与其原始相关的细胞组分。使用PCR扩增从而与其他细胞组分充分地可分辨(例如在凝胶上)的多核苷酸可例如被视为“分离的”。本发明的多核苷酸可为“基本上纯的”，即具有使用本领域已知的具体纯化技术所能取得的最高程度的纯度。

“杂交”指其中核酸的一条链与互补链通过碱基配对结合的过程。当一个多核苷酸的至少一条链可在限定的严格条件下与另一多核苷酸的一条链退火时，这些多核苷酸对于彼此是“可杂交的”。杂交需要两个多核苷酸含有基本上互补的序列；然而，取决于杂交的严格度，可容忍错配。通常，两个序列在高严格度(如例如，在65℃在0.5xSSC水溶液中)的杂交需要所述序列在其整个序列上呈现某种高程度的互补性。中等严格度(如例如在65℃的2xSSC水溶液)和低严格度(如例如在55℃的2xSSC水溶液)的条件相应地需要进行杂交的序列之间较低的总体互补性。(1xSSC是0.15M NaCl，0.015M柠檬酸Na)。如用于本文中，上述溶液和温度指杂交过程中的探针洗涤阶段。术语“在严格(低，中等)条件下杂交的多核苷酸”旨在涵盖单链和双链多核苷酸，尽管仅一条链会与另一多核苷酸的互补链杂交。在指定的溶液中的洗涤可在从几分钟至几日的时间范围内进行，而本领域技术人员会方便地选择适当的洗涤时间以就不同水平的同源性区分结合的序列。

在一个方面，本发明提供了芸薹属植物，如芥菜植物，其能够产生具有按重量计包含高百分比的油酸和低百分比的亚麻酸的内源脂肪酸含量的种子。在具体实施方案中，所述油酸可包含多于约70.0%、71.0%、72.0%、73.0%、74.0%、75.0%、76.0%、77.0%、78.0%、79.0%、80.0%、81.0%、82.0%、83.0%、84.0%或85.0%，包括所有的整数及其分数或任何具有大于85%的值的整数的油酸。在具体实施方案中，所述脂肪酸的亚麻酸含量可为少于约5%、4%、3%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%、0.5%或0%，且包含所有整数及其分数。在一个示例性实施方案中，所述植物是芥菜，其种子具有包含按重量计至少70%油酸和按重量计少于3%亚麻酸的内源脂肪酸含量。在一个其他的实施方案中，所述植物是芥菜植物，其种子具有包含按重量计至少70.0%油酸和按重量计不超过约5%亚麻酸的内源脂肪酸含量。

在一个方面，本发明提供芸薹属植物，如芥菜植物，其能够产生具有如表11所示，包含按重量计高百分比的油酸和低百分比的亚麻酸的内源脂肪酸含量以及可分别包含少于约5.5%总饱和脂肪酸或>10%总饱和脂肪酸的低总饱和脂肪酸或高总饱和脂肪酸的种子。

已知来自芥菜种子的油的组成与来自欧洲油菜的种子的油在脂肪酸组分(例如较高的芥酸含量)、精油(例如，异硫氰酸烯丙酯(allyl isothiocyanate))和次要组分(例如，生育酚、金属、鞣酸、酚类、磷脂、色体(color body)等)方面有所不同。已发现来自芥菜的种子中的油(包括提取油)与来自欧洲油菜的油相比氧化稳定性更高，尽管来自芥菜的油通常具有更高水平的C18:3。(C.Wijesundera等,“Canola Quality Indian Mustard oil(Brassica juncea)is More Stable to Oxidation than Conventional Canola oil(Brassica napus),”J.Am.Oil Chem.Soc.(2008)85:693–699)。

在另一个方面，本发明提供增加芸薹属植物油酸含量并减少亚麻酸含量的方法。此类方法可包括：(a)在来自具有大于55%的油酸含量和少于14%的亚麻酸含量的芸薹属种系的至少一些细胞中诱导诱变；(b)从所述经诱变的细胞至少之一再生植物，并选择具有包含至少70%油酸(或者如上所示油酸的阈浓度)和少于3%的亚麻酸(或者如上所示亚麻酸的阈浓度)的脂肪酸含量的再生植物；和(c)从所述再生的植物衍生出更多世代的植物，所述植物的更多世代的个体植物具有包含至少70%油酸(或者如上所示油酸的阈浓度)和少于3%的亚麻酸(或者如上所示亚麻酸的阈浓度)的脂肪酸含量。在一些实施方案中，所述芸薹属物种可为芥菜。术语“高油酸含量”和“低亚麻酸含量”涵盖了上述可能的值的全部范围。在其他实施方案中，本发明的方法还可包括就减少的亚油酸含量(如上述可能值的范围)选择一种或多种种系，再生植物和更多世代的植物。在其他实施方案中步骤(c)可涉及选择并培养来自步骤(b)的再生植物的种子。在其他实施方案中，本发明的方法可包括重复指定步骤直至达到所需的油酸含量和/或亚油酸含量。

在另一个实施方案中，提供了就增加的油酸含量和减少的亚油酸含量筛选单个种子的方法，包括：确定所述种子发芽一部分的脂肪酸的油酸含量；或亚油酸含量；或油酸含量和亚油酸含量的一种或多种；将一种或多种含量与参照值比较；和推出种子中可能的相对油酸、亚油酸或油酸和亚油酸含量。在具体实施方案中，用于分析的植物部分可为叶、子叶、茎、叶柄、柄/蒂/茎(stalk)或任何其他组织或组织片段(如具有与种子组成表现出可靠关联的组成的组织)的部分或全部。在一系列实施方案中，发芽的部分可为叶的一部分。在某些实施方案中，推出种子脂肪酸组成的步骤可包括假定在所述叶中给定酸水平的显著变化反映了种子中该酸水平类似的相对变化。在本发明的一个具体实施方案中，通过分析叶组织对于芸薹属植物筛选单个植物种系的方法，所述单个植物种系的种子具有包含按重量计至少70%油酸和按重量计少于3%亚麻酸的内源脂肪酸含量。此外，可通过气液层析分析所述叶组织的脂肪酸组成，其中可通过如大量种子(bulk-seed)分析或半粒种子分析等方法来进行脂肪酸的提取。

在其他实施方案中，本发明提供芸薹属植物，其可为芥菜植物，包含前述来自芥菜种系的等位基因。在某些实施方案中，所述植物在fad2-a和fad3-a基因座可为纯合的，表现为突变体等位基因。在一个其他实施方案中，所述芥菜植物、植物细胞或其部分含有具有来自本文中公开的前述序列的核酸序列的等位基因。

在一些实施方案中，本发明可涉及从所述低油酸/该亚麻酸芥菜(～45%油酸和～14%亚麻酸)通过检查BJfad2b基因存在与否来区分出HOLL，本发明的双低级芥菜(≥70%油酸和≤5%亚麻酸)(作为参考，参见Yao等的美国专利公开20030221217号)。这种区分可涉及如本领域所知的确证BJfad2a基因为双低级芥菜种系中仅有的功能性油酸脂肪酸去饱和酶基因。

在一个实施方案中，芥菜种系含有fad2和fad3基因，如公开于国际公开号WO2006/0248611A1，例示于其所附的图1和3以及SEQ ID NO:7、9、12和13。所得的突变体等位基因编码delta-12脂肪酸去饱和酶蛋白，其例示于所附的图2以及SEQ ID NO:8、10和11。在其他实施方案中，所述芥菜种系可在fad2-a和fad3-a基因座含有突变，且所得的突变体等位基因可在预测的BJFAD2-a和BJFAD3-a蛋白的序列中编码一个或多个突变。适用于本发明的fad2a和fad3a突变基因及其所得蛋白的代表性实例包括但不限于：公开于国际公开WO2006/079567A3号(例如，图1和2，以及SEQ ID NO:3和4)；国际公开WO2005/107590A2号(例如SEQ ID NO:1至12)；美国专利6,967,243B2号(例如图2和3，以及SEQ ID NO:11、12、15、16、17和18)；以及欧洲公开1862551A1号(例如图1至10，以及SEQ ID NO:22至33)中的那些。

引物对FAD22F：CAATCCCTCGCTCTTTCTCCTACC例示于SEQ ID NO:1，而FAD26R：CCTTTCTTGTCACCTTCCCTGTCC例示于SEQ ID NO:2。fad31片段通过引物对BNFD31CF(GAGGCTTGGACGACCACTTG) (SEQ.ID.NO.3)和BNFD31CR(GACTGGACCAACGAGGAATG)(SEQ.ID.NO.4)扩增。突变体特异性引物FAD2GM(CGCACCGTGATGGTTAA CGGTTT)(SEQ.ID.NO.5)和FAD3cGM(ATAAATAATGTTGATCTACTTAT)(SEQ.ID.NO.6)设计用于使用PCR扩增检测fad2和fad32的突变体HOLL等位基因的目的。

与本发明序列的同源性可通过与适当的核酸探针杂交，通过用合适的引物的PCR技术或通过任何其他常用技术来检测。在具体的实施方案中，提供了核酸探针，其可包含与本发明的等位基因的部分同源的序列。其他实施方案可涉及使用合适的引物对以扩增或检测本发明序列例如与增加的油酸含量相关的序列的存在。

下述术语用于描述两个或更多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参照序列”，(b)“比较窗(comparison window)”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”，和(e)“基本上相同”。

如本文中使用的“参照序列”为用作序列比较基础的限定序列。参照序列可为指定序列的子集或其整体；例如，全长cDNA或基因序列的区段，或完整的cDNA或基因序列。

如本文中使用的“比较窗”是指多核苷酸序列中连续和指定的区段，其中在比较窗中的多核苷酸序列与参照序列(其不包含添加或缺失)相比为了两个序列的最佳比对可包含添加或缺失(即缺口)。通常，比较窗长度为至少20个连续核苷酸，并任选地可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员理解为了避免由于在多核苷酸序列中包含缺口而导致与参照序列的高度相似性，通常引入缺口罚分并将其从匹配数中减去。

用于比较的序列比对方法在本领域是周知的。因此，任何两个序列之间百分比同一性的确定可使用数学算法来实现。此类数学算法的非限定性实例是Myers和Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的同源性比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的检索相似性方法(search-for-similarity-method)；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264的算法，按照Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877修改。

可利用这些数学算法的计算机实现(implementation)以供比较序列以确定序列同一性。此类实现包括但不限于：PC/Gene程序(可从Intelligenetics,Mountain View,Calif.获得)中的CLUSTAL；Wisconsin Genetics Software Package,Version8(可从Genetics Computer Group(GCG),575Science Drive,Madison,Wis.,USA获得)中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可使用缺省参数进行。CLUSTAL程序充分描述于Higgins等(1988)Gene73:237-244(1988);Higgins等(1989)CABIOS5:151-153;Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90;Huang等(1992)CABIOS8:155-65;以及Pearson等(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988，见上)的算法。对于ALIGN程序，当比较氨基酸序列时，可使用PAM120加权残基表(weight residue table)，缺口长度罚分为12，而缺口罚分为4。Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序是基于Karlin和Altschul(1990，见上)的算法。BLAST核苷酸检索可使用BLASTN程序，得分(score)=100，词长(wordlength)=12来进行，以获得与编码本发明蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可使用BLASTX程序，得分=50，词长=3来进行，以获得与本发明的蛋白或多肽同源的氨基酸序列。就比较而言，为了获得有缺口的比对，可利用Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389所述的Gapped BLAST(BLAST2.0中)。或者，可使用PSI-BLAST(BLAST2.0中)进行迭代检索，其检测分子之间的远缘关系。参见Altschul等(1997，见上)。当利用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可使用相应程序(例如，对于核苷酸序列为BLASTN，对于蛋白为BLASTX)的缺省参数。比对还可通过审视(inspection)人工进行。比对还可使用Sequencher^TM软件(来自Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)进行以供鉴定比对序列之间的同源性和变化，如果其存在。

如本文中使用的“序列同一性”或“同一性”在两个核酸或多肽序列的情境中，是指两个序列中的残基当在指定的比较窗中以最大程度对应进行比对时是相同的。当使用序列同一性百分比指蛋白时，发现并不相同的残基位置常常是由于保守氨基酸取代而不同的，其中氨基酸残基取代其他具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基，并因此并不改变分子的功能性质。当序列不同在于保守取代时，可向上调整序列同一性百分比以就取代的保守性进行校正。因此类保守取代而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行该调整的手段对于本领域技术人员是公知的。通常这涉及将保守取代评分为部分而非完全的错配，由此增加了序列同一性百分比。因此，例如，当给予相同的氨基酸1分而给予非保守取代零分时，给予保守取代零至1之间的评分。保守取代的评分例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,Calif.)中实现来加以计算。

如本文中使用的“序列同一性百分比”意指通过在比较窗中比较两个最优比对的序列来确定的值，其中比较窗中多核苷酸序列的部分与参照序列(其并不包含添加或缺失)相比为了两个序列的最佳比对可包含添加或缺失(即缺口)。百分比是通过确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得到匹配位置数，并将匹配位置数除以比较窗中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比来计算的。

术语多核苷酸序列“基本上相同”意指包含使用一种上述比对程序使用标准参数与参照序列相比具有至少70%序列同一性，优选至少80%，更优选至少90%，且最优选至少95%序列同一性的序列的多核苷酸。本领域技术人员会知道，这些值可经适当调整并考虑密码子简并性、氨基酸相似性、开读框定位等以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白的相应同一性。术语“基本上相同”在肽的情境下表明肽在所指明的比较窗中包含与参照序列具有至少70%序列同一性，优选80%，更优选85%，最优选与参照序列至少90%或95%序列同一性的序列。优选地，最佳比对是使用Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法进行的。两个肽序列基本上相同的指标是一个肽与针对第二肽所产生的抗体具有免疫反应性。因此，例如当两个肽仅因保守取代而不同时，一个肽基本上与第二肽相同。“基本上相似的”肽共享如上所示的序列，不过不相同的残基位置可因保守氨基酸变化而不同。

如本文中使用的术语“Omega-9”对于来自双低菜的油分布意指具有包含按重量计至少68.0%油酸和按重量计少于或等于4.0%亚麻酸的脂肪酸含量的非氢化油。对于双低菜植物，术语“Omega-9”意指双低菜植物产生具有包含按重量计至少68.0%油酸和按重量计少于4.0%亚麻酸的内源脂肪酸含量的种子。

在选定的实施方案中，本发明提供包含完整的开读框(ORF)和/或之前公开的突变体fad2和fad3基因5’上游区的分离的DNA序列。本发明相应地还提供预想的突变体蛋白的多肽序列，包含来自之前所述的突变体等位基因的突变。已知膜结合的去饱和酶，如FAD2，具有保守的组氨酸盒。在这些组氨酸盒之外的氨基酸残基的变化也可影响FAD2酶活性(等,Molecular Breeding4:543-550,1998)。

在本发明的一个方面，本文中所述的突变体等位基因可用于植物育种。具体而言，本发明的等位基因可用于培育高油酸芸薹属物种，如芥菜、欧洲油菜、芜菁、黑芥和Brassica carinata。本发明提供用于将突变体等位基因与可选序列(alternativesequence)区分的分子标记。本发明由此提供用于涉及具有本发明等位基因的植物的遗传杂交的分离和选择分析的方法。本发明由此提供用于来源于涉及具有本发明等位基因的植物的遗传杂交的后代的分离和选择分析的方法。

在另一些实施方案中，本发明提供用于鉴定具有所需脂肪酸组成或所需基因组特征的芸薹属植物如芥菜植物的方法。本发明的方法可例如涉及在基因组中确定特定FAD2和/或FAD3等位基因，如本发明的等位基因或野生型J96D-4830/BJfad2a等位基因的存在。在具体实施方案中，本方法可包括鉴定与一种鉴定的等位基因相关的核酸多态性或与本发明的一种等位基因相关的抗原决定簇的存在。此种确定可例如用多种技术如相关DNA片段的PCR扩增、DNA指纹法、RNA指纹法、凝胶印迹和RFLP分析、核酸酶保护测定、相关核酸片段的测序、(单克隆或多克隆)抗体的生成或适应于区分由相关等位基因产生的蛋白与该蛋白的其他变体或野生型形式的其他方法来实现。本发明还提供通过确定本发明突变体等位基因的存在用于鉴定芥菜植物的方法，所述芥菜植物的种子具有包含按重量计至少70%油酸的内源脂肪酸含量。

在一些选定的实施方案中，本发明突变体等位基因的具体单个碱基对变化可用于设计等位基因特异性PCR引物，例如利用3’错配。可进行多种引物组合，如在3’端具有“G/C”(用于扩增野生型等位基因)或在3’端具有“A/T”(用于扩增突变体等位基因)的正向引物或反向引物。在其他选定的实施方案中，本发明突变体等位基因的特定单个碱基对变化可用于设计等位基因特异性PCR引物，例如利用3’错配。可进行多种引物组合，如在3’端具有“C/G”(用于扩增野生型等位基因)或在3’端具有“T/A”(用于扩增突变体等位基因)的正向引物或反向引物。对于等位基因特异性PCR实验方案的示例性总结，参见Myakishev等,2001,Genome Research11:163-169,or等,1999,Molecular Breeding4:543-550。

在其他实施方案中，多种用于检测单核苷酸多态性(SNP)的方法可用于鉴定本发明的等位基因。此类方法可例如，包括TaqMan测定法或Molecular Beacon测定法(Tapp等,BioTechniques28:732-738)、Invader测定法(Mein等,Genome Research10:330-343,2000)、Golden Gate测定法(www.illumina.com)或基于单链构象多态性(SSCP)的测定法(Orita等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:2766-2770,1989)。

在其他实施方案中，本发明提供包含编码突变的FAD2和FAD3蛋白的fad2和fad3编码序列的芸薹属植物。此类突变的FAD2/FAD3蛋白与野生型FAD2蛋白相比可仅含有一个氨基酸变化。在代表性实施方案中，多种芥菜种系含有之前所述的突变的FAD2蛋白，其由之前所述的等位基因所编码。可选择此类等位基因以有效赋予本发明植物增加的油酸含量和减少的亚麻酸含量。在具体实施方案中，所需的等位基因可通过育种技术引入植物。在其他的实施方案中，本发明的等位基因可通过分子生物学技术包括植物转化引入植物。在此类实施方案中，本发明的植物可产生具有包含按重量计至少约70%油酸和按重量计少于约3%亚麻酸或任何如上所示的其他油酸和亚麻酸含量阈值的内源脂肪酸含量的种子。本发明的植物还可含有按重量计约70%至约85%的油酸，约70%至约78%的油酸，和约0.1%至约3%的亚麻酸，其中所述油组成遗传衍生自亲本种系。本发明的植物还可具有按重量计少于7.1%至少于约6.2%的总脂肪酸含量。在一个实施方案中，所述植物产生包含至少约70%油酸和少于3%亚麻酸的内源脂肪酸含量的种子，其中所述油组成遗传衍生自亲本种系。

在选定的实施方案中，本发明提供具有下述内源油含量的芸薹属种子，其可为芥菜种子，所述油含量具有一个或多个前述实施方案所示的脂肪酸组成，且其中对于内源油含量的遗传决定子(genetic determinant)来源于本发明的突变体等位基因。此类种子可例如通过对每个本发明的突变体等位基因种系进行自花授粉来获得。或者，此类种子可例如通过将所述突变体等位基因种系与第二亲本杂交之后进行选择来获得，其中所述第二亲本可为任何其他芸薹属种系如芥菜种系，其为双低级芥菜或非双低级芥菜，或任何其他芸薹属物种如欧洲油菜、芜菁、黑芥和Brassica carinata。这些育种技术对于本领域技术人员是公知的。

在其他实施方案中，本发明提供遗传稳定的芸薹属植物，如芥菜植物，其发育出具有前述一个或多个实施方案中公开的组分的成熟种子。此类植物可来源于具有本发明的突变体等位基因的芥菜种系。此类植物的油组成可遗传衍生自亲本种系。

在其他实施方案中，本发明提供产生遗传稳定的芸薹属植物如芥菜植物的方法，所述植物产生具有包含前述一个或多个实施方案所指定的组成的内源脂肪酸含量的成熟种子。本发明的方法可涉及下述步骤：将来自欧洲油菜的Omega-9基因(例如fad2a和fad3a)与其他芸薹属植物如芥菜杂交，以形成F1后代。F1后代可例如通过可包括自花授粉或发育加倍单倍体植物的手段来繁殖。通过将突变体FAD2等位基因和突变体FAD3等位基因组合，具有双重突变体等位基因(fad2和fad3)的植物可比任何单个突变体植物具有更好的油脂肪酸分布。可对所得的后代就遗传稳定的植物进行选择，所述植物生成具有前述一个或多个实施方案公开的组成的种子。此类种子可例如具有稳定的脂肪酸分布，其在总的可提取油中包含约7.1%至约6.5%的总饱和物含量。在某些变体中，后代自身可产生具有如上所示其他实施方案的组成的植物或油。具有按重量计大于约70%的油酸含量和按重量计少于约3%的亚麻酸含量。

在选定的实施方案中，在本发明植物如来源于本发明突变体等位基因的植物中油酸的增加可伴随亚油酸和亚麻酸的相应减少，而其他脂肪酸可实质上保持不变。阐明此类特征的数据示于本文中的表1、6-10和12-14。原始芥菜背景脂肪酸数据示于表2，而BC2F2半粒种子选定种系的脂肪酸数据示于表7、8和10。表12阐明了BC3F31/2种子数据，其具有非常高油酸和低亚麻酸的脂肪酸分布，此外还显示了非常低水平的亚油酸。表14阐明了表12中所示的种系(BC3F31/2种子选择，长大并自交，然后测试了15个种子批次(seed bulk))的BC3F4种子数据(FAME对于全种子)。这些结果确证了见于表12(BC3F3)的分布，并显示该分布是稳定的。

在一个方面，本发明提供具有稳定、可遗传的高油酸和低亚麻酸表型的植物。举例而言，由本发明突变体等位基因所得的高油酸和低亚麻酸表型经过M2、M3和M4世代为遗传上可遗传的。

在多个方面，本发明涉及调节植物基因组中可表达编码序列的拷贝数。“可表达的”意指编码序列的一级结构即序列表明该序列编码活性蛋白。无论如何，可表达的编码序列在特定细胞中可能无法作为活性蛋白表达。这种“基因沉默”可例如通过多种同源转基因失活机制在体内发生。同源转基因失活描述于其中在有义方向插入了转基因的植物中，发生意料之外的基因和转基因均下调的结果(Napoli等,1990Plant Cell2:279-289)。此种共抑制的准确分子基础是未知的，尽管对于同源基因序列的失活存在至少两种推定的机理。已提出通过甲基化的转录失活为一种机理，其中复制的DNA区发出基因沉默的内源机理的信号。还提出了转录后机理，其中认为基因和转基因两者的合并表达水平产生高水平的转录物，其触发两个信使的阈值诱导的降解(van Bokland等,1994,Plant J.6:861-877)。在本发明中，基因组中的可表达的编码序列相应地可不全在特定细胞中表达。

在其他实施方案中，本发明提供芥菜植物，其中相对于用于诱变实验的野生型芥菜改变了脂肪酸去饱和酶的活性，改变了油酸含量或改变了亚麻酸含量。脂肪酸去饱和酶(“FAD”)意指在脂肪酸生物合成中呈现引入双键活性的蛋白。举例而言，FAD2/FAD3酶可以以在从油酸至亚油酸的生物合成中引入第二双键的活性为特征。改变的去饱和酶活性可包括去饱和酶活性与参照植物、细胞或样品相比的增加、减少或消除。

在其他方面，去饱和酶活性的减少可包括消除编码去饱和酶的核酸序列如本发明的核酸序列的表达。在本文中消除表达意指由该核酸序列编码的功能性氨基酸序列并不以可检测的水平产生。去饱和酶活性的减少可包括消除编码去饱和酶的核酸序列如本发明编码FAD2酶或FAD3酶的序列的转录。在本文中消除转录意指由所述核酸序列编码的mRNA序列并不以可检测的水平转录。去饱和酶活性的减少还可包括从编码去饱和酶的核酸序列产生截短的氨基酸序列。在本文中产生截短的氨基酸序列意指由所述核酸序列编码的氨基酸序列失去由野生型核酸序列编码的功能性氨基酸序列的一个或多个氨基酸。此外，去饱和酶活性的减少可包括产生变体去饱和酶氨基酸序列。在本文中产生变体氨基酸序列意指所述氨基酸序列具有一个或多个与野生型核酸序列编码的氨基酸序列不同的氨基酸。如本文中更加详细地讨论，本发明公开了本发明的突变体种系产生与野生型种系J96D-4830相比具有变体氨基酸的FAD2和FAD3酶。可将多种类型的突变如移码突变、取代和缺失引入核酸序列用于减少去饱和酶活性的目的。

在一些实施方案中，本发明提供新颖的FAD2/FAD3多肽序列，其可根据本发明其他实施方案加以修饰。在本领域公知可在多肽结构中进行一些修饰和变化而基本上不改变该肽的生物学功能以获得生物学上等同的多肽。如本文中使用的术语“保守氨基酸取代”指在肽的给定位置用一个氨基酸取代另一个，其中可进行所述取代而无显著的功能丧失或取得，以获得生物学上等同的多肽。在进行此类变化时，类似氨基酸残基的取代可基于侧链取代基的相对相似性例如其大小、电荷、疏水性、亲水性等来进行，且此类取代可通过常规测试测定其对肽功能的作用。相反，如本文中使用的术语“非保守氨基酸取代”指在肽中给定位置用一个氨基酸取代另一个，其中所述取代导致肽功能的显著丧失或取得，以获得并生物学上不等同的多肽。

在一些实施方案中，保守氨基酸取代可在用一个氨基酸残基取代另一个具有类似亲水性值(hydrophilicity value)(例如，在正负2.0范围内的值)的氨基酸残基时发生，其中对氨基酸残基给定下述亲水性值(详见美国专利4,554,101号)：Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；和Trp(-3.4)。非保守氨基酸取代可在残基的亲水性值显著不同，例如相差超过2.0时发生。

在其他实施方案中，保守氨基酸取代可在用一个氨基酸残基取代另一个具有类似亲水性指数(hydrophathic index)(例如，在正负2.0范围内的值)的氨基酸残基时发生。在此类实施方案中，对每个氨基酸残基可基于其疏水性和电荷特征给定亲水性指数，如下所述：Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；Gin(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)；和Arg(-4.5)。非保守氨基酸取代可在残基的亲水性指数显著不同，例如相差超过2.0时发生。举例而言，据此，针对在对应于BJfad2-a中的氨基酸105的位置的野生型His(-3.2)进行的下述氨基酸取代会是非保守取代：Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；和Trp(-0.9)。

在其他实施方案中，保守氨基酸取代可在用一个氨基酸残基取代另一个相同类型的氨基酸残基时发生，其中氨基酸分为非极性、酸性、碱性和中性类型，如下所述：非极性：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met；酸性：Asp、Glu；碱性：Lys、Arg、His；中性：Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、GIn、Tyr。非保守氨基酸取代可在残基并不落在相同类型中时发生，如用碱性氨基酸取代中性或非极性氨基酸。

本发明还包括从本文中所述的芥菜植物的种子获得的粕，其中此种粕可为压碎的种子、压滤饼(经挤压排出油，但未经溶剂或其他化学提取的种子)、白色薄片(经压碎，并经溶剂如己烷提取以去除更多油的种子)，或来自常规压碎和溶剂提取方法的粕的形式。在一个具体实施方案中，对芥菜种子进行例如WO2008024840A2、WO03/053157、美国专利5,844,086号；WO97/27761；美国专利申请2005/0031767号，或J.Caviedes,“Aqueous ProcessingOf Rapeseed(Canola),”Thesis For Degree Of Master Of Applied Science,University Of Toronto1996,pages1-147中所述类型的水处理。

本发明的油还可用于非烹调或膳食方法和组合物。这些用途中的一些可为工业的、化妆品的或医药的。本发明的油还可用于本发明的油适合的任何应用。一般而言，本发明的油可用于在多种应用如润滑剂、润滑剂添加剂、金属加工液、液压液和耐火液压液中替代例如矿物油、酯、脂肪酸或动物脂肪。本发明的油还可用作原料用于产生修饰油的方法。用于修饰本发明的油的技术的实例包括分馏、氢化、改变油的油酸或亚麻酸含量，以及其他本领域技术人员已知的修饰技术。在一些实施方案中，本发明的油用于产生酯交换油、产生三硬脂酸甘油酯或用于电解质液体组合物，该组合物可包含于电气设备中。

本发明油的工业用途的实例包括润滑组合物的组成部分(美国专利6,689,722号；亦参见WO2004/0009789A1)；燃料例如生物柴油(美国专利6,887,283号；亦参见WO2009/038108A1)；复印装置的记录材料(美国专利6,310,002号)；粗油模拟物组合物(美国专利7,528,097号)；混凝土的密封组合物(sealing composition)(美国专利5,647,899号)；可加工的涂层剂(curable coating agnet)(美国专利7,384,989号)；工业煎炸油；清洁配制剂(WO2007/104102A1；亦参见WO2009/007166A1)；和焊液中的溶剂(WO2009/069600A1)。本发明的油还可用于工业方法，例如，产生生物塑料(美国专利7,538,236号)；和通过反向乳液聚合产生聚丙烯酰胺(美国专利6,686,417号)。

本发明油的化妆品用途的实例包括用作化妆品组合物中的润肤剂(emollient)；作为凡士林(petroleum jelly)的替代物(美国专利5,976,560号)；作为肥皂的组成部分，或作为原料用于产生肥皂的方法(WO97/26318；美国专利5,750,481号；WO2009/078857A1)；作为口腔处理溶液的组成部分(WO00/62748A1)；作为衰老处理组合物的组成部分(WO91/11169)；和作为皮肤或毛发气溶胶泡沫制备物的组成部分(美国专利6,045,779号)。

此外，本发明的油可用于医疗用途。举例而言，本发明的油可用于针对感染的保护屏障(Barclay和Vega,“Sunflower oil may help reduce nosocomial infections inpreterm infants.”Medscape Medical News<http://cme.medscape.com/viewarticle/501077>,2009年9月8日访问)；而具有高量Omega-9脂肪酸的油可用于增强移植物的存活(美国专利6,210,700号)。

应理解的是，前述为本发明的油适用的非烹调用途的非限定性实例。如前所述，本发明的油和修饰油可用于在本领域技术人员已知的所有用途中替代例如矿物油、酯、脂肪酸或动物脂肪。

应理解的是，可对本发明进行多种修饰和替代。其某些具体实施方案描述了一般方法，并由下述实施例进一步解释。本发明当然适用于所有双低级芥菜物种以及所有非双低级芥菜物种。本发明还可适用于所有其他芸薹属物种，包括芥菜、黑芥和Brassicacarinata以产生基本上相似的结果。还应理解的是，下述实施例并不旨在将本发明限定于公开的具体形式，而是说本发明应涵盖落在本发明范围之内的所有修饰、等同和替代物。

实施例

实施例1

回交

参照图1，为了完全回收芥菜的遗传背景的高油酸-低亚麻酸选择个体和芥菜亲本(Zem1、Zem2和ZE Skorospelka)之间的一个或多个回交(BC3和BC4)。在回交程序中仅使用零芥酸的芥菜种系，因为这将允许fad2和fad3突变体等位基因与FAE基因在非竞争性情况下的完全表达。

在每次进一步的回交(例如BC3、BC4)和后续的自花授粉(例如BC3F2、BC4F2)之后，首先对后代种子就fad2a和fad3a基因的存在进行组织筛选(使用本文中更加详述的标记)，然后继续生长至开花以用于后续的回交。对从选定种系收获的种子进行使用半粒种子的油分布分析，非破坏性单个全种子的NIR分析，或单个种子的NIR分析(FTNIR)。之后，将含有增加的油酸水平和减少的亚麻酸水平的样品植于土壤中并生长至成熟。从这些植物产生了自交种子，并对大量种子分析代表高油酸和低亚麻酸的油分布。鉴定了具有范围在67-80%内的油酸和少于5%的亚麻酸的选择个体。将这些选择个体彼此互交以产生所需的脂肪酸分布。

分离了来自叶组织的基因组DNA，并就已知赋予种子油中高油酸和低亚麻酸表型的对于fad2a和fad3a基因特异性的突变的存在进行筛选。植物的表型(叶的形状和纹理(texture))近似芥菜亲本。植物还在与亲本芥菜类似的田间条件(field condition)下呈现裂果抗性(pod shattering resistance)和干旱耐受性。

特异于CC基因组和不需要的AA基因组区的SSR标记不再出现于芥菜x欧洲油菜与芥菜回交的后代中。

将从芥菜和Omega-9欧洲油菜种系收集的叶组织冻干以供遗传指纹法。在使用多种植物生成F1个体的情况下，还收集了来自全部祖先的组织以覆盖可能在后续世代中观察到的等位基因。如果未收集亲本组织，则实施另一个选项，其中收集来自每个亲本种子批次(来源)的六个植物的随机样品。从每个种系最多六个个体分离DNA，并将来自每个个体的相等等分试样汇集以构成用于遗传指纹法的亲本对照。用于回交程序的所有Omega-9欧洲油菜种系的遗传指纹之前已经确立，并代表在这些种系中从所有A基因组和C基因组连锁群收集的数据。

为了进一步改进结果的诠释和可靠性，收集了叶组织并分离DNA，且还对芜菁、黑芥和甘蓝登录项(accession)制备了DNA样品池(sample pool)用于推定地鉴定分别对应于A、B和C基因组的等位基因的目的。

用一组SSR标记筛选芥菜、欧洲油菜、芜菁、黑芥和甘蓝池。除了对所观察的DNA片段收集信息之外，记录了对于无效等位基因(null allele)的信息。收集的基因分型信息储存于Geneflow^TM基因分型数据库。对选定的芥菜和欧洲油菜种系有信息意义(informative)的SSR标记的鉴定使用Geneflow^TM基因分型数据库的多态性报道功能来达成。

标记协助选择以减少特异于欧洲油菜的基因组区是在回交世代中通过用经由亲本筛选鉴定的多态性SSR标记筛选回交种群来进行的。除了多态性共显性标记之外，还将对于芥菜种系评分为无效的标记用于标记协助选择所需的A和B基因组区。用于推进(advancement)的植物的选择是通过育种和实验室焦点使用表型和基因型观察来进行的。将基于标记分布不具有Omega-9欧洲油菜CC基因组以及不需要的AA基因组区段的后代植物选用于推进至下一步骤。

实施例2

开发芥菜特异性标记

开发了可检测与FAD2b相关的BB基因组DNA和其他可从黑芥和芥菜(代表BB基因组)获得的序列的存在性的DNA标记。为了标记开发，开发了加倍单倍体定位种群(doublehaploid mapping population)。此外，从已知的B基因组序列开发了DNA(SSR和SNP)标记。这些标记能够确证转变种系中芥菜背景的回收程度。

总共1931个欧洲油菜SSR标记，主要含有二核苷酸和三核苷酸重复基序，可用于亲本筛选。目前正将这些标记对一组属于芥菜(Zem1、Zem2和ZE Skorospelka种系)、Omega-9欧洲油菜、芜菁、黑芥和甘蓝的芸薹属种系进行筛选。该筛选提供了两类信息。第一，因为这些SSR标记是从欧洲油菜基因组开发的，该筛选提供了关于其在其他基因组中的效用的信息，并允许鉴定特异性对应于AA、BB或CC基因组的等位基因。第二，该筛选允许鉴定核心组的标记以供用于芥菜定位和性状渗入(trait introgression)。

除了上述提及的标记之外，就可用于芥菜的SSR标记检索了公共数据库。鉴定了总计438个公开的SSR，其中101个来自欧洲油菜(AA CC基因组)，113个来自黑芥(BB基因组)，95个来自甘蓝(CC基因组)且129个来自芜菁(AA基因组)。在这些中，鉴定了113个来自黑芥的SSR，129个来自芜菁的SSR和一些来自欧洲油菜的SSR潜在地可用于芥菜。

将来自我们目前收集的选择性标记，以及从已知的B基因组序列开发的SSR和SNP标记，用于在回交育种中确证芥菜背景的存在。从亲本筛选鉴定的有信息意义的标记也用于构建芥菜连锁图，以及芥菜和欧洲油菜之间的比较图以鉴定共享的标记基因座。在芥菜中定位渗入的fad2a和fad3a基因座以提供证据表明其已经成功地渗入芥菜的AA基因组。

通过使用这些芥菜特异性标记，鉴定了固有的突变体fad2a、fad2b、fad3a和fad3b序列以在具有改进的脂肪酸分布的选定种系中定位fad2和fad3变异。

表3显示了七个(7)芥菜和三个(3)Omega-9欧洲油菜近交系之间的种间杂交结果。表4显示了芥菜/Omega-9欧洲油菜(F1种间杂种)FAD标记筛选结果。表5显示了芥菜//芥菜/Omega-9欧洲油菜(BC1)GOI筛选结果。表6显示了芥菜*2//芥菜/Omega-9欧洲油菜(BC2F1)GOI筛选结果。

实施例3

B基因组的回收和确定

如前所述，使用选用于BB基因组的标记筛选了呈现高油酸和低亚麻酸的种子油分布的自花授粉和加倍单倍体植物。确证BB基因组存在于转变的种系中。这些突变体芥菜种系还在选用于欧洲油菜的阳性C基因组标记数上显示出减少(或完全缺乏)。这些分布通过本领域已知的其他回交和自交技术进一步增强，其改进了该种系的农艺性，例如减少生产延迟(yield drag)、减少裂果、改变多种生长区的成熟性、增加应激耐受性、增加疾病抗性等。

使用了三种不同的方法用于在呈现所需种子油分布的欧洲油菜和芥菜种间杂交的自花授粉和DH后代中确定B基因组。

A)分子标记

鉴定了能够检测欧洲油菜和芥菜种系之间的遗传多态性的分子标记。筛选了总计1931个欧洲油菜SSR标记以鉴定可区分芥菜基因组与欧洲油菜的核心组SSR。此外，如实施例2所述，检索了公共数据库以鉴定其他用于亲本筛选的标记。因此，就其区分芥菜与欧洲油菜的能力调查了超过2300个SSR标记。将来自该筛选的一组标记用于确定芥菜基因组在后代中的富集或欧洲油菜基因组的减少或缺乏。另一标记系统包括使用SNP标记。通过聚生(consortium)开发了超过3000个SNP。生成了两个高通量Illumina测定法(即，两个1536路SNP OPA(Oligo Pool All))。将这两个OPA(总计3072个SNP测定)在由所有三个四倍体欧洲油菜、芥菜和B.carinata以及芸薹属“Triangle of U”(1935)的所有三个二倍体祖先-黑芥、甘蓝和芜菁的种系组成的亲本组中进行筛选。鉴定了一组可毫无疑义地在后代中跟踪芥菜片段的SNP。具体而言这些可在后代中确证B基因组存在的SNP包含于该组中。因此，通过使用大量有信息意义的SSR和SNP用于筛选后代植物，鉴定了那些具有高百分比B基因组的植物。在表征自花授粉和DH后代之后，针对欧洲油菜和芥菜连锁图通过使用分离后代构建比较图确认了标记基因座的图谱位置(mapping position)。该比较图允许在种间交配之后鉴定潜在的标记基因座重排、添加或缺失。

B)荧光原位杂交

使用荧光原位杂交(FISH)技术确定后代中B基因组的存在和富集。将后代植物用于标记分析并用于细胞学研究，如鉴定染色体数、非整倍性的发生和用于确定目标的基因组区段。FISH是有力的工具，其可进一步加强通过分子标记获得的信息。为此目的，将可毫无疑义地确定B基因组存在的候选SSR和SNP标记序列用于抽取(pull out)大BAC克隆，然后将其用作鉴定为具有高百分比B基因组的候选后代植物的中期扩散(metaphase spread)的探针。还使用计算方法鉴定了BAC序列，前提是所述BAC序列可从数据库得到。如果确然如此，在计算机中鉴定的BAC可从相应的来源获得并用于FISH实验。

C)基因组原位杂交

基因组原位杂交(GISH)技术用于当候选后代植物的染色体可用全核BB基因组DNA探测并使用总芥菜DNA作为竞争性未标记探针时。对芥菜中BB基因组染色体的强杂交表明后代中BB基因组的存在。

将具有所需种子油分布和归于芥菜的等位基因的样品用于回交和另外的自花授粉。在分离群中，使用MAS以在最多数量的可能的多态性基因座回收优秀的基因型，同时维持所需的表型。对回交后代用SSR或SSP标记进行基因分型，着重于避免选择呈现与欧洲油菜相关的A和C基因组的等位基因。当需要大量基因座以获得所需表型时，该过程是有效的。

实施例4

对油分布的进一步修饰和测试油分布

对油种子的进一步改进是通过组合公开于公开号US2008/0168587的B基因组fad2、fad3突变或在黑芥或在芥菜种子中新产生的突变来达成的。在一个实例中，杂交是在多个种系之间进行的，鉴定了选择个体，并通过组合这些选择个体产生了具有类似农业产量的其他稳定的高油酸和低亚麻酸选择个体。

其他潜在的获得和/或鉴定其他来源的突变体fad2b和/或fad3b基因的方式包括，例如：通过已知的种质，通过快中子/EMS突变体，通过RNAi的应用，通过锌指介导的基因表达调节的调控。可通过任何上述方法减少或消除fad2b和fad3b酶的表达水平。

一旦获得/鉴定了基因，将突变体FAD基因通过下述步骤转移入芥菜植物：(a)将DAS’芥菜种系与具有突变体fad2b基因和/或fad3b基因的第二黑芥、B.carinata或芥菜植物杂交；(b)使用分子标记跟踪fad2b基因和/或fad3b基因的渗入；(c)从步骤(a)的杂交获得种子；(d)分析种子的FAP，然后从种子选择个体培养可育的植物；(e)从步骤(d)的自花授粉植物获得后代种子；(f)在不同环境下对后代进行温室和田间测试；和(g)在后代中鉴定那些具有<3%的亚麻酸值和约68%至约80%之间的油酸值的种子。

FAD2B和FAD3B酶的下调是通过在天然序列内的编码区或调节域的缺失、插入诱变来达成的。

实施例5

杂种芥菜种子油分布

HOLL油分布表现在通过产生含有细胞质雄性不育系统(参见例如Ogura，欧洲油菜CMS126-1)及其相应的育性恢复背景的HOLL亲本种系而产生的杂种中。

实施例6

将农艺学、除草剂和杀虫剂性状引入HOLL芥菜(HOLL Juncea)

除草剂抗性性状(咪唑啉酮抗性)：欧洲油菜(BASF)中的咪唑啉酮抗性性状包含位于LG01(AA基因组，距草甘膦抗性插入位点大约20cM)的PM2突变位点和位于LG11(CC基因组)的PM1突变位点。认为ahas3对应于AA基因组，而AHAS1对应于CC基因组。Swanson等(Theor.Appl Genet.78:525-530,1989)表明ahas3基因本身即提供了对咪唑啉酮除草剂的耐受性。存在两种另外的位于AA基因组上的AHAS基因：ahas2和ahas4。如果针对咪唑啉酮除草剂的抗性需要两种ahas基因，则可鉴定位于BB基因组上的AHAS基因以供诱变。已发现在芥菜中，仅PM2无法获得充分的抗性。因此，在芥菜中开发了两种或更多种基因以提供充分的咪唑啉酮抗性。

将Omega-9IMI欧洲油菜与芥菜杂交。种植了可育的种子，并将种间杂交的后代用咪唑啉酮除草剂喷洒以测定抗性。使用Invader测定的PM2的存在确证了PM2突变的存在。测定PM1突变以确定配对的BB基因组和CC基因组染色体导致PM1从欧洲油菜CC基因组遗传转移至芥菜的B基因组。

如果AHAS3基因中的突变单独提供了对咪唑啉酮除草剂的抗性，则将含有PM2的Omega-9欧洲油菜种系用于与芥菜种系杂交以消除将欧洲油菜种质重新引入完成的HOLL芥菜种系的需要。对咪唑啉酮抗性芥菜的标记协助选择与BB基因组的回收和确定同时发生。一旦开发了HOLL芥菜咪唑啉酮抗性种系，将其用于后续将性状渗入其他芥菜栽培种。

将新的除草剂性状渗入HOLL芥菜：对草甘膦抗性芥菜的开发是通过将藉由应用锌指技术将TIPS突变引入芥菜来达成的。在欧洲油菜中鉴定了五个共生同源基因(paralog)，其中的一个或两个为最高表达形式的EPSPS基因。发现能够得到草甘膦抗性表型的修饰的epsps基因存在于A基因组上，并杂交至Omega-9芥菜中以产生草甘膦抗性Omega-9芥菜。

种植了分离的后代(T1S1、F2或BC1)。收集叶样品以供DNA分离。对样品喷洒除草剂选择性标记，然后用基因特异性标记进行接合性测试。通过从抗性和易感植物的随机样品汇集DNA以包含抗性和易感类型形成了大量分离子分析(BSA)池。对R和S池，以及优异的栽培种和转化的供体栽培种，使用SSR或SNP标记进行基因分型以鉴定推定的插入染色体。对具有偏斜的部分(skewed bulk)的染色体进行选择性基因分型以鉴定基因插入位点。使用标记协助渗入以将目标基因渗入所需的HOLL芥菜。

本发明的其他实施方案

随着使分离和表征编码特定蛋白质产物的基因成为可能的分子生物学技术的出现，植物生物学领域的科学家对以下方面形成了强烈的兴趣，即工程化改造植物的基因组以使其含有和表达外来的或者额外的基因，或表达修饰形式的天然基因(可能由不同启动子驱动)，以便以特定的方式改变植物的性状。此类外来的额外的和/或经修饰的基因在本文中统称为“转基因”。在过去20年中，已经对几种作物开发了几种产生转基因植物的方法，其包括土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化和粒子轰击。对于具体的芸薹属转化实验方案，参见对专利的参照(1993年2月23日授予Moloney等的美国专利5,188,958号；2000年4月18日授予Chen等的美国专利6,051,756号；2001年10月2日授予Tulsieram等的美国专利6,297,056号)。在具体的实施方案中，本发明也涉及要求保护的品种或种系的经转化形式。

植物转化涉及构建会在植物细胞中发挥功能的表达载体。此类载体包含DNA，该DNA包含在调节元件(例如启动子)控制下的或者与调节元件(例如启动子)可操作连接的基因。表达载体可以含有一种或多种此类可操作连接的基因/调控元件组合。载体可以是质粒形式，而且可以单独或者与其他质粒组合使用，以如下文所描述的那样使用转化方法提供经转化的芸薹属植物，从而将转基因掺入芸薹属植物的遗传物质中。

供芸薹属转化用的表达载体：标记基因

表达载体包括至少一种与调节元件(例如启动子)可操作连接的遗传标记，其容许通过负选择，即抑制不含该选择标记基因的细胞生长，或者通过正向选择，即筛选由该遗传标记编码的产物，回收含有所述标记的经转化细胞。许多通常用于植物转化的选择标记基因是转化领域中公知的，包括例如编码在代谢上使可以作为抗生素或除草剂的选择性化学剂解毒的酶的基因，或者编码对抑制剂不敏感的改变了的靶物的基因。几种正向选择方法也是本领域中已知的。

一种通常用于植物转化的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，其当在植物调节信号控制下时，赋予对卡那霉素的抗性(Fraley等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:4803,1983)。另一种常用的选择标记基因是潮霉素磷酸转移酶基因，其赋予对抗生素潮霉素的抗性(Vanden Elzen等,Plant Mol.Biol.,5:299,1985)。

赋予对抗生素的抗性的细菌来源的其他选择标记基因包括庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶和氨基糖苷-3’-腺嘌呤转移酶(adenyl transferase)，博来霉素抗性决定子(Hayford等,Plant Physiol.86:1216,1988；Jones等,Mol.Gen.Genet.,210:86,1987；Svab等,Plant Mol.Biol.14:197,1990；Hille等,Plant Mol.Biol.7:171,1986)。其他选择标记基因赋予对除草剂如草甘膦、草铵膦(glufosinate)、2,4-D或溴苯腈(bromoxynil)的抗性(Comai等,Nature317:741-744,1985)；Lira等,WO2008/070845；Wright等,WO2005/107437和WO2007/053482；Gordon-Kamm等,Plant Cell2:603-618,1990；和Stalker等,Science242:419-423,1988)。

其他用于植物转化的非细菌来源的选择标记基因包括例如小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶和植物乙酰乳酸合酶(Eichholtz等,Somatic Cell Mol.Genet.13:67,1987；Shah等,Science233:478,1986)；Charest等,Plant Cell Rep.8:643,1990)。已利用编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因作为用于原核和真核细胞中基因表达的标记(Chalfie等,Science263:802,1994)。GFP和GFP的突变体可用作选择性标记。

启动子：表达载体中包含的基因必须由包含调节元件(例如启动子)的核苷酸序列驱动。数种类型的启动子现在是转化领域中公知的，可以单独使用或者与启动子联合使用的其他调节元件也是如此。如本文中所使用的，“启动子”包括提及在转录原始的上游的DNA区域，其涉及识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质以起始转录。“植物启动子”是能够在植物细胞中起始转录的启动子。在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞、或厚壁组织中起始转录的启动子。此类启动子称为“组织优选性的”。仅在某些组织中起始转录的启动子称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要在一种或多种器官中的某些细胞类型(例如根或叶中的维管细胞)中驱动表达。“诱导型”启动子是在环境控制下的启动子。可招致诱导型启动子转录的环境条件的例子包括缺氧条件或光的存在。组织特异性的、组织优选性的、细胞类型特异性的、和诱导型启动子构成“非组成型”启动子类。“组成型”启动子是在大多数环境条件下有活性的启动子。

诱导型启动子：将诱导型启动子与芸薹属中表达的基因可操作连接。任选地，将诱导型启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述核苷酸序列与用于在芸薹属中表达的基因可操作连接。通过诱导型启动子，转录速率响应诱导剂而升高。可以在本发明中使用任何诱导型启动子。参见Ward等,Plant Mol.Biol.22:361-366(1993)。例示性诱导型启动子包括但不限于：响应铜的ACEI系统的启动子(Mett等,PNAS90:4567-4571,1993)；响应苯磺酰胺除草剂安全剂的玉米的In2基因(Hershey等,Mol.Gen.Genetics227:229-237(1991)；和Gatz等,Mol.Gen.Genetics243:32-38(1994))或来自Tn10的Tet阻抑物(Gatz等,Mol.Gen.Genetics227:229-237(1991))。特别优选的诱导型启动子是响应植物正常不响应的诱导剂的启动子。例示性诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性受糖皮质激素诱导(Schena等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:0421,1991)。

组成型启动子：将组成型启动子与用于在芸薹属中表达的基因可操作连接，或者将组成型启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述编码信号序列的核苷酸序列与用于在芸薹属中表达的基因可操作连接。可以在本发明中利用许多不同的组成型启动子。例示性的组成型启动子包括但不限于：来自植物病毒的启动子，如来自CaMV的35S启动子(Odell等,Nature313:810-812,1985)和来自如稻肌动蛋白等基因的启动子(McElroy等,Plant Cell2:163-171,1990)；来自泛素的启动子(Christensen等,Plant Mol.Biol.12:619-632,1989；Christensen等,Plant Mol.Biol.18:675-689,1992)；来自pEMU的启动子(Last等,Theor.Appl.Genet.81:581-588,1991)；来自MAS的启动子(Velten等,EMBOJ.3:2723-2730,1984)；来自玉米H3组蛋白的启动子(Lepetit等,Mol.Gen.Genetics231:276-285,1992；Atanassova等,Plant Journal2(3):291-300,1992)。ALS启动子，即欧洲油菜ALS3结构基因5’的Xba1/NcoI片段(或与该Xba1/NcoI片段相似的核苷酸序列)代表一种特别有用的组成型启动子。参见PCT申请WO96/30530。

组织特异性或组织优选性启动子：将组织特异性启动子与用于在芸薹属中表达的基因可操作连接。任选地，将组织特异性启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述编码信号序列的核苷酸序列与用于在芸薹属中表达的基因可操作连接。用与组织特异性启动子可操作连接的感兴趣基因转化的植物排他地或优先地在特定组织中生成转基因的蛋白质产物。可以在本发明中利用任何组织特异性或组织优选性启动子。例示性组织特异性或组织优选性启动子包括但不限于：根优选性启动子，如来自菜豆蛋白基因的启动子(Murai等,Science23:476-482(1983)，和Sengupta-Gopalan等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3320-3324(1985))；叶特异性和光诱导型启动子，如来自cab或核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)的启动子(Simpson等,EMBO J.4(11):2723-2729(1985)，和Timko等,Nature318:579-582(1985))；花药特异性启动子，如来自LAT52的启动子(Twell等,Mol.Gen.Genetics217:240-245(1989))；花粉特异性启动子，如来自Zm13的启动子(Guerrero等,Mol.Gen.Genetics244:161-168(1993))或小孢子优选性启动子，如来自apg的启动子(Twell等,Sex.Plant Reprod.6:217-224(1993))。

通过将编码信号序列的核苷酸序列可操作连接至编码感兴趣蛋白质的基因的5’和/或3’区域的手段来实现由转基因生成的蛋白质向亚细胞区室如叶绿体、液泡、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞壁或线粒体的转运或者分泌入质外体中。可以在蛋白质合成和加工过程中测定在结构基因的5’和/或3’端的靶向序列，其中编码的蛋白质最后被区室化(compartmentalized)。

信号序列的存在将多肽引导至胞内细胞器或亚细胞区室，或者分泌至质外体。许多信号序列是本领域中已知的。参见例如Becker等,Plant Mol.Biol.20:49(1992)；C.Knox等,Plant Mol.Biol.9:3-17(1987)；Lerner等,Plant Physiol.91:124-129(1989)；Fontes等,Plant Cell3:483-496(1991)；Matsuoka等,Proc.Natl Acad.Sci.88:834(1991)；Gould等,J.Cell.Biol.108:1657(1989)；Creissen等,Plant J.2:129(1991)；Kalderon等,Cell39:499-509(1984)；Steifel等,Plant Cell2:785-793(1990)。

通过根据本发明的转基因植物，可以以商业量生产外来蛋白质。如此，用于选择和繁殖经转化植物的技术(它们是本领域中充分了解的)产生多种转基因植物，它们以常规方式收获，然后可以从感兴趣的组织或总生物量提取外来蛋白质。可以通过由例如Heney和Orr,Anal.Biochem.114:92-6(1981)所讨论的已知方法来实现从植物生物量的蛋白质提取。

根据本发明的具体实施方案，为商业生产外来蛋白质提供的转基因植物是芸薹属植物。在另一个实施方案中，感兴趣的生物量是种子。对于相对少量的显示较高表达水平的转基因植物，可以主要经由常规的RFLP、PCR和SSR分析(其鉴定整合DNA分子的近似染色体位置)来产生遗传图谱。关于这方面的例示性方法，参见Glick和Thompson,Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology,CRC Press,Boca Raton269:284(1993)。关于染色体位置的图谱信息对于主题转基因植物的专有权保护是有用的。如果进行未经授权的繁殖和与其他种质进行杂交，则可以将整合区域的图谱与可疑植物的类似图谱进行比较以确定后者是否与主题植物具有共同来源(parentage)。图谱比较会牵涉杂交、RFLP、PCR、SSR和测序，它们都是常规技术。

用于芸薹属转化的方法：已经开发了许多用于植物转化的方法，包括生物学和物理植物转化方案。参见例如Miki等,“Procedures for Introducing Foreign DNA intoPlants”于Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,B.R.Glick和J.E.Thompson编(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)第67页-第88页。另外，可获得用于植物细胞或组织转化及植物再生的表达载体和体外培养方法。参见例如Gruber等,“Vectorsfor Plant Transformation”于Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology,B.R.Glick和J.E.Thompson编(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)第89页-第119页。

土壤杆菌介导的转化：用于将表达载体导入植物中的一种方法是基于土壤杆菌属的天然转化系统。参见例如Horsch等,Science227:1229(1985)。根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)是在遗传上转化植物细胞的植物病原性土壤细菌。根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)的Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基因。参见例如C.I.Kado,Crit.Rev.Plant Sci.10:1(1991)。适用于本发明目的的土壤杆菌载体系统和土壤杆菌介导的基因转移方法的描述由Bhalla和Singh,Nature Protocols3(2):181-9(2008),Cardoza和Stewart,Methods MolBiol.343:257-66(2006),Gruber等，见上文，Miki等，见上文，及Moloney等,Plant CellReports8:238(1989)提供。还可参见1996年10月8日授予的美国专利5,563,055(Townsend和Thomas)号。

直接基因转移：已经开发了数种植物转化方法(统称为直接基因转移)作为土壤杆菌介导的转化的备选。植物转化普遍可适用的方法是微粒介导的转化，其中在测量为1至4μm的微粒的表面上携带DNA。用生物射弹装置将表达载体导入植物组织中，所述生物射弹装置将微粒加速到300至600m/s的速度，其足以穿透植物细胞壁和细胞膜。Sanford等,Part.Sci.Technol.5:27(1987)，J.C.Sanford,Trends Biotech.6:299(1988)，Klein等,Bio/Technology6:559-563(1988)；J.C.Sanford,Physiol.Plant7:206(1990)，Klein等,Biotechnology10:268(1992)。还可参见1991年5月14日授予的美国专利5,015,580号(Christou等)；1994年6月21日授予的美国专利号5,322,783(Tomes等)。

另一种用于将DNA物理投递至植物的方法是对靶细胞的超声处理。Zhang等,Bio/Technology9:996(1991)。或者，已经使用脂质体和原生质球融合来将表达载体导入植物中。Deshayes等,EMBO J.4:2731(1985)，Christou等,Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:3962(1987)。还已经报道了使用CaCl₂沉淀、聚乙烯醇或多-L-鸟氨酸来将DNA直接摄取到原生质体中。Hain等,Mol.Gen.Genet.199:161(1985)，和Draper等,Plant Cell Physiol.23:451(1982)。还已经描述了原生质体和全细胞和组织的电穿孔。Donn等,于Abstracts of VIIthInternational Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC,A2-38,第53页(1990)；D’Halluin等,Plant Cell4:1495-1505(1992)，和Spencer等,Plant Mol.Biol.24:51-61(1994)。

转化芸薹属靶标组织后，上述选择性标记基因的表达容许使用本领域中现在公知的再生和选择方法来优先选择经转化的细胞、组织和/或植物。

前述转化方法通常会用于产生转基因品种。然后可以将转基因品种与另一(非转化的或经转化的)品种杂交，以产生新转基因品种。或者，可以使用植物育种领域中公知的传统回交技术将已经使用前述转化技术工程化改造入特定的芸薹属种系中的遗传性状移入另一栽培种中。例如，可以使用回交方法来将工程化改造的性状从公共的、非良种品种移入良种品种中，或者从在其基因组中含有外来基因的品种移入不含所述基因的一种或多种品种中。如本文中所使用的，“杂交”可以指简单的X x Y杂交，或回交过程，这取决于上下文。

芸薹属的组织培养：可以通过自花授粉或者通过组织培养和再生来进行芸薹属种系的进一步产生。芸薹属的各种组织的组织培养和自其再生植物是已知的。例如，通过组织培养繁殖芸薹属栽培种记载于下述任一，但不仅限于下述任一：Chuong等,“A SimpleCulture Method for Brassica Hypocotyl Protoplasts,”Plant Cell Reports4:4-6(1985);T.L.Barsby等,“A Rapid and Efficient Alternative Procedure for theRegeneration of Plants from Hypocotyl Protoplasts of Brassica napus,”PlantCell Reports(Spring,1996);K.Kartha等,“In vitro Plant Formation from StemExplants of Rape,”Physiol.Plant,31:217-220(1974);S.Narasimhulu等,“SpeciesSpecific Shoot Regeneration Response of Cotyledonary Explants of Brassicas,”Plant Cell Reports(Spring 1988);E.Swanson,“Microspore Culture in Brassica,”Methods in Molecular Biology,Vol.6,Chapter17,p.159(1990)。

因此，本发明的另一方面是提供如下的细胞，其在生长和分化时产生具有本发明芥菜种系生理和形态特征的芸薹属植物。

如本文中所使用的，术语“组织培养物”指包含相同或不同类型的分离的细胞的组合物，或者组织成植物部分的此类细胞的集合。组织培养物的示例性类型为能产生组织培养物且在植物或植物部分中完整的原生质体、愈伤组织、植物块(plant clump)和植物细胞，如胚、花粉、花、种子、长角果、叶、茎、根、根尖、花药、雌蕊等。用于制备和维持植物组织培养物的手段是本领域中公知的。举例而言，已经使用构成器官的组织培养物来产生再生植物。美国专利号5,959,185、5,973,234和5,977,445描述了某些技术。

本发明还涉及用于通过将第一亲本芸薹属植物与第二亲本芸薹属植物杂交来产生芸薹属植物的方法，其中所述第一或第二亲本芸薹属植物为包含至少一个突变的FAD基因(即FAD2和/或FAD3)的芸薹属植物。因此，任何此类使用本发明芥菜种系的方法为本发明的一部分：自交、回交、杂种产生、与种群杂交等。

外来蛋白质基因和农艺学基因

根据一个优选实施方案，为商业生产外来蛋白质提供的转基因植物是双低植物。在另一个优选实施方案中，目标生物量是种子。对于相对少量的显示较高表达水平的转基因植物，可以主要经由常规的RFLP、PCR和SSR分析(其鉴定整合的DNA分子的近似染色体位置)来产生遗传图谱。关于这方面的例示性方法，参见Glick和Thompson,Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology,CRC Press,Boca Raton269:284(1993)。关于染色体位置的图谱信息对于主题转基因植物的专有权保护是有用的。如果进行未经授权的繁殖和与其它种质进行杂交，则可以将整合区域的图谱与可疑植物的类似图谱进行比较以确定后者是否与主题植物具有共同来源。图谱比较会牵涉杂交、RFLP、PCR、SSR和测序，其均为常规技术。

同样地，可以通过本发明的手段在经转化的植物中表达农艺学基因。更具体地，可以对植物进行遗传工程化改造以表达多种有农艺学兴趣的表型。可以在这方面使用的例示性基因包括但不限于下文进行归类的基因：

1.赋予对害虫或疾病的抗性并编码下列各项的基因：

A.植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中的疾病抗性基因(R)产物与病原体中相应无毒性(Avr)基因产物之间的特异性相互作用激活。可以用克隆的抗性基因转化植物品种以工程化改造对特定病原体株有抗性的植物。参见例如Jones等,Science266:789(1994)(克隆对黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)有抗性的番茄Cf-9基因)；Martin等,Science262:1432(1993)(对丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringaepv.tomato)有抗性的番茄Pto基因编码蛋白质激酶)；Mindrinos等,Cell78:1089(1994)(对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)有抗性的拟南芥(Arabidopsis)RSP2基因)。

B.赋予对害虫如大豆胞囊线虫的抗性的基因。参见例如PCT申请WO96/30517；PCT申请WO93/19181。

C.苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白、其衍生物或以之为模型的合成多肽。参见例如Geiser等,Gene48:109(1986)，其披露了Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以购自美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)，Manassas，Va.，例如以ATCC保藏号40098、67136、31995和31998购得。

D.凝集素。参见例如Van Damme等,Plant Molec.Biol.24:25(1994)的公开内容，其披露了数种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列。

E.维生素结合蛋白如抗生物素蛋白。参见PCT申请US93/06487。该申请教导了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作为针对虫害的杀幼虫剂的用途。

F.酶抑制剂，例如蛋白酶或蛋白水解酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。参见例如Abe等,J.Biol.Chem.262:16793(1987)(稻半胱氨酸蛋白水解酶抑制剂的核苷酸序列)；Huub等,Plant Molec.Biol.21:985(1993)(编码烟草蛋白水解酶抑制剂I的cDNA的核苷酸序列)；Sumitani等,Biosci.Biotech.Biochem.57:1243(1993)(硝孢链霉菌(Streptomycesnitrosporeus)α-淀粉酶抑制剂的核苷酸序列)；和美国专利号5,494,813(Hepher和Atkinson，1996年2月27日授权)。

G.昆虫特异性激素或信息素，如蜕皮类固醇或保幼激素、其变体、基于其的模拟物、或其拮抗剂或激动剂。参见例如Hammock等,Nature344:458(1990)披露的克隆的保幼激素酯酶(即一种保幼激素灭活剂)的杆状病毒表达的内容。

H.昆虫特异性肽或神经肽，其在表达后破坏受到影响的害虫的生理学。例如，参见Regan,J.Biol.Chem.269:9(1994)(表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的DNA)；和Pratt等,Biochem.Biophys.Res.Comm.163:1243(1989)(在太平洋折翅蠊(Diploptera puntata)中鉴定出allostatin)的公开内容。还可参见Tomalski等的美国专利号5,266,317，其披露了编码昆虫特异性、麻痹性神经毒素的基因。

I.在自然界由蛇、黄蜂(wasp)等生成的昆虫特异性毒液。例如参见Pang等,Gene116:165(1992)，是关于编码蝎昆虫毒性肽的基因在植物中的异源表达的公开内容。

J.负责超积累单萜、倍半萜、类固醇、异羟肟酸、类苯丙烷衍生物(phenylpropanoid derivative)或另一具有杀昆虫活性的非蛋白质分子的酶。

K.牵涉对生物学活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶(chitinase)和葡聚糖酶(不管是天然的还是合成的)。参见以Scott等名义的PCT申请WO93/02197，其披露了callase基因的核苷酸序列。含有几丁质酶编码序列的DNA分子可以例如从ATCC以保藏号39637和67152获得。还可参见Kramer等,InsectBiochem.Molec.Biol.23:691(1993)(其教导了编码烟草天蛾几丁质酶的cDNA的核苷酸序列)和Kawalleck等,Plant Molec.Biol.21:673(1993)(其提供了欧芹ubi4-2多聚泛素基因的核苷酸序列)。

L.刺激信号转导的分子。例如参见Botella等,Plant Molec.Biol.24:757(1994)(关于绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)和Griess等,Plant Physiol.104:1467(1994)(其提供了玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)的公开内容。

M.疏水矩肽(hydrophobic moment peptide)。参见PCT申请WO95/16776(抑制真菌植物病原体的鲎抗菌肽(Tachyplesin)的肽衍生物的公开内容)和PCT申请WO95/18855(教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽)。

N.膜通透酶、通道形成剂或通道阻断剂。例如参见Jaynes等,Plant Sci.89:43(1993)公开的天蚕抗菌肽-β(cecropin-β)，溶胞肽类似物(lytic peptide analog)的异源表达使转基因烟草植物对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)有抗性。

O.病毒侵入蛋白或自其衍生的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在经转化植物细胞中的积累赋予对由衍生出该外壳蛋白基因的病毒及相关病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。参见Beachy等,Ann.Rev.Phytopathol.28:451(1990)。已经对经转化的植物赋予了针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀刻病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性。同上。

P.昆虫特异性抗体或自其衍生的免疫毒素。如此，靶向昆虫肠中的重要代谢功能的抗体会使受影响的酶失活，这杀死昆虫。参见Taylor等,摘要号497,Seventh Int’lSymposium on Molecular Plant-Microbe Interactions(Edinburgh,Scotland)(1994)(经由生成单链抗体片段进行的转基因烟草中的酶促失活)。

Q.病毒特异性抗体。参见例如Tavladoraki等,Nature366:469(1993)，其显示了表达重组抗体基因的转基因植物受到保护免于病毒攻击。

R.在自然界由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白(developmental-arrestiveprotein)。如此，真菌内α-l,4-D-多聚半乳糖醛酸酶(α-1,4-D-polygalacturonase)通过溶解植物细胞壁同-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶(homo--α-1,4-D-galacturonase)来促进真菌定殖(colonization)和植物营养物释放。参见Lamb等,Bio/Technology10:1436(1992)。编码豆内多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征由Toubart等,Plant J.2:367(1992)描述。

S.在自然界由植物生成的发育阻滞蛋白。例如Logemann等,Bio/Technology10:305(1992)显示了表达大麦核糖体失活基因的转基因植物对真菌疾病具有升高的抗性。

2.赋予对除草剂的抗性的基因：

A.抑制生长点或分生组织的除草剂，如咪唑啉酮或磺酰脲。在这类中的例示性基因编码突变的ALS和AHAS酶，如分别由例如Lee等,EMBO J.7:1241(1988)和Miki等,Theor.Appl.Genet.80:449(1990)所描述的。

B.草甘膦(其抗性分别由例如突变体3-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPs)基因(通过引入重组核酸和/或天然EPSPs基因多种形式的体内诱变)，aroA基因和草甘膦乙酰转移酶(GAT)基因赋予)，其他膦酰基化合物如草铵膦(来自链霉属菌种包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和绿色产色链霉菌(Streptomyces viridichromogenes)的phosphinothricin乙酰转移酶(PAT)基因)，以及吡啶氧基或苯氧基丙酸和环异己酮(cyclohexone)(ACC酶抑制剂编码基因)，参见，例如授予Shah等的美国专利4,940,835号和授予Barry等的美国专利6,248,876，其公开了可赋予植物草甘膦抗性的各种形式EPSPs的核苷酸序列。编码突变体aroA基因的DNA分子可以以ATCC登录号39256获得，且该突变基因的核苷酸序列公开于授予Comai的美国专利4,769,061号。Kumada等的欧洲专利申请0 333033号，和授予Goodman等的美国专利4,975,374号，公开了赋予针对除草剂如L-phosphinothricin的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列提供于Leemans等的欧洲申请0 242 246号，DeGreef等,Bio/Technology7:61(1989)描述了表达编码PAT活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。赋予针对苯氧基丙酸和环异己酮类如稀禾定(sethoxydim)和氟吡禾灵(haloxyfop)抗性的基因的实例为如Marshall等,Theor.Appl.Genet.83:435(1992)所述的Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因。能够赋予草甘膦抗性的GAT基因描述于Castle等的WO2005012515。赋予对2,4-D、fop和吡啶氧基生长素除草剂抗性的基因描述于WO2005107437和美国专利申请系列号11/587,893，两者均转让予Dow AgroSciences LLC。

C.抑制光合作用的除草剂，如三嗪(psbA和gs+基因)或苯基氰(腈水解酶基因)。Przibila等,Plant Cell3:169(1991)描述了用编码突变的psbA基因的质粒转化衣滴虫(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于Stalker的美国专利4,810,648号，并且含有这些基因的DNA分子可以以ATCC保藏号53435、67441、和67442获得。编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达由Hayes等,Biochem.J.285:173(1992)描述。

3.赋予或促成如下增值(value-added)性状的基因，如：

A.经修饰的脂肪酸代谢，例如通过用硬脂酰-ACP去饱和酶的反义基因转化植物以提高植物的硬脂酸含量。参见Knultzon等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:2624(1992)。

B.降低的肌醇六磷酸盐含量—1)肌醇六磷酸酶编码基因的导入会增强肌醇六磷酸盐的分解，向经转化的植物添加更多游离的磷酸根。例如，参见Van Hartingsveldt等,Gene127:87(1993)，关于黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公开内容。2)可以导入的降低肌醇六磷酸盐含量的基因。例如在玉米中，这可以如下实现，即克隆与单一等位基因有关的DNA，然后再次导入，所述单一等位基因负责特征为低水平肌醇六磷酸的玉米突变体。参见Raboy等,Maydica35:383(1990)。

C.例如通过用编码改变淀粉分支样式的酶的基因转化植物来实现的经修饰的碳水化合物组成。参见Shiroza等,J.Bacteriol.170:810(1988)(链球菌(Streptococcus)突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz等,Mol.Gen.Genet.20:220(1985)(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因的核苷酸序列)；Pen等,Bio/Technology10:292(1992)(表达地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenifonnis)α-淀粉酶的转基因植物的生成)；Elliot等,Plant Molec.Biol.21:515(1993)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)；Sogaard等,J.Biol.Chem.268:22480(1993)(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)；和Fisher等,Plant Physiol.102:1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。

尽管本发明的多种实施方案公开于本文中，可根据本领域技术人员的公知常识在本发明的范围内进行许多适应和修饰。此类修饰包括用本发明任何方面已知等同物替换以基本上相同的方式取得相同的结果。数值范围包含定义范围的数值。本发明包括基本上在上文中描述并参照实施例和附图的所有实施方案和变化。

Claims

1.一种从芥菜植物的种子提取的内源油，所述种子具有包含按重量计至少70.0％油酸和少于5.0％亚麻酸的脂肪酸含量。

2.权利要求1的内源油，具有包含按重量计70.0％至85.0％油酸的脂肪酸含量。

3.权利要求1的内源油，具有包含按重量计少于3.0％亚麻酸的脂肪酸含量。

4.权利要求1的内源油，具有包含按重量计70.0％至85.0％油酸和按重量计少于3.0％亚麻酸的脂肪酸含量。

5.一种芥菜品种种子中的油，所述油具有包含按重量计至少70.0％油酸和按重量计少于5.0％亚麻酸的脂肪酸含量。

6.一种产生芥菜植物的方法，所述芥菜植物的种子具有包含按重量计至少70.0％油酸和按重量计少于5.0％亚麻酸的内源脂肪酸含量，所述方法包括：

通过传统的杂交方法，将一种或多种选自下组的核酸序列引入所述芥菜植物：突变的fad2a核酸序列，突变的fad2b核酸序列，突变的fad3a核酸序列，和突变的fad3b核酸序列。

7.来自芥菜植物种子的粕，所述芥菜植物种子具有包含按重量计至少70.0％油酸和按重量计少于5.0％亚麻酸的内源脂肪酸含量。

8.权利要求7的粕，其中所述粕为压碎的种子、压滤饼、白色薄片或来自常规压碎和溶剂提取工艺的粕的形式。

9.一种在非转基因芥菜植物作物的种子中产生的种子油，所述种子油具有包含按重量计至少70.0％油酸和按重量计少于5.0％亚麻酸的脂肪酸含量。