ES2265978T3 - Sistema regulador de ubiquitina modificado. - Google Patents

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ES2265978T3 ES00964125T ES00964125T ES2265978T3 ES 2265978 T3 ES2265978 T3 ES 2265978T3 ES 00964125 T ES00964125 T ES 00964125T ES 00964125 T ES00964125 T ES 00964125T ES 2265978 T3 ES2265978 T3 ES 2265978T3
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Abstract

Un ADN que comprende un sistema regulador de ubiquitina que carece de elementos de choque de calor, donde el sistema regulador de ubiquitina comprende un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEC ID Nº 8.

Description

Sistema regulador de ubiquitina modificado.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a la expresión génica y se refiere en particular a sistemas reguladores para regular la expresión génica basados en cierto sistema regulador de ubiquitina (URS) y el uso de este sistema regulador en combinación con un gen estructural expresable, preferiblemente un gen estructural expresable de una planta, para la expresión regulada de dicho gen estructural y para un control de la expresión regulada cuando se someta a estrés por ejemplo con temperatura elevada.
Antecedentes de la invención Manipulación genética de plantas
El obstáculo de crear plantas manipuladas genéticamente con éxito, en las principales variedades de cultivo, está superando actualmente de forma secuencial en base planta por planta. La expresión "manipulación genética" supone describir la manipulación del genoma de una planta, típicamente mediante la introducción de un gen ajeno dentro de la planta, o la modificación de los genes de la planta, para aumentar o disminuir la síntesis de productos génicos en la planta. Típicamente, los genes se introducen en una o más células de la planta que pueden cultivarse dentro de plantas viables, sexualmente competentes, completas y que pueden transformarse totalmente o que pueden ser quiméricas, teniendo algunos tejidos transformados y algunos no. Estas plantas pueden autopolinizarse o polinizarse de forma cruzada con otras plantas de la misma o de especies compatibles de modo que el gen o genes ajenos transportados en la línea germinal puedan criarse en variedades de plantas útiles en la agricultura.
Las estrategias actuales dirigidas hacia la manipulación genética de líneas de plantas implican típicamente dos procedimientos complementarios. El primer procedimiento implica la transformación genética de una o más células de la planta de un tipo caracterizado específicamente. El término "transformación" como se usa en este documento significa que un gen ajeno, típicamente en forma de construcción genética, se introduce dentro del genoma de las células individuales de la planta. Esta introducción se consigue a través de la ayuda de un vector, que se integra dentro del genoma de la planta. El segundo procedimiento implica después de la regeneración de las células de la planta transformada en plantas completas sexualmente competentes. Ni el procedimiento de transformación ni el de regeneración necesitan tener un éxito del 100%, pero deben tener un grado razonable de fiabilidad y reproductibilidad de modo que un porcentaje razonable de las células puedan transformarse y regenerarse en plantas completas.
El documento EP-A-0342926 describe un sistema regulador de ubiquitina de una planta (maíz) que comprende un elemento de choque de calor (que comprende dos elementos de consenso de choque de calor que se solapan), un promotor, un sitio de inicio de la transcripción, un intrón, y un sitio de inicio de la traducción. Se cree que el componente de elemento de choque de calor de este sistema regulador confiere inducibilidad por calor de la expresión de las secuencias de ADN asociadas, en células de dicotiledóneas o monocotiledóneas después de niveles permisivos de choque de calor.
Sistema regulador de ubiquitina de plantas, se refiere a la secuencia de nucleótidos de aproximadamente 2 kb situada en el extremo 5' del sitio de inicio de la traducción del gen de ubiquitina y comprende secuencias que dirigen el inicio de la transcripción, controlan el nivel de expresión, la inducción de genes de estrés y la potenciación de la expresión en respuesta al estrés. El sistema regulador, que comprende tanto el promotor (de una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 1 kb) como las funciones reguladoras, es la secuencia de ADN que proporciona el control regulador o la modulación de la expresión génica. Un gen estructural situado bajo el control regulador del sistema regulador de la ubiquitina de la planta, significa que un gen estructural se posiciona de modo que la expresión regulada del gen está controlada mediante las secuencias que comprenden el sistema regulador de ubiquitina.
Los promotores son elementos de ADN que dirigen la transcripción de ARN en las células. Junto con otros elementos reguladores que especifican el tejido y la especificidad temporal de la expresión génica, los promotores controlan el desarrollo de los organismos.
Ha habido un esfuerzo coordinado para identificar y aislar promotores de una amplia diversidad de plantas y animales, especialmente de los promotores que demostraron un alto nivel de expresión constitutiva y capacidad de mantener niveles estables de dicha expresión en condiciones de estrés.
La presente invención se basa en modificaciones del sistema regulador de ubiquitina de la planta.
Sumario de la invención
En un aspecto la invención proporciona por tanto una secuencia de ADN que comprende un sistema regulador de ubiquitina que no es inducible por calor, que comprende básicamente la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEC ID Nº 8.
En resumen, el sistema regulador de ubiquitina que forma parte de una secuencia de ADN de acuerdo con este aspecto de la invención se mencionará como sistema regulador de ubiquitina modificado (mURS).
El mURS comprende básicamente preferiblemente un URS de una planta, tal como un URS de maíz, por ejemplo como se ha descrito en el documento EP-A-0342926. La expresión "comprende básicamente" en este contexto significa que el mURS se corresponde generalmente a un URS sin modificar excepto, por supuesto, en las regiones donde el mURS está modificado, por ejemplo careciendo de elementos de choque de calor.
El mURS puede comprender por tanto un intrón, por ejemplo como se ha descrito en el documento EP-A-0342926.
Un mURS puede producirse, por ejemplo mediante la modificación de un URS mediante la retirada de uno o más elementos de choque de calor del mismo, por ejemplo usando técnicas de manipulación de ADN convencionales bien conocidas por los especialistas en la técnica.
En un aspecto adicional, la invención proporciona una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la invención y un gen estructural expresable de una planta bajo el control regulador del sistema regulador de ubiquitina de dicha secuencia.
La invención también proporciona un vector de expresión que comprende dicha construcción de ADN.
El mURS de la invención puede usarse de manera análoga al URS descrito en el documento EP-A-0342926, y se hace referencia en este documento a ese documento para más detalles. En particular, el mURS puede usarse para regular la expresión de un gen estructural asociado en células, particularmente en células de plantas (monocotiledóneas o dicotiledóneas).
La invención por tanto cubre el uso de una secuencia de ADN, construcción de ADN o vector de expresión de acuerdo con la invención para transformar células, particularmente células de plantas.
En un aspecto adicional de la invención, proporciona un procedimiento para transformar una célula huésped, particularmente una célula de la planta, que comprende la introducción dentro de la célula una secuencia de ADN, construcción de ADN o vector de expresión de acuerdo con la invención.
Los procedimientos para conseguir dicha transformación son bien conocidos por los especialistas en la técnica y comprenden básicamente las etapas de construir un vector de expresión en plantas que comprende una secuencia que codifica proteínas y el sistema regulador de la ubiquitina modificado de acuerdo con la invención e introducir el vector de expresión dentro de una célula de la planta.
Preferiblemente la célula de la planta se propaga dentro de una planta y la secuencia que codifica las proteínas se expresa. La presente invención es también una célula de plantas transgénicas, plantas y semillas que comprenden una construcción génica que comprende el sistema regulador de ubiquitina modificado.
Dicha planta es preferiblemente una monocotiledónea tal como trigo, cebada, avena, maíz o planta de maíz. Más preferiblemente es trigo.
La invención por tanto también incluye dentro de su alcance una célula huésped, particularmente una célula de una planta, en la cual se ha introducido una secuencia de ADN, construcción de ADN o un vector de expresión de acuerdo con la invención.
La invención proporciona además un procedimiento para expresar un gen estructural en una célula huésped de manera constitutiva, comprendiendo el procedimiento las etapas de: provocar la presencia en la célula huésped del gen estructural, unido de forma operativa a una secuencia de ADN de acuerdo con la invención definida anteriormente y provocando que el gen estructural se exprese de forma constitutiva.
El sistema regulador de ubiquitina modificado o el promotor, pueden truncarse para determinar el fragmento más pequeño capaz de expresarse. Los procedimientos de truncado incluyen delecionar secuencias y digerir la secuencia con una enzima de restricción u otra nucleasa con el fin de que mantenga básicamente la misma propiedad y/o actividad que la secuencia sin truncar. Estos procedimientos se conocen comúnmente en la técnica de la biología molecular.
Para evaluar la actividad del promotor se usa normalmente un sistema de expresión de gen informador transitorio. En dicho sistema o ensayo, el fragmento a ensayar se uniría a un gen informador y se usaría para transformar una célula de planta. Genes informados útiles incluyen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa (Lux) y \beta-glucuronidasa (GUS).
Los mURS de la invención funcionan generalmente de la misma manera que los URS sin modificar excepto que no son inducibles en respuesta al calor (y posiblemente tampoco en respuesta a otras condiciones de estrés). La invención proporciona por tanto un sistema regulador novedoso que puede conferir expresión constitutiva no inducible por calor de secuencias de ADN asociadas. La ventaja de este sistema es que la expresión de las secuencias de ADN asociadas que median en las células de planta transformadas es estable y no influida por cambios medioambientales en la temperatura, que podrían normalmente afectar a la expresión mediada por un sistema no modificado por ejemplo, como se describe en el documento EP-A-0342926.
Los mURS han demostrado funcionar para dar niveles altos de expresión constitutiva, en comparación a los obtenibles de los URS no modificados (tipo silvestre), y ser capaces de mantener niveles estables de expresión constitutiva en condiciones de estrés por calor.
El documento EP-A-0342926 incluye definiciones de diversas expresiones que se usan en la presente memoria descriptiva, incluyendo "expresión", "promotor", "control regulador", "gen estructural", "sistema regulador de ubiquitina de la planta", "elementos de choque de calor", e "intrones" y esas definiciones también se aplican a estas expresiones cuando se usan en la presente memoria descriptiva.
La invención se describirá además, a modo de ilustración, en los siguientes ejemplos así como en referencia a las figuras y Tablas adjuntas en las que:
La Figura 1 es un mapa de restricción del plásmido pPBI96-36;
La Figura 2 muestra la secuencia predicha de la secuencia de mURS en pPBI97-U3, con el sitio KpnI, que sustituye a los elementos de choque de calor que se solapan en el URS de tipo silvestre, enmarcado (esta Figura corresponde a la SEC ID Nº 8);
La Figura 3 es un mapa de restricción del plásmido pPBI97-dUG1;
La Figura 4 es un mapa de restricción del plásmido pPBI97-2BdUN1.
La Figura 5 muestra el mapa de restricción del plásmido pUN1 que contiene el URS de tipo silvestre que dirige el gen marcador seleccionable NptII.
La Figura 6 es un diagrama de barras que muestra el nivel medio relativo de la expresión de NptII en cada suceso de transformación después de un choque de calor (gris) y sin choque de calor (negro). Los resultados de las líneas transgénicas para el URS de tipo silvestre se muestran en el panel (a) y los resultados del mURS se muestran en el panel (b).
La Figura 7 es una ilustración esquemática de una cámara de bombardeo de partículas (no a escala).
Las Tablas 1 y 2 muestran el nivel de expresión de NptII en cada planta (expresado en relación al ARNr de control) con y sin tratamiento por choque de calor y el suceso de transformación del que se obtuvieron las plantas.
Ejemplos Ejemplo 1 Amplificación de un mURS usando ADN genómico de maíz como plantilla
Se preparó un mURS mediante amplificación por PCR de dos fragmentos de ADN usando ADN genómico de maíz (maíz de genotipo B73) como plantilla, seguido de la ligadura de los dos fragmentos para producir un único fragmento que carecía de los elementos consenso de choque de calor (HS). Se colocó un sitio de restricción KpnI en lugar de los elementos HS.
Los cebadores de PCR usados se diseñaron a partir de la información de secuencia publicada por Liu y col 1995 (Biochem Cell Biol 73: 19-30; database accession ZMU29159). Para delecionar el elemento HS del URS de tipo silvestre y para sustituirlo con un sitio de diagnóstico KpnI se amplificaron dos fragmentos usando las combinaciones de cebador HS1 + Ubi3-3 y HS2 + Ubi5-2, cuyas secuencias se dan a continuación. Los cebadores Ubi5-2 y Ubi3-3 son homólogos a las secuencias en la secuencia promotora publicada por Liu y col. Los cebadores HS1 y HS2 son homólogos a las secuencias situadas inmediatamente en el extremo 3' y 5' respectivamente de los dos elementos HS que se solapan en el promotor de ubiquitina como se ha descrito anteriormente. Estos dos cebadores tienen una cola KpnI (se muestran en negrita en las secuencias) en sus extremos 5'.
HS1: 5-ATTAGGTACCGGACTTGCTCCGCTGTCGGC-3 (SEC ID Nº 2)
HS2: 5-TATAGGTACCGAGGCAGCGACAGAGATGCC-3 (SEC ID Nº 3)
Ubi5-2: 5-AGCTGAATCCGGCGGCATGGC-3 (SEC ID Nº 6)
Ubi3-3: 5-TGATAGTCTTGCCAGTCAGGG-3 (SEC ID Nº 7)
Los productos amplificados se subclonaron en pGEM TEasy (Promega) para producir los plásmidos pPBI97-U1 y pPBI97-U2. Las orientaciones apropiadas para las subclonaciones posteriores se determinaron mediante análisis de digestión por restricción. Se reconstruyó una secuencia de mURS de longitud completa (2 kb) que incluía el promotor y el intrón subclonando un fragmento KpnI - SacI de pPBI97-U1 en los sitios KpnI/SacI de pPBI97-U2 para producir pPBI97-U3. La secuencia predicha del fragmento de mURS clonado en pPBI97-U3 se presenta en la Figura 2 como SEC ID Nº 8. El sitio KpnI que sustituye a los elementos de choque de calor que se solapan en el URS de tipo silvestre está enmarcado. El pPBI97-U3 contiene aproximadamente 35 pb de secuencia en su extremo 5' y aproximadamente 40 pb de secuencia en su extremo 3', ninguno de los cuales se presenta en el plásmido pAHC25 o sus derivados.
El mURS se transfirió como un fragmento PstI de pPBI97-U3 en los sitios PstI de pPBI96-36 sustituyendo el URS de tipo silvestre en pPBI96-36 (Figura 1) para producir pPBI97-dUG1 (algunas veces denominado como p97-dUG1) (Figura 3). La orientación del promotor modificado se determinó usando el sitio KpnI que está presente en el promotor modificado pero no en el promotor de tipo silvestre. pPBI96-36 y pPBI97-dUG1 son idénticos excepto que pPBI96-36 contiene el URS de tipo silvestre de pAHC25 mientras que pPBI97-dUG1 contiene el mURS del plásmido pPBI97-U3.
La función del mURS en el pPBI97-dUG1 se confirmó mediante análisis de transformación transitoria por bombardeo de partículas en diversos tejidos de plantas y comparación con la expresión mediada por el URS de tipo silvestre en pPBI96-36.
Se analizaron los siguientes tejidos de plantas: embriones inmaduros de trigo y cebada, hojas de trigo, raíces de trigo, hojas de tabaco, suspensiones de células de palma aceitera africana.
Después del bombardeo, los tejidos se incubaron a 20ºC durante 24 horas antes del análisis histoquímico.
Los resultados como se visualizan mediante expresión de GUS fueron indistinguibles entre los dos diferentes plásmidos, indicando que delecionar la secuencia de choque de calor no afecta a la capacidad del promotor modificado para mediar niveles altos de expresión constitutiva en estos tejidos en estas condiciones.
Ejemplo 2
El mURS obtenido del genoma del maíz en pPBI97-dUG1 se ha transferido también cadena arriba de una secuencia de neomicina fosfotransferasa (NptII) para producir un plásmido pPBI97-2BdUN1 (algunas veces denominado también P97-2BdUN1) (Figura 4). Este plásmido se ha usado con éxito como una construcción marcadora seleccionable en la transformación estable de trigo, como se ha descrito en la Solicitud de Patente Internacional Nº WO 00/15810, y se ha repetido en lo sucesivo en este documento.
Ejemplo 3 El mURS confiere expresión constitutiva no inducible por calor Transformación de la Planta
Se bombardearon embriones inmaduros (IME) de la variedad de trigo Bob White con pPBI97 2BdUN1 que comprendía el mURS que dirigía el gen marcador seleccionable NptII. En experimentos independientes, los IME se bombardearon también con el plásmido pUN1 (Figura 5) que comprendía el URS de tipo silvestre que dirigía a NptII.
Se produjeron varios transformantes primarios independientes (generación de Ro).
Tratamiento por choque de calor
Se seleccionaron un total de cinco sucesos transformados con pPBI97 2BdUN1 y dos sucesos transformados con pUN1 para el análisis de inducibilidad por calor. Se permitió a los transformantes primarios formar semillas y se recogió la semilla R1. Se plantaron entre 22 y 25 semillas R1 por suceso independiente y los brotes de los semilleros se ensayaron para actividad de NptII mediante un ensayo de blanqueo de las hojas. Se seleccionaron un total de 8 a 12 plantas positivas para el ensayo de blanqueo de las hojas de NptII de cada suceso original y se cultivaron en un invernadero para la etapa de las hojas 2-3. Las plantas se retiraron después del invernadero y se sometieron 4-6 plantas de cada evento a un choque de calor durante 2 horas a 42ºC en una incubadora Vulcan^{TM}, mientras que se dejaron 4-6 plantas de cada suceso a temperatura ambiente, es decir sin someterse a choque de calor. Se recogió material de las hojas de todas las líneas, tanto sometidas a choque de calor como no sometidas a choque de calor, y se almacenó a -70ºC antes del análisis.
Aislamiento del ARN y Transferencia de Northern
Tejido de hojas congelado de cada planta se molió hasta un polvo fino en nitrógeno líquido en un Mikrodismembra-
tor^{TM} de Braun. El ARN total se extrajo de aproximadamente 100 mg de tejido molido congelado usando el kit de extracción Qiagen Rneasy^{TM} de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 15 \mug de ARN total se sometieron a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1%, formaldehído 2,21 M, MOPS 40 mM pH 7,0, acetato de sodio 10 mM, y EDTA 1 mM, en un tampón de corrido MOPS 40 mM pH 7, acetato de sodio 10 mM, y EDTA 1 mM a 1 V/cm durante una noche. Los geles se lavaron brevemente en H_{2}O destilada estéril, y se transfirieron en HyBond N^{+} (Amersham International), de acuerdo con los protocolos convencionales (Sambrook y col, 1989) durante una noche. Las transferencias se desmantelaron después y se secaron al aire durante 2 horas, antes de un fijado con UV a 312 nm durante 2 minutos.
Marcado de Sondas e Hibridación
Se radiomarcaron 25 ng de la sonda apropiada (NptII o fragmento 25S ribosómico de trigo) usando el sistema Rediprime 11^{TM} (Amersham International) usando \alpha ^{32}PdCTP (Amersham Internacional) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las transferencias se hibridaron durante una noche a 65ºC en NaCl 0,6 M, Pipes 20 mM, Na_{2}EDTA. 2H_{2}O 4 mM, gelatina al 0,2%, Ficoll400 al 0,2%, PVP-360 al 0,2%, Na_{4}P_{2}P_{7}. 10H_{2}O 10 mM, SDS al 0,8%, 0,5 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Se realizaron lavados después de la hibridación en NaCl 30 mM, NaH_{2}PO_{4}.2H_{2}O 2 mM, Na_{2}EDTA-2H_{2}O 0,2 mM, SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 30 minutos, y después a 65ºC durante 10 minutos. Las transferencias se expusieron a pantallas de phosphorimager Typhoon^{TM} de uso general durante 1-2 días dependiendo de la fuerza de la señal, y las pantallas se examinaron en el Phosphorimager de Typhoon^{TM} para cuantificar la intensidad de la señal.
La expresión de NptII se determinó en relación al nivel de ARN ribosómico para estandarizar la variación en la carga de ARN total.
Resultados
Se muestra la expresión relativa de NptII en la progenie de dos sucesos independientes (línea 694 y 695) transformadas con pUN1 (URS de tipo silvestre) (Tabla 1). El nivel medio de expresión en la progenie de la línea 694 después del choque de calor fue 5 veces más alta que en la progenie que se mantuvo a temperatura ambiente (Figura 6A) de forma similar, la expresión en la progenie de la línea 695 mostró una inducción 3,4 veces mayor después del choque de calor (Figura 6A). Esto confirma que el URS de tipo silvestre es inducible por calor.
Se muestra la expresión relativa de NptII en la progenie de cinco sucesos independientes (líneas 563, 564, 578, 604, 618) transformadas con el plásmido pPBI97 2BdUN1 (mURS) (Tabla 2). En todas las líneas, el nivel medio de expresión después del choque de calor fue menor que o aproximadamente igual al de las plantas que se mantuvieron a temperatura ambiente indicando que en la expresión del mURS no es inducible por calor (Figura 6B). Esto demuestra que la retirada de los elementos de choque de calor del URS conduce a un patrón de expresión no inducible por calor.
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TABLA 1
Número Expresión Media Número Expresión Media
de relativa de de planta Relativa de
planta NptII de NptII a
choque de temperatura
calor ambiente
URS de
tipo
silvestre
Línea 694 1 3,38 7,30 14 1,22 1,44
2 6,78 10 1,27
3 9,67 11 2,23
5 6,39 12 1,03
6 10,3
Línea 695 1 1,32 1,43 2 0,47 0,42
4 1,4 5 0,38
12 0,83 9 0,32
13 0,72 10 0,47
7 2,88 23 0,47
TABLA 2
Número Expresión Media Número Expresión Media
de relativa de de planta Relativa de
planta NptII de NptII a
choque de temperatura
calor ambiente
URS
Modificado
Línea 563 1 0,28 0,48 12 0,61 0,61
11 0,30 13 0,51
6 0,44 14 0,57
7 0,44 15 0,27
8 0,92 16 1,1
Línea 564 1 0,93 1,17 3 1,06 1,32
7 1,92 4 1,34
9 1,06 5 1,24
10 0,88 19 1,15
16 1,04 23 1,82
Línea 578 12 1,14 0,94 3 0,87 0,84
13 1,31 4 0,66
14 0,9 6 1,02
18 0,61 7 0,88
19 0,72 21 0,75
Línea 604 1 0,91 0,47 8 0,91 1,14
2 0,12 10 1,64
3 0,1 11 1,21
4 0,45 18 0,78
16 0,77
Línea 618 2 0,28 0,32 10 1,12 0,71
3 0,44 11 0,65
15 0,3 14 0,47
16 0,4 6 0,73
18 0,24 8 0,85
19 0,23 9 0,42 
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimientos y materiales usados en los ejemplos descritos anteriormente
El procedimiento de transformación de trigo usado y descrito en este documento se basa en gran medida en el procedimiento descrito por Barcelo y Lazzeri (1995): Transformation of cereals by microprojectile bombardment of immature inflorescence and scutellum tissues; Methods in Molecular Biology-Plant Gene Transfer and Expression Protocols (vol 49), 113-123: Jones H (ed) Humana Press Inc., Totowa, NJ.
Se cultivaron embriones de plantas de trigo de los brotes del cultivo Bob White en un invernadero en un período de luz de 16 horas suplementado con luces para mantener una intensidad mínima de luz de 500 \mumol m-^{2} s-^{1} a 0,5 M por debajo de la hoja apical, Las temperaturas del invernadero se mantuvieron a 19ºC +/- 1ºC durante el día y 14ºC +/- 1ºC por la noche.
Los embriones inmaduros de trigo se recogieron del grano en desarrollo. Las semillas se recogieron y los embriones se cultivaron a aproximadamente 12 días después de la antesis cuando los embriones eran de aproximadamente 1 mm de longitud. Las semillas se aclararon primero en etanol al 70% durante 5 minutos y después se esterilizaron en una solución de lejía Domestos al 10% (Domestos es una marca comercial) durante 15 minutos seguidos de 6 lavados con agua destilada estéril. Después de la retirada del eje embrionario, los embriones se situaron con la superficie del eje hacia abajo en un medio de agargel solidificado MM1 (Sigma Nº de catálogo A-3301). La receta general para MM1 se da en el Apéndice 1, y las recetas para los diversos constituyentes en el Apéndice 2. Los embriones se mantuvieron en la oscuridad durante uno a dos días a 24ºC +/- 1ºC antes del bombardeo.
Los plásmidos pUN1 y p97-2BdUN1 se usaron para proporcionar marcadores de selección. Los plásmidos pUN1 y p97-2BdUN1 contienen fusiones génicas quiméricas del promotor-NptII y proporcionan selección de transformantes contra un intervalo de antibióticos aminoglicósidos incluyendo kanamicina, neomicina, geneticina y paromicina.
Se usó el bombardeo de particular para introducir plásmidos en las células de la planta. Se usó el siguiente procedimiento para precipitar ADN del plásmido en partículas de oro de 0,6 \mum (BO-RAD número de catálogo 165-2262): Se añadió un total de 5 \mug de ADN del plásmido a una suspensión de 50 \mul - sonicada durante un minuto - de partículas de oro (10 mg/ml) en un tubo de microfuga de 1,5 ml. Después de una breve agitación en vórtice durante tres segundos se añadieron 50 \mul de una solución de cloruro de calcio 0,5 M y 20 \mul de una solución de espermidina sin base 0,05 M en los extremos opuestos de la tapa del tubo de microfuga. Los contenidos del tubo se mezclaron juntos cerrando la tapa y dando pequeños golpes para desplazar el cloruro de calcio y la espermidina al fondo del tubo. Después de una agitación en vórtice durante tres segundos, la suspensión se centrifugó a 13.000 rpm durante 5 segundos. El sobrenadante se retiró después y el sedimento se resuspendió en 150 \mul de etanol absoluto. Esto requiere retirar rascando las partículas de oro del interior del tubo usando una punta de pipeta. Después de una agitación en vórtice adicional de tres segundos, la muestra se centrifugó de nuevo y el sedimento se resuspendió en un volumen total de 85 \mul en etanol absoluto. Las partículas se agitaron en vórtice brevemente y se sonicaron durante 5 segundos en un baño de agua sonicador Camlab Trisonic T 310 para asegurar dispersión fina. Se situó una alícuota de 5 \mul de las partículas de oro revestidas con ADN en el centro de un macrovehículo (BIO-RAD nº de catálogo 115-2335) y se le permitió secar durante 30 minutos. El bombardeo de partículas se realizó usando una cámara Biolisitc^{TM} PDS-1000/He (BIO-RAD Instruments, Hercules CA) que se ilustra esquemáticamente en la Figura 7, usando presión de helio de 4,48 y 6,20 MPa (650 y 900 psi) (discos de ruptura: BIO-RAD números de catálogo 165-2327 y 165-2328 respectivamente).
Haciendo referencia a la Figura 7, la cámara de vacío ilustrada comprende una carcasa 10 cuyas paredes internas incluyen una serie de nichos 12 para alojar baldas tales como la balda de muestra 14 mostrada en el cuarto nivel hacia abajo a partir de la parte superior de la carcasa. Un disco de ruptura 16 se apoya en un tubo de choque de presión de helio 18 cerca de la parte superior de la carcasa. Un soporte 20, que descansa en la segunda serie de nichos 12 por debajo de la parte superior de la carcasa, lleva la unidad 22 que incluye una pantalla de detención y varios anillos 24, con once anillos por debajo del soporte 20 y 3-4 anillos por encima del soporte 20. El macrovehículo (26) se apoya en la parte superior de la unidad 22. La distancia aproximada del disco de ruptura 16 al macrovehículo 26 es de 25 mm, con la distancia aproximada del macrovehículo 26 a la pantalla de detención siendo de 7 mm, y la distancia aproximada de la pantalla de detención a la balda de muestra 14 siendo de 67 mm. La parte superior de la unidad 22 está aproximadamente a 21 mm del fondo del tubo de choque 18, y el fondo de la unidad 22 está aproximadamente a 31 mm de la parte superior de la balda de muestra 14.
Los embriones inmaduros se bombardearon entre 1 y 2 días después del cultivo. Para el bombardeo los embriones se agruparon en un área circular de aproximadamente 1 cm de diámetro que comprendía 20-100 embriones, con la cara del eje hacia abajo en el medio MM1. Se situó una placa de petri que contenía el tejido en la cámara sobre la balda 14, en el cuarto nivel de baldas por debajo de la parte superior, como se ilustra en la Figura 7. El aire en la cámara se evacuó hasta un vacío de 723,9 mm de Hg (28,5 pulgadas de Hg). El macrovehículo 26 se aceleró con una onda de choque de helio usando membranas de ruptura que estallaban cuando la presión de helio en el tubo de choque 18 alcanza 4,48 ó 6,20 MPa (650 ó 900 psi). Dentro de una hora después del bombardeo los embriones bombardeados se colocaron en medio MM1 a 10 embriones por placa de petri de 9 cm y se mantuvieron en la oscuridad constante a 24ºC durante 2-3 semanas. Durante este período se produjeron callos embriogénicos somáticos en los embriones bombardeados.
Después de 2-3 semanas los embriones se transfirieron a un medio de regeneración en agar solidificado, conocido como medio R, y se incubaron en un período de luz de 16 horas a 24ºC. La receta general para el medio R se da en el Apéndice 1. Los embriones se transfirieron a placas frescas a intervalos de 2-3 semanas. Para la selección de los transformantes usando el gen NptII se usaron 3 regímenes diferentes: 1) Se incorporó Geneticina (GIBCO-BRL número de catálogo 10131-019) (a 50 mg/l) inmediatamente en la transferencia al medio de regeneración y se mantuvo a 50 mg/l en las transferencias posteriores a los medios de regeneración. 2) y 3) Los embriones se transfirieron primero a un medio de regeneración sin selección durante 12 días y 2-3 semanas, respectivamente, y después se transfirieron a medios que contenían Geneticina a 50 mg/l. Después de 2-3 pasos por medios de regeneración, los brotes que regeneraban se transfirieron a tubos de cultivo individuales que contenían 15 ml de medio de regeneración y media fuerza salina con selección a 35 mg/l de geneticina. Después de la formación de las raíces las plantas regeneradas se transfirieron al suelo y al invernadero.
Ensayo de blanqueo de las hojas
Los transformantes primarios y su progenie se confirmaron como transgénicos mediante el ensayo de blanqueo de las hojas. Según lo descrito en Plant Physiol. (1997) 115: 971-980. Se infiltraron pedazos de hoja al vacío con paromomicina y se valoró la resistencia después de 2-3 días. Este procedimiento se validó en comparación con los resultados de análisis de ADN genómico mediante transferencia de Southern.
Aislamiento de ADN genómico y Análisis de Southern
Los análisis de Southern de los transformantes primarios y del material de su progenie se realizaron de la siguiente manera. Se trituraron tejidos de hoja congelados en seco brevemente en un mortero y mano de mortero Kontes^{TM}, y el ADN genómico se extrajo según lo descrito en Fulton y col, 1995. Se digirieron 5 \mum de ADN con una enzima de restricción apropiada de acuerdo con las instrucciones del fabricantes, y se sometieron a electroforesis durante una noche en un gel agarosa al 1%, después de lo cual el gel se fotografió, se lavó y se sometió a transferencia en Hybond N^{TM} (Amersham Internacional) de acuerdo con el procedimiento de Southern usando procedimientos convencionales (Sambrook y col 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, NY). Después de la transferencia, los filtros se secaron al aire, se hornearon a 65ºC durante 1-2 horas y se fijaron con UV a 312 nm durante 2 minutos.
La preparación y el marcado de la sonda para los análisis de Southern de material transformado se realizó como se ha descrito anteriormente.
La histoquímica de GUS se realizó esencialmente según lo descrito en Jefferson (1987), Plant Molecular Biology Reporter, 5, (4), 387-405.
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Apéndice 1
Receta para medio MM1 concentrado x2
Constituyente Volumen de solución madre por litro
de medio concentrado x2
Macrosales MS (solución madre x10) 200 ml
Microsales L (solución madre x1000) 2 ml
FeNaEDTA MS (solución madre x100 20 ml
[Sigma catálogo F-0518]
Vitaminas modificadas MS (x1000) 1 ml
Solución de 3 aminoácidos (solución madre x25) 40 ml
mio inositol 0,2 g
(Sigma número de catálogo I-3011)
sacarosa 180 g
AgNO_{3} (20 mg/ml de solución madre) 1 ml
Añadido después de la esterilización de los filtros
Picloram (1 m/ml de solución madre) 4 ml
Añadido después de la esterilización de los filtros
Esterilizar los filtros y añadir hasta un volumen igual de agargel de moulten x2 (10 g/l).
Receta para medio R concentrado x2
Constituyente Volumen de solución madre por litro
de medio concentrado x2
Macrosales L7 (solución madre x10) 200 ml
Microsales L (solución madre x1000) 2 ml
FeNaEDTA MS (solución madre x100) 20 ml
Vitaminas/Inositol L2 (solución madre x200) 10 ml
Solución de 3 aminoácidos (solución madre x25) 40 ml
Maltosa 60 g
2,4-D (1 mg/ml de solución madre)
añadido después de la esterilización de los filtros 200 \mul
Isómeros cis trans de Zeatina mezclados 2 ml
(Melford labs nº de catálogo Z-0917) (5 mg/ml
de solución madre) añadido después de la este-
rilización de los filtros
Esterilizar los filtros y añadir hasta un volumen igual de agar de moulten x2 (16 g/litro) 
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Apéndice 2
Recetas para constituyentes de medios MM1 y R Microsales L (solución madre x1000)
por 100 ml
MnSO_{4} 7 H_{2}O 1,34 g
H_{3}BO_{3} 0,5 g
ZnSO_{4} 7 H_{2}O 0,75 g
KI 75 mg
Na_{2}MoO_{4} 2 H_{2}O 25 mg
CuSO_{4} 5 H_{2}O 2,5 mg
CoCl_{2} 6 H_{2}O 2,5 mg
Esterilizar los filtros a través de una membrana de filtro de 22 \mum almacenar a 4ºC
Macrosales MS (solución madre x10)
por litro
NH_{4}NO_{3} 16,5 g
KNO_{3} 19,0 g
KH_{2}PO_{4} 1,7 g
MgSO_{4} 7 H_{2}O 3,7 g
CaCl_{2} 2 H_{2}O 4,4 g
NB: Disolver el CaCl_{2} antes de mezclar con otros componentes
NB: Preparar el KH_{2}PO_{4} por separado en agua estéril, y añadirlo el último.
Almacenar la solución a 4ºC después de esterilizar en autoclave. 
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Vitaminas MD modificadas (solución madre x1000)
Por 100 ml
Tiamina HCl 10 mg
Piridoxina HCl 50 mg
Ácido nicotínico 50 mg
Almacenar la solución en alícuotas de 10 ml a -20ºC 
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Solución de 3 aminoácidos (solución madre x25)
Por litro
L-Glutamina 18,75 g
L-Prolina 3,75 g
L-Asparagina 2,5 g
Almacenar la solución en alícuotas de 40 ml a -20ºC 
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Macrosales L7 (solución madre x10)
por litro
NH_{4}NO_{3} 2,5 g
KNO_{3} 15,0 g
KH_{2}PO_{4} 2,0 g
MgSO_{4} 7 H_{2}O 3,5 g
CaCl_{2} 2 H_{2}O 4,5 g
NB: Disolver el CaCl_{2} antes de mezclar con otros componentes
NB: Preparar el KH_{2}PO_{4} por separado en 50 ml de agua y añadirlo el último
Almacenar la solución a 4ºC después de esterilizar en autoclave
Vitaminas/Inositol (solución madre x200)
Solución madre x200 por 100 ml
Inositol 4,0 g
Tiamina HCl 0,2 g
Piridoxina HCL 0,02 g
Ácido nicotínico 0,02 g
Pantotenato de Ca 0,02 g
Ácido ascórbico 0,02 g
Almacenar la solución en alícuotas de 40 ml a -20ºC.
<110> Monsanto PLC
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<120> Sistema regulador de ubiquitina modificado
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<140>
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<141>
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<160> 8
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcgcgatcca gactgaatgc c 
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21 
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<210> 2
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético
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<400> 2
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attaggtacc ggacttgctc cgctgtcggc 
\hfill
30 
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<210> 3
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético
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<400> 3
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tataggtacc gaggcagcga cagagatgcc 
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30 
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<210> 4
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético
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<400> 4
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atatgctgca gtgccagcgt gacccgg 
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27 
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<210> 5
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético
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tggacccctc tcgagagttc cgctccaccg tt 
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32 
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<210> 6
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético
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agctgaatcc ggcggcatgg c 
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21 
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<210> 7
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético
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<400> 7
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tgatagtctt gccagtcagg g 
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21 
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<210> 8
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<211> 2033
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<212> ADN
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<213> Zea mays 
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<400> 8
1

Claims (11)

1. Un ADN que comprende un sistema regulador de ubiquitina que carece de elementos de choque de calor, donde el sistema regulador de ubiquitina comprende un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEC ID Nº 8.
2. Un ADN de acuerdo con la reivindicación 1, donde el sistema regulador de ubiquitina comprende un intrón.
3. Una construcción de ADN que comprende un ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un gen estructural expresable en plantas bajo el control regulador del sistema regulador de ubiquitina de dicho ADN.
4. Un vector de expresión que comprende una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 3.
5. Uso de un ADN, construcción de ADN, o vector de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para transformar células de la planta.
6. Un procedimiento para transformar una célula de una planta introduciendo dentro de la célula un ADN, una construcción de ADN o vector de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Una celda huésped aislada, preferiblemente célula de una planta, en la cual se ha introducido un ADN, construcción de ADN o vector de expresión de acuerdo con las reivindicaciones 1-4.
8. Un procedimiento para expresar un gen estructural en una célula de una planta de manera constitutiva, comprendiendo el procedimiento las etapas de: provocar la presencia en la célula huésped del gen estructural unido de forma operativa a un ADN de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2; y provocar que el gen estructural se exprese de forma constitutiva por la célula huésped.
9. Una planta transgénica que comprende el ADN de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 o que comprende la construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 3 o que comprende el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4.
10. La planta de la reivindicación 10 donde la planta es una monocotiledónea tal como trigo, cebada, avena, maíz o planta de maíz.
11. Una semilla de planta que comprende el ADN de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 o que comprende la construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 3 o que comprende el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4.
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