CZ2002695A3

CZ2002695A3 - Modifikovaný ubichitinový regulační systém

Info

Publication number: CZ2002695A3
Application number: CZ2002695A
Authority: CZ
Inventors: Andrew Goldsbrough
Original assignee: Monsanto Uk Ltd
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 2000-09-07
Publication date: 2002-07-17
Also published as: HUP0202852A3; DE60028388T2; HU225171B1; EP1210446A1; ZA200201758B; CA2384517C; AU769567B2; ATE328098T1; HUP0202852A2; PL354747A1; AU7515500A; PT1210446E; DE60028388D1; DK1210446T3; US6878818B1; EP1210446B1; WO2001018220A1; CA2384517A1; ES2265978T3

Description

Modifikovaný ubichitinový regulační systém

Oblast techniky

Vynález se obecně týká exprese genu a konkrétně se zabývá regulačními systémy, které regulují expresi genu, založenými na ubichitinovém regulačním systému (URS) a použitím těchto regulačních systémů v kombinaci s exprimovatelným strukturním genem, s výhodou rostlinným strukturním exprimovatelným genem, pro regulovanou expresi uvedeného strukturního genu a pro regulovanou kontrolu exprese, pokud je vystaven například zvýšené teplotě.

Dosavadní stav techniky

Genetické inženýrství rostlin

Problém při vytváření úspěšně geneticky upravených rostlin u hlavních odrůd zemědělských plodin je postupně překonáván krok za krokem. Termínu „genetické inženýrství“ je zde užito ve smyslu manipulace s genomem rostliny, většinou tak, že je do rostliny zaveden cizí gen, nebo je provedena úprava genů rostliny, s cílem zvýšit nebo snížit syntézu genových produktů v rostlině. Většinou jsou geny zavedeny do jedné nebo více rostlinných buněk, z nichž mohou být vypěstovány celistvé, rozmnožování schopné a životaschopné rostliny, které mohou být zcela transformovány nebo chimérické, mající některé tkáně pozměněné a jiné ne. Tyto rostliny se mohou opylovat buď samy svým pylem, nebo se kříží s pylem jiných rostlin stejného nebo kompatibilního druhu tak, že cizí gen nebo geny jsou pak přenášeny v genetické linii a takto mohou být šlechtěny zemědělsky užitečné rostlinné druhy.

Současné strategie vedoucí ke genetickému inženýrství rostlinných linií typicky zahrnují dva doplňující se postupy. První postup zahrnuje genetickou transformaci jedné nebo více rostlinných buněk, konkrétně charakterizovaného typu. Termín „transformace“ tak, jak je zde použit, znamená, že je cizí gen, většinou ve formě genetického konstruktu, přenesen do genomu individuálních rostlinných buněk. Vnesení genu je provedeno pomocí vektoru, který je začleněn do genomu rostliny. Druhý postup zahrnuje regenerování transformovaných rostlinných buněk na celistvé a rozmnožování schopné rostliny. Jak transformace, tak ani regenerační proces nemusí být ze 100% úspěšné, ale musí být dosaženo určitého stupně spolehlivosti a reprodukovatelnosti, aby bylo možno rozumné procento buněk transformovat a regenerovat z nich celistvé rostliny.

• · • ·

• ·

EP-A-0342926 (jehož obsah je zde zařazen odkazem) popisuje rostlinný (kukuřice) ubichitinový regulační systém obsahující element pro teplotní šok (skládající se ze dvou shodných překrývajících se úseků pro teplotní šok), promotor, místo pro počátek transkripce, intron a místo pro počátek translace. O komponentě pro teplotní šok tohoto regulačního systému se předpokládá, že je odpovědná za vyvolání exprese asociovaných DNA sekvencí zvýšenou teplotou v buňkách jednoděložných nebo krytosemenných rostlin, která následuje po vystavení snesitelným teplotám.

Rostlinný ubichitinový regulační systém_se týká přibližně 2 kb dlouhé nukleotidové sekvence, která jde k 5' konci místa pro počátek tranlace genu pro ubichitin a obsahuje sekvence, které řídí iniciaci transkripce, regulují úroveň exprese, zapojení stresových genů a zvýšení exprese jako odpověď na stres. Regulační systém je DNA sekvence, která poskytuje jak regulační kontrolu nebo modulaci exprese genu a obsahuje jak promotor (asi 1 kb dlouhá nukleotidová sekvence), tak i regulační funkce. Pokud strukturní gen spadá pod regulační kontrolu ubichitinového regulačního systému rostliny, znamená to, že strukturní gen je umístěn tak, že regulovaná exprese tohoto genu je regulována sekvencemi, které obsahují ubichitinový regulační systém.

Promotory jsou části DNA, které řídí transkripci RNA v buňkách. Spolu s dalšími regulačními elementy, které upřesňují tkáň a dočasnou specifičnost exprese genu, promotory regulují vývoj organismu.

Byla vyvinuta intenzivní snaha identifikovat a izolovat promotory z celé řady různých rostlin a živočichů, především ty promotory, které vykazují vysokou úroveň konstitutivní exprese, a které jsou schopny udržovat stabilní úroveň této exprese za stresových podmínek.

Vynález se týká modifikací rostlinného ubichitinového regulačního systému.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje DNA sekvenci obsahující ubichitinový regulační systém, který postrádá elementy pro teplotní šok.

Jelikož ubichitinový regulační systém postrádá elementy pro teplotní šok, nemůže být indukovatelný teplotou.

Dále vynález poskytuje DNA sekvenci obsahující ubichitinový regulační systém, který nelze v podstatě indukovat působením teploty, který obsahuje nukleotidovou sekvenci se SEKV. ID.Č.8.

Pro stručnost bude ubichitinový regulační systém tvořící součást DNA sekvence podle vynálezu nazýván modifikovaný ubichitinový regulační systém (mURS).

« · · · • · • · · ·

Tento mURS s výhodou v podstatě obsahuje rostlinný mURS, jako například mURS kukuřice, jak je uvedeno v EP-A-0342926. Termín „v podstatě obsahující“ v tomto kontextu znamená, že mURS se obecně shoduje s nemodifikovaným URS, samozřejmě kromě těch regionů, kde je mURS modifikovaný, například tak, že mu chybí elementy pro teplotní šok.

Tento mURS může tedy obsahovat intron, například jak je popsáno v EP-A-0642926. mURS může být vytvořen, například modifikací URS tím, že je z něj odstraněn jeden nebo více elementů pro teplotní šok, například použitím standardních DNA manipulačních technik, které jsou odborníkům známé.

V dalším ohledu vynález poskytuje DNA konstrukt obsahující DNA sekvenci podle vynálezu a rostlinný exprimovatelný strukturní gen pod regulační kontrolou ubichitinového regulačního systému o uvedené sekvenci.

Vynález dále poskytuje expresívní vektor obsahující takovýto DNA konstrukt.

Tento mURS podle vynálezu může být použit obdobným způsobem jako URS popsaný v EP-A-0342926, který je zde tímto zahrnut odkazem, a který poskytne další podrobnosti. Tento mURS může být zejména použit k regulaci exprese asociovaného strukturního genu v buňkách, zejména rostlinných buňkách (jednoděložných nebo krytosemenných rostlin).

Vynález se tedy zabývá použitím DNA sekvence, DNA konstruktu nebo expresívního vektoru pro transformaci buněk, zejména rostlinných buněk a to v souladu s vynálezem.

Dále vynález poskytuje způsob transformace hostitelské buňky, zejména buňky rostlinné, sestávající se ze zavedení DNA sekvence, DNA konstruktu či expresívního vektoru do buňky podle vynálezu.

Způsoby, kterými je dosahováno takovýchto transformací jsou odborníkům známé a I v podstatě zahrnují kroky, které vedou ke vzniku rostlinného expresívního vektoru, který obsahuje sekvenci kódující protein a modifikovaný ubichitinový regulační systém podle vynálezu a vnesení tohoto expresívního vektoru do rostlinné buňky.

S výhodou je rostlinná buňka množena až vznikne rostlina a sekvence kódující protein je exprimována. Vynález je také transgenní rostlinnou buňkou, rostlina a semeno obsahují genový konstrukt, který obsahuje modifikovaný ubichitinový regulační systém.

Uvedená rostlina je s výhodou jednoděložná, jako například pšenice, ječmen, oves, kukuřice nebo maize. Nejlépe je to pšenice.

·· · · ·’ ··· · r · ··· · ···· · ♦

Vynález tedy zahrnuje, v souladu se svým zaměřením, hostitelskou buňku, konkrétně rostlinnou buňku, do níž byla zavedena DNA sekvence, DNA konstrukt nebo expresívní vektor podle vynálezem.

Vynález dále poskytuje způsob exprese strukturního genu v hostitelské buňce konstitutivním způsobem, přičemž obsahuje tyto kroky: zavedení strukturního genu do hostitelské buňky, operabilní spojení sDNA sekvencí podle vynálezu definované výše, a konstitutivní vyvolání exprese strukturního genu.

Modifikovaný ubichitinový regulační systém nebo promotor může být zkrácen tak, aby byl určen nejmenší úsek schopný exprese. Metody zkracování zahrnují deletování sekvencí a rozštěpení sekvencí pomocí restrikčních enzymů nebo jiných nukleáz s cílem zachovat stejnou vlastnost a/nebo aktivitu, jakou měla nezkrácená sekvence. Tyto metody jsou běžně známé v molekulární genetice.

K určení aktivity promotoru se většinou použije reportní genový systém s dočasnou expresí genu.V takovémto systému nebo pokusu bude zkoumaný úsek připojen kreportnímu genu a použit při transformaci rostlinné buňky. Vhodné reportní geny zahrnují: chloramfenikolacetytransferázu (CAT), luciferázu (Lux) a β-glukuronidázu (GUS).

mURS podle vynálezu funguje obecně stejně jako nemodifikovaný URS, s výjimkou toho, že není indukovatelný teplotou (a pravděpodobně ani jinými stresovými podmínkami). Vynález tedy poskytuje nový regulační systém, který může být zodpovědný za teplotou nevyvolatelnou konstitutivní expresi asociovaných DNA sekvencí. Výhodami tohoto systému je, že exprese asociovaných DNA sekvencí v transformované buňce je stále zprostředkována a že není ovlivněna změnami okolní teploty, což by za normálních okolností ovlivňovalo expresi zprostředkovanou nemodifikovaným systém, jak je například popsáno v EP-A-0342926.

Ukázalo se, že mURS funguje tak, že je schopen poskytovat vysokou hodnotu konstitutivní exprese, srovnatelnou s expresí dosaženou u nemodifikovaného divokého typu URS, je také schopen udržovat stabilní úroveň konstitutivní exprese za podmínek teplotního šoku.

EP-A-0342926 zahrnuje definování různých termínů, které jsou použity i v tomto popisu a zahrnují termíny: „exprese“, „promotor“, „regulační kontrola“, „strukturní gen“, „rostlinný ubichitinový regulační systém“, „elementy teplotního šoku“, „introny“ a tyto definice se také vztahují k termínům použitým v tomto popisu.

Vynález bude názorně popsán pomocí následujících příkladů s odkazy na připojené obrázky a tabulky.

* · « «· · · · · ·· ·· • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·

Podrobný popis obrázků a tabulek

Obr. 1 je restrikční mapa plazmidu pPBI96-36;

Obr. 2 je restikční mapa plazmidu pdHUbiGUS;

Obr. 3 ukazuje předpovídanou sekvenci mURS sekvence v pPBI97-U3, s restrikčním místem KpnI (v rámečku), která nahrazuje překrývající se elementy teplotního šoku v divokém typu URS (tento obrázek odpovídá SEKV.ID.Č.8);

Obr. 4 je restrikční mapou plazmidu pPBI97-dUGl;

Obr. 5 je restrikční mapou plazmidu pPBI97-2BdUNl.

Obr. 6 ukazuje restrikční mapu plazmidu pUNl, který obsahuje divoký typ URS řídící NptlI volitelný gen signálního znaku.

Obr. 7 je sloupcový diagram znázorňující střední relativní hodnotu exprese NptlI pro každou provedenou transformaci, po teplotním šoku (šedá) a bez teplotního šoku (černá). Výsledky z transgenních linií pro divoký typURS jsou ukázány v oddíle (a) a výsledky pro mURS jsou ukázány v oddíle (b).

Obr. 8 je schématickou ilustrací komory pro bombardování částicemi (není znázorněna v měřítku).

Tabulky 1 a 2 ukazují úroveň exprese NptlI v každé rostlině (vyjádřeno poměrně krRNA kontrole) při vystavení teplotnímu šoku a bez něj a ukazují provedenou transformační událost, z níž daná rostlina pochází.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výzkum vlivu odstranění elementů teplotního šoku z ubichitinového regulačního systému na expresi.

Dva shodné překrývající se elementy teplotního šoku (HS) v ubichitinovém regulačním systému kukuřice (URS) jsou definovány vEP 0342926 a US 5 614 399. Modifikovaný URS (mURS) byl získán podle popisu níže.

Plazmid pPBI95-l je derivát pAHC25 (Christensen, AH & Quial, PH 1996. Transgenní výzkum 5:213-218), v němž do restrikčního místa pro Smál v pAHC25 byla vnesena sekvence spojovníku Sací [d(pCGAGCTCG)] (New Engalnd Biolabs [NEB] katalog č. 1044).

···· · · · · · · • · · · · • · · · ···· · • * · · · · · • fl · · · ··· ·· » · · mURS postrádající elementy pro teplotní šok byl zkonstruován ze dvou PCR fragmentů, které byly amplifikovány za použití pPBI95-l, jako templátu, přičemž bylo použito následujících kombinací primerů.

GUS 1: 5'TCGCGATCCAGACTGAATGCC3' (SEKV. ID. Č: 1) s

HS1: 5'ATTAGGTACCGGACTTGCTCCGCTGTCGGC3' (SEKV. ID. Č: 2).

a

HS2: 5' TATAGGTACCGAGGCAGCGACAGAGATGCC3' (SEKV. ID. Č: 3) s Ubi5': 5' ATATGCTGCAGTGCCAGCGTGACCCGG3' (SEKV. ID. Č: 4).

Amplifikační produkt GUS1 + HS1 je fragment o délce přibližně 1330 pb. Výsledný fragment obsahuje KpnI restrikční místo (z primeru HS1) a Sací restrikční místo (z pPBI95-l) blízko konce 5'a konce 3'v tomto pořadí.. Ubi5'+ HS2 dávají amplifikační produkt dlouhý přibližně 680 pb. Výsledný fragment má Pstl restrikční místo (z pPBI95-l) a KpnI restrikční místo (z primeru HS2) v blízkosti konce 5 'a konce 3 'v tomto pořadí.

Výsledné amplifikační fragmenty GUS1/HS1 a Ubi5'/HS2 byly rozštěpeny restriktázami KpnI a Sací a KpnI a Pstl v tomto pořadí a dvojnásobně navázány do restrikčních míst pro Pstl a Sací vpUC19. Výsledný rekonstituovaný mURS byl potom přenesen jako HindlII/SacI fragment do plazmidu pPBI96-36, kde nahradil nemodifikovaný URS (Obr. 1) a byl tak vytvořen plazmid pdHUbiGUS (Obr. 2). Plazmid pPBI96-36 obsahuje kontrolní genovou fúzi GUS-Nos, která je pod kontrolou divokého typu ubichitinového promotoru (získaného z pAHC25) v pUC plazmidovém hlavním řetězci.

Primer je navržen tak, že 32 pb dlouhá sekvence (TGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTT) (SEKV. ID. Č:5) obsahující dva překrývající se shodné elementy pro teplotní šok v URS definovaném v patentu US 5 614 399, jenž jsou nahrazeny KpnI (GGTACC) restrikčním místem v mURS.

Schopnost mURS udržovat vysokou úroveň exprese asociované DNA sekvence byla ověřována v pokusech s dočasnou expresí GUS tak, že pšeničná a ječmenná nezralá embrya byla bombardována částicemi pdHUbiGUS a pPBI96-36. Plazmid pPBI96-36 je identický s pdHUbiGUS, kromě toho, že obsahuje divoký typURS místo mURS. Oba konstrukty zvýšily úroveň exprese GUS, která byla zjišťována pozorováním množství a intenzity modrých ohnisek zvýrazněných po histochemických analýzách s použitím X-gluk (jako substrátu) (metody jsou popsány vJefferson RA [1987] Výzkum chimérických genů • ·· · ·· ···· ·· ·· • · · · · · · · •·· · ···· · · · ···· · · · · ·

Μ ··· · · ·«·· v rostlinách: Systém GUS genové fúze. Plant Molecular Biology Reportér 5 (4) 387-405). Ve skutečnosti byla exprese GUS zprostředkovaná oběma konstrukty prakticky nerozeznatelná.

Příklad 2

Amplifíkace mURS s použitím genomové DNA z kukuřice jako templátu

Druhý mURS byl připraven PCR amplifikací dvou DNA fragmentů z genomové DNA z kukuřice (genotyp kukuřice B73) jako templátu, následovala ligace dvou fragmentů za vzniku jednoho fragmentu, který postrádal shodné elementy pro teplotní šok (HS). Znovu bylo vytvořeno restrikční místo pro KpnI na místě, kde byly původně HS elementy.

Použité PCR primery byly navrženy podle informací o sekvenci publikované Liu et al 1995 (Biochem Cell Biol 73: 19-30; číslo databáze ZMU29159}. Dva fragmenty, jejichž sekvence jsou uvedeny níže, byly amplifikovány s použitím kombinace primerů HS1 + Ubi3-3 a HS2 + Ubi5-2 s cílem nahradit HS elementy v divokém typu URS diagnostickými KpnI restrikčními místy. Primery Ubi5-2 a Ubi3-3 jsou homologní se sekvencemi v sekvenci promotoru publikované Liu et al. Primery HS1 a HS2 jsou homologní se sekvencemi .které se nacházejí přímo na 3' a 5' koncích, v tomto pořadí, dvou překrývajících se HS elementů v ubichitinovém promotoru, jak bylo uvedeno výše. Oba tyto primery mají KpnI restikční místo (tučně znázorněno v sekvenci) na jejich 5'koncích.

HS1: 5-ATTAGGTACCGGACTTGCTCCGCTGTCGGC-3 (SEKV. ID. Č: 2)

HS2: 5-TATAGGTACCGAGGCAGCGACAGAGATGCC-3 (SEKV. ID. Č: 3)

Ubi5-2: 5-AGCTGAATCCGGCGGCATGGC-3 (SEKV. ID. Č: 6)

Ubi3-3: 5-TGATAGTCTTGCCAGTCAGGG-3 (SEKV. ID. Č: 7)

Amplifikační produkty byly subklonovány do pGEM TEázy (Promega), čímž vyznikly plazmidy pPBI97-Ul a pPBI97-U2. Příslušné orientace vhodné pro následné subklonování byly určeny pomocí restrikčního štěpení. Sekvence mURS o plné délce (2Kb) obsahující promotor a intron byla rekonstruována subklonováním fragmentu ohraničeného restrikčními místy KpnI-SacI zpPBI97-Ul do restrikčních míst KpnI/SacI pPBI97-U2 s cílem získat pPBI97-U3. Předpokládaná sekvence klonovaného mURS fragmentu vpPBI97-U3 je ukázána na Obr. 3 jako SEQ ID No. 8. Restrikční místo KpnI, které nahrazuje překrývající se elementy pro teplotní šok u divokého typu URS (v rámečku). Plazmid pPBI97-U3 obsahuje • · · · · · • 9 přibližně 35 pb dlouhou sekvenci na jeho 5'konci a asi 40 pb dlouhou sekvenci na jeho 3'konci, z nichž ani jedna není přítomna u plazmidu pAHC25 ani u jeho derivátů.

mURS byl přenesen jako Pstl fragment z pPBI97-U3 do Pstl restrikčních míst vpPBI96-36 a nahradil divoký typ URS vpPBI96-36, vznikl tak plazmid pPBI97-dUGl (někdy také označovaný jako p97-dUGl) (Obr. 4). Orientace modifikovaného promotoru byla určena použitím KpnI restrikčního místa, které je přítomno v modifikovaném, ale ne v divokém typu promotoru. Plazmidy pPBI96-36 a pPBI97-dUGl jsou identické až na to, že pPBI96-36 obsahuje divoký typ URS z pAHC25, zatímco pPBI97-dUGl obsahuje mURS z plazmidu pPBI97-U3.

Funkce mURS v pPBI97-dUGl byla potvrzena pomocí krátkodobých transformačních pokusů tak, že byly různé rostlinné tkáně bombardovány částicemi a výsledky byly srovnávány s expresí zprostředkovanou divokým typem URS v pPBI96-39.

Po té byly rostlinné tkáně analyzovány: pšeničná a ječmenná nezralá embrya, listy pšenice, kořeny pšenice, tabákové listy, olejnaté suspenze palmových buněk.

Po bombardování byly tkáně inkubovány při teplotě 20 °C 24 hodin před histochemickými analýzami.

Výsledky zvýrazněné pomocí exprese GUS byly nerozeznatelné pro dva různé plazmidy, což znamená, že odstranění sekvencí pro teplotní šok neovlivňuje výkonnost modifikovaného promotoru při zprostředkování vysoké úrovně konstitutivní exprese v těchto tkáních za těchto podmínek.

Příklad 3 mURS získaný z genomu kukuřice v plazmidu pPBI97-dUGl byl také přenesen proti směru sekvence neomicinové fosfotransferázy (NptlI) za vzniku plazmidu pPBI97-2BdUN 1 (někdy také uváděný jako P97-2BdUNl) (Obr. 5). Tento plazmid byl úspěšně použit jako výběrový konstrukt signálního znaku v stabilní transformaci pšenice, jak bylo popsáno v evropské patentové přihlášce č. 98307337.0, a od té doby.

Přiklad 4 mURS řídí teplotou nevyvolatelnou konstitutivní expresi.

Rostlinná transformace.

Nezralá embrya (IMEs) pšenice typu Bob White byly bombardovány pPBI97-2BdUNl, který obsahuje mURS řídící výběrový NptlI gen signálního znaku. V nezávislých pokusech, IMEs byly také bombardovány plazmidem pUNl (Obr. 6), který obsahuje divoký typ URS řídící NptlI.

Byla vytvořena řada nezávislých primárních transformantů (Ro generace).

Vystavení teplotnímu šoku.

Pro pokusy, zda má teplota vliv, bylo vybráno celkem pět případů transformovaných pomocí pPBI97-2BdUNl a dva případy transformované pUNl. První transformanti byly ponecháni, aby vytvořily semena a semena generace RI byla sebrána. Pro každý nezávislý případ bylo zaseto mezi 22 a 25 semeny RI a semenáčky byly testovány na NptlI aktivitu pomocí metody odbarvování listů. Z každého původního případu bylo vybráno celkem mezi 8 až 12 rostlinami, které měly pozitivní NptlI test odbarvování listů, ty se nechaly vyrůst ve skleníku do dvou až třílistého stádia. Rostlinky pak byly odstraněny ze skleníku a 4 až 6 rostlin z každého vzorku bylo vystaveno teplotnímu šoku na 2 hodiny při 42 °C v inkubátoru Vulcan™, zatímco 4 až 6 rostlin z každého vzorku bylo ponecháno při teplotě místnosti, to znamená bez vystavení teplotnímu šoku. Listy byly sesbírány ze všech linií, vystavených teplotnímu šoku i nevystavených, a byly před analýzou uchovány při -70 °C.

Izolace RNA a Northern Blotting

Zmrazená tkáň listů byla rozdrcena na jemný prášek pod kapalným dusíkem v Braunově Dismembrátoru™. Celková RNA byla vyextrahována z přibližně 100 mg zmrzlé listové tkáně s použitím Qiagen Rneasy™ extrakčního kitu podle návodu výrobce. Byla provedena elektroforéza 15 pg celkové RNA v 1% agaróze, přes noc při rychlosti lV/cm, v pufru o složení: 2,21M formaldehyd, 40mM MOPS pH 7,0; lOmM acetát sodný, lmM EDTA. Gely byly krátce omyty destilovanou vodou a blotovány na HyBond N⁺ (Amersham International), podle standardních protokolů (Sambrook et al, 1989) přes noc. Membrány byly odstraněny a sušeny na vzduchu 2 hodiny, pak byly 2 minuty fixovány v UV při 312 nm.

Značení nukleotidové sondy a hybridizace ng příslušné nukleotidové sondy (NptlI, nebo pšeničného ribosomálního 25S fragmentu) bylo radioaktivně značeno s použitím Rediprime 11™ systému (Amersham International), byl použit a³²PdCTP (Amersham International) podle pokynů výrobce. Membrány byly hybridizovány při 65 °C přes noc v 0,6M NaCl, 20mM Pipes, 4mM Na₂EDTA.2H₂O, 0,2% želatina, 0,2% fíkol 400, 0,2% PVP-360, lOmM Na4P₂O₇.10H₂O, 0,8% SDS, 0,5mg/ml denaturované DNA z lososího spermatu. Po hybridizaci byly membrány *· • · · · • · ·

proplachovány nejdříve při pokojové teplotě 30 minut a pak 10 min. při 65 °C v roztoku 30mM NaCl, 2mM NaH₂PO₄.2H₂O, 0,2 mM Na₂EDTA.2H₂O, 0,l% SDS. Membrány byly vystaveny Typhoon™ General Purpose fosforimager mřížkám (screens) l až 2 dny podle intenzity signálu, a intenzita signálu na mřížkách byla změřena na Typhoon™ Phosphorimageru.

Exprese NptlI byla určována ve srovnání k úrovni ribozomální RNA, aby byly standardizovány odchylky v množství celkové RNA.

Výsledky

Relativní exprese NptlI u potomstva ze dvou nezávislých případů (linie 694 a 695) transformovaných pomocí pUNl (divoký typ URS) je ukázána v (tabulce l). Průměrná úroveň exprese u potomstva z linie 694 byla po teplotním šoku 5x větší než v potomstvu, které bylo ponecháno při pokojové teplotě (obr. 7a). Podobně exprese v potomstvu z linie 695 ukázala 3,4x větší spuštění po teplotním šoku (obr. 7a). To je potvrzením spouštění divokého typu URS teplotním šokem.

Relativní exprese NptlI u potomstva z pěti nezávislých případů (linie 563, 564, 578, 604, 618) transformovaných pomocí pPBI97-2BdUNl (mURS) je ukázáno (tabulka 2). Ve všech liniích byla průměrná úroveň exprese po teplotním šoku bud’ menší, nebo přibližně stejná jako u rostlin ponechaných při pokojové teplotě, což znamená, že mURS není spouštěn teplotou (obr. 7b). To ukazuje, že odstranění elementů pro teplotní šok z URS vede k způsobu exprese, která není spouštěna teplotou.

Tabulka l

	Číslo rostliny	Relativní NptlI exprese po teplotním šoku	Průměr	Číslo rostliny	Relativní NptlI exprese při pokojové teplotě	Průměr
Divoký tvo
URS
Linie 694	l	3,38	7,30	14	l,22	l,44
	2	6,78		10	l,27
	3	9,67		ll	2,23
	5	6,39		12	l,03
	6	10,3
Linie 695	l	l,32	l,43	2	0,47	0,42
	4	l,4		5	0,38
	12	0,83		9	0,32
	13	0,72		10	0,47
	7	2,88		23	0,47

« »

• · · • · » a · ♦ • · · / 9 **· to* ·*» ··»

Tabulka 2

	Číslo rostliny	Relativní NptlI exprese po teplotním šoku	Průměr	Číslo rostliny	Relativní NptlI exprese při pokojové teplotě	Průměr
Modifikovaný
URS
Linie 563	1	0,28	0,48	12	0,61	0,61
	11	0,30		13	0,51
	6	0,44		14	0,57
	7	0,44		15	0,27
	8	0,92		16	1,1
Linie 564	1	0,93	1,17	3	1,06	1,32
	7	1,92		4	1,34
	9	1,06		5	1,24
	10	0,88		19	1,15
	16	1,04		23	1,82
Linie 578	12	1,14	0,94	3	0,87	0,84
	13	1,31		4	0,66
	14	0,9		6	1,02
	18	0,61		7	0,88
	19	0,72		21	0,75
Linie 604	1	0,91	0,47	8	0,91	1,14
	2	0,12		10	1,64
	3	0,1		11	1,21
	4	0,45		18	0,78
	16	0,77
Linie 618	2	0,28	0,32	10	1,12	0,71
	3	0,44		11	0,65
	15	0,3		14	0,47
	16	0,4		6	0,73
	18	0,24		8	0,85
	19	0,23		9	0,42

Metody a materiály použité v popsaných příkladech.

Zde použitá a popsaná metoda transformace pšenice je z velké část založena na metodě zahrnuté v Barcelo a Lazzeri (1995): Transformace obilovin bombardováním nezralých, nekvetoucích tkání a tkání děložních lístků mikročásticemi; Methods in Molecular Biology-Plant Gene Transfer and Expression Protocols (vol 49), 113-123; Jones H (ed) Humana Press lne., Totowa, NJ.

Zárodečné rostlinky pšenice - jarní odrůda Bob White byly pěstovány ve skleníku při lóhodin dlouhém denním osvětlení, které bylo udržováno na minimální intenzitě 500pmol m²s'’ ve výšce 0,5 m nad vrcholovým listem. Teplota ve skleníku byla udržována na 19 °C ± °C během dne a na 14 °C ± 1 °C v noci.

···* • · to ·· « toto* to t to > · » • to *· » to w · • to · > · · · · · · · a to toto · · · · ·· ·»* to« toto··

Nezralá embrya pšenice byla sklizena z vyvíjejících se obilek. Byla sklizena semena a embrya byla pěstována asi 12 dní po opylování, když byly klíčky dlouhé asi lmm. Semena byla nejdříve oplachována 5 minut 70% ethanolem a pak sterilizována 15 minut v 10% roztoku odbarvovací lázně Domestos (Domestos je obchodní značka) a propláchnuta 6x sterilní destilovanou vodou. Po odstranění zárodečných klíčků (axis) byla embrya dána stranou, přičemž klíčky byly umístěny přední stranou dolů na agarózový gel (Sigma katalog č. A-3301) zpevněný pomocí MM1 média. Obecný návod na MM1 je uveden v Dodatku 1, a návody na různé složky v Dodatku 2. Před bombardováním byla embrya uchována v temnu jeden nebo dva dny při teplotě 24 °C ± 1 °C.

Plazmidy pUNl a p97-2BdUNl byly použity pro vytvoření výběrových signálních znaků.

Plazmidy pUNl a p97-2BdUNl obsahují chimérické fúze promotor-NptlI genu a poskytují možnost selekce transformantů na skupině aminoglykosidových antibiotik, které zahrnují: kanamycin, neomycin, geneticin a paromycin.

Bombardování částicemi bylo použito k zavedení plazmidů do buněk. Následující metoda byla použita k precipitací plazmidové DNA do zlatých částic o velikosti 0,6 μιη (BIO-RAD katalogové č. 165-2262): Celkem 5 μg plazmidové DNA bylo přidáno do 50 μΐ a vystaveno na 1 minutu ultrazvuku (sonikováno)- suspenze zlatých částic (10 ng/ml) v centrifugační mikrozkumavce 1,5 ml. Po krátkém rozvíření asi 3 sekundy bylo přidáno 50 μΐ 0,5M roztoku chloridu vápenatého a 20 μΐ 0,05M roztoku báze bez spermidinu, každé na opačnou stranu víčka centrifugační mikrozkumavky. Po zavření víčka byl obsah zkumavky smíchán dohromady sklepáním chloridu sodného a spermidinu na dno. Po opětovném rozvíření 3 sekundy byla suspenze centrifugována při 13 000 otáčkách za minutu po dobu 5 sekund. Supernatant byl odstraněn a pelet resuspendován v 150 μΐ absolutního ethanolu. Zlaté částice byly ze dna zkumavky seškrábnuty špičkou pipety. Po dalším rozvíření po dobu 3 sekund byl vzorek znovu centrifugován a pelet byl resuspendován v absolutním ethanolu o celkovém objemu 8 μΐ. Částice byly krátce rozvířeny a sonikovány 5 s v Camlab Trisonic T310 sonikátoru s vodní lázní, aby bylo zajištěno skutečně jemné rozptýlení. Alikvotní podíl 5 μΐ DNA pokrytých zlatých částic byl umístěn do středu makronosiče (BIO-RAD katalog č.l 15-2335) a ponechán 30 min., aby uschl. Bombardování částicemi bylo prováděno pomocí komory Biolisitc™ PDS-1000/He (BIO-RAD Instruments, Hercules CA), která je schématicky znázorněna na Obr. 8, bylo použito helium o tlaku 4,49 MPa a 6,21 MPa (ruptumí disky: BIO-RAD katalogová č. 165-2327 a 165-2328 jednotlivě).

• · • · · ·

Podle Obr. č. 8 obsahuje znázorněná vakuová komora pouzdro (10), jehož vnitřní stěny zahrnují sérii 12 výklenků pro umístění poliček, jako je např. ploška (14) na čtvrté úrovni od vrchu komory. Ruptumí? disk (16) je připevněn v tubě pro tlakový šok He (18) blízko vrcholu komory. Podpora (20), umístěná v druhé sadě výklenků od vrcholu komory nese jednotku (22), která obsahuje stopující stínítko a sadu kroužků (24), sil kroužky pod podporou (20) a 3 až 4 kroužky nad podporou (20). Makronosič (26) je umístěn na vrcholu jednotky (22). Přibližná vzdálenost od ruptumího disku (16) k makronosiči (26) je 25 mm, a vzdálenost od makronosiče (26) k stopujícímu stínítku je přibližně 7 mm, vzdálenost od stopujícího stínítka k plošce se vzorky (14) je přibližně 67 mm. Vrchol jednotky (22) je vzdálen asi 21 mm ode dna šokové tuby (18), a dno jednotky (22) je vzdáleno asi 31 mm od vrcholu poličky se vzorky (14).

Nezralá embrya byla bombardována mezi 1. až 2. dnem po kultivaci. Pro bombardování byla embrya seskupena v kruhové oblasti o průměru přibližně 1 cm, která obsahovala 20 až 100 embryí, kličkovou stranou dolů vMMl médiu. Petriho miska obsahující tuto tkáň byla umístěna v komoře na plošce (14), na čtvrté úrovni od vrcholu, jak je znázorněno na Obr. 8. Vzduch z komory byl odčerpán na vakuum o tlaku 97 kPa (723,9 mm Hg). Makronosič (26) byl urychlen pomocí heliové šokové vlny s použitím ruptumích membrán, které se roztrhnou, když tlak helia v šokové tubě dosáhne 4,49 MPa nebo 6,21 MPa. V průběhu 1 hodiny po bombardování byla položena embrya na MM1 médium - 10 embryí na 9 cm Petriho misku a pak ponechána při konstantním temnu při 24 °C 2 až 3 týdny. Během tohoto období se na bombardovaných embryích vytvořil somatický zárodečný kalus.

Po 2 až 3 týdnech byla embrya přenesena na agarem vyztužené regenerační médium, známé jako R medium, a byla inkubována při 16 hodin dlouhém denním osvětlení při 24 °C. Obecný návod pro přípravu R média je uveden v Dodatku 1. Embrya byla přenesena na čisté tácy v 2 až 3 týdenních intervalech. Pro selekci transformantů byly použity tři různé systémy s použitím NptlI genu: 1) Geneticin (GIBCO-BRL katalog č. 10131-019) byl inkorporován (50 mg/1) hned při přenesení do regeneračního média a udržován na koncentraci 50 mg/1 při dalších přenosech do regeneračních médií. 2) & 3) Embrya byla nejdříve přenesena do regeneračního média bez výběru na 12 dní a 2 až 3 týdny, v tomto pořadí, a pak přenesena do média obsahujícího Geneticin o koncentraci 50 mg/1. Po 2 až 3 opakováních v regeneračním médiu byly regeneruj ící se výhonky přeneseny do individuálních kultivačních zkumavek, které obsahovaly 15 ml regeneračního média s poloviční koncentrací soli s volbou geneticinu • « · ··· · · ·· • « · · · · · v ···· · · · • · · · · · · • · · · · · • · ··· ·· · · · · o koncentraci 35 mg/1. Po vzniku kořínku byly regenerující se rostlinky přeneseny do půdy a umístěny ve skleníku.

Zkouška odbarvování listů

Pomocí zkoušky odbarvování listů (popsáno vPlant. Physiol. (1997) 115: 971-980) byly primární transformanti a potomstvo potvrzeni jako transgenní. Řezy listů byly infiltrovány paromomycinem ve vakuu a zkoumány na rezistenci po 2 až 3 dnech. Tato metoda byla potvrzena srovnáním s výsledky analýzy genomové DNA pomocí Southern blottingu (přenos na membránu).

Izolace genomové DNA a Southern analýzy

Southern analýza materiálu z primárních transformantů a potomstva byla prováděna následovně: Zmrzlá suchá listová tkáň byla krátce rozdrcena Kontes™ tloučkem ve třecí misce, genomová DNA byla vyextrahována podle popisu ve Fulton et al, 1995. 5 gg DNA bylo rozštěpeno pomocí příslušného restikčního enzymu podle návodu výrobce a DNA pak byla elektroforézována přes noc na 1% agarózovém gelu, gel byl potom vyfotografován, opláchnut a přenesen na Hybond N+™ (Amersham International) membránu podle Southern metody s použitím standardních postupů (Sambrook et al 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd. Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbouur, NY). Po blottingu byly filtry usušeny na vzduchu, pečeny při 65 °C 1 až 2 hodiny a fixovány 2 min. pomocí UV při 312 nm.

Příprava nukleotidové sondy a značení pro Southern analýzy transformovaných materiálů byla provedena podle popisu uvedeného výše.

GUS histochemie byla provedena v podstatě podle popisu vJefferson (1987), Plant Molecular Biology Reportér, 5, (4), 387-405.

Dodatek 1

Recept na 2x koncentrované MM1 médium

Složka	Objem/množství zásobního roztoku na 1 litr 2x koncentrovaného média
Macrosoli MS (lOx zás. roztok)	200ml
Mikrosoli L (lOOOx z.r.)	2ml
FeNaEDTA MS (lOOx z.r.) (Sigma katalog F-0518)	20ml
Modifikovaný Vits MS (xlOOO)	lml
Roztok 3 aminokyselin (25x z.r.)	40ml

• · • · • · • · · • · · · · ·

Myoinositol (Sigma katalog č. 1-3011)	0,2g
Sukróza	180g
AgNo3 (20mg/ml z.r.) Přidáno po sterilizaci filtrů	lml
Picloram (lm/ml z.r.) Přidáno po sterilizaci filtr	4ml

Filtry se sterilizují a přidají se do stejného objemu moulten 2x agarózového gelu (1 Og/1).

Recept na 2x koncentrované R médium

Složka	Objem/množství zásobního roztoku na 1 litr 2x koncentrovaného média
Macrosoli L7 (lOx zás. roztok)	200 ml
Mikrosoli L (lOOOx z.r.)	2 ml
FeNaEDTA MS (lOOx z.r.)	20 ml
Vits/Inositol L2 (200x z.r.)	10 ml
Roztok 3 aminokyselin (25x z.r.)	40 ml
Maltóza	60 g
2,4-D (lmg/ml z. r.) přidán po sterilizaci	200 pl
Směs cis-trans izomerů Zeatinu (5mg/ml z.r.) (Melford labs katalog č. Z-0917) Přidáno po sterilizaci filtrů	2 ml

Filtry se sterilizují a přidají se do stejného objemu moulten 2x agaru (16g/l).

Dodatek 2

Recept na složky MM1 a R médií

Mikrosoli L (lOOOx zásobní roztok)

	Na 100 ml
MnSo₄.2H₂O	1,34 g
H₃BO₃	0,5 g
ZnSO₄.7H₂O	0,75 g
KI	75 mg
Na₂MoO₄.2H₂O	25 mg
CuSO₄.5H₂O	2,5 mg
CoC1₂.6H₂O	2,5 mg

Filtry se sterilizují přes 22 pm membránový filtr Skladovat při teplotě 4 °C • · · · · ·

Makrosoli MS (lOx zásobní roztok)

	na litr
NH₄NO₃	16,5 g
kno₃	19,0 g
kh₂po₄	1,7 g
MgSO₄.7H₂O	3,7 g
CaCl₂.2H₂O	4,4 g

NB: Rozpustit CaCl₂ před smícháním s ostatními složkami NB: Připravit KH2PO4 zvlášť ve sterilní H₂O a přidat nakonec. Roztok skladovat při 4 °C po autoklávování.

Modifikované MS Vits (lOOOx zásobní roztok)

	na lOOml
Thiamin HCI	10 mg
Pyridoxin HCI	50 mg
Kyselina nikotinová	50 mg

Skladovat roztok v 10 ml alikvotních částech při -20 °C.

Roztok 3 aminokyselin (25x zásobní roztok)

	na litr
L-glutamin	18,75 g
L-prolin	3,75 g
L-asparagin	2,5 g

Roztok skladovat v 40 ml alikvotních částech při -20 °C.

Makrosoli L7 (lOx zásobní roztok)

	na litr
NH₄NO₃	2,5 g
kno₃	15,0 g
kh₂po₄	2,0 g
MgSO₄.7H₂O	3,5 g
CaCl₂.2H₂O	4,5 g

NB: Rozpustit CaCl₂ před smícháním s ostatními složkami NB: Připravit KH₂PO₄ zvlášť v 50 ml H₂O a přidat nakonec. Roztok skladovat pri 4 °C po autoklávování.

Vits/Inositol (200x zásobní roztok)

200x zásobní roztok	na 100 ml
Inositol	4,0 g
Thiamin HCI	0,2 g
Pyridoxin HCI	0,02 g
Kyselina nikotinová	0,02 g
Pantoten vápenatý	0,02 g
Kyselina askorbová	0,02 g

Roztok skladovat v 40 ml alikvotních částech při -20 °C.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

Vilpf ·· ··· · ·· • · · • · · · · ···· · · · · ¹• · · · · · · ·· ··· · · ··

1. DNA sekvence obsahující ubichitinový regulační systém, který postrádá části pro teplotní šok.
2. DNA sekvence obsahující ubichitinový regulační systém, který není teplotou indukovatelný.
3. DNA sekvence podle nároku 1 nebo 2, kde ubichitinový regulační systém v podstatě obsahuje rostlinný ubichitinový regulační systém.
4. DNA sekvence podle nároku 3, kde ubichitinový regulační systém v podstatě obsahuje nukleotidovou sekvenci podle SEKV. ID. C.8.
5. DNA sekvence podle kteréhokoliv z předcházejících nárófců, kde ubichitinový regulační systém obsahuje intron.
6. DNA konstrukt obsahující DNA sekvenci podle kteréhokoliv z předcházejících nároků a rostlinný exprimovatelný strukturní gen za regulační kontroly ubichitinového regulačního systému o uvedené sekvenci.
7. Expresivní vektor obsahující DNA konstrukt podle nároku 6.
8. Použití DNA sekvence, DNA konstruktu, nebo expresního vektoru podle kteréhokoliv z předcházejících nároků pro transformaci buněk, konkrétně rostlinných buněk.
9. Způsob transformace hostitelské buňky, vyznačující se tím, že se do buňky zavede DNA sekvence, DNA konstrukt nebo expresivní vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že hostitelskou buňku je rostlinná buňka.

• ·· · ·· ···· • · · ·
11. Hostitelská buňka, s výhodou rostlinná buňka, do níž byla zavedena DNA sekvence, DNA konstrukt nebo expresní vektor podle kteréhokoliv z předcházejících nároků.
12. Způsob exprese strukturního genu v hostitelské buňce konstitutivním způsobem, vyznačující se tím, že se do hostitelské buňky vpraví strukturní gen, operativně napojený kDNA sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, načež se navodí exprese strukturního genu konstitutivně hostitelskou buňkou.
13. Transgenní rostlina nesoucí DNA sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, nebo nesoucí DNA konstrukt podle nároku 6, nebo nesoucí expresívní vektor podle nároku 7.
14. Rostlina podle nároku 13, kde rostlina je jednoděložná jako pšenice, ječmen, oves, kukuřice nebo maize.
15. Semeno rostliny, které obsahuje DNA sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, nebo obsahující DNA konstrukt podle nároku 6, nebo obsahující expresívní vektor podle nároku 7.