JP2009148288A - 器官形成を改良した植物及びその作出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】種々の器官形成が改良された組換え植物を作出する
【解決手段】植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも１つの核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物に比べて少なくとも１種の器官形成が改良された植物及びその子孫。
【選択図】図１

Description

本発明は、種々の改良された器官形成を有する植物、詳細には改良された茎、葉、花、子房（さや、果実）、種子を有する植物に関する。また、本発明は該植物の作出方法に関する。

植物はそれぞれの生息地の様々な環境要因に適応して生活している。例えば、植物は生育する環境に応じて形を変化させる能力を有している。植物が一旦ある場所に根をおろしてしまうと、その場所の環境がいかにその植物に適していなくても移動することができず、自分自身の形を変化させることで適応して生育を続ける。植物にとっては形を変えることは生き残っていくうえで必須条件となっている。

種々の器官形成を改良するために交雑育種、最近の遺伝子工学技術を利用した育種、植物ホルモンや植物調節剤の作用を利用した方法等が行われている。

植物の器官形成や形態形成の制御機構を解明するためにシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を用いて数多くの研究が行われている。花形成に関与する遺伝子としては、ＬＥＡＦＹ（ＬＦＹ）、ＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）、ＡＧＡＭＯＵＳ（ＡＧ）、ＳＵＰＥＲＭＡＮ（ＳＵＰ）、ＦＩＬ（ＦＩＬ）などが報告されている。茎形成に関与する遺伝子としてはＴＣＨ４、ｄｂｐなどが報告されている。葉形成に関与する遺伝子としてはＬＡＮ１、ＭＡＣなどが報告されている。根形成に関与する遺伝子としては、ｔｔｇ、ｇｌ２、ＣＰＣ、ＩＲＥなどが報告されている。

これまでに遺伝子工学技術を利用した、形態形成や器官形成を改良した植物の作出が行われている。ジンクフィンガーモチーフを有する転写因子（ＰｅｔＳＰＬ３）をペチュニアに導入して花の形態変化が報告されている（特開平11-262390）。ＣＰＣ遺伝子やＩＲ
Ｅ遺伝子をシロイヌナズナに導入して根の形態変化が報告されている（特開平10-4978、
特開2000-270873）。しかし、これらの遺伝子を形質転換した植物の多くは、実際には産
業上利用可能な程度に十分な効果は得られておらず、実用化に至っていないのが現状である。

ポリアミンとは第１級アミノ基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素の総称で生体内に普遍的に存在する天然物であり、２０種類以上のポリアミンが見いだされている。代表的なポリアミンとしてはプトレシン、スペルミジン、スペルミンがある。ポリアミンの主な生理作用としては(1)核酸との相互作用による核酸の安定化と構造変化(2)種々の核酸合成系への促進作用(3)タンパク質合成系の活性化(4)細胞膜の安定化や物質の膜透過性の強化などが知られている。

植物におけるポリアミンの役割としては細胞増殖や分裂時に核酸、タンパク質生合成の促進効果や細胞保護が報告されているが、最近ではポリアミンと環境ストレス耐性との関わりも注目されている。

形態形成とポリアミンの関わりは、体細胞胚形成、不定根形成について幾つか報告されている。例えば、ニンジン（非特許文献１：Planta, 162, 532, 1984、非特許文献２：Science, 223, 1433, 1984）、エンバク（非特許文献３：Plant Growth Reg., 3, 329, 1985）、ハクサイ（非特許文献４：Plant Sci., 56, 167, 1988）、ペチュニア（非特許文献５：Plant Sci., 62, 123, 1989）でポリアミンにより体細胞胚形成が促進されることや
、リョクトウ（非特許文献６：Physiol. Plant., 64, 53, 1985、非特許文献７：Plant Cell Physiol., 24, 677, 1983）では不定根形成が促進されることが示されている。ポリ
アミンと花、茎、葉、子房などの器官形成との関与については、これまでほとんど報告されていない。
Planta, 162, 532, 1984 Science, 223, 1433, 1984 Plant Growth Reg., 3, 329, 1985 Plant Sci., 56, 167, 1988 Plant Sci., 62, 123, 1989 Physiol. Plant., 64, 53, 1985 Plant Cell Physiol., 24, 677, 1983 植物のポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素としてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）等が知られている。これらのポリアミン代謝関連酵素をコードするポリアミン代謝関連遺伝子については植物から既に幾つか単離されている。ＡＤＣ遺伝子はエンバク（非特許文献８：Mol. Gen. Genet., 224, 431-436, 1990）、トマト（非特許文献９：Plant Physiol., 103, 829-834, 1993）、シロイヌナズナ（非特許文献１０：Plant Physiol., 111, 1077-1083, 1996）、エンドウ（非特許文献１１：Plant Mol. Biol., 28, 997-1009, 1995）、ＯＤＣ遺伝子はチョウセンアサガオ（Datura）（非特許文献１２：Biocem. J., 314, 241-248, 1996）、ＳＡＭＤＣ遺伝子はジャガイモ（非特許文献１３：Plant Mol. Biol., 26, 327-338, 1994）、ホウレンソウ（非特許文献１４：Plant Physiol., 107, 1461-1462, 1995）、タバコ、ＳＰＤＳ遺伝子はシロイヌナズナ（非特許文献１５：Plant cell Physiol., 39(1), 73-79, 1998）等から単離されている。 Mol. Gen. Genet., 224, 431-436, 1990 Plant Physiol., 103, 829-834, 1993 Plant Physiol., 111, 1077-1083, 1996 Plant Mol. Biol., 28, 997-1009, 1995 Biocem. J., 314, 241-248, 1996 Plant Mol. Biol., 26, 327-338, 1994 Plant Physiol., 107, 1461-1462, 1995 Plant cell Physiol., 39(1), 73-79, 1998

従って、本発明の目的は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を人為的に制御して、ポリアミンレベルを変化させることによって、種々の器官形成が改良された組換え植物を作出することである。

本発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意努力した結果、ポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素遺伝子を単離して、該遺伝子を植物に導入して過剰発現することによって、ポリアミン代謝を操作してポリアミン濃度を変化させることによって、茎、葉、花、子房（果実、さや）、種子（胚珠）など種々の器官形成のパラメーターが改良されることを見出した。

ポリアミンは分子中にアミンを多く含む塩基性物質であり、代表的なポリアミンとしては二分子のアミンを含むプトレシン、三分子のアミンを含むスペルミジン、四分子のアミンを含むスペルミン等がある。植物において、これらのポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素としてはプトレシンについてはＡＤＣ、ＯＤＣ、スペルミジンについて
はＳＡＭＤＣ、ＳＰＤＳ、スペルミンについてはＳＡＭＤＣ、ＳＰＭＳ等が見つかっている。これらのポリアミン代謝関連酵素をコードしているポリアミン代謝関連酵素遺伝子についても既に幾つかの植物で単離されている。さらに、幾つかのポリアミン代謝関連酵素遺伝子については植物への導入が試みられているが、得られた形質転換植物で茎、葉、花、子房、種子などの器官形成の改良については報告されていない。

このような状況下に、本発明者らは植物の器官形成を改良するために鋭意、検討した結果、器官形成において、特にポリアミンであるスペルミジンやスペルミン含量が重要であることを見いだし、実際に植物組織からスペルミジンやスペルミン生合成に関わるポリアミン代謝関連遺伝子（ＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ）を単離、同定した。さらに、該遺伝子を植物に導入して過剰発現することによって、ポリアミン代謝を操作してポリアミン濃度を変化させることによって、茎、葉、花、子房（果実、さや）、種子（胚珠）など種々の器官形成のパラメーターが改良されることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、以下の発明を提供するものである。
１． 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも１つの核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物に比べて少なくとも１種の器官形成が改良された植物及びその子孫。

２． ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子である請求項１記載の植物及びその子孫。

３． 該器官形成が改良された植物が、植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物を形質転換して得られる形質転換植物である、請求項１記載の植物及びその子孫。

４． 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）をコードする遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）をコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）をコードする遺伝子、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）をコードする遺伝子、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種である請求項２に記載の植物及びその子孫。

５． 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、スペルミジン合成酵素をコードする遺伝子である請求項４記載の植物及びその子孫。 ６．
６． ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有するスペルミジン合成酵素遺伝子である、請求項４記載の植物及びその子孫。 （ａ）配列番号１（ＳＰＤＳ、１３２８）に示される塩基配列中塩基番号７７〜１０６０で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。

７． 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有するＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項４記載の植物及びその子孫。
（ａ）配列番号３（ＳＡＭＤＣ、１８１４）に示される塩基配列中塩基番号４５６〜１５
４７で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
８． 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有するアルギニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項４記載の植物及びその子孫。

（ａ）配列番号５（ＡＤＣ、３０３７）に示される塩基配列中塩基番号５４１〜２６６１で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。

９． 内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が、該遺伝子のイントロンまたはエクソン、該遺伝子のプロモーターを含む５‘上流側の調節領域または終止コドンの下流側であって、遺伝子発現に影響する領域のいずれかのアンチセンスＤＮＡまたは２本鎖ＲＮＡを形成するセンスＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡである請求項２に記載の植物及びその子孫。

１０． 器官が、茎、塊茎、葉、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維及び胚珠からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の植物及びその子孫。

１１． 器官形成が栄養生長期よりも生殖生長期において顕著に改良される請求項１に記載の植物及びその子孫。

１２． 茎の数が改良された植物である、請求項１に記載の植物及びその子孫。

１３． 葉の数が改良された植物である、請求項１に記載の植物及びその子孫。

１４． 花の数および／または花の開花期（開花開始時期又は開花している期間）が改良された植物である、請求項１に記載の植物及びその子孫。

１５． 子房の数および／または子房の発達期間が改良された植物である、請求項１に記載の植物及びその子孫。

１６． 種子の数が改良された植物である、請求項１に記載の植物及びその子孫。

１７． 双子葉植物である、請求項１に記載の植物及びその子孫。

１８． 葉、茎、根、花、子房、果実、種子、繊維又はカルスの形態である請求項１に記載の植物及びその子孫。

１９． 前記核酸配列が内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子であり、器官形成の改良が植物の矮小化又はミニチュア化である請求項２に記載の植物及びその子孫。

２０． 請求項１〜９のいずれかに記載の植物及びその子孫から得られる葉、茎、根、花、子房、果実、種子、繊維又はカルス。

２１． 請求項１〜９のいずれかに記載の植物及びその子孫から得られる有用物質。

２２． 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも１つの核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された器官形成を有する植物の作出方法。

２３． ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子である請求項２２記載の方法。

２４． 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された器官形成を有する植物の作出方法。

２５． ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子である請求項２４記載の方法。

２６． 該形質転換細胞から植物体を再生する工程をさらに含む、請求項２４記載の方法。

２７． 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）をコードする遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）をコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）をコードする遺伝子、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）をコードする遺伝子、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種である請求項２５に記載の方法。

２８． 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の塩基を有するスペルミジン合成酵素遺伝子である、請求項２７記載の方法。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列中塩基番号７７〜１０６０で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。

２９． 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の塩基を有するＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項２５記載の方法。（ａ）配列番号３に示される塩基配列中塩基番号４５６〜１５４７で示される塩基配列、（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。

３０． 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の塩基を有するアルギニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項２５記載の方法。
（ａ）配列番号５に示される塩基配列中塩基番号５４１〜２６６１で示される塩基配列、（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。

３１． 内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が、該遺伝子のイントロンまたはエクソン、該遺伝子のプロモーターを含む５‘上流側の調節領域または終止コドンの下流側であって、遺伝子発現に影響する領域のいずれかのアンチセンスＤＮＡまたは２本鎖ＲＮＡを形成するセンスＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡである請求項２５に記載の方法。

３２． 器官が、茎、塊茎、葉、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維及び胚珠からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２４に記載の方法。

３３． 器官形成が栄養生長期よりも生殖生長期において顕著に改良される請求項２４に記載の方法。

３４． 改良された器官形成を有する植物が、茎の数が改良された植物である、請求項２４に記載の方法。

３５． 改良された器官形成を有する植物が、葉の数が改良された植物である、請求項２４に記載の方法。

３６． 改良された器官形成を有する植物が、花の数または花の開花期が改良された植物である、請求項２４に記載の方法。

３７． 改良された器官形成を有する植物が、子房の数または子房の発達期間が改良された植物である、請求項２４に記載の方法。

３８． 改良された器官形成を有する植物が、種子の数が改良された植物である、請求項２４に記載の方法。

３９． 改良された器官形成を有する植物が、双子葉植物である、請求項２４に記載の方法。

４０． 以下の工程：
（１）植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、
（２）該形質転換細胞から、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された器官形成を有する植物体を再生し、
（３）該植物体から受粉により種子を採取し、および
（４）該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における該核酸配列を検定して該核酸配列のホモ接合体を選抜すること
を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された器官形成を有する形質が固定された植物の作出方法。

４１． 以下の工程：
（１）植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも１つの核酸配列の抑制因子を含む少なくとも１つの発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、
（２）該形質転換細胞からカルスを誘導する
を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された器官形成を有する形質が固定されたカルスの作出方法。

本発明により、植物の種々の器官形成を改良することができ、植物の器官や組織の品質、価値、生産性、収量の向上、或いは矮小化による耐倒伏性の向上などが期待できる。具体的には、茎、葉、花、子房、果実、さや、種子の数が増加することによって、該器官が農作物として生産される場合、品質、生産性、収量の増加が期待される。例えば、イネは１株当たりの種子数が増加することで収穫できる米の収量が増大することが期待できる。トウモロコシは１株当たりの雌穂の数が増加することで穀粒の収量が増大することが期待できる。ダイズは１株当たりのサヤの数が増加することでマメの収量が増大することが期待できる。ワタは１株当たりのコットンボールの数が増加することで収穫できる繊維の収量が増大することが期待できる。サツマイモやジャガイモは塊根や塊茎の数が増加することでイモの収量が増大することが期待できる。果樹は着果した果実（子房）の数が増加して、発達期間が長くなることで生産性の向上が期待される。観賞植物は花、茎、葉、特に花の数が増加し、かつ開花期間が延長されたり、ミニチュア化することで見栄えが良くなり、商品価値が高まることが期待される。さらに、植物の形や形態を変化させることで様々な環境適応性が向上し、栽培の安定化、生産性の向上、栽培地域の拡大なども期待できる。

図１は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含む発現コンストラクトの構造を示す。 図２は、形質転換体におけるクロダネカボチャＳＰＤＳ遺伝子の発現結果を示す。図２中、1.野生株(WT)；2.形質転換体(TSP-14)； 3.形質転換体(TSP-15)； 4. 形質転換体(TSP-16)； 5. 形質転換体(TSP-17)； 6. 形質転換体(TSP-19)。 図３は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との茎数の比較を示す。 図４は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との茎、葉、花、子房、種子数の比較を示す写真である。 図５は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との主茎数の比較を示す図である。 図６は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との側茎数の比較を示す図である。 図７は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との開花日の比較を示す図である。 図８は、外来遺伝子が発現していた個体についての個体当たりの経時的花数変化の測定結果を示す。 図９は、外来遺伝子が発現していた個体についての個体当たりの経時的花数変化の測定結果を示す。

本発明において「器官」とは、植物のあらゆる器官（組織）で、例えば、茎、塊茎、葉、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維、胚珠などを指す。該器官（組織）の形成に関わる形質としては、数量、生育期間、形、着色、性質、特性などをいう。ポリアミンの発現量は、植物の器官の数量と密接に関係し、葉、花、果実、塊茎、塊根さや、さく果などについては、数量とともに生育の開始は早くなり、かつ、終了が遅くなるので、長期間これらを鑑賞及び賞味することができる。

本発明で得られる植物は、栽培環境（例えば環境ストレス）に左右されずポリアミンの発現量が増大し、器官形成を改良することができる。

ポリアミン量を調節する核酸配列としては、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が挙げられる。外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は植物体中のポリアミン量を増大させ、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子は植物体中のポリアミン量を減少させる。

本発明において「該ポリアミン量を調節する核酸配列を有していない植物」とは該核酸配列（例えば外因性のポリアミン代謝関連酵素遺伝子又は内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子）をゲノム上に有しないあらゆる植物を意味する。従って、いわゆる野生種のほか、通常の交配によって樹立された栽培品種、それらの自然または人工変異体、並びにポリアミン代謝関連酵素遺伝子以外の外因性遺伝子を導入されたトランスジェニック植物などをすべて包含する。

本発明で言うところの「ポリアミン」は生物体内に普遍的に存在する一般的な天然物であり、第一級アミノ基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素化合物である。例えば、１，３−ジ
アミノプロパン、プトレシン、カダベリン、カルジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノプロピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモスペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミジン、Ｎ，Ｎ−ビス（アミノプロピル）カダベリン、ホモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミン、ホモカルドヘキサミンなどが挙げられる。

ポリアミン代謝関連酵素遺伝子
本発明において「ポリアミン代謝関連酵素遺伝子」とは、植物におけるポリアミンの生合成に関与する酵素のアミノ酸をコードする遺伝子であり、例えば代表的なポリアミンであるプトレシンについてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子とオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子、スペルミジンについてはＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子とスペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子、スペルミンについてはＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子とスペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子が関与し、律速になっていると考えられている。

アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ：arginine decarboxylase EC4.1.1.19.）はＬ−アルギニンからアグマチンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ：ornithine decarboxylase EC4.1.1.17.）はＬ−オルニチンからプトレ
シンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ：S-adenosylmethionine decarboxylase EC4.1.1.50.）はＳ−アデノシルメチオニンからアデノシルメチルチオプロピルアミンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ：spermidine synthase EC2.5.1.16.）はプトレシンとアデノシルメチルチオプロピルアミンからスペルミジンとメチルチ
オアデノシンを生成する反応を触媒する酵素である。

これらの遺伝子は、いずれの由来であってもいいが、例えば、種々の植物から単離することができる。具体的には、双子葉植物、例えばウリ科；ナス科；シロイヌナズナ等のアブラナ科；アルファルファ、カウピー（Vigna unguiculata）等のマメ科；アオイ科；キ
ク科；アカザ科；ヒルガオ科からなる群から選ばれたもの、又は単子葉植物、例えばイネ、小麦、大麦、トウモロコシ等のイネ科などが含まれる。乾燥に強いサボテンやアイスプラント（Mesembryanthemum crystallinum）でもよい。好ましくは、ウリ科植物、より好
ましくはクロダネカボチャがよい。

本発明の植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子を単離する植物組織としては種子形態、または生育過程にあるものである。生育中の植物は全体、あるいは部分的な組織から単離することができる。単離することができる部位としては、特に限定はされないが、好ましくは植物の全樹、蕾、花、子房、果実、葉、茎、根などである。

本発明において使用されるポリアミン代謝関連酵素遺伝子の好ましい例として、スペルミジン合成酵素遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子を挙げることができる。具体的には、
・配列番号１に示される塩基配列中塩基番号７７〜１０６０で示される塩基配列を有するＤＮＡ
・配列番号３に示される塩基配列中塩基番号４５６〜１５４７で示される塩基配列を有するＤＮＡ、及び
・配列番号５に示される塩基配列中塩基番号５４１〜２６６１で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
が挙げられる。さらに、
・該上記いずれかの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有し、且つ該配列と同等のポリアミン代謝関連酵素活性を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡ、及び
・該上記いずれかの配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つ該配列と同等のポリアミン代謝関連酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
が挙げられる。

ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、特定ポリアミン代謝関連酵素遺伝子配列にコードされるポリアミン代謝関連酵素と同等のポリアミン代謝関連酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列のみが該特定配列とハイブリット（いわゆる特異的ハイブリット）を形成し、同等の活性を有しないポリペプチドをコードする塩基配列は該特定配列とハイブリット（いわゆる非特異的ハイブリット）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０，２Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。

一般的に生理活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において１個もしくは複数のアミノ酸が置換、削除、挿入または付加された場合であっても、その生理活性が維持される場合があることは当業者において広く認識されている。ここでいう「１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列」とは、このような修飾が加えられ、かつポリアミン代謝関連酵素をコードする遺伝子が例示され、このような遺伝子も本発明の範囲に含まれる。例えば、polyＡテールや５’、３’末端の非翻訳領域が「欠失」されてもよいし、アミノ酸を欠失するような範囲で塩基が「欠失」されてもよい。また、フレームシフトが起こらない範囲で塩基が「置換」されてもよい。また、アミノ酸が付加されるような範囲で塩基が「付加」されてもよい。但し、そのような修飾があっても、ポリアミン代謝関連酵素活性を有することが必要である。好ましくは、「１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された遺伝子」がよい。

このような改変されたＤＮＡは例えば、部位特異的変異法（Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, 6487-6500, 1982）等によって、特定の部位のアミノ酸が置換、削除、挿入、付加されるように本発明のＤＮＡの塩基配列を改変することによって得られる。

本発明における「アンチセンス遺伝子」とはポリアミン代謝関連酵素遺伝子の塩基配列に相補的な配列を有する遺伝子を意味する。アンチセンスＤＮＡは、例えば配列番号１、３、５の塩基配列に相補的なものであり、アンチセンスＲＮＡはそれらから産生されるものである。
内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子
該抑制因子は、該遺伝子の発現を抑制するものであれば特に制限されず、例えば該遺伝子及びその上流又は下流から選ばれる配列のアンチセンスＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＲＮＡｉが例示される。該アンチセンスＤＮＡは、該遺伝子のイントロンまたはエクソン、該遺伝子のプロモーターを含む５‘上流側の調節領域または終止コドンの下流側であって、遺伝子発現に影響する領域のいずれかに相補的であればよい。アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも３００塩基、特に少なくとも５００塩基を有する。該アンチセンスＤＮＡの転写産物は、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズするか、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子或いはその上流又は下流の配列の非コーディング領域（例えばプロモーター、イントロン、転写終結因子）にハイブリダイズする。ＲＮ
Ａｉは、標的遺伝子に対するセンス配列と、標的遺伝子に対するアンチセンス配列を有するＲＮＡから構成され、該センス配列とアンチセンス配列は２本のＲＮＡに各々含まれて２本鎖ＲＮＡとして機能してもよく、１本のＲＮＡに含まれて２重鎖部分とそれらをつなぐループ配列を有する１つのＲＮＡ分子として機能してもよい。

器官形成が改良された植物及びその子孫
本発明において、「器官」としては、上述のごとく、植物のあらゆる器官（組織）で、例えば、茎、塊茎、葉、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維、胚珠などを包含し、該器官（組織）の形成に関わる形質として数量、生育期間、形、着色、性質、特性が例示される。

本発明において、「器官形成が改良された植物」および「改良された器官形成を有する植物」とは、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子を導入することによって、導入前に比して器官形成に関わる形質である、数量、生育期間、形、着色、性質、特性が付与若しくは向上若しくは抑制した植物をいう。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または該抑制因子を植物に導入することにより、茎、葉、花、子房、種子の形成に関わる形質が、該外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または該抑制因子を有していない植物に比べて向上した植物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

具体的には、ポリアミン量を調節する核酸配列により「茎の数が改良された植物」とは、植物の茎（主茎、側茎、花茎、幹、枝などを含む）の数が増加した植物、該抑制因子により植物の茎（主茎、側茎、花茎、幹、枝などを含む）の数が減少ないし縮小した植物である。
「葉の数が改良された植物」とは、植物の葉の数が増加又は減少若しくは縮小した植物である。
「花の数または花の開花期が改良された植物」とは、植物の花の数が増加又は減少若しくは縮小した植物、または植物の花の開花時期が早まりまたは開花期間が増大した植物である。「子房の数または子房の発達期間が改良された植物」とは、植物の子房、果実、さや、さく果の数が増加又は減少若しくは縮小した植物、または子房、果実、さや、さく果の着果から成熟までの生育または発達の期間が増大又は減少若しくは縮小した植物である。「種子の数が改良された植物」とは、植物の種子（胚珠などを含む）の数が増加又は減少若しくは縮小した植物である。

これによって植物（器官・組織など）の品質、生産性、収量の向上、商品性の向上などが期待できる。また、野菜、果物等の可食性植物では、食用部分（葉、果実、塊茎、根茎など）のポリアミン量を減らすことで品質などの特性に好影響を与える可能性がある。従って、これらの食用部分では抑制因子を発現させ、その他の部分ではポリアミン関連酵素遺伝子を発現させて品質を向上しつつ収量の向上を図ることも可能である。

さらに、器官形成の改良で植物の形や形態が変化することで種々の環境ストレスに対する適応性（抵抗性）の向上も期待できる。特に、葉の数及びクロロフィルの増加による葉の緑色の増大、根（根茎、塊茎を含む）の伸長、茎の数及び太さの増大は、植物の環境適応性を増大させると考えられる。

さらに、本発明の好ましい実施形態の１つにおいて、植物は栄養生長期における外観上の相違は小さいが（葉が濃緑色になる）、生殖生長期において葉、花、茎等の器官の改良がより著しく認められ、これは植物の潜在能力（ポテンシャル）を向上させたものと理解される。

本発明の植物には、植物体全体（全樹）に限らず、そのカルス、種子、あらゆる植物組織、葉、茎、塊茎、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、胚珠、繊維などが含まれる。更にその子孫も本発明の植物に含まれる。

本発明において「植物及びその子孫から得られる有用物質」とは、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入することによって、導入前に比して器官形成が向上した植物およびその子孫で生産された有用物質をさし、有用物質としては例えば、アミノ酸、油脂、デンプン、タンパク質、フェノール、炭化水素、セルロース、天然ゴム、色素、酵素、抗体、ワクチン、医薬品、生分解性プラスチックなどが含まれる。

本発明の植物は、該外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を有していない植物に、遺伝子工学的手法により外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が導入され、且つ安定に保持されたものである。ここで「安定に保持される」とは、少なくともポリアミン代謝関連酵素遺伝子が導入された当代の植物体で該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が発現し、それによって器官形成が改良するのに十分な期間、該植物細胞内に保持されることをいう。従って、現実的には、該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は宿主植物の染色体上に組み込まれるのが好ましい。該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は次世代に安定に遺伝することがより好ましい。

また、ここで「外因性」とは、植物が生来有しておらず、外部より導入されたものを意味する。従って、本発明の「外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子」は、遺伝子操作により外部より導入される、宿主植物と同種の（すなわち、該宿主植物由来の）ポリアミン代謝関連酵素遺伝子であってもよい。コドン使用（codon usage）の同一性を考慮すれば、
宿主由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子の使用もまた好ましい。

外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子はいかなる遺伝子工学的手法によって植物に導入されてもよく、例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を有する異種植物細胞とのプロトプラスト融合、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を発現するように遺伝子操作されたウイルスゲノムを有する植物ウイルスによる感染、あるいはポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含有する発現ベクターによる宿主植物細胞の形質転換が挙げられる。

好ましくは、本発明の植物は、植物中で機能し得るプロモーターの制御下にある外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含む発現ベクターで、該外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を有していない植物の細胞を形質転換することにより得られる、トランスジェニック植物である。

植物中で機能し得るプロモーターとしては、例えば、植物細胞で構成的に発現するカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子（ＯＣＳ）プロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子プロモーター等を挙げることができる。さらにこれらに限定されない公知の植物プロモーターも挙げられる。

３５Ｓプロモーターのような器官全体に恒常的に発現させるプロモーターだけでなく、器官または組織特異的プロモーターを用いれば、特定の器官、又は組織だけに目的遺伝子を発現させることができ、特定の器官又は組織だけ器官形成を改良することができる。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と花器に特異的に働くプロモーター（例えば、WO99/43818、特開平11-178572、特開2000-316582）を用いることによって、花の器官のみで花の数や花の開花期を改良することができる。さらに、果実、子房に特異的に働くプロモーター（例えば、Plant Mol. Biol., 11, 651-662, 1988）を用いることによって、子房、
果実の生育や発達期間を改良することができる。

時期特異的なプロモーターを用いれば、特定の時期だけに目的遺伝子を発現させることができ、特定の時期だけに器官形成を改良することができる。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と栄養生長期に働くプロモーターを用いることによって、栄養生長期のみで器官形成を改良することができる。

低温、高温、塩、乾燥、光、熱、ホルモンあるいは傷害等の調節性のプロモーターを用いれば、生活環境に応じて目的遺伝子を発現させることができる。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と植物が低温に遭遇した時だけ転写を起こさせ得るプロモーター（例えば、BN115プロモーター：Plant Physiol.,106, 917-928, 1999）を用いることによって、低温時のみ植物体のポリアミン代謝を制御し器官形成を改良することができる。さらに、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と植物が乾燥に遭遇した時だけ転写を起こさせ得るプロモーター（例えば、Atmyb2プロモーター：The Plant Cell, 5, 1529-1539, 1993）を用いることによって、乾燥時のみ植物体のポリアミン代謝を制御し器官形成を改良することができる。

本発明の発現ベクターにおいて、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は、植物中で機能し得るプロモーターによりその転写が制御されるように、該プロモーターの下流に配置される。該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の下流には、植物で機能し得る転写終結シグナル（ターミネーター領域）がさらに付加されていることが好ましい。例えば、ターミネーターＮＯＳ（ノパリン合成酵素）遺伝子等が挙げられる。

本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列等のシス調節エレメントをさらに含んでもよい。また、該発現ベクターは、薬剤耐性遺伝子マーカーなどの形質転換体選抜のためのマーカー遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（ＮＰＴII）遺伝子、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子等をさらに含んでもよい。選択圧をかけない条件では、組み込まれた遺伝子が脱落する現象が起こる場合があるので、除草剤耐性遺伝子をベクター上で共存させておけば、栽培中該除草剤を使用することにより、常に選択圧がかかった条件を実現できるという利点もある。

さらに、大量調製および精製を容易にするために、該発現ベクターは、大腸菌での自律複製を可能にする複製起点および大腸菌での選択マーカー遺伝子（例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等）を含むことが望ましい。本発明の発現ベクターは、簡便には、ｐＵＣ系またはｐＢＲ系の大腸菌ベクターのクローニング部位に上記ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現カセットと必要に応じて選択マーカー遺伝子を挿入することにより構築することができる。

アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）やアグロバク
テリウム・リゾゲネス（Agrobacteriumu rhizogenes）による感染を利用して外因性ポリ
アミン代謝関連酵素遺伝子を導入する場合には、該細菌が保持するＴｉまたはＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域（植物染色体に転移する領域）内に該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子発現カセットを挿入して用いることができる。現在、アグロバクテリウム法による形質転換の標準的な方法ではバイナリーベクター系が使用される。Ｔ−ＤＮＡ転移に必要な機能は、Ｔ−ＤＮＡ自身とＴｉ（またはＲｉ）プラスミドの両者から独立に供給され、それぞれの構成要素は別々のベクター上に分割できる。バイナリープラスミドはＴ−ＤＮＡの切り出しと組込みに必要な両端の２５ｂｐボーダー配列を有し、クラウンゴール（または毛状根）を引き起こす植物ホルモン遺伝子が除去されており、同時に外来遺伝子の挿入余地を与えている。このようなバイナリーベクターとして、例えばｐＢＩ１０１やｐＢＩ
１２１（ともにCLONTECH社）などが市販されている。なお、Ｔ−ＤＮＡの組込みに作用するVir領域は、ヘルパープラスミドと呼ばれる別のＴｉ（またはＲｉ）プラスミド上にあ
ってトランスに作用する。

植物の形質転換には、従来公知の種々の方法を使用することができる。例えば、セルラーゼやヘミセルラーゼなどの細胞壁分解酵素処理により、植物の細胞からプロトプラストを単離し、該プロトプラストと上記ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現カセットを含む発現ベクターとの懸濁液にポリエチレングリコールを加えてエンドサイトーシス様の過程で該発現ベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（ＰＥＧ法）、ホスファチジルコリン等の脂質膜小胞内に超音波処理等により発現ベクターを入れ、該小胞とプロトプラストをＰＥＧ存在下に融合させる方法（リポソーム法）、ミニセルを用いて同様の過程で融合させる方法、プロトプラストと発現ベクターの懸濁液に電気パルスを印加して外液中のベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（エレクトロポレーション法）が挙げられる。しかしながら、これらの方法は、プロトプラストから植物体へ再分化させる培養技術を必要とする点で煩雑である。細胞壁を有するインタクトな細胞への遺伝子導入手段としては、マイクロピペットを細胞に刺し込み、油圧やガス圧でピペット内のベクターＤＮＡを細胞内に注入するマイクロインジェクション法、およびＤＮＡをコーティングした微小金粒子を火薬の爆発やガス圧を利用して加速し、細胞内に導入するパーティクルガン法等の直接導入法と、アグロバクテリウムによる感染を利用した方法とがある。マイクロインジェクションは操作に熟練を要し、また、扱える細胞数が少ないという欠点がある。従って、操作の簡便性を考慮すれば、アグロバクテリウム法および、パーティクルガン法により植物を形質転換することが好ましい。パーティクルガン法は、栽培中の植物の頂端分裂組織に直接遺伝子を導入することが可能である点さらに有用である。また、アグロバクテリウム法において、バイナリーベクターに植物ウイルス、例えばトマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）等のジェミニウイルスのゲノムＤＮＡをボーダー配列の間に同時に挿入することにより、栽培中の植物の任意の部位の細胞に注射筒などを用いて菌懸濁液を接種するだけで、植物体全体にウイルス感染が拡がり、同時に目的遺伝子も植物体全体に導入される。

以下に、具体例として、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の取得方法とアグロバクテリウムによる目的遺伝子の導入および形質転換植物の作出方法を例示するが、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子に関しても以下の記載を参考にして当業者は容易に植物に導入し、形質転換植物を作出することが可能である。
１．ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の取得
（１）ＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーの作製
昼１８℃／夜１４℃・３日間の低温処理を行ったクロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche）の根組織から常法に従い、ｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡを抽出する。単離したｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡから市販のＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）等を用いてＰＣＲ用に使用するｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。単離したｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡを鋳型として、３’末端に２つのｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎを持つ修飾ｌｏｃｋ−ｄｏｃｋｉｎｇ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を用いてｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成し、ポリメラーゼ反応によって２本鎖化したｃＤＮＡを得る。該２本鎖ｃＤＮＡをＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼにより末端を平滑化し、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡアダプターをライゲーション反応により結合させ、アダプター結合二本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作製する。
（２）ＰＣＲプライマーの設計
ポリアミン代謝関連酵素遺伝子としてＳＰＤＳ遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子、ＯＤＣ遺伝子を単離することができる。ＳＰＤＳ遺伝子はシロイヌナズナやヒヨス、ＳＡＭＤＣ遺伝子はジャガイモ、ホウレンソウ、タバコ、ＡＤＣ遺伝子はダイズ、エンド
ウ、トマト、ＯＤＣ遺伝子はチョウセンアサガオ（Datura）等から単離されており、既に塩基配列が決定している。従って、決定している既知の塩基配列を比較し、非常に保存されている領域を選抜し、ＤＮＡオリゴマーを合成しＰＣＲ用プライマーを設計することができる。
(３）ＰＣＲによるＳＰＤＳ遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子断片の取得
上記（１）の方法で作製したＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、上記（２）の方法で設計したプライマーを使用して、それぞれＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動で分離し、グラスミルク法などで精製する。精製したＰＣＲ産物はＴＡベクターなどのクローニングベクターに連結させる。

クローン化されたｃＤＮＡの塩基配列の決定は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法あるいはダイデオキシ法等により決定できる。いずれの方法も市販されているキットを用いて行うことができ、配列決定を自動的に行うオートシーケンサーを使用してもよい。
（４）完全長遺伝子の単離
完全長の遺伝子を得るためには、常法に従って、プラークハイブリダイゼーション、ＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA ends）法やＭａｒａｔｈｏｎ ＲＡＣＥ法等により完全長の遺伝子を得ることができる。

このようにして取得した遺伝子は、ポリアミン生合成に関与する遺伝子であり、この遺伝子を利用して巧妙に、即ち、遺伝子発現を分子生物学的に制御することにより、ポリアミンレベルの制御が可能となり、種々の器官形成が改良された植物の作出も可能になる。２．シロイヌナズナにおけるアグロバクテリウムによる目的遺伝子の導入、および形質転換植物の作出。

上記１．で取得した遺伝子を植物宿主に導入することにより、種々の器官形成、特に茎、葉、花、子房、果実、さや、種子などの器官形成が改良された特性を有するトランスジェニック植物を作出することができる。
（１）発現コンストラクトの作製および、アグロバクテリウムの形質転換
発現コンストラクトの作製は前記１．で得られたポリアミン代謝関連酵素遺伝子をオープンリーディングフレームをすべて含むような適当な制限酵素で切断後、必要に応じて適当なリンカーを連結し、植物形質転換用ベクターに挿入して作製することができる。植物形質転換用ベクターとしては、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１などを用いることができる。

作製した発現コンストラクトを大腸菌中で増幅後、発現コンストラクトをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１等に、三者接合法（Nucleic Acid Research, 12, 8711, 1984）、凍結融解法、エレクトロポレーション法等に
より形質転換することができる。例えば、三者接合法は目的遺伝子を含んだ発現コンストラクトを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド（例えばｐＲＫ２０１３等）を保有する大腸菌、およびアグロバクテリウムを混合培養して、抗生物質（例えばリファピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン等）を含んだ培地上で培養することによって形質転換アグロバクテリウムを得ることができる。
（２）トランスジェニック植物の作出
本発明において、遺伝子導入を行う植物としては、植物体全体、植物器官（例えば葉、茎、根、花器、生長点、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）、植物培養細胞などを挙げることができる。

（１）で作製した形質転換アグロバクテリウムを例えばカルス再生法（Plant Cell Reports, 12, 7-11, 1992）で植物に感染させて目的遺伝子を導入することができる。すなわち、シロイヌナズナの種子を常法に従って、ＭＳＯプレート（ムラシゲ・スクーグ無機塩類４．６ｇ、ショ糖１０ｇ、１０００×ビタミンストック液１ｍｌ／リットル、ｐＨ６．
２）に播種し、無菌的に栽培する。発根した根の切片を用いてＣＩＭプレート（ＭＳＯプレートに２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を終濃度０．５μｇ／ｍｌ、カイネチンを０．０５μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）上でカルス培養を行う。プロモーターに目的遺伝子を接続し、カナマイシン及びハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドにより形質転換したアグロバクテリウムを培養し、希釈したものをチューブに分注し、カルス化した根の切片を浸し、数日間ＣＩＭプレート上で共存培養する。菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖したら、除菌操作を行い、ＳＩＭＣプレート（ＭＳＯプレートに、N6-[2-イソペンテニル] アデニンを終濃度５μｇ／ｍｌ、インドール酢酸（ＩＡＡ）を終濃度０．１５μｇ／ｍｌ、クラフォランを終濃度５００μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）上で数日間培養を行う。これらの切片を最終的にＳＩＭＣＳプレート（カナマイシンおよびハイグロマイシンＢを含有するプレート）上で培養し、１週間ごとに新しいプレートに移植を繰り返す。形質転換した切片は増殖を続け、カルスが現れてくる。抗生物質で選択しているため、非形質転換切片は褐変する。形質転換体が５ｍｍ程度の大きさになり、ロゼット葉を形成するまで培養する。完全なロゼットの形状を示すようになったら、形質転換体の根元をカルス部分を含まないようにメスで切り取り、ＲＩＭプレート（ＭＳＯプレートにＩＡＡを終濃度０．５μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）に移植する。大きなカルスが付いていると、発根してもカルスを介して根が出ていて、ロゼットとは維管束がつながっていないことが多い。約８〜１０日後、無機塩類培地〔５ｍＭ ＫＮＯ₃、２．５ｍ
Ｍ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ₄ 、２ｍＭ Ｃａ（ＮＯ₃ ）₂
、５０μＭ Ｆｅ−ＥＤＴＡ、１０００×微量要素（７０ｍＭ Ｈ₃ ＢＯ₃ 、１４ｍＭ ＭｎＣｌ₂、０．５ｍＭ ＣｕＳＯ₄ 、１ｍＭ ＺｎＳＯ₄ 、０．２ｍＭ ＮａＭｏＯ₄
、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ ＣｏＣｌ₂）１ｍｌ／リットル〕に浸したロック
ウール上に定植する。開花し、さやを形成した植物体は無機塩類培地に浸した土に移植し、種子を得ることができる。この種子を滅菌処理し、ＭＳＨ（ＭＳＯプレートのハイグロマイシンＢを終濃度５Ｕ／ｍｌとなるように加えたもの）に播種して発芽させることにより形質転換体を得ることができる。

さらに、（１）で作製した形質転換アグロバクテリウムを例えば減圧浸潤法（The Plant Journal, 19(3), 249-257, 1999）で植物に感染させて目的遺伝子を導入することがで
きる。すなわち、シロイヌナズナの種子を常法に従って培養土（例えばメトロミックス等）に播種して、２２℃、長日条件下（例えば１６時間日長・８時間暗黒等）で栽培する。約３〜４週間後に伸長した主軸（花茎）を切除して、側枝の誘導を開始させる。摘心約１週間をに培養した形質転換アグロバクテリウム懸濁液にシロイヌナズナを浸し、これをデシケーターに入れてバキュームポンプで約−０．０５３Ｍｐａ（４００ｍｍＨｇ）になるまで吸引後、１０分間、室温放置する。感染後の鉢を深底トレイに移して、横倒しに置き、トレイの底に少量の水を滴下して透明な覆いを被せ多湿条件下で約１日放置する。感染後の鉢を起こして、２２℃・長日条件下で栽培を開始して、種子の収穫を行う。

約２〜４週間の間、種子の収穫を行い、収穫した種子は茶こしなどで莢やゴミを取り除き、デシケーター内で乾燥保存する。

トランスジェニック植物体の選択は、収穫した種子を常法に従って殺菌処理して、約９ｍｌの０．１％寒天水溶液に懸濁して、選択培地（例えば、１×ＭＳ塩、１×ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン、１％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｇ／ｌ ＭＥＳ、０．８％ 寒天、１００ｍｇ／ｌ カルベニシリン、５０ｍｇ／ｌ カナマイシン、４０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシンなど）に広げ、２２℃で無菌栽培する。抗生物質に対して抵抗性を示すトランスジェニック植物体は順調に生長して、約１〜２週間で同定することができる。本葉が約４〜６枚展開したトランスジェニック植物体を培養土を含んだ鉢に移植して２２℃で長日栽培を開始する。

得られたトランスジェニック植物より、常法に従ってＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子をプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、遺伝子導入の有無を確認することができる。

また、トランスジェニック植物や、非トランスジェニック植物より、常法に従ってＲＮＡを抽出し、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子のセンス配列、もしくはアンチセンス配列を有するプローブを作製し、これらのプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行い、目的遺伝子の発現の状態を調べることができる。

また、得られたトランスジェニック植物からカルス誘導を行い、カルスを作出することができる。

減圧浸潤法で得られたトランスジェニック植物（Ｔ１）の、自家受粉により得られるＴ２種子の形質転換出現比率は、通常メンデルの法則に従う。例えば、該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が一遺伝子座にヘテロ（heterozygous）に組み込まれた場合、Ｔ２種子では形質転換体は３：１の割合で分離する。Ｔ２種子を栽培して、自家受粉させて得られるＴ３種子において、形質転換体がすべての種子で出現すれば、該Ｔ２形質転換植物はホモ接合体（homozygote）であり、該形質転換植物が３：１に分離すれば、該Ｔ２形質転換植物は導入されたポリアミン代謝関連酵素遺伝子についてヘテロ（heterozygote）であると決定できる。

このようにして選抜された、導入されたポリアミン代謝関連酵素遺伝子についてホモ接合体である植物は、改良された器官形成が固定された系統として、種子産業の分野において極めて有用である。

上記に示した、サザン解析やノーザン解析でポリアミン代謝関連酵素遺伝子の遺伝子発現解析を行ったトランスジェニック植物はポリアミン含量や種々の器官形成の評価を行うことができる。

例えば、ポリアミンの定量は、０．０５〜１ｇの試料をサンプリングして、５％過塩素酸水溶液を加えて、ポリアミンを抽出する。抽出したポリアミンの定量はダンシル化またはベンゾイル化等で蛍光標識した後、ＵＶまたは蛍光検出器を接続した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて内部標準法で分析することができる。

例えば、種々の器官形成の評価は、茎形成の評価は、トランスジェニック植物の自家受粉で得られたＴ２種子又はＴ３種子を適当な生育培地又は生育土壌に播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時間日長）、２０〜２５℃で生育させて茎（例えば主花茎、側花茎、枝など）の数や形等を調べることにより評価することができる。葉形成の評価は、トランスジェニック植物の自家受粉で得られたＴ２種子又はＴ３種子を適当な生育培地又は生育土壌に播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時間日長）、２０〜２５℃で生育させて葉（例えばロゼット葉、本葉など）の数や形等を調べることにより評価することができる。花形成の評価は、トランスジェニック植物の自家受粉で得られたＴ２種子又はＴ３種子を適当な生育培地又は生育土壌に播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時間日長）、２０〜２５℃で生育させて花の数や開花時期、開花期間および形、色等を調べることにより評価することができる。子房形成の評価は、トランスジェニック植物の自家受粉で得られたＴ２種子又はＴ３種子を適当な生育培地又は生育土壌に播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時間日長）、２０〜２５℃で生育させて子房（例えばさや、果実など）の数、形、色や着果から成熟までの発達期間等を調べることにより評価することができる。種子形成の評価は、トランスジェニック植物の自家受粉で得られたＴ２種子又はＴ３種子を適当な生育培地又は生育土壌に播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時
間日長）、２０〜２５℃で生育させて種子の数や形、収穫後に発芽率等を調べることにより評価することができる。

本発明の形質転換される植物は、特に限定されるものではないが、双子葉植物、単子葉植物、草本性植物、木本性植物などが挙げられる。例えば、サツマイモ、トマト、キュウリ、カボチャ、メロン、スイカ、タバコ、シロイヌナズナ、ピーマン、ナス、マメ、サトイモ、ホウレンソウ、ニンジン、イチゴ、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、ダイズ、ナタネ、ソルガム、ユーカリ、ポプラ、ケナフ、杜仲、サトウキビ、アカザ、ユリ、ラン、カーネーション、バラ、ペチュニア、トレニア、キンギョソウ、シクラメン、カスミソウ、ゼラニウム、ヒマワリ、シバ、ワタ、マツタケ、シイタケ、キノコ、チョウセンニンジン、柑橘類、バナナ、キウイ、キャッサバ、サゴヤシ等が挙げられる。好ましくは、サツマイモ、ジャガイモ、トマト、キュウリ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、ペチュニア、トレニア、ユーカリ、ワタである。

以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１：植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子のクローニング
（１）ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡの調製
クロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche）をバーミキュライトに播種し、子葉展開時に市販の床土（サンサン床土；タキイ種苗社製）を詰めた鉢に移植した。鉢上げしたクロダネカボチャを植物栽培用のインキュベーター（気温 昼２６℃／夜２２℃、１３時間日長）内に置いた。第２本葉展開時にインキュベーター内の温度を昼１８℃／夜１４℃まで下げ低温処理を開始した。低温処理３日後に、根、茎、葉に分けてサンプリングした。ＲＮＡ抽出まで−８０℃のフリーザーに保存した。

約４gのクロダネカボチャの根組織を直ちに液体窒素中で凍結し、液体窒素存在下乳鉢
で細かく粉砕した。その後、10 mlの抽出用0.2Mトリス酢酸緩衝液〔5M guanidine thiocyanate、0.7%β-mercaptoethanol、1%polyvinylpyrrolidone（M.W.360,000）、0.62%N-Lauroylsarcosine Sodium Salt、pH8.5）を加えポリトロンホモジナイザー（KINEMATICA社製）を用い氷冷下2分間粉砕した。ただし、β−メルカプトエタノールとポリビニルピロリ
ドンは使用する直前に添加した。その後、粉砕液を17,000×gで20分間遠心分離し、上清
を回収した。

この上清をミラクロスに濾過し、その濾液を超遠心分離管に入れた5.7M塩化セシウム溶液1.5 mlに静かに重層し、155,000×g、20℃で20時間遠心した後、上清を捨てRNAの沈殿
を回収した。この沈殿を3mlの10mM Tris-HCl、1mM EDTA・2Na、pH8.0（ＴＥ緩衝液と呼ぶ）に溶解し、さらに等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（容積比、25:24:1）を加え良く混合した後、遠心分離を行って上層の水層を回収した。得られた水
層に、1/10倍量の3M 酢酸ナトリウム（氷酢酸でpH6.2に調製）と、2.5倍量のエタノール
を添加して良く混合し、-20℃で一晩静置した。その後、17,000×gで20分間遠心分離し、得られた沈殿を70%エタノールで洗浄して減圧乾燥した。

この乾燥標品を500μlの前述のTE緩衝液に溶解し、全ＲＮＡ溶液を得た。このＲＮＡ溶液を65℃で5分間インキュベートした後、氷上で急冷した。これに2×結合緩衝液（10mM Tris-HCl、5mM EDTA・2Na、1M NaCl、0.5% SDS、pH7.5）を等量になるようにＲＮＡ溶液に加え、平衡化緩衝液（10mM Tris-HCl、5mM EDTA・2Na、0.5M NaCl、0.5% SDS、pH7.5）で予め平衡化したオリゴｄＴセルロースカラム（Clontech社製）に重層した。次いで、カラムを約１０倍量の前述の平衡化緩衝液で洗浄した後、溶出緩衝液（10mM Tris-HCl、5mM EDTA・2Na、pH7.5）でpoly(A)^＋RNAを溶出した。

得られた溶出液に1/10倍量の前述の3M 酢酸ナトリウム水溶液と、2.5倍量のエタノールを加え混合し、-70℃で静置した。その後、10,000×gで遠心分離を行ない、得られた沈殿を70%エタノールで洗浄して減圧乾燥した。この乾燥標品を再度500μlのTE緩衝液に溶解
し、オリゴｄＴセルロースカラム精製を繰り返し行った。得られた低温処理したクロダネカボチャの根由来のpoly(A)^＋RNAはＰＣＲ用のｃＤＮＡライブラリーと完全長遺伝子単離用のｃＤＮＡライブラリーの作製に用いた。
（２）ＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーの作製
cDNAライブラリーの作製はMarathon cDNA Amplification Kit（Clontech社製）を使用
した。（１）で得られたクロダネカボチャの根由来のpoly(A)^＋RNAを鋳型として３’末端に２つのdegenerate nucleotide position を持つ修飾lock-docking オリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を用い、GublerとHoffmanらの方法（Gene, 25, 263-269 (1983)）に
従い２本鎖cDNAを合成した。

得られたcDNAの両末端にMarathon cDNAアダプター（T4 DNA ligaseによりds cDNAの両
末端へ結合しやすくなるように５’末端をリン酸化したもの）を連結した。得られたアダプター結合のｃＤＮＡをクロダネカボチャ根由来のＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーとした。
（３）ＰＣＲ用プライマーの設計
既に植物や哺乳類から単離されているアルギニン脱炭酸酵素遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、スペルミジン合成酵素遺伝子の決定されている塩基配列を比較した。そして、非常に相同性が高く保存されている領域を選び出し、ＤＮＡオリゴマーを合成した（配列プライマーＩ〜VI）。
ＳＰＤＳプライマーＩ（配列番号７）：5’-GTTTTGGATGGAGTGATTCA-3’
ＳＰＤＳプライマーII（配列番号８）：5’-GTGAATCTCAGCGTTGTA-3’
ＳＡＭＤＣプライマーIII（配列番号９）：5’-TATGTGCTGTCTGAGTCGAGC-3’
ＳＡＭＤＣプライマーIV（配列番号１０）：5’-GCTAAACCCATCTTCAGGGGT-3’
ADCプライマーV(配列番号１１)：5’-GGGCT(T/G)GGA(G/A)T(G/C)GACTA(C/T)-3’
ADCプライマーVI（配列番号12）:
5’-(T/C)CC(A/G)TC(A/G)CTGTC(G/A)CA(G/C)GT-3’
（４）ＰＣＲによる増幅
（２）で得られたＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、（３）で設計した配列プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲのステップは最初、９４℃、３０秒、４５℃、１分間、７２℃、２分間で５サイクル、続いて９４℃、３０秒、５５℃、１分間、７２℃、２分間で３０サイクル行った。
（５）アガロースゲル電気泳動
ＰＣＲ増幅産物を１．５％アガロース電気泳動を行い、泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色し、ＵＶトランスイルミネーター上で増幅バンドを検出した。
（６）ＰＣＲ産物の確認と回収
検出された増幅バンドを確認し、カミソリの刃を用いてアガロースゲルから切り出した。切り出したゲルを１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、ＱＩＡＥＸII Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN社製）を用いてゲルからＤＮＡ断片の単離精製を行った。回収したＤＮＡ断片をｐＧＥＭＴクローニングベクター（Promega社製）にサブクロ
ーニングし、大腸菌に形質転換後、常法に従ってプラスミドＤＮＡを調製した。
（７）塩基配列決定
得られたプラスミドの挿入配列の塩基配列決定をダイデオキシ法（Messing, Methods in Enzymol., 101, 20-78, 1983）により行った。ＳＰＤＳ遺伝子については３種類の遺
伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子については１種類の遺伝子、ＡＤＣ遺伝子については２種類の遺伝子が単離された。
（８）ホモロジー検索
これらの遺伝子の塩基配列を既知遺伝子塩基配列のデータベースとホモロジーサーチを行うとＳＰＤＳ遺伝子は既知の植物由来のＳＰＤＳ遺伝子と７０％の相同性を示した。ＳＡＭＤＣ遺伝子については既知の植物由来のＳＡＭＤＣ遺伝子と７０％以上の相同性を示した。ＡＤＣ遺伝子については既知の植物由来のＡＤＣ遺伝子と６７％以上の相同性を示した。
（９）完全長遺伝子の取得
完全長遺伝子はプラークハイブリダイゼーション法で取得した。cDNAライブラリーの作製はZAP-cDNA Synthesis Kit（Stratagene社製）を使用した。（１）で得られたクロダネカボチャ根由来のpoly(A)^＋RNAを鋳型としてオリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を用い、GublerとHoffmanらの方法（Gene, 25, 263-269 (1983)）に従い２本鎖cDNAを合成し
た。

得られたcDNAの両末端にEcoRIアダプター（内部にXho IとSpe Iサイトを持つ）を連結
し、Xho Iで消化した後、それをλファージベクター、λZAP IIアームのEcoRIとXho I部
位に連結後、インビトロパッケージングキット（Stratagene社製、GIGAPACK Gold）を用
い、パッケージングを行ない、大腸菌SURE株（OD660=0.5）に感染させることにより多数
の組換えλファージを得た。これをクロダネカボチャ根由来のcDNAライブラリーとした。このライブラリーのサイズは8.0×10^６であった。

プローブの作製は（６）で調製したＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ遺伝子のプラスミドＤＮＡからインサートｃＤＮＡを単離・調製し、得られたcDNAを鋳型として、Random Primed DNA Labeling Kit（USB社製）を用いて、^３２P標識プローブを作製した。得られた^３２P標識cDNAをプローブに用いた。

前記、クロダネカボチャ根由来のcDNAライブラリーを構成するファージを大腸菌に感染させてLB寒天培地上で増殖させ、約50,000個のファージDNAをナイロンメンブレン（ハイ
ボンド−N、アマシャム社製）に写し取った。

ファージDNAを写し取ったナイロンメンブレンをアルカリ変性液（0.5M NaOH、1.5M NaCl）を含んだ濾紙上に移し、4分間放置し、次に中和液（0.5M Tris-HCl、1.5M NaCl、pH8.0）を含んだ濾紙上に移し５分間放置した。2×SSC（0.3M NaCl、0.03Ｍ クエン酸三ナト
リウム）で洗浄した後、メンブレンをストラタリンカー（Stratagene社製）を用いDNAの
固定を行なった。固定処理を行なったナイロンメンブレンをハイブリダイゼーション溶液（50%ホルムアミド、0.5%SDS、6×SSPE（3M NaCl、0.2M NaH₂PO₄、20mMEDTA・2Na、pH7.4）、5×デンハルト溶液（0.1% Ficoll、0.1% Polyvinylpyrrolidone、0.1% bovine serum
albumin）、50μg/ml変性サケ精子DNAを含有中において、42℃で3時間プレハイブリさせ、作製したcDNAプローブを加え42℃で18時間ハイブリダイズさせた。その後、メンブレンを取り出し、2×SSC、1×SSC、0.5×SSCおよび0.1×SSCを含有する溶液を用いて、42℃で1時間〜2時間洗浄した。このメンブレンを乾燥した後、Ｘ線フィルムを密着させて一晩感光させた。

その結果、ＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ遺伝子断片から得たプローブでハイブリダイズした陽性クローンを選抜することができた。

陽性クローンのファージDNAそれぞれから、インビボ・エクシジョン法によりcDNAイン
サートを持つプラスミドクローンを調製した。インビボ・エクシジョン法は、ZAP-cDNA Synthesis Kit（stratagene社製）の方法に従った。

ＳＰＤＳ遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子を含む各ファージ液200μl、大腸菌XL1-Blue懸濁液200μl、ヘルパーファージR408懸濁液１μlを混ぜ37℃で15分間インキュ
ベートした後、3mlの2×YT培地を加え37℃で2時間振盪培養し、70℃で20分間処理し、遠
心分離（4,000×g、10分間）して上清を回収した。得られた上清30μlと大腸菌SURE懸濁
液30μlを混ぜ、37℃で15分間インキュベートした後、アンピシリンを50ppm含むLB寒天培地に数μl植菌し、37℃で一晩培養した。コロニーを形成した大腸菌は、cDNAインサート
を持つプラスミドクローンを含んでいた。これらのプラスミドの挿入配列の塩基配列決定を、ダイデオキシ法（Messing, Methods in Enzymol., 101, 20-78, 1983）により行っ
た。その結果、開始コドンを含むプラスミドであることが明らかとなった。

得られた完全長のクロダネカボチャ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子をＦＳＰＤ１（配列番号１，２）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子をＦＳＡＭ２４（配列番号３，４）、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子をＦＡＤＣ７６（配列番号５，６）と命名した。

得られたＦＳＰＤ１と既知の植物由来のスペルミジン合成酵素遺伝子とアミノ酸比較を行った（表１）。表１の結果からクロダネカボチャ根由来のＦＳＰＤ１は他の植物由来のＳＰＤＳ遺伝子とアミノ酸レベルで高い相同性を示した。

得られたＦＳＡＭ２４と既知の植物由来のＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子とアミノ酸比較を行った（表２）。表２の結果からクロダネカボチャ根由来のＦＳＡＭ２４は他の植物由来のＳＡＭＤＣ遺伝子とアミノ酸レベルで高い相同性を示した。

得られたＦＡＤＣ７６と既知の植物由来のアルギニン脱炭酸酵素遺伝子とアミノ酸比較を行った（表３）。表３の結果からクロダネカボチャ根由来のＦＡＤＣ７６は他の植物由来のＡＤＣ遺伝子とアミノ酸レベルで高い相同性を示した。

実施例２：トランスジェニックシロイヌナズナの作製
（１）発現コンストラクトの作製
配列番号１に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＳＰＤ１の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＸｈｏＩで切断し、グラスミルク法で精製した。次にｐＧＥＭ−７Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＸｈｏＩ切断して、ＦＳＰＤ１断片をセンスとアンチセンス方向にそれぞれサブクローニングした。ｐＧＥＭ−７Ｚｆのマルチクローニングサイトの制限酵素ＸｂａＩとＫｐｎＩで再度ＦＳＰＤ１断片を切り出して、３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−と命名した。その発現コンストラクトの構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−と命名した。

配列番号３に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＳＡＭ２４の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＮｏｔＩで切断し、それぞれ平滑末端化した。これらの断片を平滑末端化した３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にセンス方向とアンチセンス方向にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−と命名した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−と命名した。

配列番号５に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＡＤＣ７６の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＮｏｔＩで切断し、それぞれ平滑末端化した。これらの断片を平滑末端化した３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にセンス方向とアンチセンス方向にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−と命名した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−と命名した。
（２）プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
（１）で得られた大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−とヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌ＨＢ１０１株を、それぞれ５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃で１晩、アグロバクテリウムＣ５８株を５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で２８℃で２晩培養した。各培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに取り集菌したのち、ＬＢ培地で洗浄した。これらの菌体を１ｍｌのＬＢ培地に懸濁後、３種の菌を１００μｌずつ混合し、ＬＢ培地寒天培地にまき、２８℃で培養してプラスミドをアグロバクテリウムに接合伝達（三者接合法）させた。１から２日後に一部を白金耳でかきとり、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、２０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、２５ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体をＣ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−、Ｃ５
８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−、Ｃ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−と命名した。トランスジェニックシロイヌナズナの作製は減圧浸潤法〔以下（３）〜（６）〕または、カルス再生法〔以下（７）〜（１２）〕で行った。
（３）シロイヌナズナの栽培
培養土メトロミックス（ハイポネックスジャパン社製）をプラスチック鉢に入れ、表面を網戸用のメッシュで覆い、メッシュの間にシロイヌナズナコロンビア株（以下「コロンビア株」又は「野生株」という）の種子（奈良先端科学技術大学院大学、河内孝之博士より提供）を２〜５粒づつ播種した。２日間・４℃の低温室にいれ発芽処理後、２２℃・長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）に移して栽培を行った。約４〜６週間後に主軸花茎が５〜１０ｃｍ伸長した植物体について、摘心して側枝の誘導を行った。摘心約１〜２週間後にアグロバクテリウム感染処理を行った。
（４）アグロバクテリウム懸濁液の調製
前記（２）で作製したアグロバクテリウムを感染２日前に、抗生物質（５０μｇ／ｍｌ
カナマイシン、２０μｇ／ｍｌ ハイグロマイシン）を含んだ１０ｍｌＬＢ培地に植菌して２８℃で２４時間振とう培養した。さらに、この培養液を分取して抗生物質（５０μｇ／ｍｌ カナマイシン、２０μｇ／ｍｌ ハイグロマイシン）を含んだ１０００ｍｌ ＬＢ培地に移して、さらに、２８℃、約２４時間振とう培養した（ＯＤ_６００が１．２〜１．５になるまで）。培養液を室温下で集菌して、ＯＤ_６００が０．８〜１になるように浸潤用懸濁培地（０．５×ＭＳ塩、０．５×ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン、１％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｇ／ｌ ＭＥＳ、０．４４μＭ ベンジルアミノプリン、０．０２％ Ｓｉｌｗｅｔ−７７）に再懸濁した。
（５）アグロバクテリウムの感染
前記（３）で作製したシロイヌナズナの鉢に前記（４）で調製したアグロバクテリウム懸濁液が培養土中に吸収されるのを抑えるために、鉢の培養土中に水を与えた。１０００ｍｌのビーカーに約２００〜３００ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液を分取し、シロイヌナズナの鉢を逆さにして、植物体を懸濁液に浸けた。鉢を入れたビーカーをデシケーター内に入れ、バキュームポンプで約−０．０５３ＭＰａ（４００ｍｍＨｇ）になるまで吸引後、約１０分間放置した。徐々に陰圧を解除した後、植物をアグロバクテリウム懸濁液から取り出して、キムタオルで余分なアグロバクテリウム懸濁液を取り除き、深底トレイに横倒しした。少量の水を入れて、サランラップを被せた。この状態で約１日放置した。サランラップを外して、鉢を起こして約１週間給水を停止した。その後、徐々に培養土に水を与え、約３〜５週間の間、成熟したさやから種子の収穫を行った。収穫した種子は、茶こしを用いて、さややゴミを取り除きデシケーター内に入れ十分に乾燥させた。
（６）形質転換植物の取得
前記（５）で取得した種子１００μｌ（約２０００粒）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移して、７０％エタノール中で２分間、５％次亜塩素酸ナトリウム溶液中に１５分間それぞれ浸して、最後に滅菌水で５回洗浄して種子の殺菌を行った。殺菌後の種子を１５ｍｌのファルコンチューブに移して、約９ｍｌの０．１％無菌寒天溶液を加えて、激しく混合した。種子０．１％寒天混合液をファージをプレートする要領で選択培地（１×ＭＳ塩、１×ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン、１％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｇ／ｌ ＭＥＳ、０．８％ 寒天、１００ｍｇ／ｌ カルベニシリン、５０ｍｇ／ｌ カナマイシン、４０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシン、８ｇ／ｌ Ｐｈｙｔａｇａｒ、ｐＨ５．７）に均一になるように広げた。クリーンベンチ内で約３０分乾燥後、４℃、２日間の低温処理後、２２℃のグロースチャンバーに移して、抗生物質に対して抵抗性を示す形質転換体を選抜した。本葉が３〜５枚した植物体を再度新しい選択培地に移して本葉が４〜６枚になるまで栽培した。抗生物質に対して抵抗性を示した形質転換植物（Ｔ１）を培養土を含んだ鉢に定植して、約５〜７日間多湿条件下で順化させた。順化後、２３℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培させた。得られた形質転換植物（Ｔ１）、および該形質転換植物から得られた種子（Ｔ２）から生育させたＴ２植物体についてＰＣＲまたはサザンハイブリダイゼーションによる導入遺伝子の解析とノーザンハイブリダイゼーションによ
る発現レベルの解析を行い、目的のポリアミン代謝関連酵素遺伝子が安定に組み込まれ、且つ発現している形質転換体を確認した。さらに、Ｔ２植物体からＴ３種子を収穫し、抗生物質に対する抵抗性試験（分離比検定）を行って形質転換出現比率からホモ接合体（Ｔ２）を取得した。Ｔ２種子とホモ接合体から取得したＴ３種子（Ｔ３ホモセルライン）を以下の実験に用いた。
（７）無菌シロイヌナズナの栽培
シロイヌナズナＷａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ株（以下ＷＳ株と称す）の種子（奈良先端科学技術大学院大学、新名惇彦博士より提供）数１０粒を１．５mlチューブに入れ、７０％エタノール１mlを加え３分間放置した。続いて滅菌液（５％次亜塩素酸ナトリウム、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に３分間浸し、滅菌水で５回洗浄した後に、ＭＳＯプレート（ムラシゲ−スクーグ無機塩類４．６ｇ、ショ糖１０ｇ、１０００×ビタミンストック液１ml／リットル、ｐＨ６．２）に置床した。このプレートを４℃に２日間放置して低温処理を行い、続いて植物インキュベーター（サンヨー製、ＭＬＲ−３５０ＨＴ）中に２２℃、光強度６０００ルクス、長日条件下（明期１６時間、暗期８時間）にて、２１日間培養した。感染効率を上げるために再度植物を無菌的に引き抜いて、新たなＭＳＯプレートの表面に根を広げ、さらに２日間培養を続けた。
（８）アグロバクテリウムの感染
前記で２１日間培養したＷＳ株の根を数株ずつそろえて、メスで１．５〜２．０ｃｍ程度に切りそろえ、ＣＩＭプレート（ＭＳＯプレートに２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を終濃度０．５μg／ml、カイネチンを０．０５μg／mlとなるように加えたもの）に置き並べた。光強度３０００ルクス、１６時間明期、８時間暗期で２日間培養した。前記（２）で作製したアグロバクテリウムを抗生物質（５０μｇ／ｍｌ カナマイシン、２０μｇ／ｍｌ ハイグロマイシン）を含んだ１０ｍｌＬＢ培地に植菌して２８℃で２４時間振とう培養し、アグロバクテリウムを、ＭＳ希釈液（ムラシゲ−スクーグ無機塩類６．４ｇ／ｌ、ｐＨ６．３）で３倍に希釈した。アグロバクテリウム希釈液をそれぞれ１mlずつチューブに分注し、この中にカルス化した根の切片を１０分間浸した。２枚重ねた滅菌ろ紙上に並べ、余分な水分を除き、新しいＣＩＭプレートに各々置き並べた。同条件にて２日間共存培養した。
（９）除菌
各々の菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖した切片を除菌液（ＭＳ希釈液にクラフォランを終濃度２００μg／mlになるように加えたもの）に移し、ゆっくり振盪させて６
０分間洗浄した。この操作を５回繰り返した後、滅菌ろ紙上で水分を取り除き、ＳＩＭＣプレート（ＭＳＯプレートに、２−ｉｐを終濃度５μg／ml、ＩＡＡを終濃度０．１５μg／ml、クラフォランを終濃度５００μg／mlとなるように加えたもの）に置き並べ、光強
度６０００ルクス、１６時間明期、８時間暗期で２日間培養した。
（１０）形質転換植物の選択
前記で２日間培養した切片をＳＩＭＣＳプレート（ＳＩＭＣプレートにハイグロマイシンＢを終濃度４．６Ｕ／mlとなるように加えたもの）に移植し、光強度６０００ルクス、１６時間明期、８時間暗期で培養した。以後、１週間毎に新しいＳＩＭＣＳプレートに移植した。形質転換した切片は増殖を続け、ドーム状に盛り上がったカルスとなるが、非形質転換体は褐変した。形質転換体は約２週間後、カルスが緑色を呈し、約１カ月後、葉が形成され、その後ロゼット葉となった。
（１１）形質転換植物の再生
ロゼット葉となった植物体の根本を、カルス部分を含まないように剃刃もしくはメスで切り取り、ＲＩＭプレートに軽く乗せるように挿した。８〜１０日後、１〜２ｃｍ程度の根が数本形成したものをピンセットで無機塩類培地〔５ｍＭ ＫＮＯ_３、２．５ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、２ｍＭ Ｃａ（ＮＯ_３）_２、５０μＭ Ｆｅ−ＥＤＴＡ、１０００×微量要素（７０ｍＭ Ｈ_３ＢＯ_３、１４ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．５ｍＭ ＣｕＳＯ_４、１ｍＭ ＺｎＳＯ_４、０．２ｍＭ ＮａＭｏＯ_４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ ＣｏＣｌ_２）１ml／リットル〕に浸したロックウールミ
ニポット（日東紡績社製）に定植し、培養した。開花し、莢形成後は、パーライトとバーミキュライト（ＴＥＳ社製）を１：１に混合し無機塩類混合培地に浸した土に植え換えた。約１カ月後、１株につき数百粒の種子が得られた。これを以後、Ｔ２種子と称す。
（１２）抗生物質耐性株の取得
Ｔ２種子約１００粒を（７）と同様の方法で滅菌し、ＭＳＨプレートに播種した。ほぼ３：１の割合でハイグロマイシンＢ耐性株が発芽した。
（１３）ＤＮＡ抽出とサザンハイブリダイゼーション
前記で発芽したＴ２種子を無機塩類培地に浸したロックウールミニポットにピンセットで移植し、光強度６０００ルクス、１６時間明期、８時間暗期、２２℃の条件下で培養した。２週間後、ロックウールの表面をナイフで撫でるようにメスで地上部を切り取り、直ちに液体窒素で凍結した。これを液体窒素存在下乳鉢で細かく粉砕し、１ｇ当たり、３mlのＤＮＡ抽出用緩衝液〔２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ、１％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、１００μg／ml ｐｒｏ
ｔｅｉｎａｓｅＫ〕を加え十分撹拌した。６０℃１時間インキュベート後、遠心（１０，０００×ｇ、１０分間）し上清をミラクロスで濾過し新しいチューブに移した。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出を３回行なった後、エタノール沈殿を行った。沈殿をＴＥ緩衝液に溶解した。それぞれ植物体約２．０ｇから、２０μgずつのゲノムＤＮＡが得られた。このうち１μgのＤＮＡを用いて、それぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIで切断し、１％アガロース電気泳動及びサザンハイブリ
ダイゼーションに供した。

また、形質転換を行っていないＷＳ株の種子を発芽、生育させ、植物体より、同様にＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIによる消化を行ない、１％アガロース
ゲル電気泳動及びサザンハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーション用プローブは各ＦＳＰＤ１、ＦＳＡＭ２４、ＦＡＤＣ７６遺伝子断片を用いた。

サザンハイブリダイゼーションは、モレキュラー クローニング，ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第９章、第３１〜５８頁〔コールド スプリング ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ）社、１９８９年刊〕に記載の方法に従って行った。すなわち、それぞれのＤＮＡ試料について１％アガロースゲル電気泳動を行い、泳動後、アルカリ変性を行いナイロンメンブレン（ハイボンド−Ｎ、アマシャム社製）に一晩サザンブロットした。紫外線トランスイルミネーター（２５４ｎｍ）に３分間照射させ、ＤＮＡを固定した。このメンブレンをプレハイブリダイゼーション緩衝液（５×デンハルト液、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１０μg／mlサケ精子ＤＮＡ）５ml中で５０℃、２時間プレハイブ
リダイゼーションを行った。プローブを加え、５０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む洗浄液で室温１０分間２回洗浄し、続いて同じ洗浄液で５０℃、３０分間で２回洗浄した。メンブレンは乾燥させた後、Ｘ線フィルム（コダック社製）を入れたカセット内で−８０℃一晩感光させ、オートラジオグラフィーをとった。形質転換を行っていない株（１）、ＦＳＰＤ１、ＦＳＡＭ２４、ＦＡＤＣ７６を導入した形質転換体（２）、ベクターのみを導入した形質転換体（３）について、サザンハイブリダイゼーションにより検出されたシグナルのパターンを比較した。

（２）には、（１）、（２）、（３）共通の内在性のシグナルのほかに、ＥｃｏＲＩで切断したサンプルと、ＨｉｎｄIIIで切断したサンプルでは特異的なシグナルが観察され
、目的遺伝子が（２）に組み込まれていることが観察された。
実施例３：ノーザンブロット解析
実施例２で得られたＴ２形質転換体で目的の遺伝子が実際に遺伝子発現しているかを確かめるために、ノーザンブロッティングを下記に示す様に行った。

形質転換を行っていない野生株（ＷＴ）とＴ２形質転換体（セルライン：ＴＳＰ−１４、１５、１６、１７、１９）のロゼット葉から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出は定法に従って行った。得られた全RNA10μgを1.5%ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動した後、ハイボンドNナイロンメンブランに一晩ブロッティングした。UVクロスリンカーでRNAを固定した後、プレハイブリダイゼーションバッファー（50% Formamide、5× SSPE、5
×Denhardt's、 0.1% SDS、80μg/ml Salmon sperm DNA、pH7.0）で、42℃、2時間プレ
ハイブリダイゼーションを行った。形質転換を行ったクロダネカボチャＳＰＤＳ遺伝子断片のcDNAを^３２P-dCTPとランダムラベルキット（アマシャム社製）を用いて、プローブを作製した。このプローブをプレハイブリダイゼーションに加え、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、メンブランを2×SSC、0.1% SDSを含む洗浄液からスタートし、最終的には0.1× SSC、0.1% SDSを含む洗浄液で55℃30分2回まで洗浄した。メンブランをX線フィルム（Kodak社製）を用いて、オートラジオグラフィーを行った。

ノーザンブロッティングの結果を図2に示した。図2の結果から、野生株（ＷＴ）では外因性クロダネカボチャＳＰＤＳ遺伝子の発現は検出されなかったが、形質転換を行った全てのＴ２形質転換体では非常に高いレベルでクロダネカボチャＳＰＤＳ遺伝子（ＦＳＰＤ１）が発現していることが確認された。
実施例４：ポリアミン含量の評価
（１）目的遺伝子が導入されている系統（セルライン）の選抜
実施例２で作製した形質転換体について、ＰＣＲ（またはサザン解析）とノーザン解析による目的遺伝子の導入確認でセルラインの選抜を行った。その結果、確実にポリアミン代謝関連酵素遺伝子が導入され、且つ該遺伝子を発現しているセルライン、ＴＳＰ−１１４、１１５、１１６、１１７、１１９、１３１、１３２、１５１、１５２、２２１、２２２を選抜した。ＴＳＰ−１１４〜１１５はＦＳＰＤ１が導入されている系統、ＴＳＰ−１３１、１３２はＦＳＡＭ２４が導入されている系統、ＴＳＰ−１５１、１５２はＦＡＤＣ７６が導入されている系統、ＴＳＰ−２２１、２２２はＦＳＰＤ１がアンチセンス方向で導入されている系統についてポリアミン含量を調べた。
（２）ポリアミン含量の分析
同時に栽培を行った野生株（ＷＴ）と形質転換体（ＴＳＰ）から約０．１〜０．３ｇのロゼット葉（または本葉）をサンプリングして密閉可能なポリ製バイアル瓶に移して凍結保存した。サンプリングした試料に希釈内部標準液（１，６−ｈｅｘａｎｅｄｉａｍｉｎｅ、内部標準量＝７．５ｎｍｏｌ）と５％過塩素酸水溶液（試料生体重１．０ｇ当たり５〜２０ｍｌ）を加え、オムニミキサーを用いて室温下で十分に磨砕抽出した。磨砕液を、４℃・３５，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清液を採取し本液を遊離型ポリアミン溶液とした。スクリューキャップ付きのマイクロチューブに４００μｌの遊離型ポリアミン溶液、２００μｌの飽和炭酸ナトリウム水溶液、２００μｌのダンシルクロライド／アセトン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて軽く混和した。チューブの栓をしっかりと閉めたのちアルミ箔で多い、６０℃のウォーターバスで１時間加温してダンシル化を行った。チューブを放冷した後、プロリン水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を２００μｌ加えて混和した。アルミ箔で覆ってウォーターバスで３０分間再加温した。放冷後、窒素ガスを吹き付けてアセトンを除いた後に、６００μｌのトルエンを加えて激しく混和した。チューブを静置して２相に分かれた後に、上層のトルエン層を３００μｌマイクロチューブに分取した。分取したトルエンに窒素ガスを吹き付けてトルエンを完全除去した。チューブに１００〜２００μｌのメタノールを加えてダンシル化遊離型ポリアミンを溶解させた。プトレシン、スペルミジン、スペルミンの遊離型ポリアミン量の定量は蛍光検出器（励起波長は３６５ｎｍ、発光波長は５１０ｎｍ）を接続した高速液体クロマトグラフィーを用いて内部標準法で分析した。ＨＰＬＣカラムはμＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製：０２７３２４、３．９×３００ｍｍ、粒子径１０μｍ）を使用した。試料中のポリアミン
含量は標準液と試料のＨＰＬＣチャートから、それぞれ各ポリアミンと内部標準のピーク面積を求めて算出した。その結果を表４に示す。

表４より、明らかなようにポリアミン代謝関連酵素遺伝子をセンス方向に導入したセルラインＴＳＰ−１１４、１１５、１１６、１１７、１１９、１３１、１３２、１５１、１５２は、プトレシン含量、スペルミジン含量、スペルミン含量が野生株（ＷＴ）より有意に増大し、総ポリアミン含量も野生株（ＷＴ）より有意に増大していることが明らかとなった。特にスペルミジンとスペルミン含量の増加が顕著であった。さらに、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子をアンチセンス方向に導入したセルラインＴＳＰ−２２１、２２２は、特にスペルミジン含量とスペルミン含量が野生株（ＷＴ）より有意に減少し、総ポリアミン含量も野生株（ＷＴ）より有意に減少していることが明らかとなった。

以上の結果から、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を植物にセンス方向又はアンチセンス方向で遺伝子導入することで、植物内のポリアミン含量を増加又は減少させることが可能であることが明らかとなった。これらのことから、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を植物に遺伝子導入することで、ポリアミン代謝を操作してポリアミン含量を制御できることが認められた。
実施例５：種々の器官形成の評価
（１）茎・葉・花・さや数の評価
実施例２で得られたＴ３形質転換体（ＦＳＰＤ１がセンス方向で導入されているセルライン：ＴＳＰ−１６−１、１６−２）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を培養土メトロミックス（ハイポネックスジャパン社製）を含んだプラスチック鉢に播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、鉢をプラスチックバットに入れ、２３℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。播種後、１５週間育成した。育成後、各ラインで１個体当たりの茎（花茎）数を調査した。各ライン３０個体について調査を行った。その結果を図３に示した。

図３の結果から、Ｔ３形質転換体（ＴＳＰ−１６−１、１６−２）は野生株に比べて有意に１株当たりで約７〜８本の茎数が増大していることが明らかとなった。さらに、１株
当たりの茎数が増大したことで葉（茎生葉）、花、さや（子房）数も顕著に増大していることが明らかとなった。野生株とＴＳＰ−１６−１の草姿を図４に示した。
（２）主茎と側茎数の評価
（１）の結果からＴ３形質転換体では野生株に比べて有意に茎数の増加が確認された。そこで、シロイヌナズナの茎は主茎（主花茎）と側茎（側花茎）に分かれることから、主茎と側茎についてそれぞれ数を調査することとした。実施例２で得られたＴ３形質転換体（ＦＳＰＤ１がセンス方向で導入されているセルライン：ＴＳＰ−１６１Ｂ、１６２Ｂ）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を培養土メトロミックス（ハイポネックスジャパン社製）を含んだプラスチック鉢に播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、鉢をプラスチックバットに入れ、２３℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。播種後、７週間育成し、７週間目（４９日目）から１週間毎に１３週間目（９１日目）まで、各ラインで１個体当たりの主茎（主花茎）と側茎（側花茎）数をそれぞれ調査した。各ライン３０〜３２個体について調査を行った。その結果を図５および図６に示した。

図５の結果からＴ３形質転換体は野生株に比べて、４９日目から有意に主花茎数の増加が認められ、７０日目ではＴ３形質転換体では野生株に比べて１株当たりで約１本増加した。Ｔ３形質転換体と野生株の主花茎の増加程度は９１日目までほぼ同程度で続き、最終的な主花茎数もＴ３形質転換体では野生株より高まった。

図６の結果からＴ３形質転換体は野生株に比べて、４９日目から有意に側花茎数の増加が認められ、７０日目ではＴ３形質転換体では野生株に比べて１株当たりで約４本増加した。さらに、９１日目ではＴ３形質転換体では野生株に比べて１株当たりで約５〜６本増加し、最終的な側花茎数もＴ３形質転換体では野生株より顕著に高まった。
（３）葉・花・さや数の評価
（１）の結果からＴ３形質転換体では野生株に比べて葉、花およびさや（子房）数の増加が確認された。そこで、各器官についてそれぞれ詳細に数を調査した。実施例２で得られたＴ３形質転換体（ＦＳＰＤ１がセンス方向で導入されているセルライン：ＴＳＰ−１５−３、１６−１）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を培養土メトロミックス（ハイポネックスジャパン社製）を含んだプラスチック鉢に播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、鉢をプラスチックバットに入れ、２３℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。播種後、６７日間育成して６７日目に各ラインで１個体（株）当たりの葉（茎生葉）、白色の花弁が付いている花、さや（さや長が５ｍｍ以上）数を調査した。各ライン３０個体について調べた。その結果を表５に示した。

表５の結果からＴ３形質転換体は１株当たりの本葉、花、さやの数が野生株に比べて有意に増大していることが明らかとなった。さやは全てのラインで調査後に成熟して裂開後、成熟した種子が収穫できた。１さや当たりの種子数はＴ３形質転換体と野生株で有意な
差は見られなかったが、Ｔ３形質転換体では１株当たりで１．６〜２．０倍程度さやの数が増加した結果、１株当たりで収穫された全種子数は有意に増大していることが明らかとなった。Ｔ３形質転換体から収穫されたＴ４種子と野生株の種子を用いて発芽率の比較試験を行ったところ、Ｔ４種子、野生株ともに９５〜１００％の高い発芽率が得られた。
（４）花の開花期、子房（さや）の発達期間の評価
実施例２で得られたＴ３形質転換体（ＦＳＰＤ１がセンス方向で導入されているセルライン：ＴＳＰ−１５−３、１６−１）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を培養土メトロミックス（ハイポネックスジャパン社製）を含んだプラスチック鉢に播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、鉢をプラスチックバットに入れ、２３℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。各ラインすべての株について抽だい開始日と開花日（１番花）の調査と１番花の開花日からさや（子房）の成熟日（裂開開始日）までの調査を行った。各ライン３０個体について調べた。花の開花日の結果を図７、さや（子房）の発達期間の結果を表６に示した。

図７の結果からＴ３形質転換体は野生株より開花日が早くなっていることが明らかとなった。平均でＴ３形質転換体は野生株より６〜７日程度早まっていることが確認された。

表６の結果からＴ３形質転換体は野生株に比べてさや（子房）の発達期間が有意に増大していることが明らかとなった。
実施例６：形質転換ペチュニアの評価
（１）形質転換ペチュニアの作製
ｐＢＩ１０１−３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋とｐＢＩ１０１−３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋をアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefacience）Agl0株（Lazo et al. BioTechnology 9:963-967 (1991)）に塩化カルシウムを用いる方法（たとえば、新生化学実験のてびき 3
化学同人 121-122ページ、1996）で導入した。得られた形質転換アグロバクテリウム
を、それぞれペチュニア（Petunia hybrida）品種サフィニアパープルミニ（サントリー
フラワーズ株式会社）由来のリーフディスクに感染させ、ハイグロマイシンに抵抗性を示す植物細胞を選抜、再分化させることにより、形質転換ペチュニアを取得した。ペチュニアの形質転換は公知の方法(Horsch et al. Science 227:1229-1231 (1985))を用いて行った。ｐＢＩ１０１−３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋とｐＢＩ１０１−３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋により形質転換されたペチュニアそれぞれを実験区PT144と実験区PT146とした。PT144では23
個体、PT146では43個体の独立した形質転換体を取得した。
（２）導入遺伝子の発現解析
これらの植物から染色体DNAおよびRNAをそれぞれDNeasy Plant Mini KitとRNeasy Plant Mini Kit (株式会社キアゲン、東京)を用いることにより調製した。染色体DNAを鋳型にしたPCR反応 (PT144はプライマーFSPD1F (5’-TAGTAGAGGGATTATTATGTCTGCGGA-3’)とFSPD1R (5’-ATGACGCTGATCACAATATAAAGCGAC-3’)をPT146はプライマーFSAM24F (5’-TGAAGGCTATGAAAAGAGGCTTGAAGTA-3’)とFSAM24R (5’-TCATGAGGATTGACCTTGGGATGACG-3’)を用いてPCR反応を行った。反応は、95℃で1分間保持した後、95℃・1分、52℃・2分、72℃・3分からなるサイクルを30サイクル行い、さらに72℃で1分間保持した。)により、PT144およびPT146のペチュニアはそれぞれSPDS（FSPD1）およびSAMDC（FSAM24）遺伝子を保持する形質転換体であることがわかった。また、これら形質転換ペチュニアの葉から抽出した全RNA
を用いてRT-PCR (スーパースクリプトファーストストランド合成システムRT-PCR用(イン
ビトロジェン株式会社、東京)を用いてOligo(dT)12-18プライマーを用いて、逆転写反応
を行った。逆転写産物を鋳型とし、染色体DNAと同じプライマーとサイクルでPCRを行った。)によって各個体の遺伝子発現を解析した。PT144では9個体、PT146では27個体の植物体で外来遺伝子（PT144はSPDS、PT146はSAMDC）の発現が確認された。
（３）ポリアミン含量の評価
形質転換体の中から発現量の多かった個体（セルライン）について遊離型ポリアミン含量の分析を行った。同時に栽培を行った野生株（元株：PT144-C、PT146-C）と形質転換体（PT144, PT146）から約０．３〜０．６ｇの葉をサンプリングして凍結保存した。サンプリングした試料に希釈内部標準液（１，６−ｈｅｘａｎｅｄｉａｍｉｎｅ、内部標準量＝７．５ｎｍｏｌ）と５％過塩素酸水溶液（試料生体重１．０ｇ当たり５〜１０ｍｌ）を加え、オムニミキサーを用いて室温下で十分に磨砕抽出した。磨砕液を、４℃・３５，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清液を採取し本液を遊離型ポリアミン溶液とした。スクリューキャップ付きのマイクロチューブに４００μｌの遊離型ポリアミン溶液、２００μｌの飽和炭酸ナトリウム水溶液、２００μｌのダンシルクロライド／アセトン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて軽く混和した。チューブの栓をしっかりと閉めたのちアルミ箔で覆い、６０℃のウォーターバスで１時間加温してダンシル化を行った。チューブを放冷した後、プロリン水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を２００μｌ加えて混和した。アルミ箔で覆ってウォーターバスで３０分間再加温した。放冷後、窒素ガスを吹き付けてアセトンを除いた後に、６００μｌのトルエンを加えて激しく混和した。チューブを静置して２相に分かれた後に、上層のトルエン層を３００μｌマイクロチューブに分取した。分取したトルエンに窒素ガスを吹き付けてトルエンを完全除去した。チューブに１００〜２００μｌのメタノールを加えてダンシル化遊離型ポリアミンを溶解させた。プトレシン、スペルミジン、スペルミンの遊離型ポリアミン量の定量は蛍光検出器を接続した高速液体クロマトグラフィーを用いて内部標準法で分析した。ＨＰＬＣカラムはμＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製：０２７３２４、３．９×３００ｍｍ、粒子径１０μｍ）を使用した。試料中のポリアミン含量は標準液と試料のＨＰＬＣチャートから、それぞれ各ポリアミンと内部標準のピーク面積を求めて算出した。その結果を表７に示した。

遊離型プトレシン量の野生株（144-C、146-C）における平均は29.46 nmol/gFW（ＦＷ：新鮮重）、形質転換体（144、146）の平均は38.67 nmol/gFW、遊離型スペルミジン量の野生株における平均は37.03 nmol/gFW、形質転換体の平均は50.40 nmol/gFWであり、遊離型プトレシン量、遊離型スペルミジン量がともに増加した。野生株と形質転換体間のt-検定の結果、遊離型スペルミジンは有意水準5%で差があることがわかり、形質転換体において特に遊離型スペルミジン量が増加していることが明らかとなった。さらに、PT146の形質
転換体では遊離型スペルミン含量が野生株（146-C）に比べて有意に増加していることも
確認された。

（４）形質転換ペチュニアの形態形成の評価
ペチュニアは気温約25℃で、自然光に16時間明8時間暗サイクルの人口光を補った閉鎖
系温室内で栽培し、切り戻した直後から60日目までの間、外来遺伝子が発現していた個体について個体当たりの花数変化を経時的に測定した。その結果を表８、図８、図９に示した。表８、図８、図９の結果から形質転換ペチュニアでは元株（野生株）に比べて明らかに分枝数と花数が増加した。測定期間中、元株のサフィニアパープルミニの花数は10を越えることはなかったが、PT144では6個体（67％）、PT146では18個体（67％）が花数10を
越えた。また、一枝当たりの花数も元株では0〜3個の場合が多く5個を越えることはほと
んど見られない。しかし、形質転換体では、5個を越える花をつけた枝を持つ個体がPT144では3個体（33％）、PT146では5個体（19％）と高い割合を示した。

ポリアミン量の増加とペチュニアの花数や枝数の増加に相関関係があることがわかり、導入した遺伝子がポリアミン量を増やし花数や枝数の増加をもたらすことが明らかとなった。ここで見られた花数の増加が、個々の花の開花期間が長くなったことに起因するものか、同時に開花している花芽数の増加に起因するものかを調べるために、一枝当たりの花数が多かった個体（PT144は5個体、PT146は9個体）で、開花期間の長さを調べた（花が開花した直後から花弁が萎えるまでの期間を開花期間として、1個体につき5個の花について
測定を行い、平均値で比較した）。元株の平均開花日数は8.34日、形質転換体の平均開花日数は9.35日であり、形質転換体では開花期間が増加している傾向が観察された。

Claims (12)

1. （１）植物中で機能し得るプロモーターの制御下にある外因性Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子により該外因性ＳＡＭＤＣ遺伝子を有していない植物の細胞を形質転換する工程；
   （２）工程（１）で得られた形質転換細胞から植物体を再生する工程；及び
   （３）工程（２）で得られた植物体から得られる形質転換体を栽培して器官形成の評価を行い、以下の（ｄ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる少なくとも１種の改良された器官形成を有し、該器官形成の改良により生産性又は／及び収量が向上する植物を選別する工程
   を含む、
   以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１種の改良された器官形成、及び以下の（ｄ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる少なくとも１種の器官形成を有し、該器官形成の改良により生産性又は／及び収量が向上することを特徴とする、該外因性ＳＡＭＤＣ遺伝子を有していない植物に比べて、改良された器官形成を有する植物の作出方法：
   （ａ）茎の数の増加
   （ｂ）花の数の増加
   （ｃ）花の開花期間の増加
   （ｄ）さやまたは子房または果実の数の増加
   （ｅ）種子または胚珠の数の増加
2. 前記外因性ＳＡＭＤＣ遺伝子が導入確認されたセルラインを選抜する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
3. 前記導入された外因性ＳＡＭＤＣ遺伝子がホモ接合体である植物を選抜する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 以下の工程：
   （１）前記植物体から受粉により種子を採取する工程、および
   （２）該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における前記外因性ＳＡＭＤＣ遺伝子を検定して該外因性ＳＡＭＤＣ遺伝子のホモ接合体を選抜する工程
   を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記プロモーターが構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは時期特異的プロモーターである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 前記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも２以上の器官形成が同時に改良されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. （１）植物中で機能し得るプロモーターの制御下にある外因性ＳＡＭＤＣ遺伝子により該外因性ＳＡＭＤＣ遺伝子を有していない植物の細胞を形質転換する工程；
   （２）工程（１）で得られた形質転換細胞から植物体を再生する工程；及び
   （３）工程（２）で得られた植物体から得られる形質転換体を栽培して器官形成の評価を行い、以下の（ｄ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる少なくとも１種の改良された器官形成を有し、該器官形成の改良により生産性又は／及び収量が向上する植物を選別する工程
   を含む、
   植物の以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１種、及び以下の（ｄ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる少なくとも１種の器官形成を改良する方法：
   （ａ）茎の数の増加
   （ｂ）花の数の増加
   （ｃ）花の開花期間の増加
   （ｄ）さやまたは子房または果実の数の増加
   （ｅ）種子または胚珠の数の増加
8. 前記外因性ＳＡＭＤＣ遺伝子が導入確認されたセルラインを選抜する工程をさらに含む請求項７に記載の方法。
9. 前記導入された外因性ＳＡＭＤＣ遺伝子がホモ接合体である植物を選抜する工程をさらに含む、請求項７または８に記載の方法。
10. 以下の工程：
    （１）前記植物体から受粉により種子を採取する工程、および
    （２）該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における前記外因性ＳＡＭＤＣ遺伝子を検定して該外因性ＳＡＭＤＣ遺伝子のホモ接合体を選抜する工程
    をさらに含む、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
11. 前記プロモーターが構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは時期特異的プロモーターである、請求項７〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも２以上の器官形成が同時に改良されることを特徴とする請求項７〜１１のいずれかに記載の方法。

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