WO2003084314A1

WO2003084314A1 - Plant with improved organogenesis and method of constructing the same

Info

Publication number: WO2003084314A1
Application number: PCT/JP2003/004427
Authority: WO
Inventors: Yoshihisa Kasukabe; Izumi Ihara; Shoji Tachibana; Keisuke Matsui; Masako Mizutani
Original assignee: Toyobo Research Center Co., Ltd.
Priority date: 2002-04-08
Filing date: 2003-04-08
Publication date: 2003-10-16
Also published as: CN101333535B; EP1498027A1; CA2481764A1; JPWO2003084314A1; US20120036598A1; EP1498027A4; EP2064943A3; US20090100546A1; CN101333535A; CN1646005A; AU2003221058A1; EP1498027B1; BR0309122A; JP2009148288A; US8455713B2; JP2008161192A; US20090100547A1; JP3775506B2; US8053629B2; EP2064943A2

Description

器官形成を改良した植物及びその作出方法

技術分野

本発明は、種々の改良された器官形成を有する植物、詳細には改良された茎、葉、花、子房 (さや、果実)、種子を'有する植物に関する。また、本発明は該植物の作出方法に関する。 '

背景技術

植物はそれぞれの生息地の様々な環境要因に適応して生活している。例えば、植物は生育する環境に応じて形を変化させる能力を有している。植物がー且ある場所に根をおろしてしまうと、その場所の環境力いかにその植物に適していなくても移動することができず、自分自身の形を変化させることで適応して生育を続ける。植物にとっては形を変えることは生き残っていくうえで必須条件となっている。

種々の器官形成を改良するために交雑育種、最近の遺伝子工学技術を利用した育種、植物ホルモンや植物調節剤の作用を利用した方法等が行われて、る。

植物の器官形成や形態形成の制御機構を解明するためにシロイヌナズナ

{Arabidopsis

を用いて数多くの研究が行われている。花形成に関与する遺伝子としては、 LEAFY(LFY)ヽ APETALA1 (¾P_人 ^LGAMOL/S ^ G^ SUPERMAN (SUP)ヽ ¾L i¾Lノなどが報告されている。茎形成に関与する遺伝子としては: TC ¾、 d bなどが報告されている。葉形成に関与する遺伝子としては Πムびよどが報告されている。根形成に関与する遺伝子としては、 ttg、 gl2、 CJPCヽどが報告されている。

これまでに遺伝子工学技術を利用した、形態形成や器官形成を改良した植物の作出が行われている。ジンクフィンガーモチーフを有する転写因子 PetSPl3、をペチュニアに導入して花の形態変化が報告されている（特開平 11-262390)。遺伝子や伝子をシロイヌナズナに導入して根の形態変化が報告されている（特開平 10-4978、特開 2000-270873)。しかし、これらの遺伝子を形質転換した植物の多くは、実際には産業上利用可能な程度に十分な効果は得られておらず、実用化に至っていないのが現状である。ポリてミンとは第 1級アミノ基を 2つ以上もつ脂肪族炭化水素の総称で生体内に普遍的に存在する然物であり、 ²0 類以上のポリアミンが見いだされている。代表的なポリアミンとしてはプトレシン、スペルミジン、スペルミンがある。ポリアミンの主な生理作用としては (1)核酸との相互作用による核酸の安定化と構造変化 (2)種々の核酸合成系への促進作用 ( タンパク質合成系の活性ィ匕 (4)細胞膜の安定ィ匕ゃ物質の膜透過性の強化などが · 知られている。

植物におけるポリアミンの役割としては細胞増殖や分裂時に核酸、タンパク質生合成 ■ の促進効果や細胞保護が報告されてレヽるが、最近ではポリアミンと環境ストレス耐性との関わりも注:目されている。 · '

形態形成とポリアミンの関わりは、体細胞胚形成、不定根形成について幾つか報告されている。例えば、ニンジン (Planta, 162, 532, 1984、 Science, 223, 1433, 1984)、ェンパク (Plant Growth Reg., 3, 329, 1985)、ハクサイ（Plant Sci" 56, 167, 1988)、ペチュニア (Plant Sci., 62, 123, 1989)でポリアミンにより体細胞胚形成が促進されることや、リヨクトウ (Physiol. Plant., 64, 53, 1985、 Plant Cell Physiol., 24, 677, 1983)では不定根形成が促進されることが示されている。ポリアミンと花、茎、葉、子房などの器官形成との関与については、これまでほとんど報告されていない。

.植物のポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素としてはアルギニン脱炭酸酵素 (ADC)、オル二チン脱炭酸酵素 (ODC)、 S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素（SA MDC)、スぺレミジン合成酵素（SPDS)、スペルミン合成酵素（SPMS)等が知られている。これらのポリアミン代謝関連酵素をコードするポリアミン代謝関連遺伝子については棹物^ら既に幾つか単離されている。 ADC遺伝子はェンバタ（Mol. Gen. Genet" 224, 431-436, 1990)、トマト（Plant Physiol., 103, 829-834, 1993)、シロイヌナズナ (Plant

Physiol., I l l, 1077-1083, 1996)、エンドゥ（Plant Mol. Biol, 28, 997-1009, 1995)、 ODC 遺伝子はチョウセンアサガオ（Datura) (Biocem. J., 314, 241-248, 1996)、 SAMDC遺伝子はジャガイモ (Plant Mol. Biol" 26, 327-338, 1994)、ホウレンソゥ（Plant Physiol., 107, 1461-1462, 1995)、タバコ、 SPDS遺伝子はシロイヌナズナ（Plant cell Physiol, 39(1), 73- 79, 1998)等から単離されている。従って、本発明の目的は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を人為的に制御して、ポリアミンレベルを変化させることによって、種々の器官形成が改良された組換え植物を作出することである。

図面の簡単な説明

図 1は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含む発現コンストラクトの構造を示す。

図 2は、形質転換体におけるクロダネカボチヤ SPDS遺伝子の発現結果を示す。図 2 中、 1.野生株 (WT) ;2.形質転換体 (TSP- 14) ; 3.形質転換体 (TSP-15) ; 4.形質転換体 (TSP-16) ; 5.形質転換体 (TSP-17) ; 6.形質転換体 (TSP- 19)。

図 3は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との茎数の比較を示す。図 4は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との茎、葉、花、子房、種子数の比較を示す写真である。

図 5は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との主茎数の比較を示す図である。

図 6は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との側茎数の比較を示す図である。

図 7は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との開花日の比較を示す図である。

図 8は、外来遺伝子が発現していた個体についての個体当たりの経時的花数変化の測定結果を示す。図 9は、外来遺伝子力 S発現していた個体についての個体当たりの経時的花数変化の測定結果を示す。

' 発 Kの開示

本発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意努力した結果、ポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素遺伝子を単離して、該遺伝子を植物に導入して過剰発現することによって、ポリアミン代謝を操作してポリアミン濃度を変化させることによって、茎、葉、花、子房（果実、さや）、種子（胚珠）など種々の器官形成のパラメーターが改良されることを見出した。

ポリアミンは分子中にアミンを多く含む塩基性物質であり、代表的なポリアミンとしては二分子のアミンを含むプトレシン、三分子のアミンを含むスペルミジン、四分子のアミンを含むスペルミン等がある。植物において、これらのポリアミン生合成に関わるポリアミン代差替え用紙（,ΰ26) 謝関連酵素としてはプトレシンについては ADC、 ODC、スペルミジンについては SAM DC、 SPDS、スペルミンについては SAMDC、 SPMS等が見つかっている。これらのポリアミン代謝関連酵素をコードしているポリアミン代謝関連酵素遺伝子についても既に幾つかの植物で単離されている。さらに、幾つかのポリアミン代謝関連酵素遺伝子については植物への導入が試みられているが、得られた形質転換植物で茎、葉、花、子房、種子などの器官形成の改良については報告されていない。

このような状況下に、本発明者らは植物の器官形成を改良するために鋭意、検討した結果、器官形成において、特にポリアミンであるスペルミジンやスペルミン含量が重要であることを見レ、だし、実際に植物組織力もスペルミジンやスペルミン生合成に関わるポリアミン代謝関連遺伝子 (SPDS、 SAMDC、 ADC)を単離、同定した。さらに、該遺伝子を植物に導入して過剰発現することによって、ポリアミン代謝を操作してポリアミン濃度を変化させることによって、茎、葉、花、子房 (果実、さや)、種子 (胚珠)など種々の器官形成のパラメーターが改良されることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、以下の発明を提供するものである。

1. 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも 1つの核酸配列を安定に保持、っ該核酸配列を有していなレ、植物に比べて少なくとも 1種の器官形成が改良された植物及ぴその子孫。

2 2 . 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも' 1つ:の核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された器官形成を有する植物の作出方法。

2 4 . 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも 1つの核酸配列を含む少なくとも 1つの発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された器官形成を有する植物の作出方法。

4 0 . 以下の工程：

( 1 ) 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも 1つの核酸配列を含む少なくとも 1つの発現ベクターで、該核酸配列を有していなレ、植物の細胞を形質転換し、 ( 2 ) 該形質転換細胞から、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された器官形成を有する植物体を再生し、

( 3 ) 該植物体から受粉により種子を採取し、および .

( 4 ) 該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における該核酸配列を検定して該核酸配列のホモ接合体を選抜すること

を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された器官形成を有する形質が固定された植物の作出方法。

4 1 . 以下の工程：

( 1 ) 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも 1つの核酸配列の抑制因子を含む少なくとも 1つの発現ベクターで、該核酸配列を有していな！ヽ植物の細胞を形質転換し、

( 2 ) 該形質転換細胞からカルスを誘導する

を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない植物に比ぺて改良された器官形成を有する形質が固定されたカルスの作出方法。

本発明において「器官」とは、植物のあらゆる器官 (組織)で、例えば、茎、塊茎、葉、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維、胚珠などを指す。該器官 (組織)の形成に関わる形質としては、数量、生育期間、形、着色、性質、特性などをいう。ポリアミンの発現量は、植物の器官の数量と密接に関係し、葉、花、果実、塊茎、塊根さや、さく果などについては、数量とともに生育の開始は早くなり、かつ、終了が遅くなるので、長期間これらを鑑賞及び賞味することができる。

本発明で得られる植物は、栽培環境 (例えば環境ストレス）に左右されずポリアミンの発現量が増大し、器官形成を改良することができる。

ポリアミン量を調節する核酸配列としては、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が挙げられる。外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は植物体中のポリアミン量を増大させ、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子は植物体中のポリアミン量を減少させる。

本発明におレ、て「該ポリアミン量を調節する核酸配列を有してヽなレ、植物」とは該核酸配列 (例えば外因性のポリアミン代謝関連酵素遺伝子又は内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子）をゲノム上に有しないあらゆる植物を意味する。従って、いわゆる野生種のほか、通常の交配によって樹立された栽培品種、それらの自然または人工変異体、並びにポリアミン代謝関連酵素遺伝子以外の外因性遺伝子を導入されたトランスジエニック植物などをすベて包含する。

本発明で言うところの「ポリアミン」は生物体内に普遍的に存在する一般的な天然物であり、第一級アミノ基を 2つ以上もつ脂肪族炭化水素化合物である。例えば、 1， 3—ジァミノプロパン、プトレシン、カダベリン、カルジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノプ口ピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモスペルミン、カナバルミン、ァミノペンチルノルスペルミジン、 N， N—ビス（ァミノプロピル）カダべリン、ホモスペルミン、力ルドペンタミン、ホモ力ルドペンタミン、力ルドへキサミン、ホモ力ルドへキサミンなどが拳げられる。

ポリアミン代謝関連酵素遺伝子

本発明において「ポリアミン代謝関連酵素遺伝子」とは、植物におけるポリアミンの生合成に関与する酵素のアミノ酸をコードする遺伝子であり、例えば代表的なポリアミンであるプトレシンについてはアルギニン脱炭酸酵素 (ADC)遺伝子とオル二チン脱炭酸酵素（O DC)遺伝子、スペルミジンにっ、ては S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素（SAMDC) 遺伝子とスぺノレミジン合成酵素（SPDS)遺伝子、スペルミンについては S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素（SAMDC)遺伝子とスペルミン合成酵素（SPMS)遺伝子が関与し、律速になっていると考えられている。

アルギニン脱炭酸酵素（ADC： arginine decarboxylase EC4.1.1 · 19.)は L一アルギニンからァグマチンと二酸ィ匕炭素を生成する反応を触媒する酵素である。オル二チン脱炭酸酵素（ODC : ornithine decarboxylase EC4.1.1.17.)は L—オノレニチンからプトレシンと二酸ィ匕炭素を生成する反応を触媒する酵素である。 S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素 (SA MDC： S-adenosylmethionine decarboxylase EC4.1.1.50.)は S—アデノシルメチォニンからアデノシルメチルチオプロピルァミンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。スペルミジン合成酵素（SPDS： spermidine synthase EC2.5.1.16.)はプトレシンとアデノシルメチルチオプロピルァミンからスペルミジンとメチルチオアデノシンを生成する反応を触媒する酵素である。

これらの遺伝子は、いずれの由来であってもいいが、例えば、種々の植物から単離することができる。具体的には、双子葉植物、例えばゥリ科；ナス科；シロイヌナズナ等のアブラナ科；アルフアルファ、カウピー ( Vigm unguiculata)等のマメ科；ァオイ科；キク科；ァカザ科;ヒルガオ科力もなる群力選ばれたもの、又は単子葉植物、例えばイネ、小麦、大麦、トウモロコシ等のイネ科などが含まれる。乾燥に強いサボテンやアイスプラント Mesembryanthemum crystalli mi)でヽ。好ましくは、ゥリ科植物、より好ましくはクロダネカボチヤがよい。

本発明の植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子を単離する植物組織としては種子形態、または生育過程にあるものである。生育中の植物は全体、あるいは部分的な組織力も単離することができる。単離することができる部位としては、特に限定はされないが、好ましくは植物の全樹、蕾、花、子房、果実、葉、茎、根などである。

本発明におレヽて使用されるポリアミン代謝関連酵素遺伝子の好まし！/ヽ例として、スペルミジン合成酵素遺伝子、 S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素遺伝子、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子を挙げることができる。具体的には、

•配列番号 1に示される塩基配列中塩基番号 77〜： 1060で示される塩基配列を有する D NA

•配列番号 3に示される塩基配列中塩基番号 456〜； 1547で示される塩基配列を有する DNA、及び

•配列番号 5に示される塩基配列中塩基番号 54：！〜 2661で示される塩基配列を有する DNA、

が挙げられる。さらに、

•該上記レ、ずれかの配列とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得る塩基配列を有し、且つ該配列と同等のポリアミン代謝関連酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA、及ぴ

.該上記いずれかの配列において、 1又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付カロされた塩基配列力なり且つ該配列と同等のポリアミン代謝関連酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA、

が挙げられる。

ここでレ、う「ストリンジェントな条件」とは、特定ポリアミン代謝関連酵素遺伝子配列にコードされるポリアミン代謝関連酵素と同等のポリアミン代謝関連酵素活性を有するポリべプチドをコードする塩基配列のみが該特定配列とハイブリット（いわゆる特異的ハイプリット）を形成し、同等の活性を有しないポリペプチドをコードする塩基配列は該特定配列とハイブリット (いわゆる非特異的ハイブリット)を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダィゼーシヨン反応および洗浄時の温度や、ハイプリダイゼーシヨン反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、 6 X SSC (0. 9M NaCl, 0. 09M クェン酸三ナトリウム）または 6 X SSPE (3M NaCl, 0, 2M NaH₂P0₄, 20mM EDTA- 2Na, pH7. 4)中 42°Cでノヽイブリダィズさせ、さらに 42°Cで 0. 5 X SSCにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の 1例として挙げられる力これに限定されるものではない。

一般的に生理活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において 1個もしくは複数のアミノ酸が置換、削除、揷入または付加された場合であっても、その生理活性が維持される場合があることは当業者において広く認識されている。ここでレ、う「1又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列」とは、このような修飾が加えられ、かつポリァミン代謝関連酵素をコードする遺伝子が例示され、このような遺伝子も本発明の範囲に含まれる。例えば、 polyAテールや 5'、 3'末端の非翻訳領域が「欠失」されてもよいし、了ミノ酸を欠失するような範囲で塩基力 S「欠失」されてもよい。また、フレームシフトが起こらない範囲で塩基力 S「置換」されてもよい。また、アミノ酸が付加されるような範囲で塩基力 S「付カロ」されてもよい。但し、そのような修飾があっても、ポリアミン代謝関連酵素活性を有することが必要である。好ましくは、「1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された遺伝子」がよい。

このような改変された DNAは例えば、部位特異的変異法 (Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, 6487-6500, 1982)等によって、特定の部位のアミノ酸が置換、削除、揷入、付加されるように本発明の DNAの塩基配列を改変することによって得られる。

本発明における「ァンチセンス遺伝子」とはポリアミン代謝関連酵素遺伝子の塩基配列に相補的な配列を有する遺伝子を意味する。アンチセンス D N Aは、例えば配列番号 1、 3、 5の塩基配列に相捕的なものであり、アンチセンス R N A はそれらから産生されるものである。

内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子

該抑制因子は、該遺伝子の発現を抑制するものであれば特に制限されず、例えば該遺伝子及びその上流又は下流から選ばれる配列のァンチセンス D N Aまたは二本鎖 R NA ( d s R N A) 、 R N A iが例示される。該アンチセンス D N Aは、 03 04427

9 該遺伝子のイントロンまたはェクソン、該遺伝子のプロモーターを含む⁵ '上流側の調節領域または終止コドンの下流側であって、遺伝子発現に影響する領域のいずれかに相補的であればよい。アンチセンス D NAの長さは、少なくとも 2 0 塩基、好ましくは少なくとも 1 0 0塩基、より好ましくは少なくとも 3 0 0塩基、特に少なくとも 5 0 0塩基を有する。該アンチセンス D NAの転写産物は、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の mR N Aとハイプリダイズするか、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子或いはその上流又は下流の配列の非コーディング領域（例えばプロモーター、イントロン、転写終結因子）にハイプリダイズする。 R NA iは、標的遺伝子に対するセンス配列と、標的遺伝子に対するアンチセンス配列を有する R N Aから構成され、該センス配列とアンチセンス配列は 2本の R NAに各々含まれて 2本鎖 R NAとして機能してもよく、 1本の R NAに含まれて 2重鎖部分とそれらをつなぐループ配列を有する 1つの RN A分子として機能してもよい。

器官形成が改良された植物及ぴその子孫

本発明において、「器官」としては、上述のごとぐ植物のあらゆる器官 (組織)で、例えば、茎、塊茎、葉、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維、胚珠などを包含し、該器官 (組織)の形成に関わる形質として数量、生育期間、形、着色、性質、特性が例示される。

本発明にぉレヽて、「器官形成が改良された植物」および「改良された器官形成を有する植物」とは、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子を導入することによって、導入前に比して器官形成に関わる形質である、数量、生育期間、形、着色、性質、特性が付与若しくは向上若しくは抑制した植物をいう。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または該抑制因子を植物に導入することにより、茎、葉、花、子房、種子の形成に関わる形質が、該外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または該抑制因子を有していなレ、植物に比べて向上した植物などが挙げられる力これらに限定されるものではない。

具体的には、ポリアミン量を調節する核酸配列により「茎の数が改良された植物」とは、植物の茎（主茎、側茎、花茎、幹、枝などを含む）の数が増加した植 P T/JP03/04427

10 物、該抑制因子により植物の茎（主茎、側茎、花茎、幹、枝などを含む）の数が減少ないし縮小した植物である。

「葉の数が改良された植物」とは、植物の葉の数が増加又は減少若しくは縮小した植物である。

「花の数または花の開花期が改良された植物」とは、植物の花の数が増加又は減少若しくは縮小した植物、または植物の花の開花時期が早まりまたは開花期間が増大した植物である。「子房の数または子房の発達期間が改良された植物」とは、植物の子房、果実、さや、さく果の数が増加又は減少若しくは縮小した植物、または子房、果実、さや、さく果の着果から成熟までの生育または発達の期間が増大又は減少若しくは縮小した植物である。

「種子の数が改良された植物」とは、植物の種子（胚珠などを含む）の数が増加又は減少若しくは縮小した植物である。

これによつて植物（器官 '組織など）の品質、生産性、収量の向上、商品性の向上などが期待できる。また、野菜、果物等の可食性植物では、食用部分（葉、果実、塊茎、根茎など）のポリアミン量を減らすことで品質などの特性に好影響を与える可能性がある。従って、これらの食用部分では抑制因子を発現させ、その他の部分ではポリアミン関連酵素遺伝子を発現させて品質を向上しつつ収量の向上を図ることも可能である。

さらに、器官形成の改良で植物の形や形態が変化することで種々の環境ストレスに対する適応性（抵抗性）の向上も期待できる。特に、葉の数及びクロロフィルの増加による葉の緑色の増大、根（根茎、塊茎を含む）の伸長、茎の数及ぴ太さの増大は、植物の環境適応性を増大させると考えられる。

さらに、本発明の好ましい実施形態の 1つにおいて、植物は栄養生長期における外観上の相違は小さいが（葉が濃緑色になる）、生殖生長期において葉、花、茎等の器官の改良がより箸しく認められ、これは植物の潜在能力（ポテンシャル）を向上させたものと理解される。

本発明の植物には、植物体全体 (全樹）に限らず、そのカルス、種子、あらゆる植物組織、葉、茎、塊茎、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、胚珠、繊維などが含まれる。更にその子孫も本発明の植物に含まれる。 W 03

11

本発明において「植物及びその子孫から得られる有用物質」とは、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入することによって、導入前に比して器官形成が向上した植物およびその子孫で生産された有用物質をさし、有用物質としては例えば、アミノ酸、油脂、デンプン、タンパク質、フエノール、炭化水素、セルロース、天然ゴム、色素、酵素、抗体、ワクチン、医薬品、生分解性プラスチックなどが含まれる。

本発明の植物は、該外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を有してレ、なレ、植物に、遣伝子工学的手法により外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が導入され、且つ安定に保持されたものである。ここで「安定に保持される」とは、少なくともポリアミン代謝関連酵素遺伝子が導入された当代の植物体で該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が発現し、それによって器官形成が改良するのに十分な期間、該植物細胞内に保持されることをいう。従って、現実的には、該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は宿主植物の染色体上に組み込まれるのが好ましレ、。該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は次世代に安定に遺伝することがより好ましい。

また、ここで「外因性」とは、植物が生来有しておらず、外部より導入されたものを意味する。従って、本発明の「外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子」は、遺伝子操作により外部より導入される、宿主植物と同種の (すなわち、該宿主植物由来の）ポリアミン代謝関連酵素遺伝子であってもよい。コドン使用（codon usage)の同一性を考慮すれば、宿主由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子の使用もまた好ましい。

外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子はレヽかなる遺伝子工学的手法によって植物に導入さてもよぐ例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を有する異種植物細胞とのプロトプラスト融合、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を発現するように遺伝子操作されたウィルスゲノムを有する植物ウィルスによる感染、あるいはポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含有する発現ベクターによる宿主植物細胞の形質転換が挙げられる。

好ましくは、本発明の植物は、植物中で機能し得るプロモーターの制御下にある外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含む発現べクターで、該外因性ポリァミン代謝関連酵素遺伝子を有していない植物の細胞を形質転換することにより得られる、トランスジエニック植物である。

植物中で機能し得るプロモーターとしては、例えば、植物細胞で構成的に発現する力リフラワーモザイクウィルス (CaMV)の 35Sプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子（NO s)プロモーター、ォクトピン合成酵素遺伝子（ocs)プロモーター、フエ二ルァラニンアンモニアリアーゼ（PAL)遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ（CHS)遺伝子プロモーター等を挙げることができる。さらにこれらに限定されない公知の植物プロモーターも挙げられる。

35Sプロモーターのような器官全体に恒常的に発現させるプロモーターだけでなぐ器官または組織特異的プロモーターを用いれば、特定の器官、又は組織だけに目的遺伝子を発現させることができ、特定の器官又は組織だけ器官形成を改良することができる。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と花器に特異的に働くプロモーター (例えば、 W099/43818,特開平 11 - 178572、特開 2000- 316582)を用いることによって、花の器官のみで花の数や花の開花期を改良することができる。さらに、果実、子房に特異的に働くプロモーター（例えば、 Plant Mol. Biol, 11, 651-662， 1988)を用いることによって、子房、果実の生育ゃ努達期間を改良することができる。 '

時期特異的なプロモーターを用いれば、特定の時期だけに目的遺伝子を発現させることができ、特定の時期だけに器官形成を改良することができる。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と栄養生長期に働くプロモーターを用いることによって、栄養生長期のみで器官形成を改良することができる。'

低温、高温、塩、乾燥、光、熱、ホルモンあるいは傷害等の調節性のプロモーターを用いれば、生活環境に応じて目的遺伝子を発現させることができる。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と植物が低温に遭遇した時だけ転写を起こさせ得るプロモーター (例えば、 BN115プロモーター： Plant Physiol., 106, 917-928， 1999)を用いることによって、低温時のみ植物体のポリアミン代謝を制御し器官形成を改良することができる。さらに、ポリァミン代謝関連酵素遺伝子と植物が乾燥に遭遇した時だけ転写を起こさせ得るプロモーター（例えば、 Atmyb2プロモーター： The Plant Cell, 5， 1529-1539, 1993)を用いることによって、乾燥時のみ植物体のポリアミン代謝を制御し器官形成を改良することができる。本発明の発現ベクターにおいて、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は、植物中で機能し得るプロモーターによりその転写が制御されるように、該プロモーターの下流に配置される。該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の下流には、植物で機能し得る転写終結シグナル (ターミネータ一領域）がさらに付加されてレ、ることが好ましい。例えば、ターミネ一ター NOS (ノパリン合成酵素)遺伝子等が挙げられる。本発明の発現ベクターは、ェンハンサー配列等のシス調節エレメントをさらに含んでもよい。また、該発現べクタ一は、薬剤耐性遺伝子マーカーなどの形質転換体選抜のためのマーカー遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ ΙΙ (ΝΡΉΙ)遺伝子、ホスフイノスリシンァセチルトランスフェラーゼ (PAT)遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子等をさらに含んでもよい。選択圧をかけない条件では、組み込まれた遺伝子が脱落する現象が起こる場合があるので、除草剤耐性遺伝子をベクター上で共存させておけば、栽培中該除草剤を使用することにより、常に選択圧力 Sかかった条件を実現できるという利点もある。 '

さらに、大量調製おょぴ精製を容易にするために、該発現べクタ一は、大腸菌での自律複製を可能にする複製起点おょぴ大腸菌での選択マーカー遺伝子 (例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等）を含むことが望ましい。本発明の発現べクターは、簡便には、 pUC系または pBR系の大腸菌ベクターのクローユング部位に上記ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現カセットと必要に応じて選択マーカー遺伝子を揷入することにより構築することができる。

ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens)ゃァグロバクテリゥム · リゾゲネス (Agrobacteriumu rhizogenes)による感染を利用して外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入する場合には、該細菌が保持する Tiまたは Riプラスミド上の T— DN A領域 (植物染色体に転移する領域）内に該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子発現カセットを挿入して用いることができる。現在、ァグロパクテリゥム法による形質転換の標準的な方法ではバイナリーベクター系が使用される。 T—DNA転移に必要な機能は、 T— DNA 自身と Ti (または Ri)プラスミドの両者カゝら独立に供給され、それぞれの構成要素は別々のベクター上に分割できる。バイナリ一プラスミドは丁— DNAの切り出しと組込みに必要な両端の 25bpボーダー配列を有し、クラウンゴール (または毛状根)を引き起こす植物ホルモン遺伝子が除去されており、同時に外来遺伝子の揷入余地を与えている。このようなバイナリーベクターとして、例えば ρΒΙΙΟΙや pBI121 (ともに CLONTECH社)などが市販されている。なお、 T一 DNAの組込みに作用する Vir領域は、ヘルパープラスミドと呼ばれる別の Ti (または Ri)プラスミド上にあってトランスに作用する。

植物の形質転換には、従来公知の種々の方法を使用することができる。例えば、セルラーゼやへミセルラーゼなどの細胞壁分解酵素処理により、植物の細胞からプロトプラストを単離し、該プロトプラストと上記ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現カセットを含む発現ベクターとの懸濁液にポリエチレングリコールを加えてエンドサイト一シス様の過程で該発現ベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法 (PEG法)、ホスファチジルコリン等の脂質膜小胞内に超音波処理等により発現ベクターを入れ、該小胞とプロトプラストを P EG存在下に融合させる方法 (リボソーム法）、ミニセルを用いて同様の過程で融合させる方法、プロトプラストと発現ベクターの懸濁液に電気パルスを印加して外液中のベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（エレクト口ポレーシヨン法）が挙げられる。しかしながら、これらの方法は、プロトプラストから植物体へ再分化させる培養技術を必要とする点で煩雑である。細胞壁を有するインタタトな細胞への遺伝子導入手段としては、マイクロピペットを細胞に刺し込み、油圧やガス圧でピペット内のベクター DNAを細胞内に注入するマイクロインジェクション法、および DNAをコーティングした微小金粒子を火薬の爆発やガス圧を利用して加速し、細胞内に導入するパーティクルガン法等の直接導入法と、ァグロパクテリゥムによる感染を利用した方法とがある。マイクロインジェクションは操作に熟練を要し、また、扱える細胞数が少ないという欠点がある。従って、操作の簡便性を考慮すれば、ァグロバタテリゥム法おょぴ、パーティクルガン法により植物を形質転換することが好ましい。パーティクルガン法は、栽培中の植物の頂端分裂組織に直接遺伝子を導入することが可能である点さらに有用である。また、ァグロパクテリゥム法において、バイナリーべクタ一に植物ウィルス、例えばトマトゴールデンモザイクウィルス (TGMV)等のジエミ-ウィルスのゲノム DNAをボーダー配列の間に同時に挿入することにより、栽培中の植物の任意の部位の細胞に注射筒などを用いて菌懸濁液を接種するだけで、植物体全体にウィルス感染が拡がり、同時に目的遺伝子も植物体全体に導入される。

以下に、具体例として、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の取得方法とァグロバタテリゥムによる目的遺伝子の導入および形質転換植物の作出方法を例示するが、内因 '14ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子に関しても以下の記載を参考にして当業者は容易に植物に導入し、形質転換植物を作出することが可能である。

1.ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の取得

( l) PCR用 cDNAライブラリーの作製

昼 18°〇ノ夜 14°C . 3日間の低温処理を行ったクロダネカボチヤ Cucurbita ficifolia

Bouche)の根組織から常法に従い、 poly (A) +RNAを抽出する。単離した poly (A) +RN Aから市販の Marathon cDNA Amplification Kit (CLONTECH社製）等を用いて PCR用に使用する cDNAライブラリーを作製することができる。単離した poly (A) +RN Aを铸型として、 3 '末端に 2つの degenerate nucleotide positionを持つ修飾 lock— docking oligo (dT)プライマーと逆転写酵素を用いて first—strand cDNAを合成し、ポリメラーゼ反応によって 2本鎖化した cDNAを得る。該 2本鎖 cDNAを T4 DNA ポリメラーゼにより末端を平滑化し、 Marathon cDNAアダプターをライゲーシヨン反応により結合させ、アダプター結合二本鎖 cDNAライブラリーを作製する。

(2) PCRプライマーの設計

ポリアミン代謝関連酵素遺伝子として SPDS遺伝子、 SAMDC遺伝子、 ADC遺伝子、 ODC遺伝子を単離することができる。 SPDS遺伝子はシロイヌナズナゃヒヨス、 SAMDC 遺伝子はジャガイモ、ホウレンソゥ、タバコ、 ADC遺伝子はダイズ、エンドゥ、トマト、 ODC 遺伝子はチョウセンアサガオ (Datura)等から単離されており、既に塩基配列が決定している。従って、決定している既知の塩基配列を比較し、非常に保存されてレ、る領域を選抜し、 DN リゴマーを合成し PCR用プライマーを設計することができる。

(3) PCRによる SPDS遺伝子、 SAMDC遺伝子、 ADC遺伝子断片の取得

上記（1)の方法で作製した PCR用 cDNAライブラリーをテンプレートとして、上記（2)の方法で設計したプライマーを使用して、それぞれ PCRを行う。 PCR産物をゲル電気泳動で分離し、グラスミルク法などで精製する。精製した PCR産物は TAベクターなどのクロー · ユングベクターに連結させる。

クローン化された cDNAの塩基配列の決定は、 Maxam— Gilbert法あるいはダイデォキシ法等により決定できる。いずれの方法も市販されているキットを用いて行うことができ、配列決定を自動的に行うオートシーケンサーを使用してもよい。

(4)完全長遺伝子の単離

完全長の遺伝子を得るためには、常法に従って、プラークハイブリダィゼーシヨス RA CE (rapid amplification of cDNA ends)法や Marathon RACE法等により完全長の遺伝子を得ることができる。

このようにして取得した遺伝子は、ポリアミン生合成に関与する遺伝子であり、この遺伝子を利用して巧妙に、即ち、遺伝子発現を分子生物学的に制御することにより、ポリアミンレベルの制御が可能となり、種々の器官形成が改良された植物の作出も可能になる。 2.シロイヌナズナにおけるァグロパクテリゥムによる目的遺伝子の導入、および形質転換植物の作出。

上記 1.で取得した遺伝子を植物宿主に導入することにより、種々の器官形成、特に茎、葉、花、子房、果実、さや、種子などの器官形成が改良された特性を有するトランスジニック植物を作出することができる。

(1)発現コンストラクトの作製おょぴ、ァグロパクテリゥムの形質転換

発現コンストラ外の作製は前記 1.で得られたポリアミン代謝関連酵素遺伝子をオーブンリーディングフレームをすベて含むような適当な制限酵素で切断後、必要に応じて適当なリンカ一を連結し、植物形質転換用ベクターに揷入して作製することができる。植物形質転換用ベクターとしては、 pBI101、 pBI121などを用いることができる。

作製した発現コンストラクトを大腸菌中で増幅後、発現コンストラクトをァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス C58、 LBA4404、 EHA101等に、三者接合法 (Nucleic Acid Research, 12, 8711, 1984)、凍結融解法、エレクト口ポレーシヨン法等により形質転換することができる。例えば、三者接合法は目的遺伝子を含んだ発現コンストラクトを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド（例えば pRK2013等）を保有する大腸菌、およびァグロパクテリゥムを混合培養して、抗生物質 (例えばリフアビシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン等)を含んだ培地上で培養することによって形質転換ァグロバタテリゥムを得ることができる。

(2)トランスジヱニック植物の作出

本発明において、遺伝子導入を行う植物としては、植物体全体、植物器官 (例えば葉、茎、根、花器、生長点、種子等)、植物組織 (例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）、植物培養細胞などを挙げることができる。

(1) で作製した形質転換ァグロパクテリゥムを例えばカルス再生法（Plant Cell Reports, 12, 7 - 11， 1992) で植物に感染させて目的遺伝子を導入することができる。すなわち、シロイヌナズナの種子を常法に従って、 MS Oプレート (ムラシゲ .スターグ無機塩類 4. 6 g、ショ糖 10 g、 1 Θ 00 Χビタミンストツク液 1 m 1 Zリットル、 pH6. 2) に播種し、無菌的に栽培する。発根した根の切片を用いて C I Mプレート（MSOプレートに 2, 4—ジクロロフエノキシ酢酸を終濃度 0. 5 μ gZm 1、力イネチンを 0. 05 _§Ζηι1となるように加えたもの）上でカルス培養を行う。プロモーターに目的遺伝子を接続し、カナマイシン及ぴハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドにより形質転換したァグロパクテリゥムを培養し、希釈したものをチューブに分注し、カルス化した根の切片を浸し、数日間 C IMプレート上で共存培養する。菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖したら、除菌操作を行い、 S IMCプレート（MSO プレートに、 N6- [2-イソペンテニル] アデニンを終濃度 5 μ gZm 1、インドール酢酸（I AA) を終濃度 0. 1 5 _§/111 1、クラフォランを終濃度 500 μ gZm 1 となるように加えたもの）上で数日間培養を行う。これらの切片を最終的に S IMCSプレート（カナマイシンおょぴハイグロマイシン Bを含有するプレート）上で培養し、 1週間ごとに新しいプレートに移植を繰り返す。形質転換した切片は増殖を続け、カルスが現れてくる。抗生物質で選択しているため、非形質転換切片は褐変する。形質転換体が 5 mm程度の大きさになり、ロゼット葉を形成するまで培養する。完全なロゼットの形状を示すようになったら、形質転換体の根元をカルス部分を含まないようにメスで切り取り、 R IMプレート（M SOプレートに I AAを終濃度 0. 5 μ g/m 1となるように加えたもの）に移植する。大きなカルスが付いていると、発根してもカルスを介して根が出ていて、ゼットとは維管束がつながつていないことが多い。約 8〜10日後、無機塩類培地〔5mM KN0₃ 、 2. 5 mM K—リン酸緩衝液（ρΗ5. 5) 、 2m M Mg S0₄ 、 2mM C a (N0₃) ₂ 、 50 Μ F e— EDTA、 100 0ズ微量要素（70111^1 H₃ B0₃ 、 14 mM MnC l₂ 、 0. 5 mM C u SOい 1 mM ZnS〇₄ 、 0. 2 mM NaMo〇₄、 10 mM Na C l、 0. 01 mM C o C 1₂ ) 1 m 1 Zリットル〕に浸したロックウール上に定植する。開花し、さやを形成した植物体は無機塩類培地に浸した土に移植し、種子を得ることができる。この種子を滅菌処理し、 MSH (MS Oプレートのハイグロマイシン Bを終濃度 5U/m 1 となるように加えたもの）に播種して発芽させることにより形質転換体を得ることができる。

さらに、（1)で作製した形質転換ァグロパクテリゥムを例えば減圧浸潤法 (The Plant Journal, 19(3), 249-257, 1999)で植物に感染させて目的遺伝子を導入することができる。すなわち、シロイヌナズナの種子を常法に従って培養土 (例えばメトロミックス等）に播種して、 22°C、長日条件下 (例えば 16時間日長 · 8時間暗黒等)で栽培する。約 3〜4週間後に伸長した主軸 (花茎)を切除して、側枝の誘導を開始させる。摘心約 1週間をに培養した形質転換ァグロバタテリゥム懸濁液にシロイヌナズナを浸し、これをデシケーターに入れてバキュームポンプで約一 0. 053Mpa (400mmHg)になるまで吸引後、 10分間、室温放置する。感染後の鉢を深底トレイに移して、横倒しに置き、トレイの底に少量の水を滴下して透明な覆いを被せ多湿条件下で約 1日放置する。感染後の鉢を起こして、 2 2°0長日条件下で栽培を開始して、種子の収穫を行う。

約 2〜4週間の間、種子の収穫を行い、収穫した種子は茶こしなどで莢やゴミを取り除き、デシケーター内で乾燥保存する。

トランスジエニック植物体の選択は、収穫した種子を常法に従って殺菌処理して、約 9m 1の 0. l%寒天水溶液に懸濁して、選択培地（例ぇば、l XMS塩、l XGamborgB5ビタミン、 1% Sucrose, 0. 5g/l MES、 0. 8% 寒天、 lOOmg/1 カルペニシリン、 50 mg/1 カナマイシン、 40mg/l ハイグロマイシンなど）に広げ、 22°Cで無菌栽培する。抗生物質に対して抵抗性を示すトランスジェニック植物体は順調に生長して、約 1〜2週間で同定することができる。本葉が約 4〜6枚展開したトランスジエニック植物体を培養土を含んだ鉢に移植して 22°Cで長日栽培を開始する。

得られたトランスジェニック植物より、常法に従って DNAを抽出し、この DNAを適当な制限酵素で切断し、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子をプローブとして用いてサザンハイプリダィゼーシヨンを行い、遺伝子導入の有無を確認することができる。

また、トランスジエニック植物や、非トランスジエニック植物より、常法に従つて R NAを抽出し、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子のセンス配列、もしくはァンチセンス配列を有するプローブを作製し、これらのプローブを用いてノーザンハイブリダィゼーションを行い、目的遺伝子の発現の状態を調べることができる。また、得られたトランスジエニック植物からカノレス誘導を行い、カルスを作出することができる。

減圧浸潤法で得られたトランスジヱニック植物 (T1)の、自家受粉により得られる T2種子の形質転換出現比率は、通常メンデルの法則に従う。例えば、該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が一遺伝子座にヘテロ (heterozygous)に組み込まれた場合、 T2種子では形質転換体は 3 : 1の割合で分離する。 T2種子を栽培して、自家受粉させて得られる T3種子において、形質転換体がすべての種子で出現すれば、該 T2形質転換植物はホモ接合体 (homozygote)であり、該形質転換植物が 3： 1に分離すれば、該 T2形質転換植物は導入されたポリアミン代謝関連酵素遺伝子についてヘテロ（heterozygote)であると決定できる。 '

このようにして選抜された、導入されたポリアミン代謝関連酵素遺伝子についてホモ接合体である植物は、改良された器官形成が固定された系統として、種子産業の分野において極めて有用である。

上記に示した、サザン解析やノーザン解析でポリアミン代謝関連酵素遺伝子の遺伝子 . 発現解析を行ったトランスジェニック植物はポリアミン含量や種々の器官形成の評価を行うことができる。

例えば、ポリアミンの定量は、 0. 05〜： Lgの試料をサンプリングして、 5%過塩素酸水溶液をカ卩えて、ポリアミンを抽出する。抽出したポリアミンの定量はダンシルイ匕またはべンゾィル化等で蛍光標識した後、 UVまたは蛍光検出器を接続した高速液体クロマトグラフィ一 (HPLC)を用いて内部標準法で分析することができる。

例えば、種々の器官形成の評価は、茎形成の評価は、トランスジエニック植物の自家受粉で得られた T2種子又は T3種子を適当な生育培地又は生育土壌に播種し、長日条件下（昼 Z夜： 16時間 Z8時間日長）、 20〜25°Cで生育させて茎（例えば主花茎、側花茎、枝など)の数や形等を調べることにより評価することができる。葉形成の評価は、トランスジヱニック植物の自家受粉で得られた T2種子又は T3種子を適当な生育培地又は生育土壌に播種し、長日条件下（昼 Z夜： 16時間 /8時間日長）、 20〜25°Cで生育させて葉 (例えばロゼット葉、本葉など）の数や形等を調べることにより評価することができる。花形成の評価は、トランスジエニック植物の自家受粉で得られた T2種子又は T3種子を適当な生育培地又は生育土壌に播種し、長日条件下 (昼 Z夜： 16時間 Z8時間日長）、 20〜 25°Cで生育させて花の数や開花時期、開花期間おょぴ形、色等を調べることにより評価することができる。子房形成の評価は、トランスジエニック植物の自家受粉で得られた T2 種子又は T3種子を適当な生育培地又は生育土壌に播種し、長日条件下 (昼 Z夜： 16 時間 Z8時間日長）、 20〜25°Cで生育させて子房 (例えばさや、果実など)の数、形、色ゃ着果力成熟までの発達期間等を調べることにより評価することができる。種子形成の評価は、トランスジェユック植物の自家受粉で得られた T2種子又は T3種子を適当な生育培地又は生育土壌に播種し、長日条件下 (昼 Z夜： 16時間 /8時間日長）、 20〜2 5°Cで生育させて種子の数や形、収穫後に発芽率等を調べることにより評価することができる。

本発明の形質転換される植物は、特に限定されるものではないが、双子葉植物、単子葉植物、草本性植物、木本性植物などが挙げられる。例えば、サツマィモ、トマト、キユウリ、カボチヤ、メロン、スイカ、タバコ、シロイヌナズナ、ピーマン、ナス、マメ、サトイモ、ホウレンソゥ、ニンジン、イチゴ、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、アルファルファ、コムギ、ォォムギ、ダイズ、ナタネ、ソルガム、ユーカリ、ポプラ、ケナフ、杜仲、サトウキビ、ァカザ、ユリ、ラン、カーネーション、バラ、ペチュニア、トレユア、キンギヨソゥ、シクラメン、カスミソゥ、ゼラ-ゥム、ヒマヮリ、シバ、ヮタ、マツタケ、シィタケ、キノコ、チョウセンニンジン、柑橘類、バナナ、キウイ、キヤッサパ、サゴヤシ等が挙げられる。好ましくは、サツマィモ、ジャガイモ、トマト、キユウリ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、ペチュニア、トレニァ、ユーカリ、ヮタである。

本発明により、植物の種々の器官形成を改良することができ、植物の器官や組織の品質、価値、生産性、収量の向上、或いは矮小化による耐倒伏性の向上などが期待できる。具体的には、茎、葉、花、子房、果実、さや、種子の数が増加することによって、該器官が農作物として生産される場合、品質、生産性、収量の増加が期待される。例えば、イネは 1株当たりの種子数が増加することで収穫できる米の収量が増大することが期待できる。トウモロコシは 1株当たりの雌穂の数が増加することで穀粒の収量が増大することが期待できる。ダイズは 1株当たりのサャの数が増加することでマメの収量が增大することが期待できる。ヮタは 1株当たりのコットンポールの数が増加することで収穫できる繊維の収量が増大することが期待できる。サッマイモゃジャガイモは塊根や塊茎の数が増加することでィモの収量が増大することが期待できる。果樹は着果した果実 (子房）の数が増カロして、発達期間が長くなることで生産性の向上が期待される。観賞植物は花、茎、葉、特に花の数が増加し、かつ開花期間が延長されたり、ミニチュア化することで見栄えが良くなり、商品価値が高まることが期待される。さらに、植物の形や形態を変化させることで様々な環境適応性が向上し、栽培の安定化、生産性の向上、栽培地域の拡大なども期待できる。発明を実施するための最良の形態以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子のクローユング

(1)ポリ（A) ⁺RNAの調製

クロダネカポチヤ (Cucurbita ficifolia Bouche)をバーミキユライトに播種し、子葉展開時に市販の床土 (サンサン床土；タキイ種苗社製)を詰めた鉢に移植した。鉢上げしたクロダネカボチヤを植物栽培用のインキュベーター（気温昼 26°CZ夜 22°C、 13時間日長）内に置いた。第 2本葉展開時にインキュベーター内の温度を昼 18°C/夜 14°Cまで下げ低温処理を開始した。低温処理 3日後に、根、茎、葉に分けてサンプリングした。 RNA抽出まで一 80°Cのフリーザーに保存した。

約 4gのクロダネカボチヤの根組織を直ちに液体窒素中で凍結し、液体窒素存在下乳鉢で細力べ粉砕した。その後、 10 mlの抽出用 0.2Mトリス酢酸緩衝液〔5M guanidine thiocyanate、 0.7% β一 mercaptoethanol、 1 %polyvmylpyrrondone (M. W.360,000)、

0.62%N-Lauroylsarcosine Sodium Salt, pH8.5)をカ卩ぇポリトロンホモジナイザー

(KJNEMATICA社製）を用レ、氷冷下 2分間粉碎した。ただし、 β—メルカプトエタノールとポリビニルピロリドンは使用する直前に添加した。その後、粉碎液を 17，000 X gで 20分間遠心分離し、上清を回収した。

この上清をミラクロスに濾過し、その濾液を超遠心分離管に入れた 5.7M塩ィ匕セシウム溶液 1.5 mlに静かに重層し、 155,000 Xg、20°Cで 20時間遠心した後、上清を捨て RNA の沈殿を回収した。この沈殿を 3mlの 10mM Tris-HCl、 ImM EDTA'2Na、pH8.0 (TE緩衝液と呼ぶ）に溶解し、さらに等量のフエノール:クロ口ホルム：イソアミルアルコール (容積比、 25:24:1)を加え良く混合した後、遠心分離を行って上層の水層を回収した。得られた水層に、 1/10倍量の 3M酢酸ナトリウム (氷酢酸で pH6.2に調製)と、 2.5倍量のエタノールを添加して良く混合し、 -20°Cでー晚静置した。その後、 17,000 Xgで 20分間遠心分離し、得られた沈殿を 70%エタノールで洗浄して減圧乾燥した。

この乾燥標品を 500 1の前述の ΤΕ緩衝液に溶解し、全 RNA溶液を得た。この RNA 溶液を 65°Cで 5分間インキュベートした後、氷上で急冷した。これに 2 X結合緩衝液 (10mM Tris-HCl、5mM EDTA'2Na、 lMNaCl、0.5% SDS、pH7.5)を等量になるように RN A溶液に加え、平衡化緩衝液（10mM Tris-HCl、5mM EDTA'2Na、0.5M NaCl、0.5% SDS、 pH7.5)で予め平衡化したオリゴ dTセルロースカラム (Clontech社製）に重層した。次いで、カラムを約 10倍量の前述の平衡化緩衝液で洗浄した後、溶出緩衝液（10mM Tris-HCl、 5mM EDTA-2Na,pH7.5)で poly(A)+R Aを溶出した。

得られた溶出液に 1/10倍量の前述の 3M酢酸ナトリウム水溶液と、 2.5倍量のエタノールを加え混合し、 -70°Cで静置した。その後、 10,000 X gで遠心分離を行なレ、、得られた沈殿を 70%エタノールで洗浄して減圧乾燥した。この乾燥標品を再度 500 μ 1の ΤΕ緩衝液に溶解し、オリゴ dTセルロースカラム精製を繰り返し行った。得られた低温処理したクロダネカポチヤの根由来の p₀ly(A)+RNAは PCR用の cDNAライブラリーと完全長遺伝子単離用の cDNAライプラリーの作製に用 1/ヽた。

(2) PCR用 cDNAライブラリーの作製

cDNAライブラリーの作製は Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech社製）を使用した。（1)で得られたクロダネカポチヤの根由来の poly(A)+RNAを铸型として 3'末端に 2 つの degenerate nucleotide positionを持つ修飾 lock-dockingォリコ (dT)プライマーと；^ 転写酵素を用い、 Gublerと Hoffinanらの方法（Gene, 25, 263-269 (1983))に従い 2本鎖 cDNAを合成した。

得られた cDNAの両末端に Marathon cDNAアダプター（T4 DNA ligaseにより ds cDNAの両末端へ結合しやすくなるように 5'末端をリン酸ィヒしたもの）を連結した。得られたアダプター結合の cDNAをクロダネカボチヤ根由来の PCR用 cDNAライブラリ一とした _c (3)>PCR用プライマーの設計

既に植物や哺乳類から単離されているアルギニン脱炭酸酵素遺伝子、 S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素遺伝子、スペルミジン合成酵素遺伝子の決定されてレ、る塩基配列を比較した。そして、非常に相同性が高く保存されてレ、る領域を選び出し、 DNAオリゴマ一を合成した (配列プライマー I〜VI)。

SPDSプライマー I (配列番号 7)： 5' -GTTTTGGATGGAGTGATTCA-3'

SPDSプライマー II (配列番号 8)： 5， - GTGAATCTCAGCGTTGTA- 3'

SAMDCプライマー III (配列番号 9)： 5' -TATGTGCTGTCTGAGTCGAGC-3'

SAMDCプライマー IV (配列番号 10) : 5' - GCTAAACCCATCTTCAGGGGT- 3'

ADCプライマー V (配列番号 11)： 5' _GGGCT(T/G)GGA(G/A)T(G/C)GACTA(C/T)-3' ADCプライマー VI (配列番号 12)： 5， - (T/C)CC(A/G)TC(A/G)CTGTC(G/A)CA(G/C)GT - 3'

(4) PCRによる増幅

(2)で得られた PCR用 cDNAライブラリーをテンプレートとして、 (3)で設計した配列プライマーを用いて PCRを行った。 PCRのステップは最初、 94°C、 30秒、 45°C、 1分間、 7 2°C、 2分間で 5サイクル、続いて 94°C、 30秒、 55°C、 1分間、 72°C、 2分間で 30サイクル行った。

(5)ァガロースゲル電気泳動

PCR増幅産物を 1. 5%ァガロース電気泳動を行い、泳動後のゲルをェチジゥムブロマイド染色し、 UVトランスイルミネーター上で増幅バンドを検出した。

(6) PCR産物の確認と回収

検出された増幅パンドを確認し、力ミソリの刃を用いてァガロースゲルから切り出した。切り出したゲノレを 1. 5mlのマイクロチューブに移し、 QIAEXII Gel Extraction Kit (QIAGEN社製)を用いてゲルから DNA断片の単離精製を行った。回収した DNA断片を pGEMTクローニングベクター（Promega社製）にサブクローユングし、大腸菌に开質転換後、常法に従ってプラスミド DNAを調製した。

(7)塩基配列決定

得られたプラスミドの挿入配列の塩基配列決定をダイデォキシ法 (Messing, Methods in EnzymoL, 101, 20-78, 1983)により行った。 SPDS遺伝子については 3種類の遺伝子、 S AMDC遺伝子については 1種類の遺伝子、 ADC遺伝子については 2種類の遺伝子が単離された。

(8)ホモロジ一検索

これらの遺伝子の塩基配列を既知遺伝子塩基配列のデータベースとホモロジ一サーチを行うと SPDS遺伝子は既知の植物由来の SPDS遺伝子と 70%の相同性を示した。 SA MDC遺伝子については既知の植物由来の SAMDC遺伝子と 70%以上の相同性を示した。 ADC遺伝子については既知の植物由来の ADC遺伝子と 67%以上の相同性を示した。

(9)完全長遺伝子の取得

完全長遺伝子はプラークハイブリダィゼーシヨン法で取得した。 cDNAライブラリーの作製は ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製）を使用した。（ 1 )で得られたクロダネカボチヤ根由来の poly(A)+RNAを鎳型としてオリゴ (dT)プライマーと逆転写酵素を用い、 Gublerと Hoffmanらの方法（Gene, 25, 263-269 (1983))に従い 2本鎖 cDNAを合成した。得られた cDNAの両末端に EcoRIアダプター（内部に ho Iと Spe Iサイトを持つ）を連結し、 Xho Iで消化した後、それを λファージベクター、 λ ZAP IIアームの EcoRIと Xho I部位に連結後、インビトロパッケージングキット（Stratagene社製、 GIGAPACK Gold)を用い、パッケージングを行ない、大腸菌 SURE株（OD660=0.5)に感染させることにより多数の組換ええファージを得た。これをクロダネカボチヤ根由来の cDNAライブラリ一とした。このライブラリーのサイズは 8.0 X 10⁶であった。

プローブの作製は（6)で調製した SPDS、 SAMDC、 ADC遺伝子のプラスミド DNAからインサート cDNAを単離 ·調製し、得られた cDNAを鎳型として、 Random Primed DNA Labeling Kit(USB社製)を用いて、標識プローブを作製した。得られた³² P標識 cDNAをプローブに用レヽた。

前記、クロダネカボチヤ根由来の cDNAライブラリーを構成するファージを大腸菌に感染させて LB寒天培地上で増殖させ、約 50,000個のファージ DNAをナイロンメンブレン (ハイポンド一 N、アマシャム社製）に写し取った。

ファージ DNAを写し取ったナイロンメンブレンをアルカリ変性液 (0.5M NaOH、1.5M NaCl)を含んだ濾紙上に移し、 4分間放置し、次に中和液（0.5M Tris-HCl, 1.5M NaCl、 pH8.0)を含んだ濾紙上に移し 5分間放置した。 2 X SSC (0.3M NaCl、0.03Mクェン酸三ナトリウム）で洗浄した後、メンプレンをストラタリンカ一 (Stratagene社製）を用い DNAの固定を行なった。固定処理を行なったナイロンメンブレンをハイプリダイゼーシヨン溶液 (50%ホルムアミド、 0.5%SDS、 6 X SSPE (3M NaCl、 0.2M NaH₂P0₄、 20mM EDTA'2Na、 pH7.4)、 5 Xデンハルト溶液 (0.1% Ficoll、 0.1% Polyvinylpyrrolidone, 0.1% bovine serum albumin)、 50 μ g/ml変性サケ精子 DNAを含有中にぉレ、て、 42°Cで 3時間プレハイブリさせ、作製した cDNAプローブを加え 42°Cで 18時間ハイプリダイズさせた。その後、メンブレンを取り出し、 2 X SSC、 1 X SSC、0.5 X SSCおよび 0.1 X SSCを含有する溶液を用いて、 42°Cで 1時間〜 2時間洗浄した。このメンブレンを乾燥した後、 X線フィルムを密着させて一晩感光させた。

その結果、 SPDS、 SAMDC、 ADC遺伝子断片力得たプローブでノヽイブリダィズした陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンのファージ DNAそれぞれから、インビボ 'ェクシジョン法により cDNAインサートを持つプラスミドクローンを調製した。インビボ 'ェクシジョン法は、 ZAP-cDNA Synthesis Kit (stratagene社製）の方法に従った。

SPDS遺伝子、 SAMDC遺伝子、 ADC遺伝子を含む各ファージ液 200 μ 1、大腸菌 XLl-Blue懸濁液 200 μ 1、ヘルパーファージ R408懸濁液 1 μ 1を混ぜ 37°Cで 15分間ィンキュペートした後、 3mlの 2 X YT培地を加え 37°Cで 2時間振盪培養し、 70°Cで 20分間処理し、遠心分離 (4,000 X g、 10分間）して上清を回収した。得られた上清 30 / ^と大腸菌 SURE懸濁液 30 μ 1を混ぜ、 37°Cで 15分間インキュベートした後、アンピシリンを 50ppm含む LB寒天培地に数植菌し、 37°Cでー晚培養した。コロニーを形成した大腸菌は、 cDNAインサートを持つプラスミドクローンを含んでいた。これらのプラスミドの揷入配列の塩基配列決定を、ダイデォキシ法 (Messing, Methods in EnzymoL, 101, 20-78, 1983)により行った。その結果、開始コドンを含むプラスミドであることが明らかとなった。得られた完全長のクロダネカボチヤ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子を FSPD1 (配列番号 1, 2)、 S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素遺伝子を FSAM24(配列番号 3, 4)、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子を FADC 76 (配列番号 5， 6)と命名した。

得られた FSPD1と既知の植物由来のスペルミジン合成酵素遺伝子とアミノ酸比較を行つた（表 1)。表 1の結果からクロダネカボチヤ根由来の FSPD1は他の植物由来の SPDS 遺伝子とアミノ酸レベルで高レ、相同性を示した。

表 1

クロダネカボチヤ由来 FSPD1遺伝子と他の SPDS遺伝子の比較

得られた FSAM24と既知の植物由来の S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素遺伝子とアミノ酸比較を行った (表 2)。表 2の結果からクロダネカボチヤ根由来の FSAM24は他の植物由来の SAMDC遺伝子とアミノ酸レベルで高レ、相同性を示した。クロダネカポチヤ由来 FSAM24遺伝子と他の SAMDC遺伝子の比較

得られた FADC76と既知の植物由来のアルギニン脱炭酸酵素遺伝子とアミノ酸比較を行った（表 3)。表 3の結果からクロダネカボチヤ根由来の FADC76は他の植物由来の A DC遺伝子とアミノ酸レベルで高、相同性を示した。クロダネカボチヤ由来 FADC76遺伝子と他の ADC遺伝子の比較

実施例 2：トランスジエニックシロイヌナズナの作製

(1)発現コンストラクトの作製

配列番号 1に示したポリアミン代謝関連遺伝子 FSPD1の塩基配列よりオープンリーデイングフレームをすベて含むように、 Xholで切断し、グラスミルク法で精製した。次に pGE M— 7Zf (Promega社製）を Xhol切断して、 FSPD1断片をセンスとアンチセンス方向にそれぞれサブクロー-ングした。 pGEM— 7Zfのマノレチタローニングサイトの制限酵素 X balと Kpnlで再度 FSPD1断片を切り出して、 35Sプロモーターが連結しているバイナリ一ベクター ρΒΙΙΟΙ— Hm2にサブクローニングした。これらのプラスミドを pBI35S— FSP D1 +/—と命名した。その発現コンストラ外の構造を図 1に示した。なお、形質転換された大腸菌 JM109を、 Escherichia coli JM109/pBI35S— FSPD1+Z—と命名した。配列番号 3に示したポリアミン代謝関連遺伝子 FSAM24の塩基配列よりオープンリーデイングフレームをすベて含むように、 Notlで切断し、それぞれ平滑末端化した。これらの断片を平滑末端ィ匕した 35Sプロモーターが連結しているバイナリーベクター ρΒΙΙΟΙ 一 Hm2にセンス方向とアンチセンス方向にサブクローニングした。これらのプラスミドを p BI35S— FSAM24+/—と命名した。なお、形質転換された大腸菌 JM109を、 Esche richia coli JM109/pBI35S— FSAM24+/—と命名した。

配列番号 5に示したポリアミン代謝関連遺伝子 FADC76の塩基配列よりオープンリーデイングフレームをすベて含むように、 Notlで切断し、それぞれ平滑末端化した。これらの断片を平滑末端ィ匕した 35Sプロモーターが連結してレ、るバイナリーベクター ρΒΙΙΟΙ 一 Hm2にセンス方向とアンチセンス方向にサブクロ一ニングした。これらのプラスミドを p BI35S— FADC76+/—と命名した。なお、形質転換された大腸菌 JM109を、 Escher ichia coli JM109ZpBI35S— FADC76+/—と命名した。

(2)プラスミドのァグロパクテリゥムへの導入

(1)で得られた大腸菌 PBI35S— FSPD1 +/—、大腸菌 pBI35S— FSAM24+Z ―、大腸菌 pBI35S— FADC76+Z—とへノレパープラスミド pRK2013を持つ大腸菌 H B101株を、それぞれ 50mg/lのカナマイシンを含む LB培地で 37°Cで 1晚、ァグロパクテリゥム C58株を 50mg/lのカナマイシンを含む LB培地で 28°Cで 2晚培養した。各培養液 1. 5mlをエツペンドルフチューブに取り集菌したのち、 LB培地で洗浄した。これらの菌体を lmlの LB培地に懸濁後、 3種の菌を 100 1ずつ混合し、 LB培地寒天培地にまき、 28°Cで培養してプラスミドをァグロパクテリゥムに接合伝達 (三者接合法)させた。 1 から 2日後に一部を白金耳でかきとり、 50mg/lカナマイシン、 20mgZレヽィグロマイシン、 25mg/lクロラムフエ二コールを含む LB寒天培地上に塗布した。 28°Cで 2日間培養した後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体を C58/pBI35S— FSPD1 + Z—、 C58,pBI35S— FSAM24+/—、 C58/pBI35S— FADC76+Z—と命名した。トランスジエニックシロイヌナズナの作製は減圧浸潤法〔以下（3)〜 (6)〕または、力ノレス再生法〔以下 (7)〜（ 12)〕で行った。

(3)シロイヌナズナの栽培

培養土メトロミックス (ノヽイボネックスジャパン社製）をプラスチック鉢に入れ、表面を網戸用のメッシュで覆レ、、メッシュの間にシロイヌナズナコロンビア株（以下「コロンビア株」又は「野生株」とレ、う）の種子 (奈良先端科学技術大学院大学、河内孝之博士より提供)を 2〜 5粒づっ播種した。 2日間 *4°Cの低温室にいれ発芽処理後、 22°C，長日条件下（16時間日長 · 8時間暗黒）に移して栽培を行った。約 4〜6週間後に主軸花茎が 5〜： LOcm伸長した植物体について、摘心して側枝の誘導を行った。摘心約 1〜2週間後にァグロバタ 5 テリゥム感染処理を行った。

(4)ァグロバタテリゥム懸濁液の,調製

前記（2)で作製したァグロパクテリゥムを感染 2日前に、抗生物質 (50 z gZml カナマイシン、 20 μ g/ml ハイグロマイシン）を含んだ lOmlLB培地に植菌して 28°Cで 24時間振とう培養した。さらに、この培養液を分取して抗生物質 (50 ^ gZml カナマイシン、

10 20 μ g/ml ハイグロマイシン）を含んだ 1000ml LB培地に移して、さらに、 28。C、約 2 4時間振お培養した (OD,が 1. 2〜1. 5になるまで)。培養液を室温下で集菌して、 O D₆₀₀が 0. 8〜1になるように浸潤用懸濁培地（0. 5 X MS塩、 0. 5 X GamborgB5ビタミン、 1% Sucrose, 0. 5g/l MES、 0. 44 Μ ベンジルァミノプリン、 0. 02% Sil et-77)に再懸濁した。

15 (5)ァグロパクテリゥムの感染

前記（3)で作製したシロイヌナズナの鉢に前記 (4)で調製したァグロバタテリゥム懸濁液が培養土中に吸収されるのを抑えるために、鉢の培養土中に水を与えた。 1000mlのビーカーに約 200〜300mlのァグロバタテリゥム懸濁液を分取し、シロイヌナズナの鉢を逆さにして、植物体を懸濁液に浸けた。鉢を入れたビーカーをデシケーター内に入れ、

20 バキュームポンプで約一0. 053MPa (400mmHg)になるまで吸引後、約 10分間放置した。徐々に陰圧を解除した後、植物をァグロバタテリゥム懸濁液から取り出して、キムタオルで余分なァグロバクテリゥム懸濁液を取り除き、深底トレイに横倒しした。少量の水を入れて、サランラップを被せた。この状態で約 1日放置した。サランラップを外して、鉢を起こして約 1週間給水を停止した。その後、徐々に培養土に水を与え、約 3〜5週間の間、

25 成熟したさや力種子の収穫を行った。収穫した種子は、茶こしを用いて、さややゴミを取り除きデシケーター内に入れ十分に乾燥させた。

(6)形質転換植物の取得

前記（5 ) で取得した種子 1 0 Ο μ ΐ (約 2 0 0 0粒）を 1 . 5 m lのエツぺンドルフチューブに移して、 7 0 %エタノール中で 2分間、 5 %次亜塩素酸ナトリウム溶液中に 15分間それぞれ浸して、最後に滅菌水で 5回洗浄して種子の殺菌を行った。殺菌後の種子を 15m 1のファルコンチューブに移して、約 9ml 'の 0. 1%無菌寒天溶液を加えて、激しく混合した。種子 0. 1%寒天混合液をファージをプレートする要領で選択培地（1 XMS塩、 l XGamb o r gB 5 ビタミン、 1 % Su c r o s e, 0. 5 g/ 1 ME S、 0. 8% 寒天、 1 00mg/l 力ノレべニシリン、 5 Omg/ 1 カナマイシン、 40 m g / 1 ハイグロマイシン、 8 g/l Phy t a g a r, pH 5. 7) に均一になるように広げた。クリーンベンチ内で約 30分乾燥後、 4°C、 .2日間の低温処理後、 22°Cのグロースチャンバ一に移して、抗生物質に対して抵抗性を示す形質転換体を選抜した。本葉が 3〜 5枚した植物体を再度新しい選択培地に移して本葉が 4〜 6枚になるまで栽培した。抗生物質に対して抵抗性を示した形質転換植物

(T 1) を培養土を含んだ鉢に定植して、約 5〜 7日間多湿条件下で順ィヒさせた。順化後、 23°C、長日条件下（16時間日長 · 8時間暗黒）で栽培させた。得られた形質転 ^¾物（T 1) 、およぴ該形質転 m«物から得られた種子 (T2) 力、ら生育させた T 2植物体について PCRまたはサザンハイプリダイゼーシヨンによる導入遺伝子の解析とノーザンハイブリダィゼーションによる発現レベルの解析を行い、目的のポリアミン代謝関違酵素遺伝子が安定に組み込まれ、且つ発現している形質転換体を確認した。さらに、 T 2植物体から T 3種子を収穫し、抗生物質に対する抵抗性試験（分離比検定）を行って形質転換出現比率からホモ接合体（T2) を取得した。 T 2種子とホモ接合体から取得した T 3種子（T3ホモセルライン）を以下の実験に用いた。

(7) 無菌シロイヌナズナの栽培

シロイヌナズナ W a s s i l ew s k i j a株（以下 WS株と称す）の種子 (奈良先端科学技術大学院大学、新名惇彦博士より提供）数 10粒を 1. 5 ml チユーブに入れ、 70%エタノール lml を加え 3分間放置した。続いて滅菌液 ( 5 %次亜塩素酸ナトリウム、 0. 02%Tr i t o nX— 1 00) に 3分間浸し、滅菌水で 5回洗浄した後に、 MS Oプレート（ムラシゲースクーグ無機塩類 4. 6 g、ショ糖 10 g、 1000 Xビタミンストック液 1 ml/リットル、 p H 6. 2) に置床した。このプレートを 4°Cに 2日間放置して低温処理を行い、続いて植物インキュベーター（サンョー製、 MLR— 350HT) 中に 22°C、光強度 6000ルクス、長日条件下（明期 16時間、喑期 8時間）にて、 21日間培養した。感染効率を上げるために再度植物を無菌的に引き抜いて、新たな MS Oプレートの表面に根を広げ、さらに 2日間培養を続けた。

(8) ァグロパクテリゥムの感染

前記で 21日間培養した WS株の根を数株ずつそろえて、メスで 1. 5〜2. O cm程度に切りそろえ、 C IMプレート（MS Oプレートに 2, 4—ジクロ口フエノキシ酢酸を終濃度 0. 5 μ_§Ζηι1、力イネチンを 0. 05 μ g/ml となるように加えたもの) に置き並べた。光強度 3000ルクス、 16時間明期、 8時間暗期で 2日間培養した。前記（2) で作製したァグロパクテリゥムを抗生物質 (5 O g/m 1 カナマイシン、 2 O g/m 1 ハイグロマイシン) を含んだ 1 Om l LB培地に植菌して 28°Cで 24時間振とう培養し、ァグロパクテリゥムを、 MS希釈液（ムラシゲースターグ無機塩類 6. 4 gZl、 pH6. 3) で 3倍に希釈した。ァグロパクテリゥム希釈液をそれぞれ lml ずつチューブに分注し、この中にカルス化した根の切片を 10分間浸した。 2枚重ねた滅菌ろ紙上に並べ、余分な水分を除き、新しい C IMプレートに各々置き並べた。同条件にて 2日間共存培養した。 ,

(9) 除菌

各々の菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖した切片を除菌液（M S希釈液にクラフォランを終濃度 200 / g/ml. になるように加えたもの）に移し、ゆつくり振盪させて 60分間洗浄した。この操作を 5回繰り返した後、滅菌ろ紙上で水分を取り除き、 S IMCプレート（MS Oプレートに、 2— i pを終濃度 5 ^g /ml, I A Aを終濃度 0. 15 / gZml、クラフォランを終濃度 500 _μ g/ml となるように加えたもの）に置き並べ、光強度 6000ルクス、 1 6時間明期、 8 時間暗期で 2日間培養した。

(10) 形質転換植物の選択

前記で 2日間培養した切片を S IMCSプレート（S IMCプレートにハイグロマイシン Bを終濃度 4. 6U/ml となるように加えたもの）に移植し、光強度 6000ルクス、 16時間明期、 8時間暗期で培養した。以後、 1週間毎に新しい S IMC Sプレートに移植した。形質転換した切片は増殖を続け、ドーム状に盛り上がったカルスとなるが、非形質転換体は褐変した。形質転換体は約 2週間後、カルスが緑色を呈し、約 1力月後、葉が形成され、その後ロゼット葉となつた。

(1 1) 形質転換植物の再生

ロゼット葉となった植物体の根本を、カルス部分を含まないように剃刃もしくはメスで切り取り、 R IMプレートに軽く乗せるように挿した。 8〜1 0日後、：!〜 2 c m程度の根が数本形成したものをピンセットで無機塩類培地〔5mM KN0₃、 2. 5mM K—リン酸緩衝液 (ρΗ5. 5) 、 2 mM Mg S〇₄、 2mM C a (N0₃) ₂、 5 0 μΜ F e—EDTA、 1 000 X微量要素（7 0 mM H₃B0₃、 14 mM Mn C 1₂、 0. 5 mM Cu S〇₄、 1 mM Z n S〇₄、 0. 2mM N aMo O 1 0 mM N a C 1、 0. 0 1 mM C o C 1₂) lmlZリットル〕に浸したロックウールミ-ポット（日東紡績社製）に定植し、培養した。開花し、莢形成後は、パーライトとバーミキユラィト（TE S 社製）を 1 ： 1に混合し無機塩類混合培地に浸した土に植え換えた。約 1力月後、 1株につき数百粒の種子が得られた。これを以後、 T 2種子と称す。

(1 2) 抗生物質耐性株の取得

T 2種子約 1 0 0粒を（7) と同様の方法で滅菌し、 MSHプレートに播種した。ほぼ 3 ： 1の割合でハイグロマイシン B耐性株が発芽した。

(1 3) DNA抽出とサザンハイブリダイゼーション

前記で発芽した T 2種子を無機塩類培地に浸したロックウールミニポットにピンセットで移植し、光強度 6 0 00ルクス、 1 6時間明期、 8時間暗期、 2 2°C の条件下で培養した。 2週間後、ロックウールの表面をナイフで撫でるようにメスで地上部を切り取り、直ちに液体窒素で凍結した。これを液体窒素存在下乳鉢で細かく粉碎し、 l g当たり、 3ml の DNA抽出用緩衝液 [ 200 mM T r i s— HC 1 (pH8. 0) 、 l O OmM EDTA— 2Na、 1 % N—ラウ口ィルサルコシンナトリウム、 1 00 μ g/ml p r o t e i n a s e K] を加え十分撹拌した。 6 0°C1時間インキュベート後、遠心（1 0， O 0 0 X g、 1 0分間）し上清をミラクロスで濾過し新しいチューブに移した。フエノール：クロ口ホルム：ィソァミルアルコーノレ (25 : 24 : 1) 抽出を 3回行なった後、エタノール沈殿を行った。沈殿を TE緩衝液に溶解した。それぞれ植物体約 2. 0 g から、 20 / gずつのゲノム DNAが得られた。このうち 1 の DNAを用いて、それぞれを制限酵素 E c o R I、 H i n dill で切断し、 1 %ァガロース電気泳動及ぴサザンハイプリダイゼーシヨンに供した。

また、形質転換を行っていない WS株の種子を発芽、生育させ、植物体より、同様に DN Aを抽出し、制限酵素 E c oR I、 H i n dlll による消化を行ない、 1 %ァガロースゲル電気泳動及ぴサザンハイブリダィゼーシヨンに供した。ハイプリダイゼーシヨン用プローブは各 F S PD 1、 F SAM24、 F ADC 76遺伝子断片を用いた。

サザンハイプリダイゼーシヨンは、モレキュラークローニング，ァラボラトリーマニュアル M o 1 e c u l a r C l o n i n g, a L a b o r a t o r y Ma n u a l ) 、第 9章、第 3 1〜 58頁〔コールドスプリングハーバー（C o l d S p r i n g Ha r b e r) 社、 1 989年刊〕に記載の方法に従って行った。すなわち、それぞれの DNA試料について 1 %ァガロースゲル電気泳動を行い、泳動後、アル力リ変性を行いナイロンメンブレン (ハイボンド一 N、アマシャム社製）にー晚サザンプロットした。紫外線トランスィルミネ一ター（254 nm) に 3分間照射させ、 DNAを固定した。このメンプレンをプレハイプリダイゼーシヨン緩衝液（5 Xデンハルト液、 6 XS SC、 0. 1%SDS、 10 ig/ml サケ精子 DNA) 5 ml 中で 50°C、 2時間プレハイブリダイゼーションを行った。プローブを力 Pえ、 50°Cでー晚ハイブリダイゼーシヨンを行った。ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを 2 X S S C、 0. 1 % S D Sを含む洗浄液で室温 10分間 2回洗浄し、続いて同じ洗浄液で 50 °C、 30分間で 2回洗浄した。メンプレンは乾燥させた後、 X線フィルム（コダック社製）を入れたカセット内で— 80°C—晚感光させ、オートラジオグラフィーをとった。形質転換を行っていない株（1) 、 FS PD 1、 FSAM24、 FAD C 76を導入した形質転換体（2) 、ベクターのみを導入した形質転換体（3) について、サザンハイブリダイゼーションにより検出されたシグナルのパターンを比較した。 ( 2 ) には、 ( 1 ) 、 ( 2 ) 、 ( 3 ) 共通の内在性のシグナルのほかに、 E c 0 R Iで切断したサンプルと、 H i n d ill で切断したサンプルでは特異的なシグナルが観察され、目的遺伝子が（2 ) に組み込まれていることが観察された。実施例 3：ノーザンプロット解析

実施例 2で得られた T2形質転換体で目的の遺伝子が実際に遺伝子発現してレ、るかを確かめるために、ノーザンプロッティングを下記に示す様に行った。

形質転換を行っていない野生株 (WT)と T2形質転換体 (セルライン: TSP—14、 15、 16、 17、 19)のロゼット葉力も全 RNAを抽出した。 RNA抽出は定法に従って行った。得られた全 RNAlO jU gを 1.5%ホルムアルデヒドァガロースゲルで電気泳動した後、ハイボンドナイロンメンブランにー晚ブロッテイングした。 UVクロスリンカ一で RNAを固定した後、プレハイブリダィゼーシヨンバッファー（50% Formamide, 5 X SSPE、 5 X Denhardfs, 0.1% SDS、 80 μ g/ml Salmon sperm DNA、 pH7.0)で、 42°C、 2時間プレハイブリダィゼーシヨンを行った。形質転換を行ったクロダネカボチヤ SPDS遺伝子断片の cDNAを³² P- dCTPとランダムラベルキット（アマシャム社製)を用いて、プローブを作製した。このプロ一ブをプレノヽイブリダィゼーシヨンに加え、 42°Cでー晚ハイブリダィゼーシヨンを行った。ハイブリダィゼ—シヨン後、メンブランを 2 X SSCヽ 0.1% SDSを含む洗浄液からスタートし、最終的には 0.1 X SSC、 0.1% SDSを含む洗浄液で 55°C30分 2回まで洗浄した。メンブランを X線フィルム (Kodak社製）を用いて、オートラジオグラフィーを行った。

ノーザンブロッテイングの結果を図 2に示した。図 2の結果から、野生株 (WT)では外因性クロダネカポチヤ SPDS遺伝子の発現は検出されな力た力形質転換を行った全ての T2形質転換体では非常に高レ、レベルでクロダネカボチヤ SPDS遺伝子（FSPD1) が発現してレ、ることが確認された。

実施例 4：ポリアミン含量の評価

(1)目的遺伝子が導入されてレ、る系統 (セルライン)の選抜

実施例 2で作製した形質転換体にっレ、て、 PCR (またはサザン解析)とノーザン解析による目的遺伝子の導入確認でセルラインの選抜を行った。その結果、確実にポリアミン代謝関連酵素遺伝子が導入され、且つ該遺伝子を発現してレ、るセルライン、 TSP— 114、 115、 116、 117、 119、 131、 132、 151、 152、 221、 222を選抜した。 TSP— 114〜1 15は FSPD1が導入されている系統、 TSP— 131、 132は FSAM24が導入されている系統、 TSP— 151、 152は FADC76が導入されている系統、 TSP— 221、 222は FSP D1がアンチセンス方向で導入されている系統についてポリアミン含量を調べた。

(2)ポリアミン含量の分析

同時に栽培を行った野生株 (WT)と形質転換体 (TSP)力も約 0. 1〜0. 3gのロゼット葉 (または本葉)をサンプリングして密閉可能なポリ製バイアル瓶に移して凍結保存した。サンプリングした試料に希釈内部標準液（1, 6-hexanediamine,内部標準量 =7. 5n mol)と 5%過塩素酸水溶液 (試料生体重 1. Og当たり 5〜20ml)を加え、ォムニミキサーを用いて室温下で十分に磨碎抽出した。磨碎液を、 4°C' 35， OOO X gで 20分間遠心分離して上清液を採取し本液を遊離型ポリアミン溶液とした。スクリューキャップ付きのマイクロチューブに 400 μ 1の遊離型ポリアミン溶液、 200 μ 1の飽和炭酸ナトリウム水溶液、 2 00 μ 1のダンシノレクロライド Ζアセトン溶液（lOmgZml)を加えて軽く混和した。チューブの栓をしつ力、りと閉めたのちアルミ箔で多レ、、 60°Cのウォーターバスで 1時間加温してダンシル化を行った。チューブを放冷した後、プロリン水溶液（lOOmgZml)を 200 μ 1カロえて混和した。アルミ箔で覆ってウォーターバスで 30分間再加温した。放冷後、窒素ガスを吹き付けてアセトンを除いた後に、 600 μ 1のトルエンを加えて激しく混和した。チューブを静置して 2相に分かれた後に、上層のトルエン層を 300 μ 1マイクロチューブに分取した _c 分取したトルエンに窒素ガスを吹き付けてトルエンを完全除去した。チューブに 100〜20 0 μ 1のメタノールを加えてダンシノレ化遊離型ポリアミンを溶解させた。プトレシン、スペルミジン、スペルミンの遊離型ポリアミン量の定量は蛍光検出器 (励起波長は 365nm、発光波長は 510nm)を接続した高速液体クロマトグラフィーを用いて内部標準法で分析した。 HPLCカラムは μ Bondapak C18 (Waters社製： 027324、 3. 9 X 300mm、粒子径 1 ' 0 At m)を使用した。試料中のポリアミン含量は標準液と試料の HPLCチャートから、それぞれ各ポリアミンと内部標準のピーク面積を求めて算出した。その結果を表 4に示す。 03 04427

35

表 4

表 4より、明らかなようにポリアミン代謝関連酵素遺伝子をセンス方向に導入したセルラィ/ TSP— 114、 115、 116、 117、 119、 131、 132、 151、 152は、プトレシン含量、スペルミジン含量、スペルミン含量が野生株 (WT)より有意に増大し、総ポリアミン含量も野生株 (WT)より有意に増大していることが明らカ^なつた。特にスペルミジンとスペルミン含量の増加が顕著であった。さらに、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子をアンチセンス方向に導入したセルライン TSP— 221、 222は、特にスペルミジン含量とスぺノレミン含量が野生株 (WT)より有意に減少し、総ポリアミン含量も野生株 (WT)より有意に減少してレ、ることが明らかとなった。

以上の結果から、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を植物にセンス方向又はアンチセンス方向で遺伝子導入することで、植物内のポリアミン含量を増加又は減少させることが可能であることが明らかとなった。これらのこと力、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を植物に遺伝子導入することで、ポリアミン代謝を操作してポリアミン含量を制御できることが認められプこ。

実施例 5 :種々の器官形成の評価

(1)茎'葉 '花 'さや数の評価 P 删扁 27

36

実施例 2で得られた T3形質転換体 (FSPD1がセンス方向で導入されてレヽるセルライン: TSP— 16— 1、 16— 2)と野生株 (WT：コロンビア株)種子を培養土メトロミックス (ノヽィポネックスジャパン社製）を含んだプラスチック鉢に播種した。播種後、約 2日間、 4°Cで低温処理後、鉢をプラスチックバットに入れ、 23°C、長日条件下（16時間日長 ·8時間暗黒)で栽培を開始した。播種後、 15週間育成した。育成後、各ラインで 1個体当たりの茎 (花茎)数を調査した。各ライン 30個体について調查を行った。その結果を図 3に示した。図 3の結果から、 Τ3形質転換体 (TSP— 16— 1、 16— 2)は野生株に比べて有意に 1 株当たりで約 7〜8本の茎数が増大していることが明ら力となった。さらに、 1株当たりの茎数が増大したことで葉 (茎生葉)、花、さや (子房)数も顕著に増大してレ、ることが明らかとなった。野生株と TSP— 16— 1の草姿を図 4に示した。

(2)主茎と側茎数の評価

(1)の結果から Τ3形質転換体では野生株に比べて有意に茎数の増加が確認された。そこで、シロイヌナズナの茎は主茎 (主花茎）と側茎 (側花茎）に分かれることから、主茎と側茎につ！/、てそれぞれ数を調査することとした。実施例 2で得られた Τ3形質転換体 (FS PD1がセンス方向で導入されているセルライン: TSP— 161B、 162B)と野生株 (WT:コロンビア株)種子を培養土メトロミックス (ハイポネッタスジャパン社製)を含んだプラスチック鉢に播種した。播種後、約 2日間、 4°Cで低温処理後、鉢をプラスチックバットに入れ、 2 3°C、長日条件下（16時間日長 · 8時間暗黒)で栽培を開始した。播種後、 7週間育成し、 7週間目（49日目）から 1週間毎に 13週間目（91日目）まで、各ラインで 1個体当たりの主茎（主花茎）と側茎 (側花茎)数をそれぞれ調査した。各ライン 30〜32個体について調査を行った。その結果を図 5および図 6に示した。

図 5の結果力 Τ3形質転換体は野生株に比べて、 49日目力有意に主花茎数の増，加が認められ、 70日目では Τ3形質転換体では野生株に比べて 1株当たりで約 1本増加した。 Τ3形質転換体と野生株の主花茎の増加程度は 91日目までほぼ同程度で続き、最終的な主花茎数も Τ3形質転換体では野生株より高まった。

図 6の結果力 Τ3形質転換体は野生株に比べて、 49日から有意に側花茎数の増加が認められ、 70日目では Τ3形質転換体では野生株に比べて 1株当たりで約 4本増加した。さらに、 91日目では Τ3形質転換体では野生株に比べて 1株当たりで約 5〜6本増加し、最終的な側花茎数も Τ3形質転換体では野生株より顕著に高まった。 03 04427

37

(3)葉 '花'さや数の評価

(1)の結果から T3形質転換体では野生株に比べて葉、花およびさや (子房)数の増加が確認された。そこで、各器官についてそれぞれ詳細に数を調査した。実施例 2で得られた T3形質転換体 (FSPD1がセンス方向で導入されて！/、るセルライン： TSP - 15-3, 16 - 1)と野生株 (WT:コロンビア株）種子を培養土メトロミックス（ハイポネッタスジャパン社製)を含んだプラスチック鉢に播種した。播種後、約 2日間、 4°Cで低温処理後、鉢をプラスチックバットに入れ、 23°C、長日条件下（16時間日長 · 8時間暗黒)で栽培を開始した。播種後、 67日間育成して 67 0目に各ラインで 1個体 (株）当たりの葉 (苤生葉）、白色の花弁が付いている花、さや (さや長が 5mm以上)数を調査した。各ライン 30個体について調べた。その結果を表 5に示した。

(数 /1株当たり）

表 5の結果から T3形質転換体は 1株当たりの本葉、花、さやの数が野生株に比べて有意に増大してレ、ることが明らカとなった。さやは全てのラインで調査後に成熟して裂開後、成熟した種子が収穫できた。 1さや当たりの種子数は Τ3形質転換体と野生株で有意な差は見られなかった力 Τ3形質転換体では 1株当たりで 1. 6〜2. 0倍程度さやの数が増加した結果、 1株当たりで収穫された全種子数は有意に増大していることが明らかとなつた。 Τ3形質転換体から収穫された Τ4種子と野生株の種子を用いて発芽率の比較試験を行ったところ、 Τ4種子、野生株ともに 95〜100%の高い発芽率が得られた。

(4)花の開花期、子房 (さや)の発達期間の評価

実施例 2で得られた Τ3形質転換体 (FSPD1がセンス方向で導入されてレ、るセルライン: TSP— 15— 3、 16— 1)と野生株 (WT:コロンビア株)種子を培養土メトロミックス (ノヽィポネックスジャパン社製)を含んだプラスチック鉢に播種した。播種後、約 2日間、 4°Cで低温処理後、鉢をプラスチックバットに入れ、 23°C、長日条件下 (16時間日長 ·8時間暗黒)で栽培を開始した。各ラインすベての株について抽だい開始日と開花日（1番花)の調査と 1番花の開花日からさや (子房)の成熟日（裂開開始日）までの調査を行った。各ライン 30個体について調べた。花の開花日の結果を図 7、さや (子房)の発達期間の結果を表 6に示した。

図 7の結果から Τ3形質転換体は野生株より開花日が早くなつていることが明らかとなつた。平均で Τ3形質転換体は野生株より 6〜7日程度早まってレ、ることが確認された。

(播種後からの日数）

表 6の結果から Τ3形質転換体は野生株に比べてさや (子房)の発達期間が有意に増大してレ、ることが明らかとなった。

実施例 6：形質転換ペチュニアの評価

(1)形質転換ペチュニアの作製

ρΒΙΙΟΙ— 35S—FSPD1 +と pBIlOl— 35S—FSAM24+をァグロバタテリゥム (Agrobacterium amefacience) AglO株 (Lazo et al. Bio Technology 9:963-967 (1991))に塩ィ匕カルシウムを用レ、る方法 (たとえば、新生化学実験のてびき 3 化学岗人 121-122 ページ、 1996)で導入した。得られた形質転換ァグロパクテリゥムを、それぞれペチュニア {Petunia hybrida)品種サフィニァパープルミニ（サントリ一フラワーズ株式会社）由来のリーフディスクに感染させ、ハイグロマイシンに抵抗性を示す植物細胞を選抜、再分化させることにより、形質転換ペチュニアを取得した。ペチュニアの形質転換は公知の方法 (Horsch et al. Science 227:1229-1231 (1985))を用いて行った。 ρΒΙΙΟΙ— 35S— FSPD 1 +と pBIlOl— 35S— FSAM24+により形質転換されたペチュニアそれぞれを実験区 PT144と実験区 PT146とした。 PT144では 23個体、 PT146では 43個体の独立した形質転換体を取得した。 (2)導入遺伝子の発現解析

これらの植物から染色体 DNAおよび RNAをそれぞれ DNeasy Plant Mini Kitと RNeasy Plant Mini Kit (株式会社キアゲン、東京)を用レヽることにより調製した。染色体 DNAを铸型にした PCR反応 (PT14 はプライマー FSPD1F (5' - TAGTAGAGGGATTATTATGTCTGCGGA - 3， )と FSPD1R (5 '一

ATGACGCTGATCACAATATAAAGCGAC - 3' )を PT146はプライマー FSAM24F (5，ー TGAAGGCTATGAAAAGAGGCTTGAAGTA- 3，）と FSAM24R (5， - TCATGAGGATTGACCTTGGGATGACG- 3， )を用いて PCR反応を行った。反応は、 95°Cで 1分間保持した後、 95°C' l分、 52°C'2分、 72°C' 3分からなるサイクルを 30サイクル行い、さらに 72°Cで 1分間保持した。）により、 PT144および PT146のペチュニアはそれぞれ SPDS (FSPD1)および SAMDC (FSAM24)遺伝子を保持する形質転換体であることがわ力つた。また、これら形質転換ペチュニアの葉から抽出した全 RNAを用いて RT-PCR (スーパースクリプトファーストストランド合成システム RT-PCR用 (インビトロジェン株式会社、東京)を用いて 01igo(dT)12- 18プライマーを用いて、逆転写反応を行った。逆転写産物を铸型とし、染色体 DNAと同じプライマーとサイクルで PCRを行った。）によつて各個体の遺伝子発現を解析した。 PT14 では 9個体、 PT146では 27個体の植物体で外来遺伝子（PT144は SPDS、 PT146は SAMDC)の発現が確認された。

(3)ポリアミン含量の評価

形質転換体の中力発現量の多かった個体 (セルライン)について遊離型ポリアミン含量の分析を行った。同時に栽培を行った野生株 (元株: PT144- C、PT146- C)と形質転換体 (PT144， PT146)力約 0. 3〜0. 6gの葉をサンプリングして凍結保存した。サンプリングした試料に希釈内部標準液（1, 6-hexanediamine,内部標準量 =7. 5應 ol)と 5%過塩素酸水溶液 (試料生体重 1. Og当たり 5〜10ml)を加え、ォムニミキサーを用いて室温下で十分に磨砕抽出した。磨砕液を、 4°C - 35, 000 X gで 20分間遠心分離して上清液を採取し本液を遊離型ポリアミン溶液とした。スクリューキャップ付きのマイクロチューブに 400 μ 1の遊離型ポリアミン溶液、 200 μ 1の飽和炭酸ナトリウム水溶液、 200 μ 1のダンシルク口ライド/アセトン溶液（10mg/ml)を加えて軽く混和した。チューブの栓をしつ力、りと閉めたのちアルミ箔で覆レ、、 60°Cのウォーターパスで 1時間加温してダンシル化を行った。チューブを放冷した後、プロリン水溶液（lOOmgZml)を 200 μ 1カ卩えて混和し PC漏蘭 27

40

た。アルミ箔で覆ってウォーターパスで 30分間再加温した。放冷後、窒素ガスを吹き付けてアセトンを除いた後に、 600 i lのトルエンを加えて激しく混和した。チューブを静置して 2相に分かれた後に、上層のトルエン層を 300 μ ΐマイクロチューブに分取した。分取したトルエンに窒素ガスを吹き付けてトルエンを完全除去した。チューブに 100〜200 I のメタノールを加えてダンシノレイヒ遊離型ポリアミンを溶解させた。プトレシン、スペルミジン、スペルミンの遊離型ポリアミン量の定量は蛍光検出器を接続した高速液体クロマトグラフィーを用いて内部標準法で分析した。 HPLCカラムは μ Bondapak C18 (Waters社製： 027324、 3. 9 x 300mm,粒子径 10 μ m)を使用した。試料中のポリアミン含量は標準液と試料の HPLCチャートから、それぞれ各ポリアミンと内部標準のピーク面積を求めて算出した。その結果を表 7に示した。

遊離型プトレシン量の野生株（144- C、 146-C)における平均は 29.46 nmol/gFW(F W:新鮮重）、形質転換体（144、 146)の平均は 38.67 nmol/gFW_N遊離型スペルミジン量の野生株における平均は 37.03 nmol/gFW、形質転換体の平均は 50.40 nmol/gFWであり、遊離型プトレシン量、遊離型スペルミジン量がともに増加した。野生株と形質転換体間の t -検定の結果、遊離型スペルミジンは有意水準 5%で差があることがわかり、形質転換体において特に遊離型スペルミジン量が増加してレ、ることが明ら力となった。さらに、 PT146の形質転換体では遊離型スペルミン含量が野生株（146- C)に比べて有意に増加してレ、ることも確認された。

表 7

(4)形質転換ペチュニアの形態形成の評価

ペチュニアは気温約 25°Cで、自然光に 16時間明 8時間暗サイクルの人口光を補つた閉鎖系温室内で栽培し、切り戻した直後から 60日目までの間、外来遺伝子が発現していた個体について個体当たりの花数変化を経時的に測定した。その結果を表 8、図 8 図 9に示した。表 8、図 8、図 9の結果力形質転換ペチュニアでは元株 (野生株）に比て明らかに分枝数と花数が増加した。測定期間中、元株のサフィユアパープルミニの花数は 10を越えることはなかったが、 PT144では 6個体（67%)、 PT146では 18個体 (67%)が花数 10を越えた。また、一枝当たりの花数も元株では 0〜3個の場合が多く 5 個を越えることはほとんど見られなレ、。しかし、形質転換体では、 5個を越える花をつけた枝を持つ個体が PT144では 3個体（33%)、 PT146では 5個体（19%)と高い割合を示した。

l£ 80/£0 OAV ポリアミン量の増加とペチュニアの花数や枝数の増カロに相関関係があることがわかり、導入した遺伝子がポリアミン量を増やし花数や枝数の増加をもたらすことが明らかとなつた。ここで見られた花数の増加が、個々の花の開花期間が長くなつたことに起因するもの力 \同時に開花している花芽数の増加に起因するものかを調べるために、一枝当たりの花数が多かった個体 (PT144は 5個体、 PT146は 9個体）で、開花期間の長さを調べた (花が開花した直後から花弁が萎えるまでの期間を開花期間として、 1個体につき 5個の花について測定を行い、平均値で比較した)。元株の平均開花日数は 8.34日、形質転換体の平均開花日数は ₉.₃₅日であり、形質転換体では開花期間が増加してレ、る傾向が観察された。

Claims

請求の範囲

1. 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも 1つの核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していなレ、植物に比べて少なくとも 1種の器官形成が改良された植物及ぴその子孫。

2. ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子である請求項 1記載の植物及びその子孫。

3. ' 該器官形成が改良された植物が、植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも 1つの核酸配列を含む少なくとも 1つの発現ベクターで、該核酸配列を有していなレ、植物を形質転換して得られる形質転換植物である、請求項 1記載の植物及ぴその子孫。 '

4. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、アルギニン脱炭酸酵素（ADC) をコードする遺伝子、オル二チン脱炭酵酵素（ODC) をコードする遺伝子、 S —アデノシルメチォニン脱炭酸酵素（SAMDC) をコードする遺伝子、スペルミジン合成酵素（SPDS) をコードする遺伝子、スペルミン合成酵素（SPM S) をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも 1種である請求項 2に記載の植物及びその子孫。

5. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、スペルミジン合成酵素をコードする遺伝子である請求項 4記載の植物及びその子孫。 6.

6. ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（a) 、（b) または（c) の塩基配列を有するスペルミジン合成酵素遺伝子である、請求項 4記載の植物及びその子孫。 .

(a) 配列番号 1 (SPDS、 1328) に示される塩基配列中塩基番号 77〜

1060で示される塩基配列、

( b ) 上記（ a ) の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、

(c) (a) または（b) の塩基配列において、 1又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。

7. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の (a)、 (b)または (c)の塩基配列を有する S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項 4記載の植物及びその子孫。

(a) 配列番号 3 (SAMDC、 18 14) に示される塩基配列中塩基番号 45 6〜 1547で示される塩基配列、

( b ) 上記（ a ) の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、且つ S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、

(c) (a) または（b) の塩基配列において、 1又は複数の塩基が欠失、置換、揷入若しくは付加された塩基配列からなり、且つ S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。

8. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（a) 、 (b) または（c) の塩基配列を有するアルギニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項 4記載の植物及びその子孫。

(a) 配列番号 5 (ADC、 3037) に示される塩基配列中塩基番号 541〜 2661で示される塩基配列、

( b ) 上記（ a ) の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、

(c) (a) または（b) の塩基配列において、 1又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。

9. 内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が、該遺伝子のィントロンまたはェクソン、該遺伝子のプロモーターを含む 5 '上流側の調節領域または終止コドンの下流側であって、遺伝子発現に影響する領域のいずれかのアンチセンス DN Aまたは 2本鎖 RN Aを形成するセンス DN Aまたはアンチセンス D N Aである請求項 2に記載の植物及びその子孫。

10. 器官が、茎、塊茎、葉、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維及び胚珠からなる群から選ばれる少なくとも 1種である請求項 1に記載の植物及ぴその子孫。

1 1 . 器官形成が栄養生長期よりも生殖生長期において顕著に改良される請求項 1に記載の植物及ぴその子孫。

1 2 . 茎の数が改良された植物である、請求項 1に記載の植物及びその子孫。

1 3 . 葉の数が改良された植物である、請求項 1に記載の植物及びその子孫 _c

1 4 . 花の数および Zまたは花の開花期（開花開始時期又は開花している期間）が改良された植物である、請求項 1に記載の植物及ぴその子孫。

1 5 . 子房の数おょぴノまたは子房の発達期間が改良された植物である、請求項 1に記載の植物及びその子孫。

1 6 . 種子の数が改良された植物である、請求項 1に記載の植物及びその子孫。

1 7 . 双子葉植物である、請求項 1に記載の植物及ぴその子孫。

1 8 . 葉、茎、根、花、子房、果実、種子、繊維又はカルスの形態である請求項 1に記載の植物及ぴその子孫。

1 9 . 前記核酸配列が内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子であり、器官形成の改良が植物の矮小ィ匕又はミニチュア化である請求項 2に記載の植物及びその'子孫。

2 0 . 請求項 1〜 9のいずれかに記載の植物及ぴその子孫から得られる葉、茎、根、花、子房、果実、種子、繊維又はカルス。

2 1 . 請求項 1〜9のいずれかに記載の植物及びその子孫から得られる有用物質。

2 2 . 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも 1つの核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された器官形成を有する植物の作出方法。

2 3 . ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遣伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子である請求項 2 2記載の方法。

2 4 . 植物中で機能し得るプロモ一ターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも 1つの核酸配列を含む少なくとも 1つの発現ベクターで、該核酸配列を有していなレ、植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された器官形成を有する植物の作出方法。

25. ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子である請求項 24記載の方法。

26. 該形質転換細胞から植物体を再生する工程をさらに含む、請求項 24 記載の方法。

27. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、アルギン脱炭酸酵素（AD C) をコードする遺伝子、オル-チン脱炭酸酵素（ODC) をコードする遺伝子、 S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素（SAMDC) をコードする遺伝子、スぺルミジン合成酵素（SPDS) をコードする遺伝子、スペルミン合成酵素（SP MS) をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも 1種である請求項 25に記載の方法。

28. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（a) 、（b) または (c) の塩基を有するスペルミジン合成酵素遺伝子である、請求項 27記載の方法。

(a) 配列番号 1に示される塩基配列中塩基番号 77〜1060で示される塩基配列、

(b) 上記（a) の塩基配列とストリンジヱントな条件下でハイプリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、

(c) (a) または（b) の塩基配列において、 1又は複数の塩基が欠失、置換、揷入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。 .

29. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（a) 、 (b) または (c) の塩基を有する S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項 25記載の方法。

(a) 配列番号 3に示される塩基配列中塩基番号 456〜1 547で示される塩基配列、 (b) 上記 (a) の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、且つ S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、

(c) (a) または（b) の塩基配列において、 1又は複数の塩基が欠失、 S換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つ S—アデノシルメチォニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。

30. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（a) 、 (b) または (c) の塩基を有するアルギニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項 25記載の方法。

(a) 配列番号 5に示される塩基配列中塩基番号 541〜2661で示される塩基配列、

(b) 上記（a) の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、

(c) (a) または（b) の塩基配列において、 1.又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付カ卩された塩基配列からなり、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。

31. 内因†生ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が、該遺伝子のィントロンまたはェクソン、該遺伝子のプロモーターを含む 5 '上流側の調節領域または終止コドンの下流側であって、遺伝子発現に影響する領域のいずれかのアンチセンス DNAまたは 2本鎖 RNAを形成するセンス DNAまたはアンチセンス DNAである請求項 25に記載の方法。

32. 器官が、茎、塊茎、葉、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維及ぴ胚珠からなる群から選ばれる少なくとも 1種である請求項 24に記載の方法。

33. 器官形成が栄養生長期よりも生殖生長期において顕著に改良される請求項 24に記載の方法。

34. 改良された器官形成を有する植物が、茎の数が改良された植物である、請求項²⁴に記載の方法。

35. 改良された器官形成を有する植物が、葉の数が改良された植物である、請求項 2 4に記載の方法。

3 6 . 改良された器官形成を有する植物が、花の数または花の開花期が改良された植物である、請求項 2 4に記載の方法。

3 7 . 改良された器官形成を有する植物が、子房の数または子房の発達期間が改良された植物である、請求項 2 4に記載の方法。

3 8 . 改良された器官形成を有する植物が、種子の数が改良された植物である、請求項 2 4に記載の方法。

3 9 . 改良された器官形成を有する植物が、双子葉植物である、請求項 2 4 に記載の方法。

4 0 . 以下の工程：

( 1 ) 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも 1つの核酸配列を含む少なくとも 1つの発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、

( 2 ) 該形質転換細胞から、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された器官形成を有する植物体を再生し、

( 3 ) 該植物体から受粉により種子を採取し、および

4 1 . 以下の工程：

( 1 ) 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する少なくとも 1つの核酸配列の抑制因子を含む少なくとも 1つの発現ベクターで、該核酸配列を有していなレ、植物の細胞を形質転換し、

( 2 ) 該形質転換細胞からカルスを誘導する

を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない植物に比ベて改良された器官形成を有する形質が固定されたカルスの作出方法。