JP5474355B2 - ＲＮＡｉを利用する植物害虫のための遺伝子組換え植物系方法 - Google Patents

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Description

本発明は昆虫種の２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）仲介遺伝子サイレンシングの分野に関する。より具体的には、本発明は新規な標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの発現を設計した遺伝子構築物に関する。これらの構築物は特にＲＮＡｉ仲介植物害虫制御に有用である。本発明は、さらに昆虫を制御する方法、昆虫横行を阻止する方法およびＲＮＡｉを利用する昆虫における下方制御遺伝子発現のための方法に関する。また、本発明は昆虫横行に抵抗性ある遺伝子組換え植物にも関する。
環境は害虫が充満していて、多くの方法が植物の害虫横行を制御するために試みられている。商業的な作物はしばしば昆虫の攻撃対象となる。植物の昆虫横行を制御するより有効な方法および組成物の開発に向けて実質的な進歩が、ここ数十年間になされている。
化学殺虫剤は害虫横行を根絶するのに非常に有効である。しかしながら、化学殺虫剤を使用するにはいくつかの不利な点が存在する。それらは環境に対して潜在的に有害であるのみならず、非選択的であって、種々の農作物および非標的動物群において有害である。化学殺虫剤は環境に残存し、一般的にはたとえ代謝されたとしても遅い。それらは食物連鎖において蓄積し、そして特にそれらが変異誘発物質および／または発癌物質として作用して不可逆的および有害な遺伝子修飾を引き起こす高次肉食動物種において蓄積する。すなわち、農作物の害虫と闘う化学殺虫剤の使用には、たえず論争が存在している。これらは同じ殺虫剤または同じ作用機序を有する殺虫剤の繰り返し使用により、そして、蓄積もまた、進化段階のより高い種ではこの薬剤に対する抵抗性の発症となるから、これらの殺虫剤に対する抵抗性を急速に生じ得る。
農学的に重要な農作物での害虫の制御は重要であり、特にソラナセアエ(Solanaceae)科、特にポテト（ソラナム・チュベロスム(Solanum tuberosum)）のみならず、トマト（ソラナム・リコペルシクム（Solanum lycopersicum））、ナス（ソラナム・メロンゲナ（Solanum melongena））、トウガラシ（ソラナム・キャプシクム（Solanum capsicum））、およびイヌホオズキ（例えば、ソラナム・アキュレアストラム（Solanum aculeastrum）、Ｓ．ブルボカスタナム（S. bulbocastanum）、Ｓ．カルディオフィルム（S. cardiophyllum）、Ｓ．ドウグラシー（S. douglasii）、Ｓ．デュルカマラ（S. dulcamara）、Ｓ．ランセオラツム（S. lanceolatum）、Ｓ．ロブスタム（S. robustum）、およびＳ．トリクェトラム（S. triquetrum））に属する植物に被害を与える害虫、特に甲虫目害虫の制御は重要である。
インドセンダン種子の抽出物を使用する生物学的制御は、野菜の甲虫目害虫に対して作用することが示されている。商業的に入手可能なインドセンダン系殺虫剤は、一次活性成分としてアザディラクチンを有する。これらの殺虫剤は広い範囲の昆虫に対して適用可能である。これらは昆虫成長制御因子として作用し、すなわち、アザディラクチンは昆虫ホルモン、エクジソンの生成を阻害することによって昆虫が脱皮することを阻止する。
バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）変異体テネブリオ二ス（teneobrionis）およびサン・ジェゴ（san diego）からのタンパクＣｒｙ３Ａおよび誘導昆虫性タンパクを使用する生物学的制御が化学制御の代替品である。Ｂｔ毒素タンパクは葉上へ噴霧されるか、あるいはジャガイモの葉で発現される製剤のいずれかで、コロラド・ポテト・ビートル(Colorado potato beetles)の幼虫を制御することに有効である。
別の生物学的製剤としては、ｄｓＲＮＡがある。最近、数年にわたってＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」による多細胞生物の遺伝子の下方制御（「遺伝子サイレンシング」とも呼ばれる）が十分に確立された技術となっている。
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、下方制御される標的遺伝子の領域に対して配列が相補的である２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される遺伝子発現の配列特異的下方制御のプロセス（「遺伝子サイレンシング」または「ＲＮＡ仲介遺伝子サイレンシング」とも呼ばれる）である（非特許文献１、２）。
最近、数年にわたって、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による多細胞生物の標的遺伝子の下方制御は、十分に確立された技術となっている。国際出願ＷＯ９９／３２６１９（Carnegie Institution）およびＷＯ００／０１８４６（本出願人）が参照される（特許文献１、２）。
ｄｓＲＮＡ遺伝子サイレンシングは、多くの異なった領域、例えば臨床用途（ＷＯ２００４／００１０１３）および植物におけるｄｓＲＮＡ仲介遺伝子サイレンシングなどにその出願が見られる（特許文献３）。植物では、遺伝子サイレンシングにおいて有用なｄｓＲＮＡ構築物もまた、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に開裂され、そして、プロセシングされるように設計されている。
ＲＮＡｉはまた、植物中で（例えば、植物全体、またはその一部、植物の組織または細胞中で）その成長、再生および／または生存において必須である植物寄生線虫の標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ断片を形成する１つまたは複数のヌクレオチド配列を発現することによって、植物寄生線虫から植物を保護する手段として提案されている。国際出願ＷＯ００／０１８４６（本出願人）および米国特許第６，５０６，５５９号（ＷＯ９９／３２６１９に基づく）が参照される（特許文献４、５）。
ＲＮＡｉの技術は一般的には植物の分野で公知であるけれども、ここ数年、Ｃ．エレガンス(C. elegans)および哺乳動物細胞は現在まで、昆虫における遺伝子発現を下方制御するためのＲＮＡｉの利用に関してほとんど知られていない。ＷＯ００／０１８４６およびＷＯ９９／３２６１９特許の出願と公開以来、昆虫に対して植物を保護するためのＲＮＡｉの利用に関する他の出願は、ほんのわずかしか公開されていない（特許文献１、２）。これらは国際出願ＷＯ０１／３７６５４（DNA Plant Technologies）、ＷＯ２００５／０１９４０８(Bar Ilan University)、ＷＯ２００５／０４９８４１(CSIRO, Bayer Cropscience)、ＷＯ０５／０４７３００(University of Utah Research foundation)および米国出願２００３／００１５００１７(Mesaら)を含む（特許文献６〜１０）。
本発明はＲＮＡｉ仲介害虫制御、特に昆虫植物病原体の制御において有用な標的遺伝子および構築物、を提供する。本発明はまた、特定害虫内の標的遺伝子発現を阻止、遅延または減少させることによって、害虫の横行を制御するための方法を提供する。
国際公開第９９／３２６１９号パンフレット 国際公開第００／０１８４６号パンフレット 国際公開第２００４／００１０１３号パンフレット 国際公開第００／０１８４６号パンフレット 米国特許第６，５０６，５５９号 国際公開第０１／３７６５４号パンフレット 国際公開第２００５／０１９４０８号パンフレット 国際公開第２００５／０４９８４１号パンフレット 国際公開第０５／０４７３００号パンフレット 米国特許第２００３／００１５００１７号 Fire A,Trends Genet, Vol. 15, 358-363, 1999 Sharp,P.A. Genes Dev. Vol. 15, 485-490, 2001
発明の説明：
本発明は昆虫農作物害虫の制御における新規で非化合物、非タンパクによるアプローチを記載する。活性成分は核酸、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、これは殺虫剤として使用され得る。他の実施態様では、ｄｓＲＮＡは宿主植物、植物の部分、植物細胞または種子で恒常的に発現されて、食性昆虫、特にビートル(beetles)などの甲虫(colopterans)から植物を保護することができる。ｄｓＲＮＡの配列は必須昆虫遺伝子の部分または全体に対応し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を経て昆虫標的の下方制御を生じる。ｍＲＮＡの下方制御の結果として、ｄｓＲＮＡは標的昆虫タンパクの発現を阻止し、それゆえ、昆虫の死、成長停止または不妊を生じる。
本発明の方法は、昆虫の生存、成長、発生および生殖を阻害する、あるいは昆虫の病原性または伝染性を低下させることが望ましい技術分野で、実用的な応用を見出すことができる。本発明の方法は、さらに昆虫の１つまたは複数の標的遺伝子の発現を特に下方制御することが望ましい実用的な応用を見出す。特に有用な実用的な応用としては、害虫横行から植物を保護することが挙げられるが、これらに限定されない。
１つの実施態様では、本発明は細胞または生物上で昆虫の成長を制御する、または昆虫感染に感受性を有する細胞または生物の昆虫の横行を阻止するための方法に関し、この方法は昆虫を２本鎖ＲＮＡに接触させることを含み、２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つは昆虫標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有し、その際、２本鎖ＲＮＡは昆虫によって摂取され、それによって成長を制御または横行を阻止する。
したがって、本発明は昆虫標的遺伝子の単離された新規なヌクレオチド配列を提供し、当該単離されたヌクレオチド配列は下記群から選択された少なくとも１つの核酸配列を含む：
（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１または２４８６のいずれかで示される配列、またはこれらの相補鎖
（ｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、２４８１または２４８６のいずれかで示される配列、またはこれらの相補鎖と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列、
（ｉｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、２４８１または２４８６で示される配列、またはこれらの相補鎖のいずれかの少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む配列、
または、前記核酸配列は配列番号４９〜１５８、２７５〜４７２、５３３〜５７５、６２１〜７６７、８１３〜８６２、９０８〜１０４０、１１６１〜１５７１、１７３０〜２０３９、２１２０〜２３３８、２３８４〜２４６０のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子のオルソログであり、
前記核酸配列は昆虫成長を制御するための本発明の２本鎖ＲＮＡを調製するために有用である。
本発明で使用する「害虫を制御すること」とは、害虫を殺すこと、または害虫の発生もしくは成長を阻止するか、または害虫の感染もしくは横行することを阻止することを意味する。ここで使用する害虫を制御することは、また、害虫の子孫（卵の発生）を制御することを包含する。ここで使用する害虫を制御することは、また、害虫の生存、成長、発生もしくは再生を阻害し、または害虫の病原性もしくは感染性を減少する。ここで記載する化合物および／または組成物は、生物を健康に維持するために使用され、害虫を制御するか、または害虫の成長もしくは発生もしくは感染もしくは横行を避けるために、治癒的に、予防的にまたは系統的に使用される。本発明で認識される特定の害虫は、植物病原性害虫である。すなわち、ここで使用する「昆虫を制御すること」は、また、昆虫の子孫（卵の発生など）を制御することを包含する。ここで使用する昆虫を制御することは、また、昆虫の生存、成長、発生もしくは生殖を抑制すること、または昆虫の病原性もしくは感染力を減少させることを包含する。本発明では、昆虫を制御することは昆虫の生物活性を抑制して、下記１つまたは複数の性状：昆虫による摂食の低下、昆虫の生存の低下、昆虫の死、昆虫の分化および発生の阻害、昆虫による有性生殖のための能力の欠損または低下、筋形成、幼若ホルモン形成、幼若ホルモン調節、イオン調節および輸送、潜在的細胞膜の維持、アミノ酸生合成、アミノ酸分解、精子形成、フェロモン合成、フェロモン感覚性(sensing)、触覚形成、羽形成、脚形成、発生および分化、卵形成、幼虫成熟、消化酵素形成、血リンパ合成、血リンパ維持、神経伝達、細胞分割、エネルギー代謝、呼吸、アポトーシス、および真核細胞の細胞骨格構造の成分、例えば、アクチンまたはチューブリンなどを生じる。ここに記載する化合物および／または組成物は、生物を健康に維持するために使用され、昆虫を制御するために、または昆虫の成長もしくは発生もしくは感染もしくは横行を回避するために、治癒的に、予防的にまたは体系的に使用される。すなわち、本発明は既に感受性ある生物が昆虫生物による横行に対する抵抗性を発生させることが可能となる。
ここで使用する「少なくとも一部に相補的である」との表現は、ヌクレオチオド配列が２つ以上のヌクレオチオド、例えば、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４またはそれ以上の隣接するヌクレオチドをもつ標的のヌクレオチド配列に完全に相補的であることを意味する。
別な実施態様では、本発明は昆虫の標的遺伝子の発現を下方制御する方法に関し、この方法は前記昆虫を２本鎖ＲＮＡに接触させることを含み、２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つは下方制御させるべき昆虫の標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を有し、その際、２本鎖ＲＮＡは昆虫に摂取され、それによって昆虫の標的遺伝子の発現を下方制御する。
用語「ａ」が「a target gene（標的遺伝子）」の文脈内で使用されるときはいつも、これは「少なくとも１つの」標的遺伝子を意味する。同じことは「少なくとも１つの」標的生物を意味する「ａ」標的生物、および「少なくとも１つの」ＲＮＡ分子または宿主細胞を意味する「ａ」ＲＮＡ分子または宿主細胞にも適用する。これはまた、以下にさらに詳述される。
１つの実施態様では、本発明の方法は昆虫の外側に存在する２本鎖ＲＮＡの昆虫による摂取に依存し（例えば、餌による）、昆虫の細胞内の２本鎖ＲＮＡの発現を必要としない。さらに、本発明はまた、昆虫が２本鎖ＲＮＡを含む組成物と接触する上記方法を包含する。
本発明はさらに、標的生物（植物、植物の部分、植物細胞または種子を摂取することができる）の少なくとも１つの標的遺伝子の発現を下方制御する方法であって、標的生物に対して、植物、植物の部分、植物細胞または種子が２本鎖ＲＮＡを発現する植物、植物の部分、植物細胞または種子を食べさせることを含む方法を提供する。
より好ましい態様では、本発明は標的生物（宿主細胞、またはその抽出物を摂取することができる）の少なくとも１つの標的遺伝子の発現を下方制御する方法であって、標的生物への、宿主植物、植物の部分、植物細胞または種子の摂取を含み、宿主植物、植物の部分、植物細胞または種子は少なくとも１つの標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部の均等なＲＮＡに相補的であるか、または表現するヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡ分子を発現し、その際、標的生物による宿主細胞、宿主植物、植物の部分、植物細胞または種子の摂取は、少なくとも１つの標的遺伝子の発現の下方制御を生じる、および／または導く方法を提供する。
本発明は昆虫標的遺伝子の発現の下方制御のために、ここで定義される植物、植物の部分、植物細胞または種子の使用を提供する。より詳細には、本発明はここに定義される宿主細胞および／またはＲＮＡ分子の使用を提供し、このＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現の下方制御のために、例えば商業生産物の製造において、植物、植物の部分、植物細胞または種子において核酸分子の転写によって生産するように、標的生物からの標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部のＲＮＡ相補鎖であるか、あるいはそのＲＮＡ均等物を表現するヌクレオチド配列を含む。本発明における好適な標的遺伝子および標的生物は、さらに詳細に以下に説明される。
１つの実施態様では、本発明の方法は２本鎖ＲＮＡが昆虫に横行された、あるいは昆虫の横行に感受性を有する細胞または生物によって発現される、ＧＭＯアプローチに依存する。好ましくは、当該細胞は植物細胞であるか当該生物は植物である。
すなわち、本発明はまた、下記工程を含む、植物病原性昆虫に抵抗性を有する植物の生産方法に関する：
（ａ）（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１のいずれかによって示される配列、またはこれらの相補鎖と少なくとも７５％同一である配列
（ｉｉ）１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１、またはこれらの相補鎖のいずれかの少なくとも１７個の隣接した配列を含む配列、および
（ｉｉｉ）（ｉ）のヌクレオチオド配列を含むセンス鎖および（ｉ）の前記ヌクレオチド配列の相補鎖を含むアンチセンス鎖を含む配列、ここで、前記ヌクレオチド配列がコードする転写物は２本鎖ＲＮＡを形成することが可能である；
からなる群から選択される、標的昆虫遺伝子のヌクレオチド配列；
または
（ｂ）配列番号４９〜１５８、２７５〜４７２、５３３〜５７５、６２１〜７６７、８１３〜８６２、９０８〜１０４０、１１６１〜１５７１、１７３０〜２０３９、２１２０〜２３３８、２３８４〜２４６０のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子の昆虫オルソログである、ヌクレオチド配列；
の少なくとも一部に相補的な配列に、操作可能に結合される少なくとも１つの制御配列を含む組み換え構築物で植物細胞を形質転換し、
形質転換植物細胞から植物を再生し；そして
組換え構築物の発現に適した条件下で形質転換植物を成長させ、前記成長させた形質転換植物は非形質転換植物に比べて植物病原性昆虫に対して抵抗性である。
昆虫は、動物界(Kingdom animal)、より具体的には節足動物門、および昆虫綱または蜘蛛型綱に属する生物を意味する全ての昆虫である。本発明の方法はＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングに感受性を有し、その身の回りの環境から２本鎖ＲＮＡを内部移行することが可能である全ての昆虫に適用される。本発明はまた、発達中のいかなる段階でも昆虫に適用可能である。昆虫は無生命(non-living)外骨格を有するから、それらは一様な速度で成長できず、むしろ、その外骨格を周期的に脱ぎ変えて成長が進む。この過程は脱皮(moultingまたはecdysis)と呼ばれる。脱皮間の段階は「中間形態」と呼ばれ、これらの段階は本発明で標的にされる。また、昆虫の卵または生きている子供もまた、本発明で標的にされる。発生サイクル中の全ての段階は、有翅亜綱の変態を含み、本発明で標的にされる。すなわち、発生の段階である幼虫、蛹、若虫などの個々の段階は全て標的にされる。
本発明の１つの実施態様では、昆虫は、次の目：ダニ目(Acari)、クモ目(Araneae)、シラミ目(Anoplura)、コウチュウ目(Coleoptera)、トビムシ目(Collembola)、ハサミムシ目(Dermaptera)、網翅目(Dictyoptera)、コムシ目(Diplura)、双翅目(Diptera)、シロアリモドキ目(Embioptera)、カゲロウ目(Ephemeroptera)、グリロバラトデア目（Grylloblatodea）、半翅目(Hemiptera)、同翅亜目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鱗翅目(Lepidotera)、食毛目（Mallophaga）、長翅目(Mecoptera)、脈翅目(Neuroptera)、トンボ目(Odonata)、バッタ目(Orthoptera)、ナナフシ目(Phasmida)、せき翅目(Plecoptera)、カマアシムシ目(Protura)、噛虫目(Psocoptera)、隠翅目(Siphonaptera)、吸蝨類(Siphunculata)、シミ目(Thysanura)、撚翅目(Strepsiptera)、アザミウマ目(Thysanoptera)、トビケラ目(Trichoptera)、および絶翅目(Zoraptera)に属する。
本発明の好ましいが、限定されない実施態様および方法では、昆虫はニラパルヴァータ属（Nilaparvata spp.）（例えば、Ｎ．ルーゲンス(N.lugens)(トビイロウンカ, brown planthopper));ラオデルファックス属(Laodelphax spp.)（例えば、Ｌ．ストリアテラス(L. striatellus)（ヒメトビウンカ, small brown planthopper））；ネフォテティックス属(Nephotettix spp.)（例えば、Ｎ．ヴィレセンス(N. virescens)またはＮ．チンクチセプス(N. cincticeps)（ツマグロヨコバイ, green leafhopper）、またはＮ．ニグロピクタス(N. nigropictus)(クロスジツマグロヨコバイ, rice leafhopper)）；ソガテッラ属(Sogatella spp.)（例えば、Ｓ．フルシフェラ(furcifera)（セジロウンカ, white-backed planthopper））；ブリッサス属(Blissus spp.)(例えば、Ｂ．ロイコプテラス・ロイコプテルス(B.leucopterus leucopterus)（ナガカメムシ, chinch bug）)；スコチノフォラ属(Scotinophora spp.)（例えば、Ｓ．ヴェルミデュレイテ(S. vermidulate)（クロカメムシ, rice balckbug））；アクロステマム属(Acrostemum spp.)（例えば、Ａ．ヒラーレ(A. hilare)(アオカメムシ, green stink bug)）;パルナラ属(Parnara spp.)(例えば、Ｐ．グッタータ(P. guttata)(イチモンジセセリ, rice skipper));キロ属(Chilo spp.)(例えば、Ｃ．サプレッサリス(C. suppressalis)(ニカメイチュウ, rice striped stem borer)、Ｃ．オーリチリウス(C. auricilius)（縁が金色の茎食い虫, gold-fringed stem borer）、またはＣ．ポリクリサス(C. polychrysus)( 頭部が暗色の茎食い虫, dark-head stem borer));キロトラエア属(Chilotraea spp.)（例えば、Ｃ．ポリクリサ(C. polychrysa)(コメ茎穴あけ虫, rice stalk borer)）；セサミア属(Sesamia spp.)(例えば、Ｓ．インフェレンス(S. inferens)(イネヨトウ, pink rice borer));トリポリザ属(Tryporyza spp.)(例えば、Ｔ．イノタータ(T. innotata)(シロメイチュウ, white rice borer)、またはＴ．インセルツーラス(T. incertulas)(キイロメイチュウ, yellow rice borer))；クナファロクロシス属(Cnaphalocrosis spp.)（例えば、Ｃ．メディナリス(C. medinalis)(コブノメイガ, rice leafroller)）;アグロマイザ属(Agromyza spp.)（例えば、Ａ．オリゼー(A. oryzae)(ハモグリバエ, leafminer)、またはＡ．パルヴィコミス(A. parvicomis)(コーンブロットハモグリバエ, corn blot leafminer)）;ディアトラエア属(Diatraea spp.)（例えば、Ｄ．サッカラリス(D. saccharalis)(サトウキビ穴あけ虫, sugarcane borer)、またはＤ．グランディオセッラ(D. grandiosella)(南西部アワノメイガ, southwestern corn borer)）;ナルナガ属(Narnaga spp.)（例えば、Ｎ．エアネセンス(N. aenescens)(フタオビコヤガ, green rice caterpillar)）;ザントデス属(Xanthodes spp.)（例えば、Ｘ．トランスベルサ(X. transversa)(イモムシ, green caterpillar)）；スポドプテラ属(Spodoptera spp.)(例えば、Ｓ．フルジペルダ(S. frugiperda)(ヨトウガの一種, fall armyworm)、Ｓ．エクシグア(S. exigua)(シロイチモジヨトウ, beet armyworm)、Ｓ．リットラリス(S. littoralis)(クライミング・カットウォーム, climbing cutworm)またはＳ．プラエフィカ(S. praefica)(ウエスタン・イエローストライプド・アーミーウォーム, western yellowstripped armyworm));ミシムナ属(Mythimna spp.)(例えば、ミシムナ(Mythimna)(シューダレチア(Pseudodaletia)セパラーテ(separate)(アワヨトウ, armyworm));ヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)（例えば、Ｈ．ゼア(H. zea)(オオタバコガ, corn earworm)）;コラスピス属(Colaspis spp.)(例えば、Ｃ．ブルンネア(C. brunnea)(グレープ・コラスピス, grape colaspis)）；リソルホプトラス属(Lissorhoptrus spp.)(例えば、Ｌ．オリゾフィラス(L. orysophilus)(イネミズゾウムシ, rice water weevil));エチノクネムス属(Echinocnemus spp.)（例えば、Ｅ．スクワモス(E. squamos)(イネゾウムシ, rice plant weevil);ディクロディスパ属(Diclodispa spp.)（例えば、Ｄ．アルミジェラ(D. armigera)(ライスヒスパ, rice hispa)）；オーレマ属(Oulema spp.)（例えば、Ｏ．オリゼー(O. oryzae)(イネドロオイムシ, leaf beetle)）;シトフィラス属(Sitophilus spp.)(例えば、Ｓ．オリゼー(S. oryzae)(ココクゾウムシ, rice weevil)); パチディプロシス属(Pachydiplosis spp.)(例えば、Ｐ．オリゼー(P. oryzae)(イネノシントメタマバエ, rice gall midge));ヒドレリア属(Hydrellia spp.)(例えば、Ｈ．グリセオラ(H. griseola)(イネミギワバエ, small rice leafminer) またはＨ．ササキ(H. sasakii)( イネカラバエ, rice stem maggot))；クロロプス属(Chlorops spp.)（例えば、Ｃ．オリゼー(C. oryzae)(カラバエ, stem maggot)）；ディアブロチカ属(Diabrotica spp.)（例えば、Ｄ．ヴィルジフェラ・ヴィルジフェラ(D. virgifera virgifera)(ウエスターン・コーン・ルートウォーム, western corn rootworm)、Ｄ．バルバリ(D. barberi)(ノザン・コーン・ルートウォーム, northern corn rootworm)、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ホワルディ(D. undecimpunctata howardi)(サザン・コーン・ルートウォーム, southern corn rootworm)、Ｄ．ヴィルジフェラ・ゼアエ(D. virgifera zeae)(メキシカン・コーン・ルートウォーム, Mexican corn rootworm)；Ｄ．バルテアタ(D. balteata)(バンデド・キューカムバー・ビートル, banded cucumber beetle)）；オストリニア属(Ostrinia spp.)（例えば、Ｏ．ヌビラリス(O. nubilalis)(アワノメイガ, European corn borer)）;アグロティス属(Agrotis spp.)（例えば、Ａ．イプシロン(A. ipsilon)(タマナヤガ, black cutworm)）;エラスモパルプス属(Elasmopalpus spp.)（例えば、Ｅ．リグノセラス(E. lignosellus)(モロコシマダラメイガ, lesser cornstalk borer)、メラノトス属(Melanotus spp.)(ハリガネムシ, wireworms);シクロセファーラ属(Cyclocephala spp.)（例えば、Ｃ．ボレアリス(C. borealis)(ノザン・マスクド・チェーファー, northern masked chafer)またはＣ．イムマキュラータ(C. immaculate)(サザン・マスクド・チェーファー, southern masked chafer)）;ポピリア属(Popillia spp.)（例えば、Ｐ．ジャポニカ(P. japonica)(マメコガネ, Japanese beetle)）；チェトクネマ属(Chaetocnema spp.)（例えば、Ｃ．プリカリア(C. pulicaria)(トウモロコシトビハムシ, corn flea beetle)）；スフェノフォラス属(Sphenophorus spp.)（例えば、Ｓ．マイディス(S. maidis)(メイズ・ビルバグ, maize billbug)）；ローパロシフム属(Rhopalosiphum spp.)（例えば、Ｒ．マイディス(R. maidis)(トウモロコシアブラムシ, corn leaf aphid)）;アニュラフィス属(Anuraphis spp.)（例えば、Ａ．マイディラディシス(A. maidiradicis)(コーン・ルート・アフィド, corn root aphid)）；メラノプラス属(Melanoplus spp.)（例えば、Ｍ．フェムルブルム(M. femurrubrum)(レッドレッグド・グラスホッパー, redlegged grasshopper)、Ｍ．ディッファレンチアティス(M. differentiates)(ディファレンシャル・グラスホッパー, differential grasshopper)またはＭ．サングイニペス(M. sanguinipes)(ミグラトリー・グラスホッパー, migratory grasshopper)）；ハイレミア属(Hylemya spp.)（例えば、Ｈ．プラツーラ(H. platura)(タネバエ, seedcorn maggot)）;アナホスリップス属(Anaphothrips spp.)（例えば、Ａ．オブスクルルス(A. obscrurus)(グラス・スリップス, grass thrips)）;ソレノプシシ(Solenopsis spp.)（例えば、Ｓ．ミレスタ(S. milesta)(シーフ・アント, thief ant)）;またはテラニチュス属(Tetranychus spp.)(例えば、Ｔ．ウルチカエ(T. urticae)(ナミハダニ, twospotted spider mite)、Ｔ．シンアバリナス(T. cinnabarinus)(ニセナミハダニ, carmine spider mite);ヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)（例えば、Ｈ．ゼア(H. zea)(コットン・ボウルウォーム, cotton bollworm)、またはＨ．アーミジェラ(H. armigera)(アメリカン・ボウルウォーム, American bollworm)）;ペクチノフォラ属(Pectinophora spp.)（例えば、Ｐ．ゴッシピエラ(P. gossypiella)(ワタギバガ, pink bollworm)）;イーリアス属(Earias spp.)(例えば、Ｅ．ビッテラ(E. vittella)(スポッテド・ボウルウォーム, spotted bollworm));ヘリオディス属(Heliothis spp.)（例えば、Ｈ．ヴィレセンス（H. virescens）(タバコガ, tobacco budworm)）;アントノムス属(Anthonomus spp.)（例えば、Ａ．グランディス(A. grandis)(ワタミハナゾウムシ, boll weevil)）;シューダトモスセリス属(Pseudatomoscelis spp.)（例えば、Ｐ．セリアツス(P. seriatus)(コットン・フリーホッパー, cotton fleahopper)）;トリアリューロデス属(Trialeurodes spp.)（例えば、Ｔ．アブチロネウス(T. abutiloneus)(バンデド−ウイングド・ホワイトフライ, banded-winged whitefly)、Ｔ．ヴァポラリオラム(T. vaporariorum)(オンシツコナジラミ, greenhouse whitefly)）;ベミシア属(Bemisia spp.)（例えば、Ｂ．アルジェンチフォリ(B. argentifoli)(シルバーリーフコナジラミ, silverleaf whitefly)）;アフィス属(Aphis spp.)（例えば、Ａ．ゴッシッピー(A. gossypii)(ワタアブラムシ, cotton aphid)）;リガス属(Lygus spp.)（例えば、Ｌ．リネオラリス(L. lineoraris)(サビイロカスミカメ, tarnished plant bug)またはＬ．ヘスペルス(L. Hesperus)(ウエスターン・ターニシュド・プラントバッグ, western tarnished plant bug)）；ユーシスツス属(Euschistus spp.)（例えば、Ｅ．コンスパーサス(E. consepersus)(コンスパース・スティンク・バッグ, consperse stink bug)）;クロロクロア属(Chlorochroa spp.)（例えば、Ｃ．サイ(C. sayi)(サイ・スティンクバッグ, Say stinkbug)）;ネザラ属(Nezara spp.)（例えば、Ｎ．ヴィリデュラ(N. viridula)(ミナミアオカメムシ, southern green stinkbug)）;スリップス属(Thrips spp.)（例えば、Ｔ．タバチ(T. tabaci)(ネギアザミウマ, onion thrips)）;フランクリニエラ属(Frankliniella spp.)（例えば、Ｆ．フスカ(F. fusca)(タバコアザミウマ, tobacco thrips)、またはＦ．オッキデンタリス(F. occidentalis)(ミカンキイロアザミウマ, western flower thrips)）;レプチノタルサ属(Leptinotarsa spp.)（例えば、Ｌ．デセムリネアータ(L. decemlineata)(コロラドハムシ, Colorado potato beetle)、Ｌ．ジュンクタ(L. juncta)（フォールス・ポテト・ビートル, false potato beetle)、またはＬ．テクサーナ(T. texana)(テクサン・フォールス・ポテト・ビートル, Texan false potato beetle)）;レマ属(Lema spp.)（例えば、Ｌ．トリリネアータ(L. trilineata)(スリーラインド・ポテト・ビートル, three-lined potato beetle)）;エピトリックス属(Epitrix spp.)（例えば、Ｅ．ククメリス(E. cucumeris)(ポテトトビハムシ, potato flea beetle)、Ｅ．ヒルチペニス(E. hirtipennis)(トビハムシ, flea beetle)、またはＥ．ツベリス(E. tuberis)(ツーバー・フリー・ビートル, tuber flea beetle)）;エピカウタ属(Epicauta spp.)（例えば、Ｅ．ヴィッタータ(E. vittata)(ストリップド・ブリスター・ビートル, striped blister beetle)）;ファエドン属(Phaedon spp.)（例えば、Ｐ．コクレアリアエ(P. cochleariae)(マスタード・リーフ・ビートル, mustard leaf beetle)）;エピラクナ属(Epilachna spp.)（例えば、Ｅ．バリヴェティス(E. varivetis)(インゲンテントウ, Mexican bean beetle)）;アチェタ属(Acheta spp.)(例えば、Ａ．ドメスティカス(A. domesticus)(イエコオロギ, house cricket));エムポアスカ属(Empoasca spp.)(例えば、Ｅ．ファバエ(E. fabae)(ジャガイモヒメヨコバイ, potato leafhopper));ミズス属(Myzus spp.)（例えば、Ｍ．ペルシカエ(M. persicae)(モモアカアブラムシ, green peach aphid)）;パラトリオザ属(Paratrioza spp.)（例えば、Ｐ．コケレリ(P. cockerelli)(キジラミ, psyllid)）;コノデルス属(Conoderus spp.)（例えば、Ｃ．フォーリ(C. falli)(サザン・ポテト・ワイアウォーム, southern potato wireworm)、またはＣ．ヴェスペルチヌス(C. vespertinus)(タバコ・ワイアウォーム, tobac
co wireworm)）;フソリマエア属(Phthorimaea spp.)(例えば、Ｐ．オ ペルクレッラ(P. operculella)(ジャガイモガ, potato tuberworm));マクロシフム属(Macrosiphum spp.)(例えば、Ｍ．ユーフォルビアエ(M. euphorbiae)(チューリップヒゲナガアブラムシ,potato aphid));チアンタ属(Thyanta spp.)（例えば、Ｔ．パリドヴィレンス(T. pallidovirens)(レッドショルダード・スティンクバッグ,redshouldered stinkbug)）;フソリマエア属(Phthorimaea spp.)(例えば、Ｐ．オ ペルクレッラ(P. operculella)(ジャガイモガ,potato tuberworm));ヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)（例えば、Ｈ．ゼア(H. zea)(トマト・フルーツウォーム, tomato fruitworm)）；ケイフェリア属(Keiferia spp.)（例えば、Ｋ．リコペリシセラ(K. lycopersicella)(トマト・ピンウォーム, tomato pinworm)）;リモニウス属(Limonius spp.)（ワイアウォーム, wireworms）;マンデュカ属(Manduca spp.)（例えば、Ｍ．セクタ(M. sexta)(タバコ・ホーンウォーム, tobacco hornworm)、またはＭ．クウィンケウェマクラタ(M. quinquemaculata)(トマト・ホーンウォーム, tomato hornworm)）;リリオマイザ属(Liriomyza spp.)（例えば、Ｌ．サチヴァエ(L. stivae)、Ｌ．トリフォリ(L. trifolli)またはＬ．ウィドブレンシス(L. huidobrensis)(ハモグリバエ, leafminer)）;ドロソフィラ属(Drosophilla spp.)（例えば、Ｄ．メラノガスター(D. melanogaster)、Ｄ．ヤクバ(D. yakuba)、Ｄ．シュードオブスキューラ(D. pseudoobscura)またはＤ．シムランス(D. simulans)；カラブス属(Carabus spp.)（例えば、Ｃ．グラヌラタス(C. granulatus);キロノムス属(Chironomus spp.)（例えば、Ｃ．テンタヌス(C. tentanus)；クテノセファリデス属(Ctenocephalides spp.)（例えば、Ｃ．フェリス(C. felis)(ネコノミ, cat flea)）;ディアプレペス属(Diaprepes spp.)（例えば、Ｄ．アブレヴィアタス(D. abbreviatus) (ルート・ウィーヴィル, root weevil)）；アイプス属(Ips spp.)（例えば、Ｉ．ピニ(I. pini)(パイン・エングレーバー, pine engraver)）;トリボリウム属(Tribolium spp.)（例えば、Ｔ．カスタニュウム(T. castaneum)(コクヌストモドキ, red flour beetle)）;グロッシーナ属(Glossina spp.)（例えば、Ｇ．モルシタンス(G. morsitans)(ツェツェバエ, tsetse fly)）;アノフェレス属(Anopheles spp.)（例えば、Ａ．ガムビアエ(A. gambiae)(マラリア蚊, malaria mosquito)）;ヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)（例えば、Ｈ．アーミジェラ(H. armigera)(アフリカン・ボールウォーム, African Bollworm)）;アシルソシフォン属(Acyrthosiphon spp.)（例えば、Ａ．ピスム(A. pisum)(ソラマメヒゲナガアブラムシ, pea aphid)）;アピス属（Apis spp.）（例えば、Ａ．メリフェラ(A. melifera)( セイヨウミツバチ, honey bee)）;ホマロディスカ(Homalodisca spp.)（例えば、Ｈ．コーギュレーテ(H. coagulate)(グラッシーウイングド・シャープシューター, glassy-winged sharpshooter)）;エアデス属(Aedes spp.)（例えば、Ａｅ．エアジプチ(Ae. Aegypti)(ネッタイシマカ, yellow fever mosquito)）;ボムビックス属(Bombyx spp.)（例えば、Ｂ．モリ(B. mori)(カイコ, silkworm)）;ロカスタ属(Locusta spp.)（例えば、Ｌ．ミグラトリア(L. migratoria)(トノサマバッタ, migratory locust)）;ブーフィラス属(Boophilus spp.)（例えば、Ｂ．ミクロプラス(B. microplus)(ウシマダニ, cattle tick)）;アカンソスクリア属(Acanthoscurria spp.)(例えば、Ａ．ゴメシアナ(A. gomesiana)(レッドヘアード・チョコレート・バード・イーター, red-haired chololate bird eater));ディプロプテラ属(Diploptera spp.)（例えば、Ｄ．プンクタータ(D. punctata)(パシフィック・ビートル・コックローチ, pacific beetle cockroach)）;ヘリコニウス属(Heliconius spp.)（例えば、Ｈ．エラート(H. erato)(レッド・パッション・フラワー・バタフライ, red passion flower butterfly)またはＨ．メルポメネ(H. melpomene)(ポストマン・バタフライ, postman butterfly)）;クルクリオ属(Curculio spp.)（例えば、Ｃ．グランディウム(C. glandium)(アコーン・ウィーヴィル, acorn weevil)）;プルテッラ属(Plutella spp.)（例えば、Ｐ．キシロステッラ(P. xylostella)(コナガ, diamondback moth)）;アムブリオムマ属(Amblyomma spp.)（例えば、Ａ．ヴァリエガツム(A. variegatum)(ウシマダニ, cattle tick)）;アンテラエア属(Anteraea spp.)（例えば、Ａ．ヤママイ(A. yamamai)(カイコガ, silkmoth)）;およびアーミジェレス属(Armigeres spp.)（例えば、Ａ．スバルバツス(A. subalbatus)）；などのような、しかしこれに限定されない植物害虫である昆虫からなる群から選択される。
本発明の好ましい植物病原性昆虫は、レプチノタルサ属(Leptinotarsa spp.)（例えば、Ｌ．デセムリネアータ(L. decemlineata)(コロラドハムシ, Colorado potato beetle)、Ｌ．ジュンクタ(L. juncta)（フォールス・ポテト・ビートル, false potato beetle)、またはＬ．テクサーナ(T. texana)(テクサン・フォールス・ポテト・ビートル, Texan false potato beetle)）;ニラパルヴァータ属（Nilaparvata spp.）（例えば、Ｎ．ルーゲンス(N.lugens)(トビイロウンカ, brown planthopper)); ラオデルファアックス属(Laodelphax spp.)（例えば、Ｌ．ストリアテラス(L. striatellus)（ヒメトビウンカ,small brown plnathopper））；ネフォテティックス属(Nephotettix spp.)（例えば、Ｎ．ヴィレセンス(N. virescens)またはＮ．チンクチセプス(N. cincticeps)（ツマグロヨコバイ, green leafhoppr）、またはＮ．ニグロプクタス(N. nigropictus)(クロスジツマグロヨコバイ, rice leafhopper)）；ソガテッラ属(Sogatella spp.)（例えば、Ｓ．フルシフェラ(furcifera)（セジロウンカ, white-backed planthopper））；キロ属(Chilo spp.)(例えば、Ｃ．サプレッサリス(C. suppressalis)(ニカメイチュウ, rice striped stem borer)、Ｃ．オーリチリウス(C. auricilius)（縁が金色の茎食い虫, gold-fringed stem borer）、またはＣ．ポリクリサス(C. polychrysus)(頭部が暗色の茎食い虫, dark-head stem borer)); セサミア属(Sesamia spp.)(例えば、Ｓ．インフェレンス(S. inferens)(イネヨトウ, pink rice borer));トリポリザ属(Tryporyza spp.)(例えば、Ｔ．イノタータ(T. innotata)(シロメイチュウ, white rice borer)またはＴ．インセルツーラス(T. incertulas)(キイロメイチュウ, yellow rice borer))；アントノムス属(Anthonomus spp.)（例えば、Ａ．グランディス(A. grandis)(ワタミハナゾウムシ, boll weevil)）; ファエドン属(Phaedon spp.)（例えば、Ｐ．コクレアリアエ(P. cochleariae)(マスタード・リーフ・ビートル, mustard leaf beetle)）;エピラクナ属(Epilachna spp.)（例えば、Ｅ．バリヴェティス(E. varivetis)(インゲンテントウ, Mexican bean beetle)）; トリボリウム属(Tribolium spp.)（例えば、Ｔ．カスタニュウム(T. castaneum)(コクヌストモドキ, red flour beetle)）; ディアブロチカ属(Diabrotica spp.)（例えば、Ｄ．ヴィルジフェラ・ヴィルジフェラ(D. virgifera virgifera)(ウエスターン・コーン・ルートウォーム, western corn rootworm)、Ｄ．バルバリ(D. barberi)(ノザン・コーン・ルートウォーム, northern corn rootworm)、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ホワルディ(D. undecimpunctata howardi)(サザン・コーン・ルートウォーム, southern corn rootworm)、Ｄ．ヴィルジフェラ・ゼアエ(D. virgifera zeae)(メキシカン・コーン・ルートウォーム, Mexican corn rootworm)；オストリニア属(Ostrinia spp.)（例えば、Ｏ．ヌビラリス(O. nubilalis)(アワノメイガ, European corn borer)）; アナホスリップス属(Anaphothrips spp.)（例えば、Ａ．オブスクルルス(A. obscrurus)(グラス・スリップス, grass thrips)）; ペクチノフォラ属(Pectinophora spp.)（例えば、Ｐ．ゴッシピエラ(P. gossypiella)(ワタギバガ, pink bollworm)）; ヘリオディス属(Heliothis spp.)（例えば、Ｈ．ヴィレセンス（H. virescens）(タバコガ, tobacco budworm)）; トリアリューロデス属(Trialeurodes spp.)（例えば、Ｔ．アブチロネウス(T. abutiloneus)(バンデド−ウイングド・ホワイトフライ, banded-winged whitefly)、Ｔ．ヴァポラリオラム(T. vaporariorum)(オンシツコナジラミ, greenhouse whitefly)）; ベミシア属(Bemisia spp.)（例えば、Ｂ．アルジェンチフォリ(B. argentifoli)(シルバーリーフコナジラミ, silverleaf whitefly)）; アフィス属(Aphis spp.)（例えば、Ａ．ゴッシッピー(A. gossypii)(ワタアブラムシ, cotton aphid)）; リガス属(Lygus spp.)（例えば、Ｌ．リネオラリス(L. lineoraris)(サビイロカスミカメ, tarnished plant bug)またはＬ．ヘスペルス(L. Hesperus)(ウエスターン・ターニシュド・プラントバッグ, western tarnished plant bug)）；ユーシスツス属(Euschistus spp.)（例えば、Ｅ．コンスパーサス(E. consepersus)(コンスパース・スティンク・バッグ, consperse stink bug)）; クロロクロア属(Chlorochroa spp.)（例えば、Ｃ．サイ(C. sayi)(サイ・スティンクバッグ, Say stinkbug)）; ネザラ属(Nezara spp.)（例えば、Ｎ．ヴィリデュラ(N. viridula)(ミナミアオカメムシ, southern green stinkbug)）; スリップス属(Thrips spp.)（例えば、Ｔ．タバチ(T. tabaci)(ネギアザミウマ, onion thrips)）; フランクリニエラ属(Frankliniella spp.)（例えば、Ｆ．フスカ(F. fusca)(タバコアザミウマ, tobacco thrips)、またはＦ．オッキデンタリス(F. occidentalis)(ミカンキイロアザミウマ, western flower thrips)）; アチェタ属(Acheta spp.)(例えば、Ａ．ドメスティカス(A. domesticus)(イエコオロギ, house cricket)); ミズス属(Myzus spp.)（例えば、Ｍ．ペルシカエ(M. persicae)(モモアカアブラムシ, green peach aphid)）; マクロシフム属(Macrosiphum spp.)(例えば、Ｍ．ユーフォルビアエ(M. euphorbiae)(チューリップヒゲナガアブラムシ, potato aphid)); ブリッサス属(Blissus spp.)(例えば、Ｂ．ロイコプテラス・ロイコプテルス(B.leucopterus leucopterus)（ナガカメムシ, chinch bug）)；アクロステマム属(Acrostemum spp.)（例えば、Ａ．ヒラーレ(A. hilare)(アオカメムシ, green stink bug)）; キロトラエア属(Chilotraea spp.)（例えば、Ｃ．ポリクリサ(C. polychrysa)(コメ茎穴あけ虫, rice stalk borer)）；リソルホプトラス属(Lissorphoptrus spp.)(例えば、Ｌ．オリゾフィラス(L. orysophilus)(イネミズゾウムシ, rice water weevil)); ローパロシフム属(Rhopalosiphum spp.)（例えば、Ｒ．マイディス(R. maidis)(トウモロコシアブラムシ, corn leaf aphid)）;およびアニュラフィス属(Anuraphis spp.)（例えば、Ａ．マイディラディシス(A. maidiradicis)(コーン・ルート・アフィド, corn root aphid)）からなる群から選択される植物害虫である。
より具体的な実施態様では、本発明の方法はレプチノタルサ(Leptinotarsa)種に適用可能である。レプチノタルサ(Leptinotarsa)は、クリソメリダエ(Chrysomelidae)またはヨモギハムシ(Leaf beatles)の系統群に属する。トビハムシ(Flea Beetles)およびトウモロコシ根切りムシ(Corn Rootworms) などのクリソメリド・ビートル(Chrysomelid beetles)およびアルファルファタコゾウムシ(Alfalfa beetles)などのクルクリオニズ(Curculionids)は、特に重要な害虫である。ドビハムシ(Flea Beetles)は、多くの草、穀物および薬草の葉を食べる多数の小さな葉食性ビートルを含む。トビハムシ(Flea Beetles)は、多数の属（例えば、アティッカ(Attica)、アッフソナ(Apphthona)、アルゴピステス(Argopostes)、ディソニチャ(Disonycha)、エピトリックス(Epitrix)、ロンジタルサス(Longitarsus)、プロダグリコメラ(Prodagricomela)、システーナ(Syntena)およびフィロトレータ(Phyllotreta)）を含む。ナタネトビハムシ(Rape Flea Beetles)としても公知であるトビハムシ(Flea Beetles)、フィロトレタ・クルシフェラエ(Phyllotreta cruciferae)は、特に重要な害虫である。トウモロコシ根切りムシ(Corn Rootworms)は、ディアブロチカ(Diabrotica)属（例えば、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ウンデシムプンクタータ(D. undecimpunctata undecimpunctata)、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ホワルディイ(D. undecimpunctata howardii)、Ｄ．ロンジコルニス(D. longicornis)、Ｄ．ヴィルジフェラ(D. virgifera)およびＤ．バルテアタ(D. balteata)中に見出される種を含む。トウモロコシ根切りムシ(Corn Rootworms)は、トウモロコシおよびニガウリに大規模な損害を引き起こす。ウエスターン・スポッテド・キューカンバー・ビートル(Western Spotted Cucumber Beetle)、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ウンデシムプンクタータ(D. undecimpunctata undecimpunctata)は、アメリカ西部におけるニガウリの害虫である。（クローバタコゾウムシ(Clover wewvils)としても公知である）アルファルファタコゾウムシ(Alfalfa weevils)は、ハイペラ属(Hypera genus)（Ｈ．ポスティカ(H. postica)、Ｈ．ブルンネイペンニス(H. brunneipennis)、Ｈ．ニグリオストリス(H. nigriostris)、Ｈ．プンクタータ(H. punctata)およびＨ．メレス(H. meles)）に属し、マメ科植物の重要な害虫と考えられる。エジプトアルファルファタコゾウムシ(Egyptian alfalfa weevil)、Ｈ．ブルンネイペンニス(H. brunneipennis)は、アメリカ西部におけるアルファルファの重要な害虫である。
３０種類以上のレプチノタルサ種(Leptinotarsa species)が存在する。すなわち、本発明はレプチノタルサ種(Leptinotarsa species)を制御する方法、より具体的には、昆虫を殺傷するか、またはレプチノタルサ(Leptinotarsa)昆虫の発生または成長を阻止するか、または昆虫が感染または横行することを阻止する方法を包含する。本発明により制御する具体的なレプチノタルサ種(Leptinotarsa species)は、コロラドハムシ（前記レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leceptinotarsa decemlineata))およびフォールス・ポテト・ビートル（前記レセプチノタルサ・ジュンクタ(Leceptinotarsa juncta))を含む。
ＣＰＢは、我々の国産ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム(Solanum tuberosum)、他の栽培または野生のジャガイモ近縁および非近縁種（例えば、Ｓ．デミッスム(S. demissum)、Ｓ．フレジャ・エイ・オー(S. phureja a.o.)および下記種を含む他のソラナセオウス(Solanaceous)（イヌホウズキ）植物種の（深刻な）害虫である；
（ａ）作物種、トマト（いくつかのリコペルシコン種(Lycopersicon species)）、ナス（ソラヌム・メロンジェナ(Solanum melongena)、コショウ（いくつかのカプシクム種(Capsicum species)）、タバコ（観賞植物を含むいくつかのニコチアーナ種(Nicotiana species)）およびセンナリホウズキ（フィサリス種(Physalis species)）；
（ｂ）ウィード／ハーブ種、ワルナスビ（Ｓ．カロリネンス(S. carolinense)）、イヌホオズキ（Ｓ．デュルカマラ(S. dulcamara)）、ベラドンナ（アスロパ種(Asropa species)）、チョウセンアサガオ（ダツーラ種(Ｄatura species)）、ヒヨス（ヒオスシアムス種(Hyoscyamus species)）およびバッファロー・バー（Ｓ．ロストラツム(S. rostratum)）。
ＦＰＢはワルナスビに主に見られるが、イヌホオズキ、センナリホウズキ、およびショクヨウホウズキ（フィサリス種(Physalis species)）にも生じる。
「昆虫」との用語は、卵、幼虫または若虫、蛹および成虫の段階を含む発生の全段階におけるおよび全てのタイプの昆虫を包含する。
本発明は、昆虫がレプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata)（コロラドハムシ）であり、植物がジャガイモ、ナス、トマト、コショウ、タバコ、センナリホウズキまたはコメ、コーンまたはワタである、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がファエドン・コクレアリアエ(Phaedon cochleariae)(マスタード・リーフ・ビートル)であり、植物がカラシナ、ハクサイ、カブの葉、コラード若葉または青梗菜である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がエピラクナ・バリヴェティス(Epilachna varivetis)(インゲンテントウ)であり、植物がマメ、フィールド・ビーン、ガーデン・ビーン、インゲンマメ、ライマメ、ヤエナリ、サヤインゲン、黒目豆、ベルベット・ビーン、ダイズ、ササゲ、キマメ、クローバーまたはアルファルファである、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がアントノムス・グランディス(Anthonomus grandis)(ワタミハナゾウムシ)であり、植物がワタである、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がトリボリウム・カスタニュウム(Tribolium castaneum)(コクヌストモドキ)であり、植物が小麦粉、穀物、食事、クラッカー、マメ、スパイス、パスタ、ケーキミックス、乾燥ペットフード、ドライフラワー、チョコレート、ナッツ、種子、およびイーブン・ドライド・ミュージアム・スペーシメンなどの貯蔵された穀物製品の形態である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がミズス・ペルシカエ(Myzus persicae)(モモアカアブラムシ)であり、植物が特にモモ、アプリコットおよびプラムなどのプラナス（Prunus）などの樹木；朝鮮アザミ、アスパラガス、マメ、ビーツ、ブロッコリ、芽キャベツ(Brussel sprouts)、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、カンタロープ、セロリ、コーン、キュウリ、ウイキョウ、ケイル、球茎甘藍、カブ、ナス、レタス、カラシナ、オクラ、パセリ、マメ、コショウ、ジャガイモ、ダイコン、ホウレンソウ、カボチャ、トマト、カブ、オランダガラシおよびスイカを含むがこれに限定されない、ソラナセアエ（Solanaceae）、ケノポディアセアエ(Chenopodiaceae)、コムポシタエ（Compositae）、クルシフェラエ（Cruciferae）およびククルビータアエ(Cucurbitaceae)科の野菜作物；タバコ、シュガービートおよびヒマワリなどの、しかしこれに限定されない畑作物；花作物または他の観賞用植物である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilaparvata lugens)であり、植物がイネである、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がキロ・サプレッサリス(Chilo suppressalis)(ニカメイチュウ)であり、植物がイネ、オオムギ、ソルガム、トウモロコシ、コムギまたは草である、ここに記載された方法にまで及び。
本発明は、昆虫がプルテッラ・キシロステッラ(Plutella xylostella)(コナガ)であり、植物がキャベツ、ハクサイ、芽キャベツ、ケイル、アブラナ、ブロッコリ、カリフラワー、カブ、カラシナまたはダイコンなどの、しかしこれに限定されないブラッシカ種(Brassica species)である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がアチェタ・ドメスティカス(Acheta domesticus)(イエコオロギ)であり、植物はここに記載されるいかなる植物であるか、またはいかなる有機物である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明から利点を得る「感受性を有する生物」との用語では、害虫の横行に対して感受性を有するいかなる生物も含まれる。好ましくは、植物は植物害虫生物による横行から保護されることによって、本発明から利点を得る。
好ましい実施態様では、感受性を有する生物は植物であり、害虫は植物病原性昆虫である。この実施態様では、昆虫は植物病原性害虫に横行されるか、またはこの横行に対して感受性を有する植物、植物の部分、植物細胞または植物種子中でｄｓＲＮＡ分子を発現して、ＲＮＡ分子に接触させる。
この文脈中で、「植物」との用語は昆虫の成長および／または昆虫の横行を阻止または減少させるために処理することが望まれるいかなる植物材料をも包含する。これは、とりわけ、植物全体、実生、種子などの増殖または再生材料、挿し木、接木、外植体など、および植物細胞および組織培養物も含む。植物材料は害虫生物の少なくとも１つの標的遺伝子のセンス鎖のヌクレオチド配列の少なくとも一部のＲＮＡ相補鎖であるか、あるいはこれのＲＮＡ均等物を表示する、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子を発現するか、あるいは発現する能力を有するべきであり、このようにして、ＲＮＡ分子は植物と害虫の相互作用時に害虫に取り込まれ、前記ＲＮＡ分子はＲＮＡ干渉によって標的遺伝子を阻害するか、または標的遺伝子の発現を下方制御することが可能である。
標的遺伝子はここに記載される標的遺伝子のすべてであり、例えば、害虫の生存、成長、発生または再生に必須である標的遺伝子である。本発明は下方制御され得る、昆虫において興味あるいかなる遺伝子（「標的遺伝子」としてここに引用される）にも関する。
「遺伝子発現の下方制御」および「遺伝子発現の阻害」との用語は、交互に使用され、測定可能または観察可能な遺伝子発現の低下または標的遺伝子からのタンパク生成物および／またはｍＲＮＡ生成物の濃度における、検出可能な遺伝子発現の完全な消滅をいう。好ましくは、下方制御は昆虫の他の遺伝子の発現を実質的には直接に阻害しない。遺伝子発現におけるｄｓＲＮＡの下方制御効果は、通常の遺伝子発現に比べて、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、好ましくは７０％、８０％またはさらに好ましくは９０％または９５％であると計算される。標的遺伝子の性質に応じて、昆虫の細胞中での遺伝子発現の下方制御または阻害は、細胞または昆虫全体の表現形の分析によって、またはＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ヌクレアーゼプロテクション、ノザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、放射性免疫分析（ＲＩＡ）、他の免疫測定法、または蛍光標識細胞分析（ＦＡＣＳ）などの分子技術を使用するｍＲＮＡまたはタンパク発現の測定によって確認され得る。
「標的遺伝子」は、本質的には、これは昆虫の成長または病原性または感染性と干渉するため、阻止されることが望ましい全ての遺伝子である。例えば、もしも本発明の方法が昆虫の成長および／または横行を阻止するために使用されるべきなら、その場合、昆虫の生存、成長、発生または再生にとって必須である標的遺伝子、または昆虫の病原性または感染性に関与する全ての遺伝子を選択することが好ましく、このようにして標的遺伝子の特定の阻害が致命的な表現型となるか、あるいは昆虫の横行を減少または停止させる。
非限定的な実施態様では、標的遺伝子は本発明の方法を使用してその発現が下方制御されるか、または阻害される場合、昆虫が殺されるか、または昆虫の再生または成長が停止されるか、または遅延されるようなものである。このタイプの標的遺伝子は昆虫の生存にとって必須であると考えられ、必須遺伝子と呼ばれる。したがって、本発明は標的遺伝子が必須遺伝子である、ここに記載される用法を包含する。
さらなる非限定実施態様では、標的遺伝子は、これが本発明の方法を使用して下方制御される場合、昆虫による横行または感染、昆虫によって引き起こされる損害、および／または宿主生物を荒らすかもしくは感染する、および／またはこのような損害を生じる昆虫の能力が低下されるものである。「横行する」および「感染する」または「横行」および「感染」との用語は、一般的に全体にわたって交互に使用される。このタイプの標的遺伝子は昆虫の病原性または感染力に関与すると考えられる。したがって、本発明は、標的遺伝子が昆虫の病原性または感染力に関与する、ここに記載される方法にまで及ぶ。後者タイプの標的遺伝子を選択する利点は、昆虫がさらに植物または植物の部分に感染することをブロックし、さらなる世代を形成することを阻害することである。
１つの実施態様では、標的遺伝子は保存遺伝子または昆虫特異的遺伝子である。
さらに、昆虫標的遺伝子のＲＮＡｉを指図するまたはＲＮＡ−仲介遺伝子サイレンシングまたは阻害する能力を有するすべての好適な２本鎖ＲＮＡ断片が、本発明の方法で使用される。
他の実施態様では、本質的に害虫の成長、発生および再生（昆虫としてなど）に関与する遺伝子が選択される。遺伝子の例としては、リボソーマルタンパクの構造サブユニットおよびＣＨＤ３遺伝子などのベータ−コータマー(beta-coatamer)が挙げられるが、これらに限定されない。Ｓ４（ＲｐＳ４）およびＳ９（ＲｐＳ９）などのリボソーマルタンパクは、タンパク生合成に関与するリボソームの構造上の成分であり、そして細胞内可溶質の小さなリボソーマルサブユニットの構成成分であり、Ｌ９およびＬ１９などのリボソーマルタンパクはリボソームに局在化するタンパク生合成に関与するリボソームの構造上の成分である。Ｃ．エレガンス(C. elegance)のベータ−コートマー遺伝子は、膜小胞外皮を形成する多量複合体のサブユニットであるタンパクをコードする。同様な配列はアラビドプシス・サリアーナ(Arabidopsis thaliana)、ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)、およびサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などの種々の生物に見出されている。関連した配列はレピチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata)、ファエドン・コクレアリアエ(Phaedon cochleariae)、エピラクナ・ヴァリヴェスティス(Epilachna variestis)、アンソノムス・グランディス(Anthonomus grandis)、トリボリウム・キャスタニュウム(Tribolium castaneum)、ミズス・ペルシカエ(Myzus persicae)、ニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilaparvata lugens)、キロ・サプレッサリス(Chilo suppresssalis)、プルテッラ・キシロステッラ(Plutella xylostella)およびアチェタ・ドメスティカス(Acheta domesticus)などの種々の生物に見出されている。
本発明に使用する他の標的遺伝子は、例えば、生存、成長、発生、再生および感染性において重要な役割を果たすものを含む。これらの標的遺伝子は、例えば、シノラブダイティス(Caenorhabditis)またはドロソフィラ(Drosophila)のハウスキーピング遺伝子、転写因子、および害虫特異的遺伝子または致死突然変異を含む。本発明に使用する標的遺伝子はまた、他の生物、例えば、昆虫またはアラクニダエ(arachniae)（例えば、レプチノタルサ属(Leptinotarsa spp.)、ファエドン属(Phaedon spp.)、エピラクナ属(Epilachna spp.)、アントノムス(Anthonomus spp.)、トリボリウム属(Tribolium spp.)、ミズス属(Myzus spp.)、ニラパルヴァータ属(Nilaparvata spp.)、キロ属(Chilo spp.)、プルテッラ(Plutella spp.)またはアチェタ属(Acheta spp.)）から得たものであってもよい。
好ましい標的遺伝子は、表１Ａに特定されるもの、および他の害虫生物など他の標的生物から得たオルソログ遺伝子を含む。
本発明の方法では、ｄｓＲＮＡは昆虫の成長を阻害するか、または病原性または感染性を干渉するために使用される。
すなわち、本発明はアニールされた相補鎖を含む単離２本鎖ＲＮＡに関し、そのうちの１つは、昆虫の標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する。標的遺伝子はここに記載される標的遺伝子のいずれかであってもいいし、あるいは同じ機能を発揮するその一部であってもいい。
本発明の一実施態様では、アニールされた相補鎖を含む単離された２本鎖ＲＮＡを提供する。そのうちの１つは、昆虫標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する。ここで、前記標的遺伝子は下記群から選択される配列を含む：
（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、または２４８１のいずれかに示される配列、またはこれらの相補鎖と少なくとも７５％同一であるか、および
（ｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、または２４８１のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドによって示される配列、
または、前記昆虫標的遺伝子は、配列番号４９〜１５８、２７５〜４７２、５３３〜５７５、６２１〜７６７、８１３〜８６２、９０８〜１０４０、１１６１〜１５７１、１７３０〜２０３９、２１２０〜２３３８、２３８４〜２４６０のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子の昆虫オルソログである。
遺伝子サイレンシングを測定するために使用される分析法に依存して、成長阻害はコントロールｄｓＲＮＡで処理された害虫生物に比べて、約５％、１０％、より好ましくは約２０％、２５％、３３％、５０％、６０％、７５％、８０％、最も好ましくは約９０％、９５％、または約９９％以上であると定量され得る。
本発明の他の実施態様では、単離された２本鎖ＲＮＡが提供される。そこで、前記アニールされた相補鎖の少なくとも１つが配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、または２４８１のいずれかに示されるヌクレオチド配列の少なくとも１つと均等であるＲＮＡを含むか、またはそこで、前記アニールされた相補鎖はその長さが少なくとも１７塩基対の断片のＲＮＡ均等物、その長さが好ましくは少なくとも１８、１９、２０または２１、より好ましくは少なくとも２２、２３または２４塩基対を含む。
もしも本発明の方法が、宿主細胞または宿主生物に、または宿主細胞または宿主生物で、特別な昆虫の成長または横行を特に制御するために使用されるなら、２本鎖ＲＮＡがいかなる宿主遺伝子とも有意な相同性を共有しないか、または宿主の必須遺伝子を少なくとも共有しないことが好ましい。この文脈では、２本鎖ＲＮＡは宿主細胞のいかなる遺伝子とも３０％以下、より好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、およびさらにより好ましくは５％以下同一である核酸配列を示すことが好ましい。配列の同一性（％）は２本鎖ＲＮＡ領域の完全長に対して計算される。もしもゲノム配列データが宿主生物において入手可能であるなら、標準的なバイオ情報ツールを使用して、２本鎖ＲＮＡとの配列同一性をクロスチェックする。１つの実施態様では、ｄｓＲＮＡと宿主配列の間に２１個以上の隣接したヌクレオチドの配列同一性が存在しない。これはｄｓＲＮＡの２１個の隣接塩基対が宿主生物のゲノム中に生じていないことが好ましいことを意味する。他の実施態様では、ｄｓＲＮＡの２４個以上の隣接ヌクレオチドは宿主種からのいかなるヌクレオチド配列とも約１０％以下または約１２．５％の以下の配列同一性を有する。
２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つは下方制御されるべき標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチオド配列を有する。２本鎖ＲＮＡの他の鎖は第１番目の鎖と塩基対を有することができる。
標的昆虫遺伝子の「標的領域」または「標的ヌクレオチド配列」との表現は、遺伝子の好適な領域またはヌクレオチド配列である。標的領域は標的遺伝子の少なくとも１７、少なくとも１８または少なくとも１９個の隣接したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２０または少なくとも２１個のヌクレオチドおよびより好ましくは標的遺伝子の少なくとも２２、２３または２４個のヌクレオチドを含むべきである。
２本鎖ＲＮＡ（の少なくとも一部）は昆虫標的遺伝子の標的領域と配列同一性１００％を共有するであろうことが好ましい。しかしながら、２本鎖領域の全長にわたって配列同一性１００％が機能的ＲＮＡ阻害には必須でないと評価される。標的配列に対して、挿入、欠失および単一変異を有するＲＮＡ配列は、ＲＮＡ阻害において効果的であると判断されている。ここで使用される「に対応する」または「に相補的である」との用語は交互に使用され、これらの用語が２本鎖ＲＮＡと標的遺伝子の標的領域の間の配列対応を呼ぶ場合、それらはしたがって配列同一性１００％を絶対的に必要としないと解釈される。しかしながら、２本鎖ＲＮＡと標的領域の間の配列同一性（％）は一般的に少なくとも８０％または８５％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、またはより好ましくは少なくとも９７％、９８％およびなおもより好ましくは少なくとも９９％同一である。２本の核酸鎖はそれらの塩基対が少なくとも８５％の場合、「実質的に相補的」である。
ここで使用される「相補的である」との用語は、ＤＮＡ−ＲＮＡ相補性とともにＤＮＡ−ＤＮＡ相補性の両方に関する。これと同様に、「ＲＮＡ均等」との用語はＤＮＡ配列において、塩基「Ｔ」がリボ核酸に通常、存在する対応する塩基「Ｕ」によって置換されることを実質的に意味する。
ｄｓＲＮＡは標的遺伝子の標的領域に対応する配列を含むけれども、ｄｓＲＮＡ全体が標的領域の配列に対応することを絶対的に必須としない。例えば、もしもこのような配列が物質(material extent)へのＲＮＡ阻害において、ｄｓＲＮＡの実行に影響を与えないなら、ｄｓＲＮＡは標的特異的配列に隣接する短い非標的領域を含んでいてもよい。
ｄｓＲＮＡはＲＮＡｉの実行を最適化するために、１つまたはそれ以上の置換塩基を含む。ｄｓＲＮＡのそれぞれの塩基をいかに変化させ、そして所与のｄｓＲＮＡの実行を最適化するために、得られたｄｓＲＮＡの活性を試験する（例えば、好適なインビトロ・テスト・システムで）ことは、当業者には自明であろう。
ｄｓＲＮＡはさらにＤＮＡ塩基、非天然塩基または非天然骨格連鎖または糖−リン酸骨格の修飾を、例えば、貯蔵中の安定性を増強するために、またはヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性を増強するために含む。
約２１ｂｐの短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の形成が、有効な遺伝子サイレンシングにおいて望ましいことが既に報告されている。しかしながら、本出願人の出願において、ある害虫生物により有効に摂取されるためには、ｄｓＲＮＡの最小の長さは好ましくは少なくとも約８０〜１００ｂｐであることが示されている。自由生活する線虫、Ｃ．エレガンス(C. elegans)、または植物寄生線虫、メロイドジーン・インコグニータ(Meloidogyne incognita)などの無脊椎動物では、これらのより長い断片はたぶん無脊椎動物によるこれらの長いｄｓＲＮＡのより有効な摂取により、遺伝子サイレンシングにおいてより有効であるとの徴候が存在する。
２７-マー平滑末端または２９-ｂｐステムおよび２-ｎｔ ３'突出部を有する短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡのいずれかからなる合成ＲＮＡ２本鎖は、従来の２１−マーｓｉＲＮＡよりもＲＮＡ干渉のより潜在的誘導物質であることも最近、示唆されている。すなわち、上記同定される標的に基づき、２７-マー平滑末端または２９-ｂｐステムおよび２-ｎｔ（ヌクレオチド）の３'突出部を有する短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡのいずれかである分子もまた、本発明の範囲内に含まれる。
したがって、１つの実施態様では２本鎖ＲＮＡ断片（または領域）はそれ自体、好ましくは少なくとも長さ１７ｂｐ、好ましくは長さ１８または１９ｂｐ、より好ましくは少なくとも長さ２０ｂｐ、より好ましくは少なくとも２１ｂｐ、または少なくとも２２ｂｐ、または少なくとも２３ｂｐ、または少なくとも２４ｂｐ、２５ｂｐ、２６ｂｐまたは少なくとも２７ｂｐである。「２本鎖ＲＮＡ断片」または「２本鎖ＲＮＡ領域」との表現は標的遺伝子（の部分）に対応する２本鎖ＲＮＡの小さな実体(small entity)をいう。
一般的には、２本鎖ＲＮＡは約１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ、２０ｂｐ、２１ｂｐ、２２ｂｐ、２３ｂｐ、２４ｂｐ、２５ｂｐ、２７ｂｐ、５０ｂｐ、８０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、または１５００ｂｐの２本鎖ＲＮＡ領域などの好ましくは約１７〜１５００ｂｐ、なおより好ましくは約８０〜１０００ｂｐ、最も好ましくは約１７〜２７ｂｐ、または約８０〜２５０ｂｐである。
２本鎖ＲＮＡの長さの上限は、ｉ）昆虫により摂取されるべきｄｓＲＮＡの必要条件およびｉｉ）ＲＮＡｉを行う断片中への細胞内に加工されるべきｄｓＲＮＡの必要条件に依存する。選択された長さはまた、ＲＮＡの合成法およびＲＮＡの細胞への輸送法によっても影響される。好ましくは、本発明の方法に使用されるべき２本鎖ＲＮＡは長さ１０，０００ｂｐ以下、より好ましくは１０００ｂｐまたはそれ以下、より好ましくは５００ｂｐまたはそれ以下、より好ましくは３００ｂｐまたはそれ以下、より好ましくは１００ｂｐまたはそれ以下であろう。いかなる所与の標的遺伝子および昆虫においても、有効な阻害に最適なｄｓＲＮＡの長さは実験によって決定されるであろう。
２本鎖ＲＮＡは完全にまたは部分的に２本鎖である。ＲＮＡがなおも昆虫によって摂取され、ＲＮＡｉを実行することが可能であるという条件のもとに、部分的に２本鎖であるＲＮＡは２本鎖部分の一方または両末端に短い1本鎖突出部(overhang)を含む。２本鎖ＲＮＡはまた内在的な非相補的領域を含む。
本発明の方法は、多数の標的遺伝子の下方制御または阻害を達成するために、または１つの標的遺伝子の複数の潜在的阻害を達成するために、同じ昆虫に対して２つまたはそれ以上の異なった２本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ構築物の同時または連続的提供を包含する。
他方、多数の標的は多数の標的配列をヒットする１つの２本鎖ＲＮＡの提供によってヒットされ、そして１つの標的は、標的遺伝子に対応する２本鎖ＲＮＡ断片の１つ以上のコピーの存在によってより有効に阻害される。すなわち、本発明の１つの実施態様では２本鎖ＲＮＡ構築物は多数のｄｓＲＮＡ領域を含み、各ｄｓＲＮＡ領域の少なくとも１つの鎖は昆虫標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を含む。本発明によると、ＲＮＡ構築物のｄｓＲＮＡ領域は同じまたは異なった標的遺伝子に相補的であり、および／またはｄｓＲＮＡ領域は同じ昆虫種からの、または異なった昆虫種からの標的に相補的である。
「ヒットする(hit, hits およびhitting)」との用語は、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖が標的遺伝子またはヌクレオチド配列に相補的であり、および結合するようなことを示す代替可能な言葉である。
１つの実施態様では、２本鎖ＲＮＡ領域は標的遺伝子に相補的であるヌクレオチド配列の多数のコピーを含む。他方、ｄｓＲＮＡは同じ標的遺伝子の１つ以上の標的配列をヒットする。すなわち、本発明は昆虫標的のヌクレオチド配列の少なくとも部分に相補的である前記ヌクレオチド配列の少なくとも２つのコピーを含む単離された２本鎖ＲＮＡ構築物を包含する。
本発明の文脈中、「多数」との用語は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６などを意味する。
「さらなる標的遺伝子」または「少なくとも１つの他の標的遺伝子」との表現は、例えば、第２番目、第３番目または第４番目などの標的遺伝子を意味する。
上記標的のうちの１つ以上をヒットするｄｓＲＮＡ、または上記標的の異なったものに対する異なったｄｓＲＮＡの組み合わせが開発され、本発明の方法に使用される。
したがって、本発明は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、または２４８１のいずれかで示されるヌクレオチド配列の少なくとも１つのＲＮＡ均等物の少なくとも２つのコピー、またはその長さが少なくとも１７塩基対、好ましくは長さ少なくとも１８、１９、２０または２１、より好ましくは少なくとも２２、２３または２４塩基対の断片のＲＮＡ均等物の少なくとも２つのコピーを含む単離された２本鎖ＲＮＡ構築物に関する。好ましくは、前記２本鎖ＲＮＡは配列番号１５９または１６０に示されるヌクレオチド配列のＲＮＡ均等物、あるいはその長さが少なくとも１７、好ましくは少なくとも１８、１９、２０または２１、より好ましくは少なくとも２２、２３または２４塩基対の断片を含む。さらなる実施態様では、本発明は配列番号１５９または１６０に示されるヌクレオチド配列のＲＮＡ均等物の少なくとも２つのコピーを含む単離された２本鎖ＲＮＡ構築物に関する。
したがって、本発明はｄｓＲＮＡがアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つが昆虫標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であり、そして互いに独立して選択される少なくとも２つのヌクレオチド配列のＲＮＡ均等物を含むヌクレオチド配列を有する、ここに記載される方法にまで及ぶ。１つの実施態様では、ｄｓＲＮＡは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、または２４８１のいずれかで示される配列から独立して選択される、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、４または５のヌクレオチド配列のＲＮＡ均等物、または長さが少なくとも１７塩基対、好ましくは少なくとも１８、１９、２０または２１、より好ましくは少なくとも２２、２３または２４塩基対のその断片を含む。
少なくとも２つのヌクレオチド配列はここに記載される標的遺伝子から誘導される。１つの好ましい実施態様では、ｄｓＲＮＡは昆虫の生存、成長、発生または再生において必須である少なくとも１つの標的遺伝子をヒットし、そして上記した病原性または感染性に関与する少なくとも１つの遺伝子をヒットする。他方、ｄｓＲＮＡは同じカテゴリーの多数遺伝子をヒットする。例えば、ｄｓＲＮＡは少なくとも２つの必須遺伝子または同じ細胞機能に関与する少なくとも２つの遺伝子をヒットする。さらなる実施態様では、ｄｓＲＮＡは少なくとも２つの標的遺伝子をヒットし、その標的遺伝子は異なった細胞機能に関与する。例えば、ｄｓＲＮＡはタンパク合成（例えば、リボソームサブユニット）、細胞内タンパク輸送、核ｍＲＮＡスプライシングに関与するか、または表１Ａに記載される機能のうちの１つに関与する２つまたはそれ以上の遺伝子をヒットする。
好ましくは、本発明は、前記昆虫標的遺伝子が下記群から選択される配列を含み、
（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、または２４８１のいずれかによって示される配列、またはそれらの相補鎖と少なくとも７５％同一である配列、および
（ｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、または２４８１のいずれか、またはそれらの相補鎖の少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む配列、
または、前記昆虫遺伝子は配列番号４９〜１５８、２７５〜４７２、５３３〜５７５、６２１〜７６７、８１３〜８６２、９０８〜１０４０、１１６１〜１５７１、１７３０〜２０３９、２１２０〜２３３８、２３８４〜２４６０のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子の昆虫オルソログである、ここに記載される方法にまで及ぶ。
２本鎖ＲＮＡのｄｓＲＮＡ領域（または断片）は、以下のように結合される。
ａ）１つの標的遺伝子を標的とする多数のｄｓＲＮＡ領域が結合される場合、それらはＲＮＡ構築物で元来の順（すなわち、その領域が標的遺伝子に現れる順）で結合される。
ｂ）他方、断片の元来の順は無視されて、それらは２本鎖ＲＮＡ構築物中へいかなる順序でもランダムまたは故意にごちゃ混ぜにされ、結合される。
ｃ）他方、１つのシングル断片はｄｓＲＮＡ構築物中で数回、例えば、１〜１０回、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回、繰り返される。または、
ｄ）ｄｓＲＮＡ領域（単一または異なった標的遺伝子を標的とする）はセンスまたはアンチセンス方向に結合される。
さらに、結合されるべき標的遺伝子は、下記遺伝子カテゴリーの１つまたは複数から選択される：
ｅ）上記記載された「必須」遺伝子または「病原性遺伝子」とは、１つまたは複数の標的昆虫において生命維持に必要であり、サイレンスされると、致死的または重大な表現型（例えば、摂食、再生、成長）となる遺伝子を包含する。強力な致死的標的遺伝子の選択は、潜在的ＲＮＡｉ効果となる。本発明のＲＮＡ構築物では、同じまたは異なった（非常に有効な）致死的遺伝子を標的とする多数のｄｓＲＮＡ領域は、昆虫制御のＲＮＡｉ効果の潜在性、効率性および速度をさらに増加するために結合される。
ｆ）「弱い」遺伝子はここに記載される細胞経路の１つで特別に興味ある機能をもつ標的遺伝子を包含する。しかし、独立してサイレンシングされると弱い表現型効果となる。本発明のＲＮＡ構築物では、１つまたは異なった弱い遺伝子を標的とする多数のｄｓＲＮＡ領域はより強いＲＮＡｉ効果を得るために結合される。
ｇ）「昆虫特異的」遺伝子は、生命情報科学の相同性検索、例えば、ＢＬＡＳＴ検索によって決定されるように、非昆虫生物に実質的な相同性ある対応物を有しない遺伝子を包含する。昆虫特異的標的遺伝子の選択は、非標的生物において効果が全くないか、または実質的な（有害）効果を有しない種特異的ＲＮＡｉ効果となる。
ｈ）「保存された遺伝子」は標的生物と非標的生物との間に（アミノ酸レベルで）保存される遺伝子を包含する。非標的種に可能性ある効果を減少させるために、このように有効であるが、保存された遺伝子が分析され、これらの保存された遺伝子の可変領域から得た標的配列は、ＲＮＡ構築物のｄｓＲＮＡ領域によって標的化されるように選択される。ここで、保存とは核酸配列のレベルで利用される。すなわち、このような可変領域は核酸配列のレベルで保存標的遺伝子の最小の保存セクションを包含する。
ｉ）「保存径路」遺伝子は、同じ生物学的径路または細胞過程に関与する遺伝子を包含するか、または特異的および潜在的ＲＮＡｉ効果となる異なった昆虫種において同じ機能性およびより有効な昆虫制御を有する遺伝子を包含する。
ｊ）他方、本発明のＲＮＡ構築物は異なった生物学的径路から得た多数の遺伝子を標的とし、広い細胞性ＲＮＡｉ効果およびより有効な昆虫制御となる。
本発明では、全ての２本鎖ＲＮＡ領域はここに記載される標的遺伝子のすべてのヌクレオチド配列の少なくとも部分または一部分に相補的である少なくとも１つの鎖を含む。しかしながら、２本鎖ＲＮＡ領域の１つがここに記載される標的遺伝子の１つのヌクレオチド配列の一部分に相補的である少なくとも１つの鎖を含むなら、他の２本鎖ＲＮＡ領域は他の昆虫標的遺伝子の一部分に相補的である少なくとも１本の鎖（公知標的遺伝子を含む）を含む。
本発明のなおも他の実施態様では、さらに、少なくとも１つのさらなる配列および所望によりリンカーを含む、ここに記載される単離された２本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ構築物が提供される。１つの実施態様では、さらなる配列は、（ｉ）ｄｓＲＮＡ構築物の大規模生産を促進する配列；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡの安定性を増加または減少させる配列；（ｉｉｉ）タンパクのまたは他の分子の結合が昆虫によるＲＮＡ構築物の摂取を促進することを可能とする配列；（iv）受容体または昆虫の表面上のもしくは細胞質内の分子に結合するアプタマーである配列、または昆虫による摂取、エンドサイトーシスおよび／またはトランスサイトーシスを促進する配列；または（v）ｄｓＲＮＡ領域のプロセッシングを触媒するさらなる配列を含む群から選択される。１つの実施態様では、リンカーは従来の自己切断ＲＮＡ配列、好ましくはｐＨ感受性リンカーまたは疎水性感受性リンカーである。１つの実施態様では、リンカーはイントロンである。
１つの実施態様では、２本鎖ＲＮＡ構築物の多数ｄｓＲＮＡ領域は１つまたはそれ以上のリンカーに接続する。他の実施態様では、リンカーはＲＮＡ構築物のある部位に存在し、ｄｓＲＮＡ領域は他の目的の領域と離れている。ｄｓＲＮＡ構築物における異なったリンカータイプが本発明で提供される。
他の実施態様では、２本鎖ＲＮＡ構築物の多数ｄｓＲＮＡ領域はリンカーなしでも結合される。
本発明の特別な実施態様では、リンカーは害虫生物のより小さなｄｓＲＮＡ領域を連絡切断するために使用される。有利にも、この状況ではリンカー配列は特別な環境下により小さなｄｓＲＮＡ領域への長いｄｓＲＮＡの分割を促進して、これらの環境下に分離したｄｓＲＮＡ領域の放出となり、これらのより小さなｄｓＲＮＡ領域によるより有効な遺伝子サイレンシングにつながる。好適な従来の自己切断リンカーの例としては、高ｐＨ条件で自己切断するＲＮＡ配列である。このようなＲＮＡ配列の好適な例としては、ボーダ(Borda)ら、(Nucleic Acids Res. 2003 May 15;31(10):2595-600)に記載される。この参考資料は本明細書中に参考として導入される。この配列はハンマーヘッド型リボソームＨＨ１６の触媒作用をもつ核部に由来する。
本発明の他の態様では、リンカーはＲＮＡ構築物のある部位に局在し、ｄｓＲＮＡ領域は他のもの、例えば他の目的の配列と分離している。これは好ましくはＲＮＡ構築物にいくつかのさらなる機能を提供する。
本発明の１つの特別な実施態様では、本発明のｄｓＲＮＡ構築物は昆虫によるｄｓＲＮＡの摂取を促進するアプタマーを備えている。アプタマーは昆虫によって摂取される物質に結合するように設計される。このような物質は昆虫または植物起源に由来する。アプタマーの１つの具体的な例としては、膜貫通タンパク、例えば昆虫の膜貫通タンパクに結合するアプタマーである。他方、アプタマーは昆虫によって摂取される（植物）代謝産物または栄養素に結合する。
他方、リンカーはエンドソーム内で自己切断性である。これは、本発明の構築物がエンドサイトーシスまたはトランスサイトーシスを経て昆虫によって摂取される場合、有利であり、したがって、昆虫種のエンドソームにおいて区画化される。エンドソームは低ｐＨ環境を有し、リンカーの切断となる。
疎水条件で自己切断する上記リンカーは、１つの細胞から他の細胞へ細胞壁中の移行を経て移動するために使用される場合、例えば、害虫生物の細胞壁を横断する場合、本発明のｄｓＲＮＡ構築物において特に有用である。
イントロンもまたリンカーとして使用される。ここで使用される「イントロン」とはメッセンジャーＲＮＡの非コードＲＮＡ配列である。本発明の構築物における特別に好適なイントロン配列は、（１）Ｕ−リッチ（３５〜４５％）；（２）塩基対がランダムに選択されるか、または公知イントロン配列に基づく平均長さ１００ｂｐ（約５０〜約５００ｂｐの間を変化する）を有する；（３）−ＡＧ：ＧＴ−または−ＣＧ：ＧＴ−を有する５'末端で始まる、および／または（４）−ＡＧ：ＧＣ−または−ＡＧ：ＡＡ−の３'末端を有する。
約１塩基対から約１０，０００塩基対にわたる非相補的ＲＮＡ配列もまたリンカーとして使用される。
特別な理論またはメカニズムによって拘束されることを望まない場合、長い２本鎖ＲＮＡはその身近な環境から昆虫によって摂取されると考えられる。腸中に摂取され、腸上皮細胞へ移送された２本鎖ＲＮＡは、次いで内因性エンドヌクレアーゼの作用によって、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短い２本鎖ＲＮＡに細胞内で加工される。次いで、得られたｓｉＲＮＡはＲＩＳＣまたはＲＮＡ干渉サイレンシングコンプレックスと称する多成分ＲＮＡａｓｅコンプレックスの生成を経て、ＲＮＡｉを仲介する。
昆虫細胞内で標的遺伝子の下方制御を達成するために、細胞壁の外部へ添加された２本鎖ＲＮＡは、細胞中へ摂取され、次いで、ｓｉＲＮＡに細胞内で加工され得るｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ構築物であり、これは次いでＲＮＡｉを仲介するか、または細胞の外部へ添加されたＲＮＡはそれ自体、細胞中に摂取され得るｓｉＲＮＡであり、それによってＲＮＡｉを実施することができる。
ｓｉＲＮＡは一般的に１９〜２５塩基対、または２０〜２４塩基対の範囲である長さを有する短い２本鎖ＲＮＡである。好ましい実施態様では、下方制御されるべき標的遺伝子に対応して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基対、および特に２１または２２塩基を有するｓｉＲＮＡが使用される。しかしながら、本発明はこのようなｓｉＲＮＡの使用に限定されることを意図していない。
ｓｉＲＮＡは２本鎖部分に隣接して、一方または両方の端に１本鎖の突出部を含む。特に好ましい実施態様では、ｓｉＲＮＡは３'突出ヌクレオチド、好ましくは２つの３'突出チミジン（ｄＴｄＴ）またはウリジン（ＵＵ）を含む。３'ＴＴまたはＵＵ突出部は、もしもｄｓＲＮＡの２本鎖部分に含まれる配列のすぐ上流の標的遺伝子の配列がＡＡであるなら、ｓｉＲＮＡに含まれる。これはｓｉＲＮＡのＴＴまたはＵＵ突出部が標的遺伝子にハイブリダイズすることを可能とする。３'ＴＴまたはＵＵ突出部もまたｓｉＲＮＡの他の末端に含まれるけれども、ｓｉＲＮＡの２本鎖部分に含まれる配列の下流の標的配列がＡＡを有することは必須としない。この文脈では、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラであるｓｉＲＮＡもまた予期される。これらのキメラは、例えば上記のようにＤＮＡ塩基（例えば、ｄＴｄＴ）の３'突出部を有する２本鎖ＲＮＡを含むｓｉＲＮＡを含み、そして１つまたは複数のＲＮＡ塩基またはリボヌクレオチド、または全鎖が全てリボヌクレオチドであるポリヌクレオチドの２本鎖ＲＮＡは、ＤＮＡ塩基またはデオキシヌクレオチドで代替される。
ｄｓＲＮＡは（非共有）塩基対によって互いにアニールされる２本の別個の（センスおよびアンチセンス）ＲＮＡ鎖から形成される。他方、ｄｓＲＮＡは折りたたみ式ステムループまたはヘアピン構造を有し、その際、ｄｓＲＮＡの２本のアニールされた鎖は共有結合される。この実施態様では、ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、部分的に自己相補的である１つのポリヌクレオチド分子の異なった領域から形成される。もしもｄｓＲＮＡがインビボでの発現によって、例えば、以下に説明される宿主細胞または生物中で、またはインビトロ転写によって合成されるべきなら、この構造を有するＲＮＡが便宜的である。２本のＲＮＡ鎖に結合する「ループ」の正確な性質および配列は、ＲＮＡｉを仲介する分子の２本鎖部分の能力を損なうべきでないことを除いて、本発明では一般的には重要でない。ＲＮＡｉで使用する「ヘアピン」または「ステム−ループ」ＲＮＡの態様は、一般的には当業界において公知である（例えば、ＣＳＩＲＯとの名前で、ＷＯ９９／５３０５０参照、その内容は本明細書中に参考として導入される）。本発明の他の実施態様では、ループ構造はリンカー配列および上記の付加的配列を含む。
本発明の他の態様は、ここに記載される昆虫標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列である。このような標的ヌクレオチド配列は本発明のｄｓＲＮＡ構築物を設計するために特に重要である。このような標的ヌクレオチド配列は、長さが好ましくは少なくとも１７、好ましくは少なくとも１８、１９、２０または２１、より好ましくは少なくとも２２、２３または２４ヌクレオチドである。好ましい標的ヌクレオチド配列の非限定例は、実施例で示される。
１つの実施態様では、本発明はここに記載される２本鎖ＲＮＡまたは２本鎖ＲＮＡ構築物をコードする単離されたヌクレオチド配列を提供する。
より具体的な実施態様では、本発明は配列番号４９〜１５８、２７５〜４７２、５３３〜５７５、６２１〜７６７、８１３〜８６２、９０８〜１０４０、１１６１〜１５７１、１７３０〜２０３９、２１２０〜２３３８、２３８４〜２４６０のいずれかに示される配列からなる単離された核酸配列、またはそれらのうち、少なくとも１７、好ましくは少なくとも１８、１９、２０または２１、より好ましくは少なくとも２２、２３または２４ヌクレオチドの断片に関する。
当業者は、これらの標的遺伝子の相同体が見いだされ得ること、およびこれらの相同体は本発明の方法で有用であることを認識するであろう。
タンパク、またはヌクレオチド配列は、もしもそれらが「有意な」レベルの配列類似性またはより好ましくは配列同一性を示すなら、相同であるようである。真に相同である配列は、共通の祖先の遺伝子からの分岐により関連している。配列相同性は２つのタイプ：（ｉ）相同性が異なった種に存在する場合、それらはオルソログとして公知であり、例えば、マウスとヒトのα−グロビン遺伝子はオルソログである。（ｉｉ）パラログは１つの種内で相同である遺伝子であり、例えば、マウスのα−およびβ−グロビン遺伝子はパラログである。
好ましい相同体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１によって示される配列、またはこれらの相補鎖の群から選択される配列と少なくとも約８５％または８７．５％、なおもより好ましくは約９０％、なおもより好ましくは少なくとも約９５％および最も好ましくは少なくとも約９９％同一である配列を含む遺伝子である。配列の同一性を決定する方法は、当業界では日常的であり、Blast ソフトウェアおよびEMBOSSソフトウェア（The European Molecular Biology Open Softwear Suite (2000), Rice, P. Longden I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp267-277）の使用を含む。ここで使用される「同一性(identity)」との用語は、ヌクレオチドレベルでの配列間の関係をいう。「同一性％」との表現は、最適に整列した配列、例えば、２つまたはそれ以上を比較ウインドウの上で比較することによって決定される。その際、比較ウインドウの配列の一部は最適に整列した配列の参照配列と比較される挿入または欠失を含む。参照配列は挿入または欠失を含まない。参照ウインドウは少なくとも１０個の隣接したヌクレオチオドから約５０、約１００または約１５０のヌクレオチド、好ましくは約５０および１５０ヌクレオチドの間から選択される。次いで、「同一性％」がウインドウの配列間で同一であるヌクレオチドの数を測定し、ウインドウのヌクレオチドの数で同一のヌクレオチドの数を割って、１００倍して計算される。
他の相同体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１のいずれかによって示される配列を含む遺伝子のアレル変異体である遺伝子である。さらに好ましい相同体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１のいずれかによって示される配列を含む遺伝子に比べて、少なくとも１つのヌクレオチド多形性（ＳＮＩＰ）を含む遺伝子である。
他の実施態様では、本発明は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の昆虫オルソログである標的遺伝子を包含する。実施例として、オルソログは配列番号４９〜１２３、２７５〜４３４、５３３〜５６２、６２１〜７３８、８１３〜８５２、９０８〜１０１０、１１６１〜１４３７、１７３０〜１９８７、２１２０〜２２９０、および２３８４〜２４３８のいずれかに示されるヌクレオチド配列、または少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７ヌクレオチドのその断片を含む。昆虫または蛛形綱(arachnida)のオルソログ遺伝子または本発明の配列のうちの１つの少なくとも１７ｂｐの断片を含む配列の非限定リストは、表４に示される。
他の実施態様では、本発明は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の線虫オルソログである標的遺伝子を包含する。例として、線虫オルソログは、配列番号１２４〜１３５、４３５〜４４６、５６３〜５６４、７３９〜７５１、８５３、８５４、１０１１〜１０２５、１４３８〜１４７３、１９８８〜２００１、２２９１〜２２９８、２４３９または２４４０のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそのうちの少なくとも１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドの断片を含む。他の態様では、すなわち本発明は生物での線虫の成長を制御するか、または線虫感染に感受性のある生物の線虫横行を阻止するために、ここに記載される方法のいずれも包含する。この方法は線虫細胞を２本鎖ＲＮＡと接触させることを含み、ここで２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つは配列番号１２４〜１３５、４３５〜４４６、５６３〜５６４、７３９〜７５１、８５３、８５４、１０１１〜１０２５、１４３８〜１４７３、１９８８〜２００１、２２９１〜２２９８、２４３９または２４４０に示されるヌクレオチド配列のいずれかの、少なくとも１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドの断片を含む標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する。ここで、２本鎖ＲＮＡは線虫によって摂取され、それによって成長を制御するか、または横行を阻止する。本発明はまた、配列番号１２４〜１３５、４３５〜４４６、５６３〜５６４、７３９〜７５１、８５３、８５４、１０１１〜１０２５、１４３８〜１４７３、１９８８〜２００１、２２９１〜２２９８、２４３９または２４４０に示される配列のいずれかの、少なくとも１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドの断片を含む線虫−抵抗性遺伝子組換え植物に関する。本発明の配列のうちの１つの少なくとも１７ｂｐの断片を含む線虫オルソログ遺伝子または配列の非限定的リストは、表５に示される。
他の実施態様では、本発明は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の真菌オルソログである標的遺伝子を包含する。その例としては、真菌オルソログは配列番号１３６〜１５８、４４７〜４７２、５６５〜５７５、７５２〜７６７、８５５〜８６２、１０２６〜１０４０、１４７５〜１５７１、２００２〜２０３９、２２９９〜２３３８、２４４１〜２４６０のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそのうちの少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７ヌクレオチドの断片を含む。他の態様では、すなわち本発明は細胞または生物上の真菌の成長を制御するか、または真菌感染に感受性を有する細胞または生物の真菌横行を阻止するためのここに記載される方法のいずれも包含する。この方法は真菌細胞を２本鎖ＲＮＡと接触させることを含む。ここで、２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つは配列番号１３６〜１５８、４４７〜４７２、５６５〜５７５、７５２〜７６７、８５５〜８６２、１０２６〜１０４０、１４７５〜１５７１、２００２〜２０３９、２２９９〜２３３８、２４４１〜２４６０で示される配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドの断片を含む標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を有する。ここで、２本鎖ＲＮＡは真菌によって摂取され、それによって成長を制御するか、または横行を阻止する。本発明はまた、配列番号１３６〜１５８、４４７〜４７２、５６５〜５７５、７５２〜７６７、８５５〜８６２、１０２６〜１０４０、１４７５〜１５７１、２００２〜２０３９、２２９９〜２３３８、２４４１〜２４６０で示される配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、２０または２１の断片を含む真菌−抵抗性遺伝子組換え植物に関する。真菌オルソログ遺伝子または本発明の配列のうちの１つの少なくとも１７ｂｐの断片を含む配列の非限定的リストは、表６に示される。
本発明の１つの好ましい実施態様では、ｄｓＲＮＡは宿主細胞または宿主生物によって（例えば、転写されて）発現され、宿主細胞または生物は昆虫に感受性を有するか、または昆虫による横行に脆弱である生物である。この実施態様では、昆虫の１つまたは複数の標的遺伝子のＲＮＡｉ−仲介遺伝子サイレンシングは、宿主生物での、または宿主生物上での昆虫の成長を制御するか、および／または宿主生物の昆虫横行を阻止または減少させるメカニズムとして使用される。すなわち、宿主生物の細胞内での２本鎖ＲＮＡの発現は、特定の昆虫に対して、またはある昆虫の綱に対して抵抗性を付与する。ｄｓＲＮＡが1つ以上の昆虫標的遺伝子をヒットする場合、宿主生物の細胞内の２本鎖ＲＮＡの発現は１つ以上の昆虫または１つ以上の昆虫の綱に対して抵抗性を付与する。
好ましい実施態様では、宿主生物は植物であり、昆虫は植物病原性昆虫である。この実施態様では、昆虫は植物表現性昆虫に感染された、あるいはこの昆虫の横行を受けやすい植物または植物細胞中で２本鎖ＲＮＡを発現して、２本鎖ＲＮＡに接触する。
この文脈では、「植物」との用語は、昆虫の成長および／または昆虫横行を阻止または減少させるために処理することが望まれるいかなる植物材料をも包含する。これは、とりわけ、植物全体、種子などの播種、増殖または再生材料、切断片、移植片、外植体など、および植物細胞および組織培養物を含む。植物材料は昆虫の１つまたは複数の標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡを発現すべきであるか、または発現する能力を有するべきである。
したがって、さらなる態様では、本発明は植物、好ましくは遺伝子組換え植物または（遺伝子組換え）植物のための増殖もしくは再生材料、または少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡを発現するか、または発現する能力を有する植物細胞培養物を提供する。この際、２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つは昆虫の標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有し、その結果、２本鎖ＲＮＡは植物−昆虫の相互作用時に昆虫に摂取される。この２本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉による標的遺伝子を阻害するか、または下方制御する能力を有する。標的遺伝子はここに記載されるいかなる標的遺伝子、例えば、昆虫の生存、成長、発生または再生において必須である標的遺伝子でもある。
この実施態様では、昆虫はいかなる昆虫でもあるが、好ましくは植物病原性昆虫である。好ましい病原性昆虫としては上記のものが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の方法に使用される植物、または本発明の遺伝子組換え植物はいかなる植物も包含するが、好ましくは、植物病原性昆虫による横行に感受性を有する植物である。
したがって、本発明は、植物が、下記植物（または穀物）：アルファルファ(alfalfa)、リンゴ(apple)、アプリコット(apricot)、朝鮮アザミ(artichoke)、アスパラガス(asparagus)、アボガド(avocado)、バナナ(banana)、オオムギ(barley)、マメ(beans)、ビート(beet)、ブラックベリー(blackberry)、ブルーベリー(blueberry)、ブロッコリ(broccoli)、芽キャベツ(brussel sprouts)、キャベツ(cabbage)、アブラナ(canola)、ニンジン(carrot)、キャッサバ(cassava)、カリフラワー(cauliflower)、穀物(a cereal)、セロリ(celery)、桜(cherry)、柑橘類(citrus)、クレメンタイン(clemintine)、コーヒー(coffee)、コーン(corn)、ワタ(cotton)、キュウリ(cucumber)、ナス(eggplant)、チコリ(endive)、ユーカリ(eucalyptus)、イチジク(figes)、ブドウ(grape)、グレープフルーツ(grapefruit)、落花生(groundnuts)、センナリホウズキ(ground cherry)、キウイフルーツ(kiwifruit)、レタス(lettuce)、ニラ(leek)、レモン(lemon)、ライム(lime)、パイン(pine)、トウモロコシ(maize)、マンゴー(mango)、メロン(melon)、キビ(millet)、マッシュルーム(mushroom)、ナット・オート(nut aot)、オクラ(okra)、タマネギ(onion)、オレンジ(orange)、観賞用植物または花または樹木(an ornamental plant or flower or tree)、パパイア(papaya)、パセリ(parsley)、エンドウマメ(pea)、モモ(peach)、ピーナッツ(peanut)、ピート(peat)、コショウ(pepper)、カキ(persimmon)、パイナップル(pineapple)、オオバコ(plantain)、プラム(plum)、ザクロ(pomegranate)、ジャガイモ(potato)、カボチャ(pumpkin)、ラディッキオ(radicchio)、ダイコン(radish)、ナタネ(rapeseed)、ラズベリー(raspberry)、コメ(rice)、ライ麦(rye)、サトウモロコシ(sorghum)、ダイズ(soy)、ダイズ(soy beans)、ホウレンソウ(spinach)、イチゴ(strawberry)、テンサイ(sugarbeet)、サトウキビ(sugargcane)、ヒマワリ(sunflower)、サツマイモ(sweet poatao)、タンジェリン(tangerine)、茶(tea)、タバコ(tobacco)、トマト(tomato)、ツルクサ(a vine)、スイカ(waetermelon)、コムギ(wheat)、トロロイモ(yams)およびズッキーニ(zucchini)の群から選択される、ここに記載される方法にまで及ぶ。
１つの実施態様では、本発明は、植物がジャガイモであり、標的遺伝子がレプチノタルサ属(Leptinotarsa spp.)（例えば、Ｌ．デセムリネアータ(L. decemlineata)(コロラドハムシ,Colorado potato beetle)、Ｌ．ジュンクタ(L. juncta)（フォールス・ポテト・ビートルfalse potato beetle)、またはＬ．テクサーナ(T. texana)(テクサン・フォールス・ポテト・ビートル,Texan false potato beetle)）;レマ属(Lema spp.)（例えば、Ｌ．トリリネアータ(L. trilineata)(スリーラインド・ポテト・ビートル,three-lined potato beetle)）; エピトリックス属(Epitrix spp.)(例えば、Ｅ．ヴィッタータ(E. vittata)(ストリップド・ブリスター・ビートル, striped blister beetle)）;ファエドン属(Phaedon spp.)（例えば、Ｐ．コクレアリアエ(P. cochleariae)(マスタード・リーフ・ビートル, mustard leaf beetle)）; エムポアスカ属(Empoasca spp.)(例えば、Ｅ．ファバエ(E. fabae)(ジャガイモヒメヨコバイ, potato leafhopper));ミズス属(Myzus spp.)（例えば、Ｍ．ペルシカエ(M. persicae)(モモアカアブラムシgreen peach aphid)）; パラトリオザ属(Paratrioza spp.)（例えば、Ｐ．コケレリ(P. cockerelli)(キジラミpsyllid)）; オストリニア属(Ostrinia spp.)（例えば、Ｏ．ヌビラリス(O. nubilalis)(アワノメイガEuropean corn borer)）; コノデルス属(Conoderus spp.)（例えば、Ｃ．フォーリ(C. falli)(サザン・ポテト・ワイアウォームsouthern potato wireworm)、またはＣ．ヴェスペルチヌス(C. vespertinus)(タバコ・ワイアウォームtobacco wireworm)）;およびフソロマエア属(Phthorimaea spp.)(例えば、Ｐ．オ ペルクレッラ(P. operculella)(ジャガイモガpotato tuberworm))からなる群から選択された昆虫由来の遺伝子である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
他の実施態様では、本発明は植物がトマトであり、標的遺伝子がマクロシフム属(Macrosiphum spp.)(例えば、Ｍ．ユーフォルビアエ(M. euphorbiae)(チューリップヒゲナガアブラムシ,potato aphid)); ミズス属(Myzus spp.)（例えば、Ｍ．ペルシカエ(M. persicae)(モモアカアブラムシ, green peach aphid)）; トリアリューロデス属(Trialeurodes spp.)（例えば、Ｔ．ヴァポラリオルム(T.vaporariorum)(グリーンハウス・ホワイトフライ, greenhouse whitefly)、またはＴ．アブチロニア(T. abutilonia)(バンデド−ウイングド・ホワイトフライ, banded-winged whitefly); ベミシア属(Bemisia spp.)（例えば、Ｂ．アルジェンチフォリ(B. argentifoli)(シルバーリーフコナジラミ, silverleaf whitefly)）; フランクリニエラ属(Frankliniella spp.)（例えば、Ｆ．オッキデンタリス(F. occidentalis)(ミカンキイロアザミウマ, western flower thrips)）; レプチノタルサ属(Leptinotarsa spp.)（例えば、Ｌ．デセムリネアータ(L. decemlineata)(コロラドハムシ, Colorado potato beetle)、Ｌ．ジュンクタ(L. juncta)（フォールス・ポテト・ビートル, false potato beetle)、またはＬ．テクサーナ(T. texana)(テクサン・フォールス・ポテト・ビートル, Texan false potato beetle)）; エピトリックス属(Epitrix spp.)（例えば、Ｅ．ヒルチペニス(E. hirtipennis)(トビハムシ, flea beetle)）; リガス属(Lygus spp.)（例えば、Ｌ．リネオラリス(L. lineoraris)(サビイロカスミカメtarnished plant bug)またはＬ．ヘスペルス(L. Hesperus)(ウエスターン・ターニシュド・プラントバッグ, western tarnished plant bug)）；ユーシスツス属(Euschistus spp.)（例えば、Ｅ．コンスパーサス(E. consepersus)(コンスパース・スティンク・バッグconsperse stink bug)）; ネザラ属(Nezara spp.)（例えば、Ｎ．ヴィリデュラ(N. viridula)(ミナミアオカメムシ, southern green stinkbug)）; チアンタ属(Thyanta spp.)（例えば、Ｔ．パリドヴィレンス(T. pallidovirens)(レッドショルダード・スティンクバッグ, redshouldered stinkbug)）;フソリマエア属(Phthorimaea spp.)（例えば、Ｐ．オペルクレッラ(P. operculella)(ジャガイモガ, potato tuberworm)）; ヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)（例えば、Ｈ．ゼア(H. zea)(オオタバコガ, tomato fruitwaorm）; ケイフェリア属(Keiferia spp.)（例えば、Ｋ．リコペリシセラ(K. lycopersicella)(トマト・ピンウォーム, tomato pinworm)）; スポドプテラ属(Spodoptera spp.)(例えば、Ｓ．エクシグア(S. exigua)(シロイチモジヨトウ, beet armyworm)、またはＳ．プラエフィカ(S. praefica)(ウエスタン・イエローストライプド・アーミーウォーム, western yellowstripped armyworm));リモニウム属(Limonium spp.)（線虫, wireworm); アグロティス属(Agrotis spp.)（例えば、Ａ．イプシロン(A. ipsilon)(タマナヤガ, black cutworm)）; マンデュカ属(Manduca spp.)（例えば、Ｍ．セクタ(M. sexta)(タバコ・ホーンウォーム, tobacco hornworm)、またはＭ．クウィンクウェマクラタ(M. quinquemaculata)(トマト・ホーンウォーム, tomato hornworm)）; リリオマイザ属(Liriomyza spp.)（例えば、Ｌ．サチヴァエ(L. stivae)、Ｌ．トリフォリ(L. trifolli)またはＬ．ウィドブレンシス(L. huidobrensis)(ハモグリバエ, leafminer)）;およびパラトリオザ属(Paratrioza spp.)（例えば、Ｐ．コケレリ(P. cockerelli)(トマト・キジラミ, tomato psyllid)）からなる群から選択された昆虫由来の遺伝子である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
他の実施態様では、本発明は植物がコーンであり、標的遺伝子がディアブロチカ属(Diabrotica spp.)（例えば、Ｄ．ヴィルジフェラ・ヴィルジフェラ(D. virgifera virgifera)(ウエスターン・コーン・ルートウォーム, western corn rootworm)、Ｄ．バルバリ(D. barberi)(ノザン・コーン・ルートウォーム, northern corn rootworm)、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ホワルディ(D. undecimpunctata howardi)(サザン・コーン・ルートウォームsouthern corn rootworm)、Ｄ．ヴィルジフェラ・ゼアエ(D. virgifera zeae)(メキシカン・コーン・ルートウォーム, Mexican corn rootworm)；Ｄ．バルテアタ(D. balteata)(バンデド・キューカムバー・ビートル, banded cucumber beetle)）；オストリニア属(Ostrinia spp.)（例えば、Ｏ．ヌビラリス(O. nubilalis)(アワノメイガ, European corn borer)）; アグロティス属(Agrotis spp.)（例えば、Ａ．イプシロン(A. ipsilon)(タマナヤガblack cutworm)）; ヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)（例えば、Ｈ．ゼア(H. zea)(オオタバコガ, corn earworm)）; スポドプテラ属(Spodoptera spp.)(例えば、Ｓ．フルジペルダ(S. frugiperda)(ヨトウガの一種, fall armyworm)); ディアトラエア属(Diatraea spp.)（例えばＤ．グランディオセッラ(D. grandiosella)(南西部アワノメイガ, southwestern corn borer) またはＤ．サッカラリス(D. saccharalis)(サトウキビ穴あけ虫, sugarcane borer)）; エラスモパルプス属(Elasmopalpus spp.)（例えば、Ｅ．リグノセラス(E. lignosellus)(モロコシマダラメイガ, lesser cornstalk borer)）; メラノタス属(Melanotus spp.)(ハリガネムシ, wireworms); シクロセファーラ属(Cyclocephala spp.)（例えば、Ｃ．ボレアリス(C. borealis)(ノザン・マスクド・チェーファー, northern masked chafer)）; シクロセファーラ属(Cyclocephala spp.)（例えば、Ｃ．イムマキュラータ(C. immaculate)(サザン・マスクド・チェーファー, southern masked chafer)）; ポピリア属(Popillia spp.)（例えば、Ｐ．ジャポニカ(P. japonica)(マメコガネ, Japanese beetle)）；チェトクネマ属(Chaetocnema spp.)（例えば、Ｃ．プリカリア(C. pulicaria)(トウモロコシトビハムシ, corn flea beetle)）；スフェノフォラス属(Sphenophorus spp.)（例えば、Ｓ．マイディス(S. maidis)(メイズ・ビルバグ, maize billbug)）；ローパロシフム属(Rhopalosiphum spp.)（例えば、Ｒ．マイディス(R. maidis)(トウモロコシアブラムシ, corn leaf aphid)）; アニュラフィス属(Anuraphis spp.)（例えば、Ａ．マイディラディシス(A. maidiradicis)(コーン・ルート・アフィド, corn root aphid)）；ブリッサス属(Blissus spp.)(例えば、Ｂ．ロイコプテラス・ロイコプテルス(B.leucopterus leucopterus)（ナガカメムシ, chinch bug）)；メラノプラス属(Melanoplus spp.)（例えば、Ｍ．フェムルブルム(M. femurrubrum)(レッドレッグド・グラスホッパー, redlegged grasshopper)、Ｍ．サングイニペス(M. sanguinipes)(ミグラトリー・グラスホッパー, migratory grasshopper)）；ハイレミア属(Hylemya spp.)（例えば、Ｈ．プラツーラ(H. platura)(タネバエ, seedcorn maggot)）; アグロマイザ属(Agromyza spp.)（例えば、Ａ．パルヴィコミス(A. parvicomis)(コーンブロットハモグリバエ, corn blot leafminer)）; アナホスリップス属(Anaphothrips spp.)（例えば、Ａ．オブスクルルス(A. obscrurus)(グラス・スリップス, grass thrips)）; ソレノプシシ属(Solenopsis spp.)（例えば、Ｓ．ミレスタ(S. milesta)(シーフ・アントthief ant)）;およびテラニチュス属(Tetranychus spp.)(例えば、Ｔ．ウルチカエ(T. urticae)(ナミハダニ, twospotted spider mite))からなる群から選択された昆虫由来の遺伝子である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
他の実施態様では、本発明は植物がワタであり、標的遺伝子がヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)（例えば、Ｈ．ゼア(H. zea)(オオタバコガcotton bollworm)）; ペクチノフォラ属(Pectinophora spp.)（例えば、Ｐ．ゴッシピエラ(P. gossypiella)(ワタギバガpink bollworm)）; ヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)（例えば、Ｈ．アーミジェラ(H. armigera)(アメリカン・ボウルウォームAmerican bollworm)）; イーリアス属(Earias spp.)(例えば、Ｅ．ビッテラ(E. vittella)(スポッテド・ボウルウォームspotted bollworm)); ヘリオディス属(Heliothis spp.)（例えば、Ｈ．ヴィレセンス（H. virescens）(タバコガtobacco budworm)）; スポドプテラ属(Spodoptera spp.)(例えば、Ｓ．エクシグア(S. exigua)(シロイチモジヨトウ beet armyworm)); アントノムス属(Anthonomus spp.)（例えば、Ａ．グランディス(A. grandis)(ワタミハナゾウムシboll weevil)）; シューダトモスケリス属(Pseudatomoscelis spp.)（例えば、Ｐ．セリアツス(P. seriatus)(コットン・フリーホッパーcotton fleahopper)）; トリアリューロデス属(Trialeurodes spp.)（例えば、Ｔ．アブチロネウス(T. abutiloneus)(バンデド−ウイングド・ホワイトフライbanded-winged whitefly)、Ｔ．ヴァポラリオラム(T. vaporariorum)(オンシツコナジラミgreenhouse whitefly)）; ベミシア属(Bemisia spp.)（例えば、Ｂ．アルジェンチフォリ(B. argentifoli)(シルバーリーフコナジラミsilverleaf whitefly)）;アフィス属(Aphis spp.)（例えば、Ａ．ゴッシッピー(A. gossypii)(ワタアブラムシcotton aphid)）; リガス属(Lygus spp.)（例えば、Ｌ．リネオラリス(L. lineoraris)(サビイロカスミカメtarnished plant bug)またはＬ．ヘスペルス(L. Hesperus)(ウエスターン・ターニシュド・プラントバッグwestern tarnished plant bug)）；ユーシスツス属(Euschistus spp.)（例えば、Ｅ．コンスパーサス(E. consepersus)(コンスパース・スティンク・バッグconsperse stink bug)）; クロロクロア属(Chlorochroa spp.)（例えば、Ｃ．サイ(C. sayi)(サイ・スティンクバッグSay stinkbug)）; ネザラ属(Nezara spp.)（例えば、Ｎ．ヴィリデュラ(N. viridula)(ミナミアオカメムシsouthern green stinkbug)）;スリップス属(Thrips spp.)（例えば、Ｔ．タバチ(T. tabaci)(ネギアザミウマonion thrips)）; フランクリニエラ属(Frankliniella spp.)（例えば、Ｆ．フスカ(F. fusca)(タバコアザミウマtobacco thrips)、またはＦ．オッキデンタリス(F. occidentalis)(ミカンキイロアザミウマwestern flower thrips)）; メラノプラス属(Melanoplus spp.)（例えば、Ｍ．フェムルブルム(M. femurrubrum)(レッドレッグド・グラスホッパーredlegged grasshopper)、またはＭ．ディッファレンチアティス(M. differentiates)(ディファレンシャル・グラスホッパーdifferential grasshopper)）；およびテラニチュス属(Tetranychus spp.)(例えば、Ｔ．シンアバリナス(T. cinnabarinus)(ニセナミハダニcarmine spider mite)またはＴ．ウルチカエ(T. urticae)(ナミハダニtwospotted spider mite))からなる群から選択された昆虫由来の遺伝子である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
他の実施態様では、本発明は、植物がコメであり、標的遺伝子がニラパルヴァータ属（Nilaparvata spp.）（例えば、Ｎ．ルーゲンス(N.lugens)(トビイロウンカ, brown planthopper)); ラオデルファックス属(Laodelphax spp.)（例えば、Ｌ．ストリアテラス(L. striatellus)（ヒメトビウンカ,small brown plnathopper））；ネフォテティックス属(Nephotettix spp.)（例えば、Ｎ．ヴィレセンス(N. virescens)またはＮ．チンクチセプス(N. cincticeps)（ツマグロヨコバイ, green leafhopper）、またはＮ．ニグロプクタス(N. nigropictus)( クロスジツマグロヨコバイ, rice leafhopper)）；ソガテッラ属(Sogatella spp.)（例えば、Ｓ．フルシフェラ(furcifera)（セジロウンカ, white-backed planthopper））；ブリッサス属(Blissus spp.)(例えば、Ｂ．ロイコプテラス・ロイコプテルス(B.leucopterus leucopterus)（ナガカメムシ, chinch bug)）；スコチノフォラ属(Scotinophora spp.)（例えば、Ｓ．ヴェルミデュレイテ(S. vermidulate)（クロカメムシ, rice balckbug））；アクロステマム属(Acrostemum spp.)（例えば、Ａ．ヒラーレ(A. hilare)(アオカメムシ, green stink bug)）; パルナラ属(Parnara spp.)(例えば、Ｐ．グッタータ(P. guttata)(イチモンジセセリ, rice skipper)); キロ属(Chilo spp.)(例えば、Ｃ．サプレッサリス(C. suppressalis)(ニカメイチュウrice striped stem borer)、Ｃ．オーリチリウス(C. auricilius)（縁が金色の茎食い虫gold-fringed stem borer）、またはＣ．ポリクリサス(C. polychrysus)( 頭部が暗色の茎食い虫dark-head stem borer)); キロトラエア属(Chilotraea spp.)（例えば、Ｃ．ポリクリサ(C. polychrysa)(コメ茎穴あけ虫rice stalk borer)）；セサミア属(Sesamia spp.)(例えば、Ｓ．インフェレンス(S. inferens)(イネヨトウpink rice borer)); トリポリザ属(Tryporyza spp.)(例えば、Ｔ．インノタータ(T. innotata)(シロメイチュウwhite rice borer)、トリポリザ属(Tryporyza spp.)(例えば、Ｔ．インセルツーラス(T. incertulas)(キイロメイチュウyellow rice borer))；クナファロクロシス属(Cnaphalocrosis spp.)（例えば、Ｃ．メディナリス(C. medinalis)(コブノメイガrice leafroller)）; アグロマイザ属(Agromyza spp.)（例えば、Ａ．オリゼー(A. oryzae)(ハモグリバエleafminer)）; ディアトラエア属(Diatraea spp.)（例えば、Ｄ．サッカラリス(D. saccharalis)(サトウキビ穴あけ虫sugarcane borer)）; ナルナガ属(Narnaga spp.)（例えば、Ｎ．エアネセンス(N. aenescens)(フタオビコヤガgreen rice caterpillar)）; ザントデス属(Xanthodes spp.)（例えば、Ｘ．トランスベルサ(X. transversa)(イモムシgreen caterpillar)）；スポドプテラ属(Spodoptera spp.)(例えば、Ｓ．フルジペルダ(S. frugiperda)(ヨトウガの一種fall armyworm)); ミシムナ属(Mythimna spp.)(例えば、ミシムナ(Mythimna)(シュードダレチア(Pseudaletia)セパラーテ(separate)(アワヨトウarmyworm)); ヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)（例えば、Ｈ．ゼア(H. zea)(オオタバコガcorn earworm)）; コラスピス属(Colaspis spp.)(例えば、Ｃ．ブルンネア(C. brunnea)(グレープ・コラスピスgrape colaspis)）；リソルホプトラス属(Lissorhoptrus spp.)(例えば、Ｌ．オリゾフィラス(L. orysophilus)(イネミズゾウムシrice water weevil)); エチノクネムス属(Echinocnemus spp.)（例えば、Ｅ．スクワモス(E. squamos)(イネゾウムシrice plant weevil); ディクロディスパ属(Diclodispa spp.)（例えば、Ｄ．アルミジェラ(D. armigera)(ライスヒスパrice hispa)）；オーレマ属(Oulema spp.)（例えば、Ｏ．オリゼー(O. oryzae)(イネドロオイムシleaf beetle)）; シトフィラス属(Sitophilus spp.)(例えば、Ｓ．オリゼー(S. oryzae)(ココクゾウムシrice weevil)); パチディプロシス属(Pachydiplosis spp.)(例えば、Ｐ．オリゼー(P. oryzae)(イネノシントメタマバエrice gall midge)); ヒドレリア属(Hydrellia spp.)(例えば、Ｈ．グリセオラ(H. griseola)(イネミギワバエsmall rice leafminer))；クロロプス属(Chlorops spp.)（例えば、Ｃ．オリゼー(C. oryzae)(カラバエstem maggot)）；およびヒドレリア属(Hydrellia spp.)(例えば、Ｈ．ササキ(H. sasakii)( イネカラバエrice stem maggot))からなる群から選択された昆虫由来の遺伝子である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明の遺伝子組換え植物は具体的に上記したそれぞれの昆虫種に抵抗性を有する具体的に上記した全ての植物にまで及ぶ。好ましい遺伝子組換え植物（または遺伝子組換え植物のための再生もしくは増殖材料、または培養された遺伝子組換え植物細胞）は、植物（または遺伝子組換え植物のための再生もしくは増殖材料、または培養された遺伝子組換え植物細胞）であり、前記植物は、
（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１のいずれかによって示される配列、またはこれらの相補鎖と少なくとも７５％同一である配列；および
（ｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む配列、
からなる群から選択される核酸配列を含むか、
または前記核酸は配列番号４９〜１５８、２７５〜４７２、５３３〜５７５、６２１〜７６７、８１３〜８６２、９０８〜１０４０、１１６１〜１５７１、１７３０〜２０３９、２１２０〜２３３８、２３８４〜２４６０のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子の昆虫オルソログである。
本発明はまた、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、２４８１、または２４８６のいずれか、またはその相補鎖に示されるヌクレオチド配列の少なくとも１つ、または少なくとも１７、好ましくは少なくとも１８、１９、２０または２１、より好ましくは少なくとも２２、２３または２４ヌクレオチドを含むそれらの断片を含む、本発明のヌクレオチドの少なくとも１つを発現するか、または発現する能力を有する植物（または遺伝子組換え植物のための再生もしくは増殖材料、または培養された遺伝子組換え植物細胞）を包含する。
植物は１つまたは複数の細胞、細胞タイプまたは組織で２本鎖ＲＮＡを積極的に発現（転写）する形態で提供される。他方、植物は「発現可能であり」、所望のｄｓＲＮＡをコードする導入遺伝子で形質転換されるが、導入遺伝子は植物が供給される（および形態）では、植物中で活性でないことを意味する。
したがって、他の実施態様では、組換えＤＮＡ構築物は、少なくとも１つの制御配列に操作可能に結合された本発明のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ構築物をコードするヌクレオチド配列を含んで提供される。好ましくは、制御配列は以下に説明される構成プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含む群から選択される。
標的遺伝子はここに記載されるいかなる標的遺伝子でもある。好ましくは、制御要素は植物細胞中で活性である制御要素である。さらに好ましくは、制御要素は植物由来である。「制御配列」との用語は、広い範囲で使用され、操作可能に結合される配列の発現を行うことができる制御核酸をいう。
核酸の発現を活性化するか、または増強するプロモーターおよび核酸または合成融合分子またはそれらの誘導体も前記用語で包含され、いわゆるアクチベーターまたはエンハンサーである。ここに使用される「操作可能に結合される」との用語は、プロモーター配列と目的の遺伝子の間の機能的結合を呼び、プロモーター配列は目的の遺伝子の転写を開始することができる。
一例として、２本鎖ＲＮＡをコードする導入遺伝子ヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターの誘導因子の添加によって、または特定の成長もしくは発生の段階が達したときに、ｄｓＲＮＡの転写を可能とする誘導性または成長もしくは発生の段階特異的プロモーターの制御下に配置され得る。
他方、２本鎖ＲＮＡをコードする導入遺伝子は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、２本鎖ＣＡＭＶ３５Ｓプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、ルビスコプロモーター、ＧＯＳ２プロモーター、ゴマノハグサ(Figwort)モザイクウイルス（ＦＭＶ）３４Ｓプロモーター、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーター(Verdauger B. ら、Plant Mol Biol. 1998 37(6):1055-67)を含む群から選択されるいずれかのようなものなど、強い構成プロモーターの制御下に配置される。
他方、２本鎖ＲＮＡをコードする導入遺伝子は、ＰｓＭＴＡクラス3キチナーゼをコードする遺伝子の根特異的プロモーター、ｃａｂ１およびｃａｂ２のプロモーターなどの光合成組織特異的プロモーター、ｒｂｃＳ、ｇａｐＡ、ｇａｐＢおよびＳＴ−ＬＳ１タンパク、ＪＡＳプロモーター、カルコンシンセターゼプロモーターおよびイチゴ由来のＲＪ３９のプロモーターを含む群から選択されるいずれかのようなものなど、組織特異的プロモーターの制御下に配置される。
他の実施態様では、２本鎖ＲＮＡをコードする導入遺伝子は、例えば、ジャガイモプロティナーゼ阻害剤II（ＰｉｎｔII）プロモーター(Duan Xら、Nat. Biotechnol. 1996. 14(4):49408))；または創傷誘導プロモーター、例えばジャスモン酸およびエチレン誘導プロモーター、ＰＤＦ１．２プロモーター(Manners JMら、Plant Mol. Biol. 1998, 38(6): 1071-80) ；または防御関連プロモーター、例えば、サリチル酸誘導プロモーターおよび植物病原性関連タンパク（ＰＲタンパク）プロモーター（ＰＲ１プロモーター（Cornelissen BJら、Nucleic Acids Res. 1987, 15(17): 6799-811）；ＣＯＭＴプロモーター (Toquin Vら、Plant Mol. Biol. 2003, 52(3): 495-509) の、昆虫誘導プロモーターの制御下に配置される。
さらに、昆虫に対する遺伝子組換え植物の抵抗性を発生する本発明の方法を使用する場合、組織特異的プロモーターの制御下に本発明の２本鎖ＲＮＡをコードする核酸を配置することが有利であろう。植物細胞から害虫へのｄｓＲＮＡの移送を改善するためには、植物は好ましくは植物害虫によって、まず接近するか、あるいは損傷する植物部分でｄｓＲＮＡを発現できる。植物病原性昆虫の場合、ｄｓＲＮＡを発現する好ましい組織は、葉、茎、根および種子である。したがって、本発明の方法では植物組織優先プロモーターとしては、葉特異的プロモーター、茎特異的プロモーター、師部特異的プロモーター、木部特異的プロモーター、根特異的プロモーター、または種子特異的プロモーター（蔗糖輸送体遺伝子ＡｔＳＵＣプロモーター(Baud Sら、Plant J. 2005, 43(6): 824-36)、コムギ高分子量グルテン遺伝子プロモーター(Robert LSら、Plant Cell, 1989, 1(6): 569-78)）などが使用される。根特異的プロモーターの好適な例としては、ＰｓＭＴＡ(Fordam-Skelton, A.P.ら、1997, Plant Molecular Biology 34: 659-668)、およびクラス3キチナーゼプロモーターがある。葉および茎特異的または光活性化される光合成組織特異的プロモーターとしては、砂糖ダイコン由来の２種のクロロフィル結合タンパク（ｃａｂ１およびｃａｂ２）(Stahl D.J.ら、2004 BMC Biotechnology, 2004, 4:31)、ｒｂｃＳ(Nomua M.ら、2000 Plant Mol. Biol. 44: 99-106)がコードするリブロース−二リン酸エステルカルボキシラーゼ(Rubisco)、クロロプラストグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼのＡ(gapA)およびＢ(gapB)サブユニット(Conley T.R.ら、1994 Mol. Cell Biol. 19: 2525-33；Kwon H. Bら、1994 Plant Physiol. 105: 357-67)、葉および茎特異的（ＳＴ−ＬＳ１）タンパクをコードするソラナム・ツベロスム(Solanum tuberosum)遺伝子のプロモーター(Zaidi M.A.ら、2005 Transgenic Res. 14: 289-98)、ＪＡＳプロモーターなどの茎制御−防衛誘導遺伝子(米国特許公開公報20050034192/US-A1)がある。花特異的プロモーターの例としては、例えばカルコン合成酵素プロモーター(Faktor O.ら、1996 Plant Mol. Biol. 32: 849)があり、果実特異的プロモーターとしては、例えばイチゴ由来のＲＪ３９がある（ＷＯ９８３１８１２）。
本発明のなおも他の実施態様では、ｄｓＲＮＡの発現に有用である他のプロモーターとしては、ＲＮＡＰｏｌ1、ＲＮＡＰｏｌ2、ＲＮＡＰｏｌ3、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼからのプロモーターを含み、および使用されるが、これらに限定されない。これらのプロモーターは通常、ｄｓＲＮＡのインビトロ生産に使用され、ｄｓＲＮＡは次いで抗殺虫剤、例えば抗殺虫性液体、スプレーまたは粉末に含まれる。
したがって、本発明はまた本発明の２本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ構築物のいずれかを生成する方法を包含する。この方法は、ｄｓＲＮＡまたはＲＮＡ構築物を生産するための前記核酸または組換えＤＮＡ構築物の転写を可能とする条件下で、
ａ．本発明の単離された核酸または組換えＤＮＡ構築物を無細胞成分に接触させ、また
ｂ．本発明の単離された核酸または組換えＤＮＡ構築物を細胞中に導入（例えば、形質転換、形質移入または注入により）する工程を含む。
所望により、１つまたは複数の転写終結配列はまた本発明の組換え構築物中に導入される。「転写終結配列」との用語は転写単位の末端での制御配列を包含し、３'プロセッシングおよび一次転写物のポリ−アデニル化および転写の終結にシグナルを送る。転写または翻訳エンハンサーなどのさらなる制御要素は発現構築物中に導入される。
本発明の組換え構築物はさらに、特定細胞タイプでの維持および／または複製において必要である複製オリジンを含む。１つの例としては、発現構築物が細胞中のエピソーム遺伝子要素（例えば、プラスミドまたはコスミド分子）として細菌細胞中に維持されることが必要である場合がある。好ましい複製オリジンはｆ１−ｏｒｉおよびｃｏｌＥ１ ｏｒｉが含まれるが、これらに限定されない。
組換え構築物は所望により選択マーカー遺伝子を含む。ここに使用される「選択マーカー遺伝子」との用語は、細胞の同定および／または選択を容易にするために発現される細胞上の表現型を付与するすべての遺伝子を含み、これは本発明の発現構築物に形質移入されるか、または形質転換される。好適な選択マーカーとしては、アンピシリン（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン（Ｔｃｒ）、カナマイシン（Ｋａｎｒ）、ホスフィノスリシン、およびクロラムフェニコール（ＣＡＴ）遺伝子に対する抵抗性遺伝子を含む。他の好適なマーカー遺伝子は代謝性特色、例えばｍａｎＡを提供する。可視的マーカー遺伝子もまた使用され、例えばβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼおよびグリーン・フルオレセント・プロテイン（ＧＦＰ）を含む。
ｄｓＲＮＡをコードする導入遺伝子で安定に形質転換された植物は、ｄｓＲＮＡを積極的には発現しないが、そのように行う能力を有する種子、再生材料、増殖材料または細胞培養材料として供給される。
したがって、本発明はここに記載される少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡまたは少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡ構築物；またはここに記載される少なくとも１つのヌクレオチド配列または少なくとも１つの組換えＤＮＡ構築物；またはここに記載される少なくとも１つの植物細胞を含む、植物（例えば、稲植物）、または種子（例えば、稲種子）、または細胞（例えば、細菌または植物細胞）を包含する。本発明はまた、ここに記載される少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡまたは少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡ構築物、またはここに記載される少なくとも１つのヌクレオチド配列または少なくとも１つの組換えＤＮＡ構築物を含む植物（例えば、アルファルファ(alfalfa)、リンゴ(apple)、アプリコット(apricot)、朝鮮アザミ(artichoke)、アスパラガス(asparagus)、アボガド(avocado)、バナナ(banana)、オオムギ(barley)、マメ(beans)、ビート(beet)、ブラックベリー(blackberry)、ブルーベリー(blueberry)、ブロッコリ(broccoli)、芽キャベツ(brussel sprouts)、キャベツ(cabbage)、アブラナ(canola)、ニンジン(carrot)、キャッサバ(cassava)、カリフラワー(cauliflower)、穀物(a cereal)、セロリ(celery)、桜(cherry)、柑橘類(citrus)、クレメンタイン(clemintine)、コーヒー(coffee)、コーン(corn)、ワタ(cotton)、キュウリ(cucumber)、ナス(eggplant)、チコリ(endive)、ユーカリ(eucalyptus)、イチジク(figes)、ブドウ(grape)、グレープフルーツ(grapefruit)、落花生(groundnuts)、センナリホウズキ(ground cherry)、キウイフルーツ(kiwifruit)、レタス(lettuce)、ニラ(leek)、レモン(lemon)、ライム(lime)、パイン(pine)、トウモロコシ(maize)、マンゴー(mango)、メロン(melon)、キビ(millet)、マッシュルーム(mushroom)、ナット・オート(nut aot)、オクラ(okra)、タマネギ(onion)、オレンジ(orange)、観賞用植物または花または樹木(an ornamental plant or flower or tree)、パパイア(papaya)、パセリ(parsley)、エンドウマメ(pea)、モモ(peach)、ピーナッツ(peanut)、ピート(peat)、コショウ(pepper)、カキ(persimmon)、パイナップル(pineapple)、オオバコ(plantain)、プラム(plum)、ザクロ(pomegranate)、ジャガイモ(potato)、カボチャ(pumpkin)、ラディッキオ(radicchio)、ダイコン(radish)、ナタネ(rapeseed)、ラズベリー(raspberry)、コメ(rice)、ライ麦(rye)、サトウモロコシ(sorghum)、ダイズ(soy)、ダイズ(soy beans)、ホウレンソウ(spinach)、イチゴ(strawberry)、テンサイ(sugarbeet)、サトウキビ(sugargcane)、ヒマワリ(sunflower)、サツマイモ(sweet poatao)、タンジェリン(tangerine)、茶(tea)、タバコ(tobacco)、トマト(tomato)、ツルクサ(a vine)、スイカ(waetermelon)、コムギ(wheat)、トロロイモ(yams)およびズッキーニ(zucchini)；好ましくはジャガイモ、ナス、トマト、コショウ、タバコ、センナリホウズキ、コメ、コーンまたはワタ植物）、
または種子または塊茎（例えば、アルファルファ(alfalfa)、リンゴ(apple)、アプリコット(apricot)、朝鮮アザミ(artichoke)、アスパラガス(asparagus)、アボガド(avocado)、バナナ(banana)、オオムギ(barley)、マメ(beans)、ビート(beet)、ブラックベリー(blackberry)、ブルーベリー(blueberry)、ブロッコリ(broccoli)、芽キャベツ(brussel sprouts)、キャベツ(cabbage)、アブラナ(canola)、ニンジン(carrot)、キャッサバ(cassava)、カリフラワー(cauliflower)、穀物(a cereal)、セロリ(celery)、桜(cherry)、柑橘類(citrus)、クレメンタイン(clemintine)、コーヒー(coffee)、コーン(corn)、ワタ(cotton)、キュウリ(cucumber)、ナス(eggplant)、チコリ(endive)、ユーカリ(eucalyptus)、イチジク(figes)、ブドウ(grape)、グレープフルーツ(grapefruit)、落花生(groundnuts)、センナリホウズキ(ground cherry)、キウイフルーツ(kiwifruit)、レタス(lettuce)、ニラ(leek)、レモン(lemon)、ライム(lime)、パイン(pine)、トウモロコシ(maize)、マンゴー(mango)、メロン(melon)、キビ(millet)、マッシュルーム(mushroom)、ナット・オート(nut aot)、オクラ(okra)、タマネギ(onion)、オレンジ(orange)、観賞用植物または花または樹木(an ornamental plant or flower or tree)、パパイア(papaya)、パセリ(parsley)、エンドウマメ(pea)、モモ(peach)、ピーナッツ(peanut)、ピート(peat)、コショウ(pepper)、カキ(persimmon)、パイナップル(pineapple)、オオバコ(plantain)、プラム(plum)、ザクロ(pomegranate)、ジャガイモ(potato)、カボチャ(pumpkin)、ラディッキオ(radicchio)、ダイコン(radish)、ナタネ(rapeseed)、ラズベリー(raspberry)、コメ(rice)、ライ麦(rye)、サトウモロコシ(sorghum)、ダイズ(soy)、ダイズ(soy beans)、ホウレンソウ(spinach)、イチゴ(strawberry)、テンサイ(sugarbeet)、サトウキビ(sugargcane)、ヒマワリ(sunflower)、サツマイモ(sweet poatao)、タンジェリン(tangerine)、茶(tea)、タバコ(tobacco)、トマト(tomato)、ツルクサ(a vine)、スイカ(waetermelon)、コムギ(wheat)、トロロイモ(yams)およびズッキーニ(zucchini)；好ましくはジャガイモ、ナス、トマト、コショウ、タバコ、センナリホウズキ、コメ、コーンまたはワタ種子または塊茎）、または細胞（例えば、細菌または植物細胞）を包含する。好ましくは、これらの植物または種子または細胞は組換え構築物であり、本発明のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ構築物をコードするヌクレオチド配列は上記のように少なくとも１つの制御要素に操作可能に結合されている。
植物は１つまたは複数の細胞、細胞タイプまたは組織中でＲＮＡ分子を積極的に発現（転写）する形態で提供される。他方、植物は所望のＲＮＡ分子をコードする導入遺伝子で形質転換されるが、導入遺伝子は植物が供給されるとき（およびその形態で）、植物中で活性でないことを意味する「発現可能」である。
１つの特定の実施態様では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、２４８１または２４８６に開示される配列、もしくは少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２などを含むヌクレオチドの全てまで、または異なった標的種からのオルソログ核酸分子の配列のヌクレオチドの全てまで、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２などのヌクレオチドを含む核酸分子に操作可能に結合される少なくとも１つの制御配列を含む植物または植物細胞でＲＮＡ分子の発現のための組換え（発現）構築物が提供される。多くのベクターはこの目的で入手可能であり、適当なベクターの選択は主にベクター中に挿入される核酸の大きさおよびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。
ＲＮＡｉの目的における植物中での外来性２本鎖ＲＮＡの発現のための一般的技術は、当該技術分野で公知である（Baulcombe D, 2004, Nature, 431(7006): 356-63、植物中のＲＮＡサイレンシング参照、その内容は参考としてここに導入される）。より具体的に、線虫や昆虫などの植物害虫での下方制御遺伝子発現の目的における植物中の２本鎖ＲＮＡ発現方法も、当該技術分野で公知である。同様な方法は植物病原性昆虫の標的遺伝子の下方制御発現の目的において２本鎖ＲＮＡを植物中で発現するために類似した方法で行われる。この効果を達成するために、植物は昆虫と直接接触する植物の一部で２本鎖ＲＮＡを発現（転写）することのみが必要であり、その結果、２本鎖ＲＮＡは昆虫によって摂取され得る。昆虫の性質および宿主植物との関係に依存して、ｄｓＲＮＡの発現は昆虫がその生命サイクル中に存在する植物の細胞または組織内で生じ、あるいはＲＮＡはその生命サイクル中、昆虫によって占められているアポプラストなどの細胞間の空間中に分泌される。さらに、ｄｓＲＮＡは植物細胞、例えば細胞質ゾル中、またはクロロプラスト、ミトコンドリオン、液胞または小胞体などの植物細胞オルガネラ中に局在化される。
他方、ｄｓＲＮＡは植物細胞および植物によって植物の外部へ分泌される。それ自体では、ｄｓＲＮＡは植物表面上に保護層を形成する。
さらなる態様では、本発明はまた害虫横行から植物を阻止または保護するための方法と組成物の組合せを提供する。例えば、１つの手段はｄｓＲＮＡ分子の発現を使用する方法とこのようなＢｔ殺虫性タンパクの発現を使用する方法を組合せた植物遺伝子組換えアプローチの使用を提供する。
したがって、本発明はまた前記ＲＮＡ分子を発現する前記植物細胞または植物は、パタチン、バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、殺虫性タンパク、クセノラブズス(Xenorhabdus)殺虫性タンパク、フォトラブズス(Photorhabdus)殺虫性タンパク、バチルス・ラテロスポラウス(Bacillus laterosporous)殺虫性タンパク、およびバチルス・スフェアリクス(Bacillus sphearicus)殺虫性タンパクからなる群から選択される殺虫性製剤を含むか、または発現する、ここに記載される方法または植物細胞および植物に関する。好ましくは、前記バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫性タンパクはＣｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ１７０、Ｃｒｙ２２、二成分殺虫性タンパクＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４、二成分殺虫性タンパクＣｒｙＥｔ８０およびＣｒｙＥｔ７６、二成分殺虫性タンパクＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、および二成分性殺虫性タンパクＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択される。
さらなる実施態様では、本発明は少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡを含む少なくとも植物の部分、植物細胞、植物組織または種子を含み、前記２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つは昆虫標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を有する、昆虫の成長を制御し、および／または昆虫の横行を阻止または減少させる組成物に関する。所望により、この組成物はさらに少なくとも１つの好適な担体、賦形剤または希釈剤を含む。標的遺伝子はここに記載されるすべての標的遺伝子である。好ましくは、昆虫標的遺伝子は昆虫の生存、成長、発生または再生に必須である。
他の態様では、本発明は上記した組成物に関し、昆虫標的遺伝子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、２４８１または２４８６のいずれかに示される配列の群から選択される配列、またはこれらの相補鎖と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％同一である配列を含む。
あるいは、前記昆虫標的遺伝子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、２４８１または２４８６のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子の昆虫オルソログである。
なおも別な実施態様では、本発明はここに記載されるヌクレオチド配列または組換えＤＮＡ構築物のいずれかを植物に発現可能な形態で導入することを含む、植物の収穫を増加させる方法にまで及ぶ。
本発明はさらに以下の非限定的な例を参考にして理解されるであろう。
実施例
ハイスループットスクリーニングにおけるＣ．エレガンス（C.elegans）のＣ．エレガンス標的遺伝子サイレンシング
Ｃ．エレガンスのゲノムワイドライブラリーを、２つの同一のＴ７プロモーターとターミネーターーとの間で、ｐＧＮ９Ａベクター（ＷＯ０１／８８１２１）において調製した。それは、ＩＰＴＧにより誘導されたＴ７ポリメラーゼの発現時に、センスおよびアンチセンス方向でのその発現を駆動する。
このライブラリーは、９６穴プレート形式にて、ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）細菌株に形質転換された。ゲノムワイドスクリーニングのために、これらの細菌細胞をヌクレアーゼ欠損Ｃ．エレガンスｎｕｃ−１（ｅ１３９２）株に餌として与えた。
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）細菌株において生成されたｄｓＲＮＡをＣ．エレガンスｎｕｃ−１（ｅ１３９２）線虫へ餌として与えることは、以下のように９６穴プレートにて行った：ｎｕｃ−１の卵を別個のプレートに移し、Ｌ１世代の同期化のために２０℃で同時に孵化させた。ＩＰＴＧを含む液体成長培地１００μＬと、ｄｓＲＮＡ発現のためのＣ．エレガンスゲノムフラグメントを持つベクターの各々を有するＣ．エレガンスｄｓＲＮＡライブラリーのＯＤ６００１ ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の細菌細胞培養物１０μＬとで、９６穴プレートを満たした。各ウェルに、４つの同期化Ｌ１線虫を添加し、２５．０℃で少なくとも４〜５日間インキュベートした。これらの実験を４回行なった。スクリーニングでは、６つのコントロールを用いた：
−ｐＧＮ２９＝陰性コントロール、野生型
−ｐＧＺ１＝ｕｎｃ−２２＝トゥイッチャー（ｔｗｉｔｃｈｅｒ）表現型
−ｐＧＺ１８＝キチン合成酵素＝胚致死
−ｐＧＺ２５＝ｐｏｓ−１＝胚致死
−ｐＧＺ５９ ＝ｂｌｉ−４Ｄ＝急性致死
−ＡＣＣ＝アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ＝急性致死
５日後、ｄｓＲＮＡを生成する細菌を与えたＣ．エレガンスｎｕｃ−１（ｅ１３９２）線虫の表現型を、空ベクター（ｐＧＮ２９）および他のコントロールを与えた線虫の表現型と比較した。ｄｓＲＮＡを与えた線虫を、致死性（急性もしくは幼虫）、親（Ｐｏ）世代の致死性、第１（Ｆ１）世代の（胚性）致死性、またはＰｏの成長遅延について、以下のようにスクリーニングした：（ｉ）Ｐｏの急性致死性：Ｌ１のものは成長せずに死亡し、この表現型は子孫を残すことなく、ウェルは完全に空に見える；（ｉｉ）（幼虫）Ｐｏの致死性：ＰｏはＬ１より遅い段階で死亡し、この表現型も子孫を残さない。死亡した幼虫または死亡した線虫がウェル内に見られた；（ｉｉｉ）Ｆ１の致死性：Ｌ１のものは成虫段階まで発生し、生存したままである。この表現型は子孫を持たない。これは不妊、胚性致死（ウェルの底に死亡した卵）、胚停止または幼虫停止（最終的に、致死することで終わる）による可能性がある：（ｉｖ）成長の停止および成長の遅延／遅れ：通常の発生および通常の子孫の数をもつウェルと比較して。
表１Ａに提示した標的配列について、結論としては、Ｃ．エレガンスのような線虫におけるＣ．エレガンス標的遺伝子のｄｓＲＮＡ媒介サイレンシングは、線虫の成長および生存に致命的な影響を持っていた。
上記ｄｓＲＮＡサイレンシング実験に続いて、より詳細な表現型実験を、２４穴プレートでハイスループット形式にて、Ｃ．エレガンスにおいて行った。上記のような細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）において作製されたｄｓＲＮＡライブラリーを、以下のとおり２４穴プレートにてＣ．エレガンスｎｕｃ−１（ｅ１３９２）線虫に餌として与えた：ｎｕｃ−１の卵を別個のプレートに移し、Ｌ１世代の同期化のために２０℃で同時に孵化させた。続いて、１００の同期化Ｌ１線虫を、５μｇ／ｍＬコレステロール、４μＬ／ｍＬ ＰＥＧおよび１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＳ完全餌培地５００μＬと、ｄｓＲＮＡ発現のためのＣ．エレガンスゲノムフラグメントを持つベクターの各々を有するＣ．エレガンスｄｓＲＮＡライブラリーのＯＤ６００１ ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の細菌細胞培養液５００μＬとの混合物中に浸した。浸したＬ１線虫を、２時間、２５℃で回転させておいた。
遠心分離後、上清９５０μＬを除去し、残余の５μＬと再懸濁した沈殿物（約１０〜１５の線虫を含む）を、２４穴プレートの各ウェルの中央に移し、寒天ＬＢブロスの層で満たした。接種したプレートを、２５℃で２日間インキュベートした。成虫段階で、１の成線虫を選抜し、２５℃で２日間、子孫の検査のためにインキュベートした。他の成線虫は、元の２４穴プレートでｉｎ ｓｉｔｕで検査された。これらの実験は、４回行った。
この詳細な表現型のスクリーニングを、線虫の第２の群で繰り返したが、唯一異なることは、第２群の線虫を２０℃で３日間インキュベートしたことである。
Ｃ．エレガンスｄｓＲＮＡを与えた線虫の表現型を、空ベクターを与えたＣ．エレガンスｎｕｃ−１（ｅ１３９２）線虫の表現型と比較した。
この実験に基づくと、結論は、表１Ａに提示したようなＣ．エレガンス標的遺伝子サイレンシングが、線虫の成長および生存率に致命的な影響を有していたということ、および、標的遺伝子が線虫の生存に必須であるということであった。したがって、これらの遺伝子は、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングを介した線虫を制御する（殺す、もしくは成長を阻害する）ための好適な標的遺伝子である。したがって、本発明は、植物の線虫侵入のような線虫侵入を制御するための上記Ｃ．エレガンス標的遺伝子の線虫オルソログの使用を包含する。
Ｄ．メラノガスター（D. melanogaster）オルソログの同定
実施例１にて上述したとおり、多数のＣ．エレガンス致死性配列が同定され、他の種および属においてオルソログを同定するために用いられ得る。例えば、Ｃ．エレガンスの致死性配列は、オルソログＤ．メラノガスター配列を同定するために用いられ得る。つまり、各々のＣ．エレガンス配列は、Ｄ．メラノガスターにおけるオルソログ配列について、ＧｅｎＢａｎｋのような公的データベースに対して探し出され得る。高い配列相同性を有する（Ｅ値は好ましくは、１Ｅ−３０より小さいか等しい）潜在的なＤ．メラノガスターオルソログが選択され、配列はｂｌａｓｔ ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｂｅｓｔ ｈｉｔｓであり、後者は異なる生物由来の配列（例えばＣ．エレガンスとＤ．メラノガスター）がお互いのトップブラストヒットであることを意味する。例えば、Ｃ．エレガンス由来の配列Ｃが、ＢＬＡＳＴを用いてＤ．メラノガスターにおける配列と比較される。もし、配列ＣがＤ．メラノガスターの配列Ｄをベストヒットとして持ち、そして、ＤがＣ．エレガンスの全ての配列と比較されると、結局のところ配列Ｃに到達し、そしてＤとＣがｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｂｅｓｔ ｈｉｔｓとなる。この基準はしばしばオルソロジーを定義するの使われ、異なる種の同様の配列を意味し、同様の機能を有するものである。Ｄ．メラノガスター配列のアイデンティファーは、表１Ａに提示されている。
レプチノタルサ・デセムリネアータ（Leptinotarsa decemlineata）（コロラドハムシ）
Ａ．レプチノタルサ・デセムリネアータの部分遺伝子配列のクローニング
高品質の無傷ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って、レプチノタルサ・デセムリネアータ（コロラドハムシ；入手元：Ｊｅｒｏｅｎ ｖａｎ Ｓｃｈａｉｋ，Ｅｎｔｏｃａｒｅ ＣＶＢｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｇｅｗａｓｂｅｓｃｈｅｒｍｉｎｇ，Ｐｏｓｔｂｕｓ １６２，６７００ ＡＤ Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の４つの異なる幼虫段階から単離した。ＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡは、製造者の指示（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＤＮａｓｅ処理により除去した。ｃＤＮＡは市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）3 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って生成した。
ＬＤ００１、ＬＤ００２、ＬＤ００３、ＬＤ００６、ＬＤ００７、ＬＤ０１０、ＬＤ０１１、ＬＤ０１４、ＬＤ０１５、ＬＤ０１６、ＬＣ０１８およびＬＤ０２７遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、変性プライマーを用いて一連のＰＣＲ反応を、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者の指示に従って行った。
遺伝子の各々の増幅に用いた変性プライマーの配列は、表２−ＬＤに示されており、プライマー配列と得られたｃＤＮＡ配列を含むレプチノタルサ・デセムリネアータ標的遺伝子を示す。これらのプライマーは、以下の条件のそれぞれのＰＣＲ反応にて用いた：９５℃で１０分、その後９５℃で３０秒、５５℃で１分、および７２℃で１分を４０サイクル、その後７２℃で１０分。生じたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ２５００ ２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定した。生じたＰＣＲ生成物の配列は、表２−ＬＤに示したそれぞれの配列番号により示され、部分配列として示されている。対応する部分アミノ酸配列が、表３−ＬＤに示したそれぞれの配列番号により示され、読み枠の開始が括弧で示されている。
Ｂ．レプチノタルサ・デセムリネアータ遺伝子のｄｓＲＮＡ生成
市販のＴ７ Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ミリグラム量でｄｓＲＮＡを合成した。まず、２つの別個の単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を、２つの別個のＰＣＲで生成し、各反応物はＴ７プロモーターに対して異なる向きで標的配列を含む。
標的遺伝子の各々について、センスＴ７鋳型を、特異的Ｔ７フォワード、および特異的リバースプライマーを用いて生成した。標的遺伝子の各々に対するセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＬＤに示す。ＰＣＲ反応の条件は、以下のとおりである：９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワード、および特異的Ｔ７リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件のＰＣＲ反応で生成した。標的遺伝子の各々に対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列は、表８−ＬＤに示す。生じたＰＣＲ反応物を、アガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、そして、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、生成したＴ７フォワードおよびリバース鋳型を、転写させるために混合し、生じたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムで生成した。標的遺伝子の各々について生じたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＬＤに示す。表８−ＬＤは、プライマー配列を含むレプチノタルサ・デセムリネアータの標的配列と、コンカテマー配列のｄｓＲＮＡフラグメントを調製するための配列を示す。
Ｃ．植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）へのレプチノタルサ・デセムリネアータ遺伝子のクローニング
ＲＮＡ干渉の機構はｄｓＲＮＡフラグメントを介して操作するので、上記のとおり選択された標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列を、アンチセンスおよびセンス方向で、イントロン−ＣｍＲ−イントロンによって分けてクローン化された。ＣｍＲはクロラムフェニコール抵抗性マーカーであり、ｄｓＲＮＡヘアピン構造を形成する。これらのヘアピン構造は、ａｔｔＬ含有エントリークローン（実施例１参照）およびａｔｔＲ含有デスティネーションベクター（＝ｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2））との間のＬＲ組み換え反応を用いて生成した。植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ＡｇｒｅｅｍｅｎｔによるＶＩＢ／Ｐｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙから得た。ＬＲ組み換え反応は、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）2 ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７９１−０２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、ＬＤ００２、ＬＤ００６、ＬＤ００７、ＬＤ０１０、ＬＤ０１１、ＬＤ０１４およびＬＤ０１６遺伝子の各々のヘアピン構造を生じ、それらはプロモーター−センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンス方向あるいは、プロモーター−アンチセンス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−センス方向のいずれかを有し、プロモーターは、植物作動可能な３５Ｓプロモーターである。３５Ｓプロモーターを有するバイナリーベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）がＡ．ツメガシエンス（A.tumefaciens.）への形質転換に好適である。
ＬＤ００２およびＬＤ０１０について、制限酵素ＢｓｏＢＩ＆Ｐｖｕｌによる二重消化をｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏにクローン化されたＬＤ００２に行った（実施例３Ａ参照）。ＬＤ００６、ＬＤ００７、ＬＤ０１１、ＬＤ０１４、ＬＤ０１６およびＬＤ０２７について、制限酵素ＢｓｏＢＩによる消化をｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏにクローン化されたＬＤ００６に行った（実施例３Ａ参照）。Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ａｔｔＬ部位により隣接された対象遺伝子を含むバンドを精製した。精製したフラグメント１５０ｎｇ量と、ｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）１５０ｎｇを、ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ 2酵素と共に添加し、少なくとも１時間、２５℃でインキュベートした。プロテイナーゼＫ溶液処理（３７℃で１０分）の後、全組み換え混合物を、Ｔｏｐ １０ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙコンピテント細胞へ形質転換した。陽性クローンを制限消化解析により選択した。ヘアピン構造の完全配列について：
−ＬＤ００２（アンチセンス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−センス）が配列番号２４０の前に配置されている；
−ＬＤ００６（センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンス）が配列番号２４１の前に配置されている；
−ＬＤ００７（センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンス）が配列番号２４２の前に配置されている；
−ＬＤ０１０（アンチセンス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−センス）が配列番号２４３の前に配置されている；
−ＬＤ０１１（センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンス）が配列番号２４４の前に配置されている；
−ＬＤ０１４（センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンス）が配列番号２４５の前に配置されている；
−ＬＤ０１６（アンチセンス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−センス）が配列番号２４６の前に配置されている；
−ＬＤ０２７（センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンス）が配列番号２４８６の前に配置されている。
表９−ＬＤは、各ヘアピン構造の完全配列を示す。
Ｄ．レプチノタルサ・デセムリネアータに対する活性のための人工食餌を用いたｄｓＲＮＡ標的スクリーニング
コロラドハムシ用の人工食餌を以下のように作製した（Ｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｎｓ．Ｓｃ，ｖｏｌ．１，ｎｏ．７，１−１０から採用）：水と寒天をオートクレーブし、残りの成分（下記表Ａに示す）を、温度が５５℃まで下がったら添加した。この温度で、食餌を１ウェルごとの食餌１ｍｌの量で２４穴プレート（Ｎｕｎｃ）に食餌を等分する前に、成分をよく混合した。人工食餌を、室温に冷ますことによって凝固させた。食餌は、３週間まで４℃で保存した。
表Ａ：人工食餌の成分
成分 １Ｌに対する容量
水 768ml
寒天 14g
ひいたコムギ 40g
トルラ酵母 60g
ラクトアルブミンハイドロライセート 30g
カゼイン 10g
フルクトース 20g
Ｗｅｓｓｏｎ塩混合物 4g
トマト果実粉末 12.5g
ジャガイモ葉粉末 25g
ｂ−シトステロール 1g
ソルビン酸 0.8g
メチルパラベン 0.8g
Ｖａｎｄｅｒｚａｎｔビタミン混合物 12g
ネオマイシン硫酸物 0.2g
オーロマイシン 0.130g
リファムピシン 0.130g
クロラムフェニコール 0.130g
ニスタチン 0.050g
ダイズ油 2ml
コムギ胚芽油 2ml
濃度１ｍｇ／ｍｌのｄｓＲＮＡ溶液５０μＬを、マルチウェルプレートのウェル上の固体人工食餌上に、局部的に添加した。食餌を層流室で乾燥させた。処理ごとに、２４のコロラドハムシの幼虫（第２段階）を、１ウェル毎に２昆虫で試験した。プレートを２５±２℃、６０％相対湿度、１６：８時間の明暗光周期の昆虫飼育室で保存した。昆虫を、１、２または３日ごとに生または死について評価した。７日後、標的ＬＤ００６、ＬＤ００７、ＬＤ０１０、ＬＤ０１１、およびＬＤ０１４について、食餌を同じ濃度（１ｍｇ／ｍｌ）で局所的に添加したｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌に交換した；標的ＬＤ００１、ＬＤ００２、ＬＤ００３、ＬＤ０１５およびＬＤ０１６について、食餌を新鮮な食餌のみのものに交換した。ｄｓＲＮＡ標的を、食餌のみ、もしくは配列（配列番号２３５）をコードするＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）のフラグメントに対応するｄｓＲＮＡを局所的に添加した食餌と比較した。
インタクトな裸のｄｓＲＮＡを含む人工食餌をＬ．デセムリネアータの幼虫に与えた場合、２つの別個のバイオアッセイにて示されるように（図１ＬＤ−２ＬＤ）幼虫の致死率の有意な増加を生じた。
試験された全てのｄｓＲＮＡは、７〜１４日後に、１００％の致死率を最終的にもたらした。ＧＦＰ ｄｓＲＮＡを有する食餌もしくは有さない食餌は、バイオアッセイ中、非常に小さな致死率もしくは致死率がない状態で昆虫を維持した。
典型的には、全てのアッセイにみられたように、ＣＰＢ第２段階の幼虫は２日間、ｄｓＲＮＡを有する食餌もしくは有さない食餌を通常与えられ、第３の幼虫段階へと脱皮した。この新しい幼虫段階において、ＣＰＢはそれらの摂食を有意に減らすか、完全に停止するのが観察され、結果として致死率の上昇をもたらした。
Ｅ．レプチノタルサ・デセムリネアータに対する活性についてのジャガイモ葉円盤状組織を用いたｄｓＲＮＡ標的のパイオアッセイ
選択的なバイオアッセイ法を、ＣＰＢの食糧源として人工食餌ではなくジャガイモ葉材料を用いて行った。直径約１．１ｃｍの円盤状組織（または０．９５ｃｍ２）を２〜３週齢のジャガイモ植物の葉から、好適な大きさの穿孔器を用いて、切り取った。処理された葉の円盤状組織を、１０ｎｇ／μｌ溶液の標的ＬＤ００２ ｄｓＲＮＡまたはｇｆｐコントロール ｄｓＲＮＡ ２０μｌを、向軸葉表面に添加することにより調製した。葉の円盤状組織を乾燥させ、個別に２４穴マルチプレート（Ｎｕｎｃ）の２４ウェルに置いた。単一の第２幼虫段階ＣＰＢを、各ウェルに置き、その後ティッシュペーパとマルチウェルプラスチック蓋により覆った。昆虫と葉の円盤状組織を含むプレートを、２８℃、１６：８時間の明暗光周期の昆虫室に保持した。昆虫を２日間、葉円盤状組織上で飼育し、その後昆虫を新鮮な処理した葉の円盤状組織を含む新しいプレートに移動させた。その後、昆虫を７日まで毎日、未処理の葉の円盤状組織を含むプレートに移動させた。昆虫の致死率と重量スコアを記録した。
表面に添加した標的ＬＤ００２のインタクトな裸のｄｓＲＮＡを有するジャガイモ葉円盤状組織をＬ．デセムリネアータの幼虫に与えると、幼虫の致死率に有意な増加をもたらし（すなわち、７日目には全昆虫が死んだ；１００％の致死率）、一方、ｇｆｐコントロール ｄｓＲＮＡはＣＰＢ生存に全く影響を与えなかった。標的ＬＤ００２ｄｓＲＮＡは、２〜３日後に幼虫の成長に大幅な影響を与え、一方、同濃度でｇｆｐ ｄｓＲＮＡを与えた幼虫は、正常なものと同様に発達した（図３−ＬＤ）
Ｆ．レプチノタルサ・デセムリネアータに対する活性についての人工食餌を用いたｄｓＲＮＡの短いバージョンスクリーニング
この実施例は、より短い（６０または１００ｐｂ）ｄｓＲＮＡフラグメントのそれ自体またはコンカテマー構築体が、コロラドハムシに対する毒性を引き起こすのに十分であることの発見を例示する。
ＬＤ０１４、コロラドハムシの致死率を誘導すると知られている標的を、この実施例のために選択した。この遺伝子は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅサブユニットＥ（配列番号１５）をコードする。
１００塩基対フラグメント、ＬＤ０１４＿Ｆ１、配列番号１５の位置１９５−２９４（配列番号１５９）と、６０塩基対フラグメント、ＬＤ０１４＿Ｆ２、配列番号１５の位置２３５−２９４（配列番号１６０）をさらに選択した。表７−ＬＤも参照されたい。
３００塩基対の２つのコンカテマー、ＬＤ０１４＿Ｃ１とＬＤ０１４＿Ｃ２を設計した（配列番号１６１と配列番号１６２）。ＬＤ０１４＿Ｃ１は、上記の１００塩基対フラグメント（配列番号１５９）の３回繰り返しを含み、ＬＤ０１４＿Ｃ２は上記の６０塩基対（配列番号１６０）の５回繰り返しを含む。表７−ＬＤも参照されたい。
フラグメントＬＤ０１４＿Ｆ１とＬＤ０１４＿Ｆ２を、センスおよびアンチセンスプライマーとして合成した。これらのプライマーを、クローニングの前に２本鎖ＤＮＡ分子を作成するためにアニーリングさせた。クローニングを容易するために、ＸｂａＩとＸｍａＩの制限酵素部位を、プライマーの５'および３'末端にそれぞれ含ませた。
コンカテマーは、３００塩基対の合成遺伝子として作製した。クローニングを容易するために、ＸｂａＩとＸｍａＩの制限酵素部位を合成ＤＮＡフラグメントの５'および３'末端にそれぞれ含ませた。
４のＤＮＡ分子、すなわち２の単一単位（ＬＤ０１４＿Ｆ１とＬＤ０１４＿Ｆ２）および２コンカテマー（ＬＤ０１４＿Ｃ１とＬＤ０１４＿Ｃ２）を、ＸｂａＩとＸｍａＩで消化し、ＸｂａＩとＸｍａＩとの消化により線状化したｄｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ2 ＳＫ＋にサブクローン化し、組み換えプラスミドｐ１、ｐ２、ｐ３、およびｐ４を、それぞれ得た。
２本鎖ＲＮＡ生成：ｄｓＲＮＡを市販のキットＴ７ Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて合成した。まず、２つの別個のシングル５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を、２つの別個のＰＣＲ反応において生成し、各々の反応物はＴ７プロモーターに対して異なる方向で標的配列を含む。ＬＤ０１４＿Ｆ１、センスＴ７鋳型を、特異的Ｔ７フォワードプライマーｏＧＢＭ１５９と、特異的リバースプライマーｏＧＢＭ１６４（ここでは配列番号２０４と配列番号２０５として、それぞれ示される）を用いて、以下の条件のＰＣＲ反応で生成した：９５℃で４分、その後９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーｏＧＢＭ１６３および特異的Ｔ７鋳型リバースプライマーｏＧＢＭ１６０（ここでは配列番号２０６と配列番号２０７として、それぞれ示される）を用いて、上記の条件のＰＣＲ反応で生成した。生じたＰＣＲ産物を、アガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱した。製造者の指示に従って、生成したＴ７フォワードおよびリバース鋳型を混合して、転写させ、生じたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。生じたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、ここでは配列番号２０３で示す。
ＬＤ０１４＿Ｆ２について、センスＴ７鋳型を、特異的Ｔ７フォワードプライマーｏＧＢＭ１６１と、特異的リバースプライマーｏＧＢＭ１６６（ここでは配列番号２０９と配列番号２１０としてそれぞれ示される）を用いて、以下の条件のＰＣＲ反応で生成した：９５℃で４分、その後９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーｏＧＢＭ１６５および特異的Ｔ７リバースプライマーｏＧＢＭ１６２（ここでは配列番号２１１と配列番号２１２として、それぞれ示される）を用いて、上記の条件のＰＣＲ反応で生成した。生じたＰＣＲ産物を、アガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱した。製造者の指示に従って、生成したＴ７フォワードおよびリバース鋳型を混合して、転写させ、生じたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。生じたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、ここでは配列番号２０８で示す。
また、コンカテマーについて、別個のシングル５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を、２つの別個のＰＣＲ反応において生成し、各々の反応物はＴ７プロモーターに対する異なる方向で標的配列を含む。ＬＤ０１４＿Ｃ１とＬＤ０１４＿Ｃ２を含む組み換えプラスミドｐ３とｐ４を、ＸｂａＩまたはＸｍａＩで線状化し、各々の構築物のための２つの線状フラグメントを精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写アッセイの鋳型としてクローニング部位に隣接したＴ７プロモーター用いて使用した。２本鎖ＲＮＡをＴ７Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により調製した。ＬＤ０１４＿Ｃ１とＬＤ０１４＿Ｃ２の生じたｄｓＲＮＡセンス鎖を、ここでは配列番号２１３と２１４により、それぞれ示す。
標的ＬＤ０１４とコンカテマーの短い配列は、図４−ＬＤに示すとおり、レプチノタルサ・デセムリネアータで致死を誘導することが可能であった。
Ｇ．レプチノタルサ・デセムリネアータに対する活性のための人工食餌を用いた異なる濃度でのｄｓＲＮＡスクリーニング
１μｇ／μｌから０．０１ｎｇ／μｌへの連続した１０倍希釈濃度（０．１μｇ／μｌからの標的ＬＤ０２７のために）のｄｓＲＮＡ溶液５０μｌを、２４穴プレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上の固体の人工食餌へ局所的に添加した。食餌を層流室で乾燥させた。処理ごとに、２４のコロラドハムシ幼虫（第２段階）を、ウェル毎に２昆虫で試験した。プレートを、２５±２℃、６０％相対湿度、１６：８時間の明暗光周期での昆虫飼育室に保存した。昆虫を１４日まで、一定の間隔で生もしくは死を評価した。７日後、食餌を同じ濃度でｄｓＲＮＡの局所添加された新鮮な食餌と交換した。ｄｓＲＮＡ標的を、食餌のみと比較した。
デセムリネアータ幼虫に対して異なる標的のインタクトな裸のｄｓＲＮＡｓを含む人工食餌を与えることは、図５−ＬＤに示すように、０．１〜１０ｎｇのｄｓＲＮＡ／μｌと同程度の低い濃度で、高い幼虫の致死率をもたらした。
Ｈ．成虫は標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの経口摂取に極端に敏感である
下記の例は、成虫（および幼虫の段階の昆虫のみならず）は、標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの経口摂取に極端に敏感であるとの発見を強調する。
４つの標的は、この実験のために選択された：標的２、１０、１４、１６（配列番号１６８、１８８、１９８、２２０、各々）。ＧＦＰフラグメントのｄｓＲＮＡ（配列番号２３５）はコントロールとして使用した。若い成虫（２〜３日齢）を、昆虫の性別に偏りなく、我々の実験室で飼育した培養物から無差別に抽出した。１０の成虫を処理ごとに選択した。成虫を処理の開始前少なくとも６時間、事前に空腹にさせた。処理の初日に、各々の成虫を円盤状組織ごとに（実施例３Ａで記載されたとおりに合成した：実施例３Ｅに記載したとおりに局所添加した）０．１μｇ／μｌ標的ｄｓＲＮＡの２５μｌの局所添加により前処理した４つのジャガイモ葉円盤状組織（直径１．５ｃｍ２）を与えた。各成虫を、全昆虫が等量の食糧を摂食し、従って等用量のｄｓＲＮＡを受け取ることを確実にするために、小さなペトリ皿（直径３ｃｍ）に閉じ込めた。次の日に、各成虫は上記の４つのジャガイモ葉円盤状組織を再び摂食した。３日目に処理ごとの全ての１０成虫を、回収し、プラスチック箱からなるケージ（寸法３０ｃｍ ｘ ２０ｃｍ ｘ １５ｃｍ）で、良好な通気性を付与するために蓋に細かいナイロンメッシュが組み込まれたものに一緒に置いた。箱の中に、幾分か湿ったろ紙を底面においた。いくつかの（未処理の）ジャガイモ群葉を、実験中の成虫を維持するため、ろ紙の上面においた。５日から、定期的な評価を、死、生（動く）および瀕死の昆虫の数を計数することにより行った。昆虫の瀕死かどうかは、成虫を背中を向けておき、それらが、数分間で自分の常態に戻れるかどうかで確認した：昆虫は、もし、それが、その正面に回転できないのみであれば、瀕死であると考えられた。
コロラドハムシ、レプチノタルサ・デセムリネアータの成虫に対する異なる標的に対応する２本鎖ＲＮＡの明確な特異的毒性効果は、この実験で実証された（図６−ＬＤ）。Ｇｆｐフラグメントに対する２本鎖ＲＮＡは、最後の評価の日に（１９日）で、ＣＰＢ成虫に対する毒性を示さなかった。この実験は、ＣＰＢ成虫の生存が経口で送達され、ｄｓＲＮＡにさらされた２，３日後のみに、大幅に減少したことを明確に示した。例えば、標的１０について、５日に、１０成虫のうちの５匹が瀕死となった（病的でゆっくり動く）：６日に、１０成虫のうちの４匹が、瀕死だが生存しているもののうちの３匹とともに死んだ；９日、全成虫が死んだのが観察された。
この実験の結果として、害虫に対する標的２本鎖ＲＮＡの適用を、コロラドハムシの場合と同様に、それは、広大な農作物の損害を引き起こし得る害虫の２つの生活段階（幼虫と成虫）を含むように広げ得る。
Ｉ．コロラドハムシ（Colorado poteto beetle）の幼虫、レプチノタルサ・デセムリネアータに対する遺伝子組み換えジャガイモ植物を試験する実験室の試験
以下に提供された実施例は、ＣＰＢ遺伝子特異的ヘアピンＲＮＡを発現する遺伝子組み換えジャガイモ植物がコロラドハムシに悪影響を及ぼすことを見出した例示である。
ジャガイモ形質転換
安定的に形質転換したジャガイモ植物が、ＮＳＦ Ｐｏｔａｔｏ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｏｔａｔｏｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｎｓｆ５）．におけるＪｕｌｉｅ Ｇｉｌｂｅｒｔを介して受け取られた適合したプトロコルを用いて得られた。感受性の２倍体Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ６４８７−９から由来するジャガイモ“ＬｉｎｅＶ”（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｔ ＰＲＩ Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから得た）の茎節間の外植片が、形質転換のための開始材料として用いられた。
インビトロ由来の外植片を、ヘアピン構築物を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲで感染させた。共栽培３日後、外植片を、１００ｍｇ／ｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎと３００ｍｇ／ｌ Ｔｉｍｅｎｔｉｎを含む選択培地上においた。形質転換６週間後、最初の推定芽を除去し、選択培地中に根付かせた。異なる外植片から発生した芽を、独立した事象として扱い、同じカルスから発生した芽を、それらのクローンステータスが、サザンにより評価され得るまで、「同胞（シブリング）」と名付け、芽の節での断片を、「クローン」と称した。
根を下ろした芽のトランスジェニックステータスは、ＧＦＰ蛍光もしくは、標的配列に対するプラス／マイナスＰＣＲのいずれかにより確認した。陽性の芽は、その後、組織培養でクローン的に増殖させて、十分な複製数が、形質転換後１４週間試験するのに利用し得る最初の植物を用いたコロラドハムシアッセイのために得られることを確実にした。
バイオアッセイ
遺伝子組み換えジャガイモ植物を、以下の条件で植物生育室の８〜１２の折りたたまれていない葉の段階まで生育させた：２３±２℃，６０％相対湿度，１６：８時間の明暗光周期。植物を、鉢の土中にしっかりと置いた瓶の首で、植物を覆うようにさかさまに５００ｍｌ瓶を置くことにより閉じ込め、底を切断して開けて、吸気をさせるために細かいナイロンメッシュにより覆い、中の結露を減少させて、幼虫が逃げるのを防いだ。
このバイオアッセイで、７つの新生児のＣＰＢ幼虫が、各遺伝子組み換えジャガイモ植物の葉に置かれた。ＬＤ００２ヘアピン構築物（配列番号２４０を含む）（ｐＧＢＮＢ００１／２８ＡからＦとラベルされた）と空のベクター（ｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）／１１ＡからＦとラベルされた）の形質転換事象ごとの６つの遺伝子組み換えジャガイモシブリング（すなわち１つのカルス由来の植物）と、２つの野生型植物を試験した。温度、湿度、光条件を上記と同じにした。７日目で（バイオアッセイの開始後７日）、生存数を計数し、各植物からの生存幼虫の平均重量を記録した。データを、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ Ｉｎｃ．からのＳｐｏｔｆｉｒｅ；ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ；９．０ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｅｒｓｉｏｎ １７．１．７７９）を用いて解析した。
この実験において、ヘアピン構築物ＬＤ００２を含む、一つの形質転換事象から発生した二つのシブリング植物において（ｐＧＢＮＢ００１／２８ＡとｐＧＢＮＢ００１／２８Ｆとラベルされた）、Ｃｏｌｏｒａｄｏ ｐｏｔａｔｏｂｅｅｔｌｅの全ての幼虫が、７日目に死んだ（図７ＬＤ）。これらの二つの植物におけるＣＰＢ幼虫による食餌損傷は、空の形質転換植物もしくは、野生型ｌｉｎｅ Ｖ植物と比較すると、非常に低かった。
ファエドン・コクレアリアエ（Phaedon cochleariae）（マスタード・リーフ・ビートル（mustard leaf beetle））
Ａ．ファミリーＰＣＲを介したファエドン・コクレアリアエ（マスタード・リーフ・ビートル）ＰＣ００１，ＰＣ００３，ＰＣ００５，ＰＣ０１０，ＰＣ０１４，ＰＣ０１６およびＰＣ０２７遺伝子の部分配列のクローニング
高品質、インタクトなＲＮＡを、ファエドン・コクレアリアエの第３段階の幼虫（マスタード・リーフ・ビートル；ｓｏｕｒｃｅ：Ｄｒ．Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｍｕｌｌｅｒ，Ｊｕｌｉｕｓ−ｖｏｎ−Ｓａｃｈｓ−ｌｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ，Ｊｕｌｉｕｓ−ｖｏｎ−Ｓａｃｈｓ−Ｐｌａｔｚ ３，Ｄ−９７０８２ Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って、単離した。ＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡは、ＤＮａｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）処理により製造者の指示に従って除去した。ｃＤＮＡを、市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）3 ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って生成した。
ＰＣ００１，ＰＣ００３，ＰＣ００５，ＰＣ０１０，ＰＣ０１４，ＰＣ０１６およびＰＣ０２７遺伝子の部分を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、変性プライマーによる一連のＰＣＲ反応を、ＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者の指示に従って行った。
各々の遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表２ＰＣに記載する。これらのプライマーを、以下の条件によりそれぞれのＰＣＲ反応において用いた：９５℃で１０分、続いて、９５℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分を４０サイクル、続いて、７２℃で１０分。生じたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４／ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ４５３０−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定した。生じたＰＣＲ産物の配列を、表２ＰＣに記載のそれぞれの配列番号により示し、これらは部分配列として言及される。
対応する部分アミノ酸配列を、表３ＰＣに記載のそれぞれの配列番号により示した。表３ＰＣは、ｃＤＮＡクローンのアミノ酸配列を提供し、読み枠の最初は、カッコで示す。
Ｂ．ファエドン・コクレアリアエ遺伝子のｄｓＲＮＡの生成
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７ Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）； Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）．を用いてミリグラム量で合成した。まず、二つの別個のシングル５'Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を、二つの別個のＰＣＲ反応で生成し、各反応物はＴ７プロモーターに対して異なる向きで標的配列を含む。
標的遺伝子のそれぞれについて、センスＴ７鋳型を、特異的Ｔ７フォワードおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。標的遺伝子の各々についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８ＰＣに示す。表８ＰＣは、プライマー配列を含むファエドン・コクレアリアエ標的配列のｄｓＲＮＡフラグメントを調整するための詳細を提供する。
ＰＣＲ反応における条件は以下のとおりである：９５℃で１分、続いて９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、そして７２℃で１分を２０サイクル、続いて９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、そして７２℃で１分を１５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を上記と同じ条件のＰＣＲ反応で特異的フォワードおよび特異的Ｔ７リバースプライマーを用いて生成した。標的遺伝子の各々についてアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を表８ＰＣに示す。生じるＰＣＲ反応物を、アガロースゲルにて解析し、ＰＣＲ精製キットにより精製し（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ＮａＣＩＯ４沈澱をおこなった。生成したＴ７フォワードおよびリバース鋳型を、製造者の指示に従って、転写させるために混合し、そして生じたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。標的遺伝子の各々について生じたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８ＰＣに示す。
Ｃ．ファエドン・コクレアリアエ（マスタード・リーフ・ビートル）遺伝子の植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）への組み換え
ＲＮＡ干渉の機構が、ｄｓＲＮＡフラグメントを介して操作するので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記で選択されたように、アンチセンスとセンスの向きでクローン化され、ｉｎｔｒｏｎ−ＣｍＲ−ｉｎｔｒｏｎにより分けられ、それによりＣｍＲはクロラムフェニコール耐性マーカーとなり、ｄｒＲＮＡヘアピン構築物を形成する。
これらのヘアピン構築物を、ａｔｔＬを含む−エントリークローン（実施例４Ａ参照）およびａｔｔＲを含む−目的ベクター（＝ｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2））との間でＬＲ組み換え反応を用いて生成した。植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）を、Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔを用いてＶＩＢ／Ｐｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙから得た。ＬＲ組み換え反応を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標） 2 ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７９１−０２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、ＰＣ００１，ＰＣ０１０，ＰＣ０１４，ＰＣ０１６およびＰＣ０２７遺伝子の各々に対して、プロモーター−ｓｅｎｓｅ−ｉｎｔｒｏｎ−ＣｍＲ−ｉｎｔｒｏｎ−アンチセンスの向きを有するヘアピン構築物を生じ、プロモーターは、植物操作可能な３５Ｓプロモーターである。３５Ｓプロモーターを有するバイナリーベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓへの形質転換に好適である。
制限酵素消化は、異なる標的を含むｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯプラスミドで実行された（実施例４Ｂ参照）：ＰＣ００１については、ＢｓｏＢＩとＰｖｕｌによる二重消化；ＰＣ０１０については、Ｐｖｕ1とＰｖｕ2による二重消化；ＰＣ０１４については、Ｈｉｎｄｉ，Ｐｖｕ1、およびＸｈｏ1による三重消化；ＰＣ０１６については、ＡｐａＬＩによる単一消化；ＰＣ０２７については、Ａｖａ1とＤｒｄ1による二重消化。Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）を用いてａｔｔＬ部位に隣接する目的遺伝子を含むバンドを精製した。精製フラグメントの１５０ｎｇ量と１５０ｎｇ ｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）を、ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ 2酵素とともに添加し、少なくとも１時間、２５℃でインキュベートした。プロテイナーゼＫ溶液処理（１０分、３７℃）の後、全体の組み換え混合物を、Ｔｏｐ １０ケミカリーコンピテント細胞に形質転換した。陽性クローンを、制限酵素消化解析により選択した。ヘアピン構築物の完全な配列は以下の通り：
−ＰＣ００１（ｓｅｎｓｅ−ｉｎｔｒｏｎ−ＣｍＲ−ｉｎｔｒｏｎ−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）は、配列番号５０８に示されている。
−ＰＣ０１０（ｓｅｎｓｅ−ｉｎｔｒｏｎ−ＣｍＲ−ｉｎｔｒｏｎ−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）は、配列番号５０９に示されている。

−ＰＣ０１４（ｓｅｎｓｅ−ｉｎｔｒｏｎ−ＣｍＲ−ｉｎｔｒｏｎ−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）は、配列番号５１０に示されている。

−ＰＣ０１６（ｓｅｎｓｅ−ｉｎｔｒｏｎ−ＣｍＲ−ｉｎｔｒｏｎ−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）は、配列番号５１１に示されている。

−ＰＣ０２７（ｓｅｎｓｅ−ｉｎｔｒｏｎ−ＣｍＲ−ｉｎｔｒｏｎ−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）は、配列番号５１２に示されている。
表９ＰＣは、それぞれのヘアピン構築物についての配列を提供する。
Ｄ．ファエドン・コクレアリアエ幼虫に対する活性について、アブラナ葉円盤状組織を用いて、ｄｓＲＮＡ標的を試験する実験室の試験
下記に提供される実施例は、マスタード・リーフ・ビートル（ＭＬＢ）幼虫が、自身の標的遺伝子に対する経口摂取したｄｓＲＮＡに対して感受性があることを見出した例である。
ＭＬＢ幼虫に対する異なる２本鎖ＲＮＡ試料を試験するために、葉の円盤状組織のアッセイをアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｖａｒｉｅｔｙ ＳＷ Ｏｂａｎ；ｓｏｕｒｃｅ：Ｎｉｃｋ Ｂａｌａａｍ，Ｓｗ Ｓｅｅｄ Ｌｔｄ．，４９ Ｎｏｒｔｈ Ｒｏａｄ，Ａｂｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＣＢ１ ６ＡＳ，ＵＫ）の葉材料を食物源として用いて行った。２５±２℃、および６０±５％相対湿度、１６：８時間の明暗光周期を有する昆虫室において、昆虫培養を維持するために、アブラナの同一の品種が使用された。約直径１．１ｃｍの円盤状組織（または０．９５ｃｍ２）を、好適なサイズの穿孔器を用いて４〜６週齢のアブラナ植物の葉から切り取った。２本鎖ＲＮＡ試料を、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＭｉｌｌｉ−Ｑで、０．１μｇ／μｌに希釈した。処理した葉の円盤状組織を、標的ＰＣ００１，ＰＣ００３，ＰＣ００５，ＰＣ０１０，ＰＣ０１４，ＰＣ０１６，ＰＣ０２７ ｄｓＲＮＡの希釈溶液および、ｇｆｐコントロール ｄｓＲＮＡまたは０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２５μｌ、葉の向軸面に、添加することにより調製した。葉の円盤状組織を、乾燥させて、葉の円盤状組織を完全に乾燥することから防ぐのを助けるｇｅｌｌｉｆｉｅｄ２％寒天の１ｍｌを含む２４ウェルマルチプレートの２４ウェルのそれぞれに別個に置いた。二匹の新生のＭＬＢ幼虫を、プレートの各ウェルにおき、それをその後、マルチウェルプラスチック蓋で覆った。プレート（４８昆虫を含む一つの処理）を、１レプリケートごとに１２昆虫の４レプリケートに分けた（各列）。昆虫と葉の円盤状組織を含むプレートを、２５±２℃、および６０±５％相対湿度、１６：８時間の明暗光周期を有する昆虫室で保持した。昆虫は、新鮮な処理した葉の円盤状組織を含む新しいプレートに移動させた後２日間、葉の円盤状組織が与えられた。
その後、バイオアッセイ開始後４日に、各レプリケートからの昆虫を回収し、未処理の新鮮なアブラナ葉を含むペトリ皿に移動させた。幼虫の致死率および平均重量を、２，４，７，９，１１日に記録した。
インタクトな裸の標的ｄｓＲＮＡ処理されたアブラナ葉を食餌されたファエドン・コクレアリアエ幼虫は、図１（ａ）に示されたような、試験されたすべての標的について幼虫の致死率の有意な増加を生じた。標的ＰＣ０１０に対して試験された２本鎖ＲＮＡは、９日目で１００％の幼虫の致死率を導き、標的ＰＣ０２７に関しては１１日目であった。ｇｆｐコントロール ｄｓＲＮＡ、０．０５％ＴｒｉｔｉｏｎＸ−１００のみ、または未処理の葉のみと比較した場合、他の全ての標的について、有意に高い致死率の値が、１１日目に到達した：（パーセンテージでの平均値±α０．０５を有する信頼区間）ＰＣ００１（９４．４±８．２）；ＰＣ００３（８６．１±４．１）；ＰＣ００５（８３．３±７．８）；ＰＣ０１４（６３．９±２０．６）；ＰＣ０１６（７５．０±１６．８）；ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ（１１．１±８．２）；０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（１９．４±１０．５）；葉のみ（８．３±１０．５）。
幼虫の生存虫は、それらの平均重量に基づいて評価された。試験されたすべての標的について、マスタード・リーフ・ビートル幼虫は、バイオアッセイの４日後、平均重量を有意に減少させた。ｇｆｐコントロール ｄｓＲＮＡまたは０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のみを与えられた昆虫、葉のみ与えられた幼虫に関しても、正常に発生した（図１（ｂ）−ＰＣ）。
Ｅ．ファエドン・コクレアリアエ幼虫に対する活性について、アブラナ葉円盤状組織を用いて、異なる濃度でのｄｓＲＮＡをスクリーニングする実験室での試験
標的ＰＣ０１０またはＰＣ０２７からのｄｓＲＮＡの２５μｌの溶液を、０．１μｇ／μｌから０．１ｎｇ／μｌまで連続して１０倍希釈したものを、上述の実施例４Ｄに記載のように、アブラナ葉の円盤状組織に局所的に添加した。陰性コントロールとしては、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のみを、葉円盤状組織に添加した。処理ごとに、２４マスタード・リーフ・ビートル新生幼虫を、１ウェル毎に２匹の昆虫を用いて、試験した。プレートを２５±２℃，６０±５％相対湿度、１６：８時間明暗光周期の昆虫生育室に保持した。２日目に、幼虫を新鮮なｄｓＲＮＡで処理した葉円盤状組織を含む新しいプレートに移動させた。標的ＰＣ０１０については４日目に、標的ＰＣ０２７については５日目に、各レプリケートから昆虫を、豊富な未処理葉材料を含むペトリディッシュに移動させた。幼虫は、生死について、標的ＰＣ０１０については２，４，７，８，９，１１日目に評価し、ＰＣ０２７については２，５，８，９，１２日目に評価した。
二つの異なるインタクトな裸の標的ｄｓＲＮＡ、ＰＣ０１０とＰＣ０２７を含むアブラナ葉円盤状組織をファエドン・コクレアリアエ幼虫に与えると、図２（ａ）と（ｂ）に示すとおり、１ｎｇ ｄｓＲＮＡ／μｌ溶液という低く減らした濃度でも、高い致死率を生じた。標的ＰＣ０１０について１１日目での、ｄｓＲＮＡの異なる濃度について、パーセンテージでの平均致死率の値±α０．０５を有する信頼区間は、０μｇ／μｌ：８．３±９．４；０．１μｇ／μｌ：１００；０．０１μｇ／μｌ：７９．２±２０．６；０．００１μｇ／μｌ：５８．３±９．４；０．０００１μｇ／μｌ：１２．５±１５．６；ａｎｄ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ＰＣ０２７ ａｔ ｄａｙ １２，０μｇ／μｌ：８．３±９．４；０．１μｇ／μｌ：９５．８±８．２；０．０１μｇ／μｌ：９５．８±８．２；０．００１μｇ／μｌ：８３．３±１３．３；０．０００１μｇ／μｌ：１２．５±８．２であった。
Ｆ．形質転換アラビドプシス・サリアーナ（Arabidopsis thaliana）植物におけるＭ．ペルシカエMyzus persicae（モモアカアブラムシ（green peach aphid））侵入の実験室の試験
形質転換植物の生成
アラビドプシス・サリアーナ植物を、ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ ｍｅｔｈｏｄ（Ｃｌｏｕｇｈ ａｎｄ Ｂｅｎｔ（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ１６：７３５−７４３）を用いて形質転換した。植物の気生部分を、５％ｓｕｃｒｏｓｅを含む溶液中で数秒間インキュベートし、一晩培養したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ Ｃ５８Ｃ１ Ｒｉｆ細胞と、０．０３％の界面活性剤Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７に再懸濁した。接種後、植物を、湿度を保つために、透明なプラスチックで１６時間覆った。形質転換効率を上昇させるために、この手順を、１週間後に繰り返した。水やりを、種が成熟したら停止し、乾燥した種を回収し、２日間冷処理した。滅菌後、種子を形質転換植物の選択のために、カナマイシン含有生育培地に播いた。
選択した植物を、最適なＴ２種子生産のために土壌に移した。
バイオアッセイ
形質転換アラビドプシス・サリアーナ植物を、分離Ｔ２種子を、適切な選択培地に発芽させることにより選択した。これら遺伝子組み換え植物の根が、うまく定着したら、その後、それらを新鮮な人工生育培地もしくは土壌に移し、最適な条件で生育させた。遺伝子組み換え植物全体を、モモアカアブラムシ（Ｍ．ペルシカエ）の幼虫に対して試験すると、（１）食べる幼虫によって植物損害に対する有意な抵抗性、（２）幼虫の致死率の増大、および／または（３）生存する幼虫の重量の減少（または他の異常な昆虫の発生）を示した。
エピラクナ・バリヴェティス（Epilachna varivetis）（インゲンテントウ（Mexican been beetle））
Ａ．エピラクナ・バリヴェティス部分遺伝子配列のクローニング
高品質、インタクトなＲＮＡを、エピラクナ・バリヴェティス（インゲンテントウ；ｓｏｕｒｃｅ：Ｔｈｏｍａｓ Ｄｏｒｓｅｙ，Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｎｇ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉｓｔ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｅｓｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｐｈｉｌｌｉｐ Ａｌａｍｐｉ Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ Ｉｎｓｅｃｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＰＯ Ｂｏｘ ３３０，Ｔｒｅｎｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ０８６２５−０３３０，ＵＳＡ）の４つの異なる幼虫段階から、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って単離した。ＲＮＡ調製物中に存在するゲノムＤＮＡを、製造者の指示に従って（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）．、ＤＮａｓａ処理により除去した。ｃＤＮＡを、市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標） 3 ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って、生成した。
ＥＶ００５，ＥＶ００９，ＥＶ０１０，ＥＶ０１５およびＥＶ０１６遺伝子の部分を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、一連のＰＣＲ反応を変性プライマーにより、ＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造者の指示に従って、行った。
遺伝子のそれぞれの増幅について用いた変性プライマーの配列を、表２ＥＶに示す。それは、プライマーの配列を含むエピラクナ・バリヴェティス標的遺伝子と、得られたｃＤＮＡ配列を示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた：ＥＶ００５とＥＶ００９について，９５℃で１０分、続いて、９５℃で３０秒、５０℃で１分、７２℃で１分３０秒を４０サイクル、続いて、７２℃で７分；ＥＶ０１４について、９５℃で１０分、続いて、９５℃で３０秒、５３℃で１分、７２℃で１分を４０サイクル、続いて、７２℃で７分；ＥＶ０１０とＥＶ０１６について、９５℃で１０分、続いて、９５℃で３０秒、５４℃で１分、７２℃で１分４０秒を４０サイクル、続いて、７２℃で７分。生じたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ４５３０−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），にクローン化し、配列決定した。生じたＰＣＲ産物の配列を、表２ＥＶに示すように、それぞれ配列番号により表し、部分配列として言及している。対応する部分アミノ酸配列を、表３ＥＶに示すようにそれぞれの配列番号により表し、そこでは、読み枠の開始が、カッコで示されている。
Ｂ．エピラクナ・バリヴェティス遺伝子のｄｓＲＮＡ産物
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７ Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）．を用いてミリグラム量で合成した。最初の二つの別個のシングル５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を、二つの別個のＰＣＲ反応において生成し、それぞれの反応物は、標的配列をＴ７プロモーターに対して異なる向きで含む。
標的遺伝子のそれぞれについて、センスＴ７鋳型を、特異的Ｔ７フォワード、および特異的リバースプライマーを用いて生成した。標的遺伝子のそれぞれについてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８ＥＶに示す。ＰＣＲ反応における条件を以下に示す：９５℃で１分、続いて、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分を２０サイクル、続いて、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分を１５サイクル、続いて、７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、上記と同じ条件のＰＣＲ反応中で、特異的フォワードおよび特異的リバースプライマーを用いて、生成した。標的遺伝子のそれぞれに対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８ＥＶに示す。
生じたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣＩＯ４沈澱した。生成したＴ７フォワードおよびリバース鋳型を、製造者の指示に従って、転写させるために混合し、生じたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。標的遺伝子のそれぞれについて生じたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８ＥＶに示す。
Ｃ．エピラクナ・バリヴェティス遺伝子の植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）への組み換え
ＲＮＡ干渉の機構が、ｄｓＲＮＡフラグメントを介して操作するので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記で選択されたように、アンチセンスとセンスの向きでクローン化され、ｉｎｔｒｏｎ−ＣｍＲ−ｉｎｔｒｏｎにより分けられ、それによりＣｍＲはクロラムフェニコール耐性マーカーとなり、ｄｒＲＮＡヘアピン構築物を形成する。これらのヘアピン構築物を、ａｔｔＬを含む−エントリークローン（実施例５Ａ参照）およびａｔｔＲを含む−目的ベクター（＝ｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2））との間でＬＲ組み換え反応を用いて生成した。植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）を、Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔを用いてＶＩＢ／Ｐｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙから得た。ＬＲ組み換え反応を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）2 ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７９１−０２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、標的遺伝子の各々に対して、プロモーター−ｓｅｎｓｅ−ｉｎｔｒｏｎ−ＣｍＲ−ｉｎｔｒｏｎ−アンチセンスの向きを有するヘアピン構築物を生じ、プロモーターは、植物操作可能な３５Ｓプロモーターである。３５Ｓプロモーターを有するバイナリーベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓへの形質転換に好適である。
制限酵素消化は、異なる標的を含むｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯプラスミドで実行された（実施例Ｂ）。Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）を用いてａｔｔＬ部位に隣接する目的遺伝子を含むバンドを精製した。精製フラグメントの１５０ｎｇ量と１５０ｎｇ ｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）を、ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ 2酵素とともに添加し、少なくとも１時間、２５℃でインキュベートした。プロテイナーゼＫ溶液処理（３７℃で１０分）の後、全体の組み換え混合物を、Ｔｏｐ １０ケミカリーコンピテント細胞に形質転換した。陽性クローンを、制限酵素消化解析により選択した。
Ｄ．エピラクナ・バリヴェティス幼虫に対する活性について、マメ葉円盤状組織を用いて、ｄｓＲＮＡ標的を試験する実験室の試験
下記に提供される実施例は、インゲンテントウ（ＭＢＢ）幼虫が、自身の標的遺伝子に対する経口摂取したｄｓＲＮＡに対して感受性があることを見出した例である。
ＭＢＢ幼虫に対する異なる２本鎖ＲＮＡ試料を試験するために、葉の円盤状組織のアッセイをサヤインゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒｉｅｔｙ Ｍｏｎｔａｎｏ；ｓｏｕｒｃｅ：Ａｖｅｖｅ ＮＶ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）の葉材料を食物源として用いて行った。２５±２℃、および６０±５％相対湿度、１６：８時間の明暗光周期を有する昆虫室において、昆虫培養を維持するために、豆の同一の品種が使用された。約直径１．１ｃｍの円盤状組織（または０．９５ｃｍ２）を、好適なサイズの穿孔器を用いて１〜２週齢までのマメ植物の葉から切り取った。２本鎖ＲＮＡ試料を、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＭｉｌｌｉ−Ｑで、１μｇ／μｌに希釈した。処理した葉の円盤状組織を、標的Ｅｖ００５，Ｅｖ０１０，ＥｖＯ１５，ＥｖＯ１６ｄｓＲＮＡの希釈溶液および、ｇｆｐコントロール ｄｓＲＮＡまたは０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２５μｌ、葉の向軸面に、添加することにより調製した。葉の円盤状組織を、乾燥させて、葉の円盤状組織を完全に乾燥することから防ぐのを助けるｇｅｌｌｉｆｉｅｄ２％寒天の１ｍｌを含む２４ウェルマルチプレートの２４ウェルのそれぞれに別個に置いた。一匹の新生のＭＢＢ幼虫を、プレートの各ウェルにおき、それをその後、マルチウェルプラスチック蓋で覆った。プレートを、１レプリケートごとに８昆虫の３レプリケートに分けた（各列）。昆虫と葉の円盤状組織を含むプレートを、２５±２℃、および６０±５％相対湿度、１６：８時間の明暗光周期を有する昆虫室で保持した。昆虫は、新鮮な処理した葉の円盤状組織を含む新しいプレートに移動させた後２日間、葉の円盤状組織が与えられた。
その後、バイオアッセイ開始後４日に、昆虫を１０日目まで、毎日未処理の新鮮なマメ葉を含むペトリ皿に移動させた。未処理の新鮮なアブラナの葉を含むペトリ皿に移動させた。昆虫の致死率を、２日目と、その後一日おきに記録した。
表面に添加されたインタクトな裸の標的ｄｓＲＮＡを含むサヤインゲン葉をＥ．バリヴェティス幼虫に与えると、図１に示すとおり、幼虫致死率の有意な増加を生じた。標的Ｅｖ０１０，ＥｖＯ１５，およびＥｖＯ１６の試験した２本鎖ＲＮＡは、８日後１００％の致死率を導き、一方、標的Ｅｖ００５のｄｓＲＮＡは、１０日経過すると、すべての幼虫を殺した。ｇｆｐコントロールｄｓＲＮＡまたは界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のみを含む処理した葉円盤状組織で飼育された昆虫の大部分は、バイオアッセイの間中、維持された（図１−ＥＶ）。
Ｅ．エピラクナ・バリヴェティス成虫に対する活性について、マメ葉円盤状組織を用いて、ｄｓＲＮＡ標的を試験する実験室の試験
下記に提供される実施例は、Ｍｅｘｉｃａｎ ｂｅａｎ ｂｅｅｔｌｅ（ＭＢＢ）成虫が、自身の標的遺伝子に対する経口摂取したｄｓＲＮＡに対して感受性があることを見出した例である。
インゲンテントウ幼虫に関して設定された同様のバイオアッセイにおいて、成虫ＭＢＢを、マメ葉円盤状組織に局所的に添加された２本鎖ＲＮＡに対して試験した。各標的Ｅｖ０１０，ＥｖＯ１５およびＥｖＯ１６からの試験ｄｓＲＮＡを、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で、最終濃度０．１μｇ／μｌまで希釈した。マメ葉円盤状組織を、それぞれの円盤状組織に試験溶液３０μｌの局所的添加により処理した。円盤状組織を、２４穴マルチウェルプレートのそれぞれのウェル中のｇｅｌｌｉｆｉｅｄ２％寒天のスライス上にそれぞれを置く前に完全に乾燥させた。３日齢の成虫を、培養ケージから回収し、バイオアッセイプレートの各ウェルに一つの成虫を置く前に７〜８時間何も与えなかった（従って、処理ごとに２４成虫）。プレートを、昆虫飼育室に起き（ＭＢＢ幼虫についてのと同じ条件下に２４時間）、その後成虫を、新鮮なｄｓＲＮＡ処理葉円盤状組織を含む新しいプレートに移動させた。さらに２４時間後、それぞれの処理からの成虫を回収し、そして二つの鉢植えの未処理の３週齢のマメ植物を含む寸法３０ｃｍ ｘ １５ｃｍ ｘ １０ｃｍのプラスチック箱に置いた。昆虫の致死率を、４日から１１日まで評価した。
エピラクナ・バリヴェティスの成虫に摂取された全ての３つの標的ｄｓＲＮＡ（Ｅｖ０１０，ＥｖＯ１５およびＥｖＯ１６）は、図２ＥＶ（ａ）にて示すように、４日から（バイオアッセイ開始後４日）の致死率において有意な増加を生じた。５日から、食餌パターンに大きな変化が、標的ｄｓＲＮＡ処理マメ葉円盤状組織を最初に食べた昆虫とｇｆｐコントロール ｄｓＲＮＡまたは界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む円盤状組織を与えた昆虫との間で見られた。未処理のマメ植物のＭＢＢ成虫による、葉状の障害の減少は、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡおよび界面活性剤のみのコントロールと比較した場合、すべての３つの標的について明らかにみることができる。さまざまなレベルにもかかわらず；標的１５を食べた昆虫は、マメ葉に対して少なくとも障害を引き起こした（図２ＥＶ（ｂ））。
アントノムス・グランディス (Anthonomus grandis)（ワタミハナゾウムシ）
Ａ．アントノムス・グランディス部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ （Ｃａｔ．Ｎｏ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示にどおりに使用し、3齢幼虫のアントノムス・グランディス（ワタミハナゾウムシ；供給源：Ｄｒ．Ｇａｒｙ Ｂｅｎｚｏｎ，Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，７ Ｋｕｈｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｃａｒｌｉｓｌｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １７０１３，ＵＳＡ）から、高品質で、インタクトなＲＮＡを単離した。製造者の指示に従ったＤＮａｓｅ処理（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ＲＮＡ調製物中に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）3 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従い使用し、ｃＤＮＡを生成した。
ＡＧ００１、ＡＧ００５、ＡＧ０１０、ＡＧ０１４およびＡＧ０１６遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、製造者の指示に従いＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、変性プライマーでの一連のＰＣＲ反応を行った。
それぞれの遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表２−ＡＧに示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた：ＡＧ００１、ＡＧ００５およびＡＧ０１６に関しては、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５０℃で１分、そして７２℃で１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分；ＡＧ０１０に関しては、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で２分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分；ＡＧ０１４関しては、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて７２℃で７分を行った。得られたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を決定した。得られたＰＣＲ産物の配列を、それぞれ配列番号により表２−ＡＧに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表３−ＡＧに表す。
Ｂ．アントノムス・グランディス（ワタミハナゾウムシ）遺伝子のｄｓＲＮＡ産物
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７ Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応において標的配列はＴ７プロモーターに対して別な向きで含んでいる。
それぞれの標的遺伝子について、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。それぞれの標的遺伝子についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＡＧに示す。タッチダウンＰＣＲを以下の通り行った：９５℃で１分、続いて９５℃で３０秒を２０サイクル、１サイクルごとに０．５℃温度減少させて６０℃で３０秒、７２℃で１分、続いて９５℃で３０秒を１５サイクル、５０℃で３０秒、そして７２℃で１分、続いて７２℃で１０分を行った。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件を用いて生成した。標的遺伝子のそれぞれに対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＡＧに示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。それぞれの標的遺伝子について得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＡＧに示す。
Ｃ．植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）へのアントノムス・グランディス遺伝子の組換え
ＲＮＡ干渉のメカニズムがｄｓＲＮＡフラグメントを介した操作であるので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記選択のとおり、アンチセンスとセンスの向きでクローニングされ、イントロン−ＣｍＲ−イントロンによって分離されており、ＣｍＲはクロラムフェニコール抵抗性マーカーであって、ｄｓＲＮＡヘアピン構築物を形成する。これらのヘアピン構築物を、エントリークローン（実施例６Ａ参照）を含むａｔｔＬと、目的ベクター（＝ｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2））含有ａｔｔＲとの間でＬＲ組換え反応を用いて作製した。植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、ＶＩＢ／Ｐｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ａ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔから取得した。ＬＲ組換え反応を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）2 ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７９１−０２０， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、それぞれの標的遺伝子についてヘアピン構築物を生じ、プロモーター−センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンスの方向性を有し、プロモーターは、植物で機能的な（ｏｐｅｒａｂｌｅ）３５Ｓプロモーターである。３５Ｓプロモーターを用いたバイナリーベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、アグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）への形質転換に好適である。
制限酵素処理を、異なる標的を含むｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯプラスミドで行った（実施例６Ｂ参照）。Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ． ２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）を用いてａｔｔＬ部位に隣接する目的の遺伝子を含むバンドを精製した。精製したフラグメントの１５０ｎｇの量と、１５０ｎｇのｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）2 ｅｎｚｙｍｅとともに添加し、少なくとも１時間２５℃でインキュベートした。プロテイナーゼＫ溶液処理（３７℃で１０分）の後、全組換え混合物を、Ｔｏｐ１０ケミカリーコンピテントセルに形質転換した。陽性クローンを、制限酵素処理解析により選択した。
Ｄ．アントノムス・グランディスに対してｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験する実験室の試験
植物ベースのバイオアッセイ
植物にＣＢＷを与える前に、化学的に誘導したｄｓＲＮＡを発現する細菌を懸濁液により植物全体に噴射した。それらを、植物生育室で生育させた。鉢の土中にしっかりと置いた瓶の首で植物を覆うように、さかさまに５００ｍｌプラスチック瓶を置くことにより、閉じ込め、底を切断して開けて、吸気できるように細かいナイロンメッシュで覆い、内側の結露を減少させて、昆虫が逃げるのを防いだ。ＣＢＷを、かごの中のそれぞれ処理した植物においた。植物を、ｐＧＸＸＸ０ＸＸプラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを持つ大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁液により処理した。異なる量の細菌が、植物に適用されている：例えば、６６、２２および７ユニット、ここで１ユニットは、６００ｎｍ波長での光学密度値で、細菌の懸濁液の１ｍｌ中に１０９細菌細胞として定義する。それぞれの場合に、噴霧器の補助により、植物に１〜１０ｍｌの全量が噴霧される。１つの植物はこの試験の各処理に使用された。生存数を計数し、各生存虫の重量を記録した。
ｐＧＮ２９コントロールと比較した場合において、ｐＧＸＸＸ０ＸＸ由来の標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁液を植物に噴霧することは、昆虫の致死率の増大を引き起こす。これらの実験は、昆虫遺伝子標的配列に対応する２本鎖ＲＮＡが、野生型かＲＮａｓｅ3欠損細菌発現システムのいずれかで産生され、昆虫致死率の増大の観点から昆虫に対して毒性であること、生存幼虫に対しては成長／発達を遅らせることを示す。また、標的昆虫遺伝子に対応する２本鎖ＲＮＡを発現する細菌からなる製剤のスプレーを用いることにより、昆虫の損害から植物／穀物の効果的な保護を与えることが実証されることが、これらの実験から明らかである。
トリボリウム・カスタニュウム(Tribolium castaneum)（コクヌストモドキ）
Ａ．トリボリウム・カスタニュウム部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示にどおりに使用し、異なる全ての昆虫ステージのトリボリウム・カスタニュウム（コクヌストモドキ；供給源：Ｄｒ．Ｌａｒａ Ｓｅｎｉｏｒ，Ｉｎｓｅｃｔ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．，Ｃａｐｉｔａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ，Ｗｅｎｔｌｏｏｇ，Ｃａｒｄｉｆｆ，ＣＦ３ ２ＰＸ，Ｗａｌｅｓ，ＵＫ）から、高品質で、インタクトなＲＮＡを単離した。製造者の指示に従ったＤＮａｓｅ処理（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ＲＮＡ調製物中に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）3 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従い使用し、ｃＤＮＡを生成した。
ＴＣ００１、ＴＣ００２、ＴＣ０１０、ＴＣ０１４およびＴＣ０１５遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、製造者の指示に従い、ＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、変性プライマーでの一連のＰＣＲ反応を行った。
それぞれの遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表２−ＴＣに示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた：９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５０℃で１分、そして７２℃で１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分；ＡＧ０１０に関しては、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で２分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分（ＴＣ００１、ＴＣ０１４、ＴＣ０１５）；９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分を行った（ＴＣ０１０）；９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５３℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて７２℃で７分を行った（ＴＣ００２）。得られたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を決定した。得られたＰＣＲ産物の配列を、それぞれ配列番号により表２−ＴＣに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表３−ＴＣに表す。
Ｂ．トリボリウム・カスタニュウム遺伝子のｄｓＲＮＡ産物
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７ Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応物は標的配列をＴ７プロモーターに対して異なる向きで含んでいる。
それぞれの標的遺伝子について、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。それぞれの標的遺伝子についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＴＣに示す。ＰＣＲ反応における条件は以下のとおりである：９５℃で１分、続いて９５℃で３０秒、６０℃で３０秒（−０．５°Ｃ／ｃｙｃｌｅ）、そして７２℃で１分を２０サイクル、続いて９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、そして７２℃で１分を１５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件を用いて生成した。標的遺伝子のそれぞれに対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８ＴＣに示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。それぞれの標的遺伝子について得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＴＣに示す。
Ｃ．植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）へのトリボリウム・カスタニュウム遺伝子の組換え
ＲＮＡ干渉のメカニズムがｄｓＲＮＡフラグメントを介した操作であるので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記選択のとおり、アンチセンスとセンスの向きでクローニングされ、イントロン−ＣｍＲ−イントロンによって分離されており、ＣｍＲはクロラムフェニコール抵抗性マーカーであって、ｄｓＲＮＡヘアピン構築物を形成する。これらのヘアピン構築物を、ａｔｔＬを含む−エントリークローン（実施例７Ａ参照）と、ａｔｔＲを含む−目的ベクター（＝ｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2））との間でＬＲ組換え反応を用いて作製した。植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、ＶＩＢ／Ｐｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ａ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔから取得した。ＬＲ組換え反応を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）2 ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７９１−０２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、それぞれの標的遺伝子についてヘアピン構築物を生じ、プロモーター−センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンスの方向性を有し、プロモーターは、植物で機能的な（ｏｐｅｒａｂｌｅ）３５Ｓプロモーターである。３５Ｓプロモーターを用いたバイナリーベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、アグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）への形質転換に好適である。
制限酵素処理を、異なる標的を含むｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯプラスミドで行った（実施例７Ｂ参照）。Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ． ２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）を用いてａｔｔＬ部位に隣接する目的の遺伝子を含むバンドを精製した。精製したフラグメントの１５０ｎｇの量と、１５０ｎｇのｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）2 ｅｎｚｙｍｅとともに添加し、少なくとも２５℃で１時間インキュベートした。プロテイナーゼＫ溶液処理（３７℃で１０分）の後、全組換え混合物を、Ｔｏｐ１０ケミカリーコンピテントセルに形質転換した。陽性クローンを、制限酵素処理解析により選択した。
Ｄ．トリボリウム・カスタニュウム幼虫に対する活性について、人工食餌を用いたｄｓ ＲＮＡ標的を試験する実験室の試験
以下に与える実施例は、コクヌストモドキ（ｒｅｄｆｌｏｕｒ ｂｅｅｔｌｅ（ＲＦＢ））幼虫が、自身の標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの経口摂取に感受性があることを見いだした例示である。
コクヌストモドキ（トリボリウム・カスタニュウム）をＩｎｓｅｃｔ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．で維持した（供給源：Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｓｉｌｗｏｏｄ Ｐａｒｋ， Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）。昆虫を、ｃｏｍｐａｎｙ ＳＯＰ／２５１／０１により飼育した。簡単にいうと、甲虫は、プラスチック瓶もしくはタンクに収容した。これらはふたがなく、換気が可能である。網が先端部を覆うように備えられ、逃げるのを防ぐための弾性バンドで固定している。幼虫飼育培地（小麦粉）を、容器の中に置き、昆虫はそこで繁殖することができる。保存された甲虫群は、１６：８時間の明暗光周期、２５±３℃で制御された温度の部屋で維持した。
標的ＴＣ０１４（配列番号７９９に対応する配列を有する）由来の２本鎖ＲＮＡは、小麦粉およびミルク粉末の混合物（全粒粉：牛乳粉末の比率４：１）に組み込まれ、一晩乾燥させた。それぞれのレプリケートを、個別に調製した：１０μｇ／μｌのｄｓＲＮＡの溶液１００μｌ（１ｍｇ ｄｓＲＮＡ）を、０．１ｇ小麦粉／牛乳混合物に添加した。乾燥した混合物を、挽いて細かい粉末にした。昆虫を、二枚のろ紙を敷いたペトリ皿（直径５５ｍｍ）内で維持した。処理した餌を、二枚のろ紙の間においた。１０匹の一齢幼虫、雌雄混合幼虫は、各々の皿（レプリケート）においた。それぞれの処理を４つのレプリケートについて行った。コントロールはＭｉｌｌｉ−Ｑとした。評価（生存数）を定期的に行った。試験中、２５〜３３℃、２０〜２５％の相対湿度、１２：１２時間の明暗光周期の条件とした。
標的ＴＣ０１４ｄｓＲＮＡにより処理された人工食餌による長期のトリボリウム・カスタニュウムの幼虫の生存は、図１−ＴＣに示すように、コントロールのみを与えたのに比較すると、有意に減少した。
ミズス・ペルシカエ（Myzus persicae）（モモアカアブラムシ）
Ａ．ミズス・ペルシカエ部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｃａｔ．Ｎｏ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用し、ミズス・ペルシカエ（モモアカアブラムシ）； 供給源：Ｄｒ．Ｒａｃｈｅｌ Ｄｏｗｎ，Ｉｎｓｅｃｔ ＆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ， Ｃｅｎｔｒａｌ ＳｃｉｅｎｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｓａｎｄ Ｈｕｔｔｏｎ，Ｙｏｒｋ，ＹＯ４１ １ ＬＺ，ＵＫ）の若虫から、高品質で、インタクトなＲＮＡを単離した。製造者の指示に従って、ＤＮａｓｅ処理（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ＲＮＡ調製物中に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）3 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従い使用し、ｃＤＮＡを生成した。
ＭＰ００１、ＭＰ００２、ＭＰ０１０、ＭＰ０１６およびＭＰ０２７遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、製造者の指示に従いＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、変性プライマーでの一連のＰＣＲ反応を行った。
それぞれの遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表２−ＭＰに示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた：ＭＰ００１、ＭＰ００２およびＭＰ０１６に関しては、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５０℃で１分、そして７２℃で１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分；ＭＰ０２７に関しては、タッチダウンプログラムを使用した：９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、１サイクルごとに１℃温度減少して６０℃で４０秒、そして７２℃で１分１０秒を４０サイクル、続いて９５℃で３０秒、５０℃で４０秒、そして７２℃で１分１０秒を３０サイクル、続いて７２℃で７分；ＭＰ０１０に関しては、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で３分を４０サイクル、続いて７２℃で７分を行った。得られたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を決定した。得られたＰＣＲ産物の配列を、それぞれ配列番号により表２−ＭＰに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表３−ＭＰに表す。
Ｂ．ミズス・ペルシカエ遺伝子のｄｓＲＮＡ産物
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７ Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応物は標的配列をＴ７プロモーターに対して異なる向きで含んでいる。
それぞれの標的遺伝子について、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。それぞれの標的遺伝子についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＭＰに示す。タッチダウンＰＣＲを以下の通り行った：９５℃で１分、続いて９５℃で３０秒、１サイクルごとに０．５℃温度減少させて、５５℃で３０秒（ＭＰ００１、ＭＰ００２、ＭＰ０１６、ＭＰ０２７およびｇｆｐについて）または５０℃で３０秒（ＭＰ０１０について）、そして７２℃で１分を２０サイクル、続いて９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、そして７２℃で１分を１５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件を用いて生成した。標的遺伝子のそれぞれに対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＭＰに示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。それぞれの標的遺伝子について得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＭＰに示す。
Ｃ．植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）へのミズス・ペルシカエ遺伝子の組換え
ＲＮＡ干渉のメカニズムがｄｓＲＮＡフラグメントを介した操作であるので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記選択のとおり、アンチセンスとセンスの向きでクローニングされ、イントロン−ＣｍＲ−イントロンによって分離されており、ＣｍＲはクロラムフェニコール抵抗性マーカーであって、ｄｓＲＮＡヘアピン構築物を形成する。これらのヘアピン構築物を、ａｔｔＬを含む−エントリークローン（実施例６Ａ参照）と、ａｔｔＲを含む−目的ベクター（＝ｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2））との間でＬＲ組換え反応を用いて作製した。植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、ＶＩＢ／Ｐｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ａ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔから取得した。ＬＲ組換え反応を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）2 ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７９１−０２０， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、ＭＰ００１，ＭＰ００２、ＭＰ０１０、ＭＰ０１６およびＭＰ０２６のそれぞれの標的遺伝子についてヘアピン構築物を生じ、プロモーター−センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンスの方向性を有し、プロモーターは、植物で機能的な（ｏｐｅｒａｂｌｅ）３５Ｓプロモーターである。３５Ｓプロモーターを用いたバイナリーベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、アグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）への形質転換に好適である。
制限酵素Ａｌｗ４４Ｉ処理を、ｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏにクローニングされた全ての標的に対して行った（実施例８Ｂ）。Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ａｔｔＬ部位に隣接する目的遺伝子を含むバンドを精製した。精製したフラグメントの１５０ｎｇの量と、１５０ｎｇｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）2 ｅｎｚｙｍｅとともに添加し、少なくとも１時間２５℃でインキュベートした。プロテイナーゼＫ溶液処理（３７℃で１０分）の後、全組換え混合物を、Ｔｏｐ１０ケミカリーコンピテントセルに形質転換した。陽性クローンを、制限酵素処理解析により選択した。
ヘアピン構造の完全配列：
− ＭＰ００１（センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンス）配列番号１０６６に示されている；
− ＭＰ００２（センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンス）配列番号１０６７に示されている；
− ＭＰ０１０（センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンス）配列番号１０６８に示されている；
− ＭＰ０１６（センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンス）配列番号１０６９に示されている；
− ＭＰ０２７（センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンス）配列番号１０７０に示されている．
表９−ＭＰは、それぞれのヘアピン構築物の完全な配列を提供する。
Ｄ．ミズス・ペルシカエに対する活性について、液体人工食餌を用いたｄｓＲＮＡ標的を試験する実験室の試験
モモアカアブラムシ（ミズス・ペルシカエ）に対する液体人工食餌は、Ｆｅｂｖａｙ ｅｔ ａｌ． （１９８８）［Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｂａｌａｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｄｉｅｔ ｆｏｒａ ｂｉｏｔｙｐｅ ｏｆ Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ ｐｉｓｕｍ（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ：Ａｐｈｉｄｉｄａｅ）．Ｃａｎ．Ｊ．Ｚｏｏｌ．６６：２４４９−２４５３］に記載のソラマメヒゲナガアブラムシ（アシルソシフォン ピスム（Acyrthosiphon pisum））に適した食餌に多少の変更を加えて作製した。食餌のアミノ酸成分を、以下の通り調製した：アラニン１７８．７１、ベータアラニン６．２２、アルギニン２４４．９、アスパラギン２９８．５５、アスパラギン酸 ８８．２５、システイン２９．５９、グルタミン酸１４９．３６、グルタミン４４５．６１、グリシン１６６．５６、ヒスチジン１３６．０２、イソロイシン１６４．７５、ロイシン２３１．５６、塩酸リジン３５１．０９、メチオニン７２．３５、オルニチン（ＨＣｌ）９．４１、フェニルアラニン２９３、プロリン１２９．３３、セリン１２４．２８、スレオニン１２７．１６、トリプトファン４２．７５、チロシン３８．６３、Ｌ−バリン１９０．８５（ｍｇ／１００ｍｌ）。チロシンは、アミノ酸混合物に添加する前に１Ｍ ＨＣｌを２，３滴落とした後に溶解し、チロシン以外のアミノ酸は、３０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏに溶解した。食餌中のビタミン混合物の成分を、以下の通り５×濃縮ストックとして調製した：アミノ安息香酸１００、アスコルビン酸１０００、ビオチン１、パントテン酸カルシウム５０、塩化コリン５００、葉酸１０、ミオイノシトール４２０、ニコチン酸１００、塩酸ピリドキシン２５、リボフラビン５、チアミン塩酸塩２５（ｍｇ／Ｌ）。リボフラビンは、５０℃で１ｍｌのＨ２Ｏ中に溶解した後、ビタミン混合物ストックに添加した。ビタミン混合物を、一定分量２０ｍｌに分注し、−２０℃で貯蔵した。ビタミン混合物の一定分量１つを、アミノ酸溶液に添加した。スクロースとＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを、それぞれ２０ｇおよび２４２ｍｇの量で混合物に添加した。微量金属ストック溶液を以下の通り作製した：ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ４．７、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ４４．５、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ６．５、ＮａＣｌ ２５．４、ＺｎＣｌ２ ８．３（ｍｇ／１００ｍｌ）。微量金属溶液１０ｍｌと、ＫＨ２ＰＯ４ ２５０ｍｇを、食餌に添加し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を加え、最終液体食餌容量が１００ｍｌになるようにした。食餌のｐＨを、１Ｍ ＫＯＨ溶液で７に調整した。溶液試料を、０．２２μｍのｆｉｌｔｅｒ ｄｉｓｃ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してろ過滅菌した。
モモアカアブラムシ（ミズス・ペルシカエ；供給源：Ｄｒ．Ｒａｃｈｅｌ Ｄｏｗｎ， Ｉｎｓｅｃｔ＆Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｎｄ Ｈｕｔｔｏｎ，Ｙｏｒｋ，ＹＯ４１ １ＬＺ，ＵＫ）を、第４〜６週齢のアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｖａｒｉｅｔｙ ＳＷ Ｏｂａｎ；供給源：Ｎｉｃｋ Ｂａｌａａｍ，Ｓｗ Ｓｅｅｄ Ｌｔｄ．，４９Ｎｏｒｔｈ Ｒｏａｄ，Ａｂｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＣＢ１ ６ＡＳ，ＵＫ）上で、７０μｍメッシュを含むアルミニウムの枠のケージ中において、２３±２℃および６０±５％の相対湿度、１６：８時間の明暗光周期の環境条件に制御されている部屋で飼育した。
バイオアッセイの開始の１日前に、飼育ケージから回収した成虫を、ペトリ皿中の摘みたて新鮮なアブラナ葉の上におき、昆虫室で一晩放置した。次の日、一齢若虫を選択して、餌室に移動させた。餌室は、薄く伸ばしたパラフィルムＭの単一層でおおわれた小さなペトリ皿（直径３ｃｍ）の上に５０μｌの餌を添加しており、１０匹の一齢幼虫を含む。餌室は、パラフィルムの第二の層で密閉され、成虫飼育と同じ条件下で飼育した。ｄｓＲＮＡの餌は、一日おきに新しいものに交換し、昆虫の生存が８日目、すなわちバイオアッセイ開始後８日目に評価を行った。処理ごとに、５つのバイオアッセイ餌室（レプリケート）を、同時に設定した。最終濃度が２μｇ／μｌになるように、試験し、コントロール（ｇｆｐ）のｄｓＲＮＡ溶液を餌に組み入れた。餌室は、２３±２℃、６０±５％相対湿度、１６：８時間の明暗光周期で維持した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ４により測定し、平均が標的２７（ＭＰ０２７）と、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡとの間で有意に異なるか否かを明確にするために、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験で決定した。
バイオアッセイの結果、餌室を用いて標的２７（配列番号１０６１）由来のインタクトな裸のｄｓＲＮＡを添加した液体人工食餌をミズス・ペルシカエの幼虫に与えることにより、図１に示すとおり、致死率の有意な増加をもたらした。標的２７、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ、餌のみで処理した生存虫の平均パーセンテージは、それぞれ、２、３４および８２であった。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験をもちいた標的０２７とｇｆｐ ｄｓＲＮＡとの比較において、片側０．００４のＰ値を生じた。このことは標的０２７の平均が、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡの期待された大きな平均から有意に異なる（Ｐ＜０．０５）ことを示す。標的０２７ ｄｓＲＮＡを組み入れた液体食餌におけるモモアカアブラムシは、餌のみ、もしくはｇｆｐ ｄｓＲＮＡコントロールを与えられたものより、著しく小さかった（データは示さず）。
Ｅ．遺伝子組み換えアラビドプシス・サリアーナ(Arabidopsis thaliana)植物へのミズス・ペルシカエ（モモアカアブラムシ）の侵入の実験室の試験
遺伝子組み換え植物の作製
アラビドプシス・サリアーナ植物に対して、ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ ｍｅｔｈｏｄ （Ｃｌｏｕｇｈ ａｎｄ Ｂｅｎｔ（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １６：７３５−７４３）を用いて形質転換を行った。植物の空中部分を、５％ショ糖、一晩培養物からのアグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８Ｃ１ Ｒｉｆ株の細胞の再懸濁液、０．０３％の界面活性剤Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７を含む溶液で、数秒間インキュベートした。接種後、湿度を保つために、植物を透明なプラスチックで１６時間覆った。形質転換効率を上昇させるために、この手順を１週間後に繰り返した。水やりを、種が成熟したら停止し、乾燥した種を回収し、２日間冷処理した。滅菌後、種子を形質転換植物の選択のために、カナマイシン含有生育培地に播いた。
選択した植物を、最適なＴ２種子生産のために土壌に移した。
バイオアッセイ
形質転換アラビドプシス・サリアーナ植物を、分離Ｔ２種子を適切な選択培地に発芽させることにより、選択した。これら遺伝子組み換え物の根が、うまく定着したら、その後、それらを新鮮な人工生育培地もしくは土壌に移し、最適な条件で生育させた。遺伝子組み換え植物全体を、モモアカアブラムシ（ミズス・ペルシカエ）の若虫に対して試験すると、（１）食べる若虫による植物損害に対する有意な抵抗性、（２）若虫の致死率の増大、および／または（３）生存若虫重量の減少（または他の異常な昆虫の発生）を示した。
ニラパルヴァータ・ルーゲンス（Nilaparvata lugens)（トビイロウンカ）
Ａ．ニラパルヴァータ・ルーゲンス部分配列のクローニング
市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）3 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従う使用方法で、ニラパルヴァータ・ルーゲンス（供給源：Ｄｒ．Ｊ．Ａ．Ｇａｔｅｈｏｕｓｅ，Ｄｅｐｔ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｕｒｈａｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＫ）の高品質全ＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。
ニラパルヴァータ・ルーゲンス ＮＬ００１、ＮＬ００２、ＮＬ００３、ＮＬ００４、ＮＬ００５、ＮＬ００６、ＮＬ００７、ＮＬ００８、ＮＬ００９、ＮＬ０１０、ＮＬ０１１、 ＮＬ０１２、ＮＬ０１３、ＮＬ０１４、ＮＬ０１５、ＮＬ０１６、ＮＬ０１８、ＮＬ０１９、ＮＬ０２１、ＮＬ０２２およびＮＬ０２７遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、ＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者の指示に従って、変性プライマーでの一連のＰＣＲ反応を行った。
遺伝子のそれぞれの増幅について用いた変性プライマーの配列を、表２−ＮＬに示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた： ＮＬ００１について、９５℃で５分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、そして７２℃で１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００２について、９５℃で３分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて、７２℃で１０分；ＮＬ００３について、９５℃で３分、続いて９５℃で３０秒、６１℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて、７２℃で１０分；ＮＬ００４について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５１℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル；ＮＬ００５について、９５℃で１０分、続いて、９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００６について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、そして７２℃で３分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００７について、９５℃で１０分、続いて、９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で１分１５秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００８とＮＬ０１４について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５３℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００９ ＮＬ０１１、ＮＬ０１２、ＮＬ０１９について、９５℃で１０分、続いて、９５℃で３０秒、５５℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０１０について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で２分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０１３について、９５℃で１０分、続いて、９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で１分１０秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０１５、ＮＬ０１６について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で１分４０秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０１８について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で１分３５秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０２１、ＮＬ０２２、ＮＬ０２７について、９５℃で１０分、続いて、９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で１分４５秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分。得られたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を決定した。得られたＰＣＲ産物の配列を、それぞれ配列番号により表２−ＮＬに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表３−ＮＬに表す。
Ｂ．ニラパルヴァータ・ルーゲンス ＮＬ０２３遺伝子のＥＳＴ配列を介した部分配列のクローニング
市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）3 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従う使用方法で、ニラパルヴァータ・ルーゲンス（供給源：Ｄｒ．Ｊ．Ａ．Ｇａｔｅｈｏｕｓｅ，Ｄｅｐｔ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｄｕｒｈａｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＫ）の高品質全ＲＮＡから、ｃＤＮＡを作製した。
公的データベースＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＣＡＨ６５６７９．２のニラパルヴァータ・ルーゲンスのＥＳＴ配列に対応するニラパルヴァータ・ルーゲンスｃＤＮＡから部分ｃＤＮＡ配列であるＮＬ０２３を増幅した。ＮＬ０２３遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、特異的プライマーに基づいたＥＳＴによる一連のＰＣＲ反応をＰｅｒｆｅｃｔＳｈｏｔ（商標）ＥｘＴａｑ（Ｃａｔ Ｎ０．ＲＲ００５Ａ，ＴａｋａｒａＢｉｏ Ｉｎｃ．）を用いて、製造者の指示に従い行った。
ＮＬ０２３に関する特異的なプライマーは、ｏＧＢＫＷ００２およびｏＧＢＫＷ００３（それぞれ配列番号１１５７と配列番号１１５８で示される）であるが、以下の条件による二つの独立したＰＣＲで使用した：９５℃で３分、続いて９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、そして７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で１０分。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定を行った。両方のＰＣＲ産物の配列決定から得られたコンセンサス配列を、ここでは配列番号１１１１で表し、ＮＬ０２３遺伝子の部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、配列番号１１１２に表す。
Ｃ．ニラパルヴァータ・ルーゲンス遺伝子のｄｓＲＮＡ産物
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７ Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応物は標的配列をＴ７プロモーターに対して異なる向きで含んでいる。
それぞれの標的遺伝子について、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。それぞれの標的遺伝子についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＮＬに示す。ＰＣＲ反応における条件は以下のとおりである：ＮＬ００１、ＮＬ００２について、９４℃で４分、続いて９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００３について、９４℃で４分、続いて９４℃で３０秒、６６℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００４、ＮＬ００６、ＮＬ００８、ＮＬ００９、ＮＬ０１０、ＮＬ０１９について、９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００５、ＮＬ０１６について、９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５７℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００７、ＮＬ０１４について、９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５１℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０１１、ＮＬ０１２、ＮＬ０２２について、９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５３℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０１３、ＮＬ０１５、ＮＬ０１８、ＮＬ０２１について、９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして、７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０２３、ＮＬ０２７について、９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５２℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて、７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件を用いて生成した。標的遺伝子のそれぞれに対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＮＬに示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製したが、以下の変更を行った：ＲＮＡペレットを、７０％エタノールで２回洗浄した。それぞれの標的遺伝子について得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＮＬに示す。
緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）コントロールがのっているＴ７プライマーによるＰＣＲ反応に用いた鋳型ＤＮＡは、ｐｌａｓｍｉｄ ｐＰＤ９６．１２（ｔｈｅ Ｆｉｒｅ Ｌａｂ，ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ− ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｆｉｒｅ／）であり、３つの人工イントロンにより分散した野生型ｇｆｐコード配列を含む。２本鎖ＲＮＡを市販のキットＴ７ ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応物は標的配列をＴ７プロモーターに対して異なる向きで含んでいる。ｇｆｐに関して、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードｏＧＡＵ１８３、および特異的リバースプライマーｏＧＡＵ１８２２（それぞれ、配列番号２３６、配列番号２３７）を用いて、以下の条件のＰＣＲ反応で生成した：９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードｏＧＡＵ１８１、および特異的リバースプライマーｏＧＡＵ１８４（それぞれ、配列番号２３６８、配列番号２３９）を用いて、上記と同じ条件のＰＣＲ反応で生成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムおよびイソプロパノールにより精製したが、以下の変更を行った：ＲＮＡペレットを、７０％エタノールで２回洗浄した。得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を配列番号２３５で示す。
Ｄ．ニラパルヴァータ・ルーゲンスに対する活性について液体人工食餌を用いてｄｓＲＮＡをスクリーニングする実験室で試験
トビイロウンカ（ニラパルヴァータ・ルーゲンス）のための液体人工食餌（ＭＭＤ−１）をＫｏｙａｍａ（１９８８）［Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｒｅａｒｉｎｇ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｓ ａｎｄ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒｓ（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ： Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ ａｎｄ Ｄｅｌｔｏｃｅｐｈａｌｉｄａｅ）ｏｎ ａｈｏｌｉｄｉｃ ｄｉｅｔ． Ｊ／ＡＲＱ ２２：２０−２７］に記載のとおり調製したが、食餌成分のスクロースの終濃度に変更を加え、１４．４％（容量分の重量）とし、使用された。食餌成分を別個の濃度で調製した：１０ｘミネラルストック（４℃保存）、２ｘアミノ酸ストック（−２０℃保存）、１０ｘビタミンストック（−２０℃保存）。各ストック成分を、試験ｄｓＲＮＡ溶液（４ｘ濃縮）を用いて希釈するために、バイオアッセイの開始直前に混合して４／３ｘ濃縮とし、ｐＨ６．５に調節し、約５００μｌアリクォートでフィルタ滅菌した。
トビイロウンカ（ニラパルヴァータ・ルーゲンス）を、２〜３か月齢のコメ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ Ｔａｉｃｈｕｎｇ Ｎａｔｉｖｅ １）植物上で、２７±２℃、相対湿度８０％、１６：８時間の明暗光周期の環境条件に制御された部屋で飼育した。餌室は、薄く伸ばしたパラフィルムＭの単一層でおおわれた小さなペトリ皿（直径３ｃｍ）の上に５０μｌの餌を添加しており、１０匹の一齢もしくは二齢幼虫を含む。餌室は、パラフィルムの第二の層で密閉され、直接光にさらされない以外は成虫飼育と同じ条件下で飼育した。ｄｓＲＮＡのある餌は、一日おきに新たにされ、昆虫の生存を毎日評価した。処理ごとに、５つのバイオアッセイ餌室（レプリケート）を、同時に設定した。最終濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように、試験とコントロール（ｇｆｐ）のｄｓＲＮＡ溶液を、餌に組み入れた。餌室は、２７±２℃、相対湿度８０％、１６：８時間の明暗光周期の環境条件で維持した。昆虫の生存データを、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線モデルを用いて解析し、群間の生存を、ｌｏｇｒａｎｋ ｔｅｓｔ（Ｐｒｉｓｍｖｅｒｓｉｏｎ ４．０）を用いて比較した。
インビトロで、インタクトな裸のｄｓＲＮＡを添加した液体人工食餌をニラパルヴァータ・ルーゲンスに餌室を用いて与えた結果、４つの別個のバイオアッセイ（図１（ａ）−（ｄ）−ＮＬ；表１０−ＮＬ（ａ）−（ｄ））（Ｄｕｒｈａｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に示すように幼虫の致死率において有意な増加を生じた。これらの結果は、異なる必須ＢＰＨ遺伝子に対応するｄｓＲＮＡが、トビイロウンカに対して有意な毒性を示したことを示す。
ＢＰＨ生存に対するバイオアッセイにおけるｇｆｐ ｄｓＲＮＡの効果は、餌のみでの生存と、有意な違いはない。
１０ＮＬ（ａ）〜（ｄ）は、以下の標的の２ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）を添加した人工食餌における、ニラパルヴァータ・ルーゲンス生存の概要を示す：表１０−ＮＬ（ａ）：ＮＬ００２、ＮＬ００３、ＮＬ００５、ＮＬ０１０；表１０−ＮＬ（ｂ）：ＮＬ００９、ＮＬ０１６；表１０−ＮＬ（ｃ）：ＮＬ０１４、ＮＬ０１８；表１０−ＮＬ（ｄ）：ＮＬ０１３、ＮＬ０１５、ＮＬ０２１。生存解析欄において、ＲＮＡｉの効果は、以下の通りに示される：＋＝ｇｆｐ ｄｓＲＮＡコントロールと比較して有意に生存が減少（α＜０．０５）；−＝ｇｆｐ ｄｓＲＮＡコントロールと比較して有意な違いがない。生存曲線を、（食餌のみと試験ｄｓＲＮＡを含む人工食餌の間で；ｇｆｐ ｄｓＲＮＡと試験ｄｓＲＮＡ；食餌のみとｇｆｐ ｄｓＲＮＡ）ｌｏｇｒａｎｋ ｔｅｓｔを用いて比較した。
Ｅ．ニラパルヴァータ・ルーゲンスに対する活性に関し、異なる濃度の人工食餌を用いてｄｓＲＮＡをスクリーニングする実験室での試験
異なる濃度の標的ＮＬ００２ ｄｓＲＮＡを添加した液体人工食餌５０μｌ、すなわち１、０．２、０．０８および０．０４ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）を、トビイロウンカ餌室に与えた。ｄｓＲＮＡを添加した食餌は、一日置きに新たにし、昆虫の生存を毎日評価した。処理ごとに５バイオアッセイ餌室（レプリケート）を、同時に設定した。餌室を、２７±２℃、相対湿度８０％、１６：８時間の明暗光周期に維持した。昆虫の生存データを、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線モデルを用いて解析し、群間の生存を、ｌｏｇｒａｎｋ ｔｅｓｔ（Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０）を用いて比較した。
異なる濃度で標的ＮＬ００２のインタクトな裸のｄｓＲＮＡを添加した液体人工食餌を与えた結果、図２−ＮＬおよび表１１−ＮＬに示すように、食餌のみの生存と比較すると、食餌１ｍｌあたり０．０４ｍｇのｄｓＲＮＡと同程度の低い最終濃度において、有意に高いＢＰＨ致死率を生じた。表１１−ＮＬは、ニラパルヴァータ・ルーゲンスの標的ＮＬ００２の１、０．２、０．０８および０．０４ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）を添加した人工食餌における生存の概要を示す。生存解析欄において、ＲＮＡｉの効果は、以下の通りに示される：＋＝ｇｆｐ ｄｓＲＮＡコントロールと比較して有意に生存が減少（α＜０．０５）；−＝ｇｆｐ ｄｓＲＮＡコントロールと比較して有意な違いがない。生存曲線を、ｌｏｇｒａｎｋ ｔｅｓｔを用いて比較した。
キロ・サプレッサリス(Chilo suppressalis)（ニカメイチュウ）
Ａ．ファミリーＰＣＲを介したキロ・サプレッサリス遺伝子の部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｃａｔ．Ｎｏ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用し、キロ・サプレッサリス（ニカメイチュウ）の４つの異なる幼虫段階から高品質で、インタクトなＲＮＡを単離した。製造者の指示に従ったＤＮａｓｅ処理（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ＲＮＡ調製物中に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）3 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従い使用し、ｃＤＮＡを生成した。
ＣＳ００１、ＣＳ００２、ＣＳ００３、ＣＳ００６、ＣＳ００７、ＣＳ００９、ＣＳ０１１、ＣＳ０１３、ＣＳ０１４、ＣＳ０１５、ＣＳ０１６およびＣＳ０１８遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、製造者の指示に従いＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、変性プライマーでの一連のＰＣＲ反応を行った。
それぞれの遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表２−ＣＳに示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた。：９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて７２℃で１０分。得られたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を決定した。得られたＰＣＲ産物の配列を、それぞれ配列番号により表２−ＣＳに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表３−ＣＳに表す。
Ｂ．キロ・サプレッサリス遺伝子のｄｓＲＮＡ生成
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７ Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応物は標的配列をＴ７プロモーターに対して異なる向きで含んでいる。
それぞれの標的遺伝子について、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。それぞれの標的遺伝子についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＣＳに示す。ＰＣＲ反応の条件は、以下のとおりである：９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件を用いて生成した。標的遺伝子のそれぞれに対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＭＰに示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。それぞれの標的遺伝子について得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８ＣＳに示す。
Ｃ．植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）へのキロ・サプレッサリス遺伝子の組換え
ＲＮＡ干渉のメカニズムがｄｓＲＮＡフラグメントを介した操作であるので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記選択のとおり、アンチセンスとセンスの向きでクローニングされ、イントロン−ＣｍＲ−イントロンによって分離されており、ＣｍＲはクロラムフェニコール抵抗性マーカーであって、ｄｓＲＮＡヘアピン構築物を形成する。これらのヘアピン構築物を、ａｔｔＬを含む−エントリークローン（実施例１０Ａ参照）と、ａｔｔＲを含む−目的ベクター（＝ｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2））との間でＬＲ組換え反応を用いて作製した。植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、ＶＩＢ／Ｐｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ａ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔから取得した。ＬＲ組換え反応を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）2 ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７９１−０２０， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、各々の標的遺伝子についてヘアピン構築物を生じ、プロモーター−センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンスの方向性を有し、プロモーターは、植物で機能的な（ｏｐｅｒａｂｌｅ）３５Ｓプロモーターである。３５Ｓプロモーターを用いたバイナリーベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、アグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）への形質転換に好適である。
異なる標的（実施例１０Ｂ参照）を含むｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯプラスミドに対し、制限酵素処理を行った。Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ａｔｔＬ部位に隣接する目的遺伝子を含むバンドを精製した。精製したフラグメントの１５０ｎｇの量と、１５０ｎｇ ｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ2 ｅｎｚｙｍｅとともに添加し、少なくとも１時間２５℃でインキュベートした。プロテイナーゼＫ溶液処理（３７℃で１０分）の後、全組換え混合物を、Ｔｏｐ１０ケミカリーコンピテントセルに形質転換した。陽性クローンを、制限酵素処理解析により選択した。
Ｄ．キロ・サプレッサリス幼虫に対する活性について、人工食餌を用いたｄｓＲＮＡ標的を試験する実験室の試験
ニカメイチュウ（キロ・サプレッサリス）（供給源：Ｓｙｎｇｅｎｔａ，Ｓｔｅｉｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、Ｋａｍａｎｏ ａｎｄ Ｓａｔｏ，１９８５（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｓｅｃｔ Ｒｅａｒｉｎｇ．Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ＆ＩＩ． Ｐ Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ ＲＦＭｏｏｒｅ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５，ｐｐ４４８）の記載に基づいて変更を加えた人工食餌で維持した。簡単にいうと、１リットルの食餌を、以下の通り作製した：２０ｇの寒天を、９８０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に添加し、オートクレーブした；該寒天溶液を、約５５℃まで冷まし、残りの成分を添加し、完全に混合した：トウモロコシ粉（ポレンタ）４０ｇ、セルロース２０ｇ、スクロース３０ｇ、カゼイン３０ｇ、小麦胚芽（あぶった）２０ｇ、ウェッソン（Ｗｅｓｓｏｎ）混合塩８ｇ、Ｖａｎｄｅｒｚａｎｔ混合ビタミン１２ｇ、ソルビン酸１．８ｇ、ｎｉｐａｇｉｎ（メチルパラベン）１．６ｇ、オーレオマイシン０．３ｇ、コレステロール０．４ｇおよびＬ−システイン０．６ｇ。食餌を約４５℃まで冷やし、食餌やりトレーかカップに注いだ。食餌を、水平積層フローキャビンに取り付けて放置した。産み付けられた卵のあるコメの葉部分を、成虫蛾を収容するケージから除去し、餌やりカップもしくはトレーに固体餌にピン止めした。卵は、放置して孵化させ、新生幼虫は、バイオアッセイおよび昆虫飼育の維持が利用可能となった。試験と飼育中、２８±２℃および８０±５％相対湿度、１６：８時間の明暗光周期の環境条件とした。
同じ人工食餌を、バイオアッセイに用いたが、食餌を２４マルチウェルプレートに等量注ぎ、各ウェルが１ｍｌの食餌を有するようにした。食餌がいったん設置されたら、試験製剤を、食餌の表面（２ｃｍ２）に適用し、１μｇ／μｌ標的ｄｓＲＮＡを５０μｌの割合とした。ｄｓＲＮＡ溶液を、放置して乾燥させ、二匹の一齢蛾幼虫を、各ウェルにおいた。７日後、幼虫を新鮮な処理した食餌があるマルチウェルプレート上に移動させた。１４日目（すなわち、バイオアッセイ開始後１４日）に、昆虫の生死の数を記録し、異常性について検討した。全部で２４幼虫が処理あたり試験された。
別のバイオアッセイとして、処理されたコメ葉を、ニカメイチュウの新生幼虫に与えた。インディカ米の亜種Ｔａｉｃｈｕｎｇ ｎａｔｉｖｅ １の小さな葉の部分を、１μｇ／μｌ標的ｄｓＲＮＡ含有０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液に浸漬し、放置して乾燥させ、各部分をゲル化した２％寒天を含む２４マルチウェルプレートのウェルに置いた。２つの新生幼虫を、食餌やりトレーから各ｄｓＲＮＡ処理葉部分（処理あたり、２４幼虫）に移動させた。４および８日後、幼虫を、新鮮な処理コメ葉部分に移動させた。幼虫の生死の数を、４、８、１２日に評価し、いかなる異常も記録した。
プルテッラ キシロステッラ(Plutella xylostella)（コナガ）
Ａ．プルテッラ キシロステッラ遺伝子の部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示にどおりに使用し、異なる全ての幼虫段階のプルテッラ キシロステッラ（コナガ；供給源：Ｄｒ．Ｌａｒａ Ｓｅｎｉｏｒ，Ｉｎｓｅｃｔ ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓＬｔｄ．，Ｃａｐｉｔａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ， Ｗｅｎｔｌｏｏｇ，Ｃａｒｄｉｆｆ，ＣＦ３ ２ＰＸ，Ｗａｌｅｓ，ＵＫ）から高品質で、インタクトなＲＮＡを単離した。ＲＮＡ調製物において存在するゲノムＤＮＡは、製造者の指示に従ったＤＮａｓｅ処理（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）により、除去した。市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）3 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従い使用し、ｃＤＮＡを生成した。
ＰＸ００１、ＰＸ００９、ＰＸ０１０、ＰＸ０１５、ＰＸ０１６遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、製造者の指示に従い、ＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、変性プライマーでの一連のＰＣＲ反応を行った。
それぞれの遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表２−ＰＸに示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた：９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５０℃で１分、そして７２℃で１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分（ＰＸ００１、ＰＸ００９、ＰＸ０１５、ＰＸ０１６）；９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で２分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分を行った（ＰＸ０１０）。得られたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を決定した。得られたＰＣＲ産物の配列を、それぞれ配列番号により表２−ＰＸに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表３−ＰＸに表す。
Ｂ．プルテッラ キシロステッラ遺伝子のｄｓＲＮＡ生成
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７ Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応物は標的配列をＴ７プロモーターに対して異なる向きで含んでいる。
それぞれの標的遺伝子について、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。それぞれの標的遺伝子についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＰＸに示す。ＰＣＲ反応の条件は、以下のとおりである：９５℃で１分、続いて９５℃で３０秒、６０℃で３０秒（−０．５℃／ｃｙｃｌｅ）、７２℃で１分を２０サイクル、続いて９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分を１５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワード、および特異的Ｔ７リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件のＰＣＲ反応で生成した。標的遺伝子の各々に対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列は、表８−ＰＸに示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。それぞれの標的遺伝子について得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＰＸに示す。
Ｃ．植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）へのプルテッラ キシロステッラ遺伝子の組換え
ＲＮＡ干渉のメカニズムがｄｓＲＮＡフラグメントを介した操作であるので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記選択のとおり、アンチセンスとセンスの向きでクローニングされ、イントロン−ＣｍＲ−イントロンによって分離されており、ＣｍＲはクロラムフェニコール抵抗性マーカーであって、ｄｓＲＮＡヘアピン構築物を形成する。これらのヘアピン構築物を、ａｔｔＬを含む−エントリークローン（実施例１１Ａ参照）と、ａｔｔＲを含む−目的ベクター（＝ｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2））との間でＬＲ組換え反応を用いて作製した。植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、ＶＩＢ／Ｐｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ａ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔから取得した。ＬＲ組換え反応を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）2 ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７９１−０２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、それぞれの標的遺伝子についてヘアピン構築物を生じ、プロモーター−センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンスの方向性を有し、プロモーターは、植物で機能的な（ｏｐｅｒａｂｌｅ）３５Ｓプロモーターである。３５Ｓプロモーターを用いたバイナリーベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、アグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）への形質転換に好適である。
制限酵素処理を、異なる標的を含むｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯプラスミドで行った（実施例１１Ｂ参照）。Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ． Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）を用いてａｔｔＬ部位に隣接する目的の遺伝子を含むバンドを精製した。精製したフラグメントの１５０ｎｇの量と、１５０ｎｇのｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）2 ｅｎｚｙｍｅとともに添加し、少なくとも２５℃で１時間インキュベートした。プロテイナーゼＫ溶液処理（３７℃で１０分）の後、全組換え混合物を、Ｔｏｐ１０ケミカリーコンピテントセルに形質転換した。陽性クローンを、制限酵素処理解析により選択した。
Ｄ．プルテッラ キシロステッラ幼虫に対する活性について、人工食餌を用いたｄｓＲＮＡ標的を試験する実験室の試験
コナガ（プルテッラ キシロステッラ）を、Ｉｎｓｅｃｔ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．（供給源：Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ−ｕｐｏｎ−Ｔｙｎｅ，ＵＫ）で維持した。昆虫を、キャベツの葉で飼育した。一齢幼虫、雌雄混合幼虫（約１日齢）を、試験に使用するために選択した。昆虫を、エッペンドルフチューブ（１．５ｍｌ容量）にいれて、維持した。市販のコナガ食餌（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ， ＮＪ，ＵＳＡ）を、製造者の指示に従って調製し、各チューブの蓋に乗せた（０．２５ｍｌ容量、８ｍｍ直径）。液体状態において、食餌の過剰分を取り除くことにより滑らかにし、平らな表面を作る。
食餌が一旦セットされたら、試験製剤を食餌表面にのせ、レプリケートあたり２５μｌの非希釈製剤（１μｇ／μｌ 標的ｄｓＲＮＡ）の割合とした。試験製剤を乾燥させて、１つの一齢蛾幼虫を各チューブに置いた。幼虫を蓋の食餌の表面におき、チューブを注意深く閉じた。チューブをさかさまにして保存し、各幼虫が蓋の上の食餌の表面に残るようにした。１週間に２回、幼虫を新鮮な食餌の入った新しいエッペンドルフチューブに移す。試験の最初の２週間、昆虫に処理された食餌を与え、その後未処理の食餌を与えた。
評価を、全ての幼虫が死ぬ時点で、全３８日の間、週に２回行った。各評価にて、昆虫を、生死について評価し、異常性について試験した。４０の単一幼虫レプリケートが、各々の処理について行われる。試験中、２３〜２６℃、５０〜６５％の相対湿度、１６：８時間の明暗光周期の条件とした。
アチェタ ドメスティカス(Acheta domesticus)(イエコオロギ）
Ａ．アチェタ ドメスティカスの部分遺伝子配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用し、アチェタ ドメスティカス（イエコオロギ；供給源：Ｄｒ．Ｌａｒａ Ｓｅｎｉｏｒ，Ｉｎｓｅｃｔ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．，Ｃａｐｉｔａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ，Ｗｅｎｔｌｏｏｇ，Ｃａｒｄｉｆｆ，ＣＦ３ ２ＰＸ，Ｗａｌｅｓ，ＵＫ）の全ての異なる幼虫段階から高品質で、インタクトなＲＮＡを単離した。製造者の指示に従ったＤＮａｓｅ処理（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ＲＮＡ調製物中に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）3 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従い使用し、ｃＤＮＡを生成した。
ＡＤ００１、ＡＤ００２、ＡＤ００９、ＡＤ０１５およびＡＤ０１６遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、製造者の指示に従いＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、変性プライマーでの一連のＰＣＲ反応を行った。
それぞれの遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表２のＡＤに示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた：９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５０℃で１分、そして７２℃で１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分。得られたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を決定した。得られたＰＣＲ産物の配列を、それぞれ配列番号により表２−ＡＤに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表３−ＡＤに表す。
Ｂ．アチェタ ドメスティカス遺伝子のｄｓＲＮＡ生成
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７ Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応物は標的配列をＴ７プロモーターに対して異なる向きで含んでいる。
それぞれの標的遺伝子について、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。それぞれの標的遺伝子についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＡＤに示す。ＰＣＲ反応の条件は、以下のとおりである：９５℃で１分、続いて９５℃で３０秒、６０℃で３０秒（−０．５℃／ｃｙｃｌｅ）、７２℃で１分を２０サイクル、続いて９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分を１５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件を用いて生成した。標的遺伝子のそれぞれに対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＡＤに示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。それぞれの標的遺伝子について得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＡＤに示す。
Ｃ．植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）へのアチェタ ドメスティカス遺伝子の組換え
ＲＮＡ干渉のメカニズムがｄｓＲＮＡフラグメントを介した操作であるので、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列は、上記選択のとおり、アンチセンスとセンスの向きでクローニングされ、イントロン−ＣｍＲ−イントロンによって分離されており、ＣｍＲはクロラムフェニコール抵抗性マーカーであって、ｄｓＲＮＡヘアピン構築物を形成する。これらのヘアピン構築物を、ａｔｔＬを含む−エントリークローン（実施例１２Ａ参照）と、ａｔｔＲを含む−目的ベクター（＝ｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2））との間でＬＲ組換え反応を用いて作製した。植物ベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、ＶＩＢ／Ｐｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ａ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔから取得した。ＬＲ組換え反応を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）2 ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７９１−０２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従って行った。これらのクローニング実験は、それぞれの標的遺伝子についてヘアピン構築物を生じ、プロモーター−センス−イントロン−ＣｍＲ−イントロン−アンチセンスの方向性を有し、プロモーターは、植物で機能的な（ｏｐｅｒａｂｌｅ）３５Ｓプロモーターである。３５Ｓプロモーターを用いたバイナリーベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）は、アグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）への形質転換に好適である。
制限酵素処理を、異なる標的を含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏプラスミドに対して行った（実施例１２Ｂ参照）。Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ａｔｔＬ部位に隣接する目的遺伝子を含むバンドを精製した。精製したフラグメントの１５０ｎｇの量と、１５０ｎｇのｐＫ７ＧＷＩＷＧ２Ｄ（2）を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）2 ｅｎｚｙｍｅとともに添加し、少なくとも１時間２５℃でインキュベートした。プロテイナーゼＫ溶液処理（３７℃で１０分）の後、全組換え混合物を、Ｔｏｐ１０ケミカリーコンピテントセルに形質転換した。陽性クローンを、制限酵素処理解析により選択した。
Ｄ．アチェタ ドメスティカス幼虫に対する活性について、人工食餌を用いて、ｄｓＲＮＡ標的を試験する実験室の試験
イエコオロギ（アチェタ ドメスティカス）を、Ｉｎｓｅｃｔ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．（供給源：ＢｌａｄｅｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌｔｄ．，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）で維持した。昆虫を、ペレット状の糠とキャベツ葉で飼育した。大きさが同じ雌雄混合幼虫と、５日齢以上でない昆虫を、試験使用のために選択した。２本鎖ＲＮＡを、コムギベースのペレット状げっ歯類食餌（ｒａｔ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｉｅｔ，Ｂ＆Ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌｔｄ．，Ｇｒｉｍｓｔｏｎ，Ａｌｄｂｒｏｕｇｈ，Ｈｕｌｌ，ＵＫ）と混合した。食餌ＢＫ００１Ｐは、重量順に以下の成分を含む：コムギ、ダイズ、小麦餌、オオムギ、ペレット結合剤、げっ歯類５ビタミン、脂質混合物、 第二リン酸カルシウム、成形炭水化物。ペレット状げっ歯類食餌を、細かく磨砕し、いかなる酵素成分をも不活性化するために混合前に電子レンジで熱処理した。全てのげっ歯類食餌は、同一性を確保するために、同じバッチからとられた。磨砕後の食餌およびｄｓＲＮＡを、完全に混合し、等重量の小さなペレットに製剤化し、室温で一晩乾燥させた。
標的およびｇｆｐコントロールからの２本鎖ＲＮＡ試料、濃度１０μｇ／μｌを、ｄｓＲＮＡ溶液１ｍｌに磨砕食餌１ｇを加える割合で適用し、それにより、ペレット１ｇあたり１０ｍｇのｄｓＲＮＡの適用割合となる。ペレットを、週毎に取り換えた。試験の最初の３週間、昆虫に処理したペレットを与えた。その後、未処理のペレットを与えた。昆虫を、蓋つきプラスチック容器内で維持し（直径９ｃｍ、深さ４．５ｃｍ）、容器あたり１０匹を維持した。各アリーナは、一つの処理食餌ペレットを含み、一つの水分供給源（湿った脱脂綿の玉）を含み、それぞれを個別の小型の計量計に置いた。実験中、適時水分を補充した。
すべてのコントロール昆虫が、死ぬかもしくは成虫段階（８４日）に脱皮するまで、評価期間は４日以上あけずに、評価を週に２回の間隔でおこなう。各評価において、昆虫の生死を評価し、異常について検査した。４６日以後、成虫への脱皮がいったん開始すると、すべての昆虫（生および死）を、幼虫もしくは成虫として評価した。生き残る昆虫を、試験の５５日目に計量した。４レプリケートを、処理のそれぞれについて行った。試験中、試験条件は、２５〜３３℃、２０〜２５％の相対湿度、１２：１２時間の明暗光周期とした。
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図１−ＬＤ：ｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。 第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐコントロール）の局所添加溶液で処理した食餌を与えた。食餌は７日後に局所添加ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌に置き換えた。生存する昆虫の数は２、５、７、８、９および１３日目に評価した。生存幼虫のパーセンテージは０日（評価開始）に対して計算した。標的ＬＤ００６：（配列番号１７８）；標的ＬＤ００７（配列番号１８３）；標的ＬＤ０１０（配列番号１８８）；標的ＬＤ０１１（配列番号１９３）；標的ＬＤ０１４（配列番号１９８）；ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ（配列番号２３５）。 図２−ＬＤ：ｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。 第２幼虫段階の昆虫に５０μｌのｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐコントロール）の局所添加溶液で処理した食餌を与えた（標的またはｇｆｐ制御）。食餌を７日後のみ、新鮮な食餌に置き換えた。生存する昆虫の数は２、５、６、７、８、９、１２および１４日目に評価した。生存幼虫のパーセンテージは０日（評価開始）に対して計算した。標的ＬＤ００１：（配列番号１６３）；標的ＬＤ００２（配列番号１６８）；標的ＬＤ００３（配列番号１７３）；標的ＬＤ０１５（配列番号２１５）；標的ＬＤ０１６（配列番号２２０）；ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ（配列番号２３５）。 図３−ＬＤ：ｄｓＲＮＡで処理されたジャガイモ葉の円盤状組織でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の幼虫の平均重量を示す。 第２幼虫段階の昆虫に、２０μｌのｄｓＲＮＡ（標的ＬＤ００２またはｇｆｐ）の局所添加溶液（１０ｎｇ／μｌ）で処理された葉の円盤状組織を与えた。２日後、昆虫は毎日、未処理葉上に移動させた。 図４−ＬＤ：標的ＬＤ０１４ｄｓＲＮＡおよびコンカテマー(concatemer)ｄｓＲＮＡのより短いもので処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。 第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡ（ｇｆｐまたは標的）の局所添加溶液で処理された食餌を与えた。生存する昆虫の数は３、４、５、６および７日に評価した。生存幼虫のパーセンテージは０日（評価開始）に対して計算した。 図５−ＬＤ：標的ＬＤ００２（ａ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。 第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所添加溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所添加ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセンテージは０日（評価開始）に対して計算した。 図５−ＬＤ：標的ＬＤ００７（ｂ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。 第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所添加溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所添加ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセンテージは０日（評価開始）に対して計算した。 図５−ＬＤ：標的ＬＤ０１０（ｃ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。 第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所添加溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所添加ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセンテージは０日（評価開始）に対して計算した。 図５−ＬＤ：標的ＬＤ０１１（ｄ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。 第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所添加溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所添加ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセンテージは０日（評価開始）に対して計算した。 図５−ＬＤ：標的ＬＤ０１４（ｅ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。 第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所添加溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所添加ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセンテージは０日（評価開始）に対して計算した。 図５−ＬＤ：標的ＬＤ０１５（ｆ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。 第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所添加溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所添加ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセンテージは０日（評価開始）に対して計算した。 図５−ＬＤ：ＬＤ０１６（ｇ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。 第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所添加溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所添加ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセンテージは０日（評価開始）に対して計算した。 図５−ＬＤ：標的ＬＤ０２７（ｈ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。 第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所添加溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所添加ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセンテージは０日（評価開始）に対して計算した。 図６−ＬＤ：ｄｓＲＮＡで処理されたジャガイモ葉の円盤状組織でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)成虫の生存を示す。若い成虫に最初の２日間に２本鎖ＲＮＡ処理された葉の円盤状組織を与え、次いで未処理ジャガイモの葉上に置いた。生存する昆虫の数は規則的に評価し、動く昆虫を生存しているが、正常に活動するようである昆虫として記録し、瀕死の昆虫は生存しているが、病的であり、遅い動きのようである昆虫として記録した。これらの昆虫は一旦、背部を下にして置かれると、常態にかえることができなかった。標的ＬＤ００２（配列番号１６８）；標的ＬＤ０１０（配列番号１８８）；標的ＬＤ０１４（配列番号１９８）；標的ＬＤ０１６（配列番号２２０）；ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ（配列番号２３５）。 図７−ＬＤ：遺伝子組換えジャガイモ植物でのコロラドハムシ(Colorado potato beetle)、レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leceptinotarsa decemlineata)の生存幼虫の死亡率および成長／発生遅延を示す。７つのＣＰＢ Ｌ１幼虫には、７日間、ＬＤ００２構築物（●）、空ベクター（▲）、または野生型ラインＶ植物（■）を有する遺伝子組換えジャガイモのシブリングを与えた。死亡率はパーセンテージおよび平均幼虫重量をｍｇで表現する。 図１−ＰＣ：Ｐ．コクレアリアエ (P. cochleariae)の幼虫の生存および成長における摂取された標的ｄｓＲＮＡの効果を示す。新生児幼虫に０．１μｇ／μｌｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐコントロール）の２５μｌの局所添加溶液で処理されたアブラナ葉の円盤状組織を与えた。２日後、昆虫を新鮮なｄｓＲＮＡ処理された葉の円盤状組織上に移動させた。４日目に、各処理において、１つのレプリケートから幼虫が集められ、新鮮な未処理アブラナ葉を含むペトリ皿に置いた。昆虫を２、４、７、９および１１日目に評価した。（ａ）ｄｓＲＮＡで処理されたアブラナ葉の円盤状組織でのＥ．ヴァリヴェスティス(E. varivestis)幼虫の生存。生存幼虫のパーセンテージは０日（評価の開始）に対して計算した。エラーバーは標準偏差を示す。標的１：配列番号４７３；標的３：配列番号４７８；標的５：配列番号４８３；標的１０：配列番号４８８；標的１４：配列番号４９３；標的１６：配列番号４９８；標的２７：配列番号５０３；ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ：配列番号２３５。 図１−ＰＣ：Ｐ．コクレアリアエ (P. cochleariae)の幼虫の生存および成長における摂取された標的ｄｓＲＮＡの効果を示す。新生児幼虫に０．１μｇ／μｌｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐコントロール）の２５μｌの局所添加溶液で処理されたアブラナ葉の円盤状組織を与えた。２日後、昆虫を新鮮なｄｓＲＮＡ処理された葉の円盤状組織上に移動させた。４日目に、各処理において、１つのレプリケートから幼虫が集められ、新鮮な未処理アブラナ葉を含むペトリ皿に置いた。昆虫を２、４、７、９および１１日目に評価した。（ｂ）ｄｓＲＮＡで処理されたアブラナ葉の円盤状組織でのＰ．コクレアリアエ(P. cochleariae)幼虫の平均重量。各レプリケートからの昆虫を互いに重量測定し、そして１匹の幼虫当たりの平均重量を計算した。エラーバーは標準偏差を示す。標的１：配列番号４７３；標的３：配列番号４７８；標的５：配列番号４８３；標的１０：配列番号４８８；標的１４：配列番号４９３；標的１６：配列番号４９８；標的２７：配列番号５０３；ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ：配列番号２３５。 図２−ＰＣ：（ａ）標的ＰＣ０１０の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理されたアブラナ葉の円盤状組織でのＰ．コクレアリアエ(P. cochleariae)の生存を示す。 新生児幼虫をｄｓＲＮＡの２５μｌの局所添加溶液で処理された葉の円盤状組織上に置いた。２日目に昆虫を新鮮な処理された葉の円盤状組織に移動させた。標的ＰＣ０１０では４日目に、標的ＰＣ０２７では５日目に、昆虫を未処理葉へ移動させた。生存する昆虫の数はＰＣ０１０では２、４、７、８、９および１１日目に、ＰＣ０２７では２、５、８、９および１２日目に評価した。生存幼虫のパーセンテージは０日（評価開始）に対して計算した。号５０３；ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ：配列番号２３５。 図２−ＰＣ：（ｂ）標的ＰＣ０２７の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理されたアブラナ葉の円盤状組織でのＰ．コクレアリアエ(P. cochleariae)の生存を示す。 新生児幼虫をｄｓＲＮＡの２５μｌの局所添加溶液で処理された葉の円盤状組織上に置いた。２日目に昆虫を新鮮な処理された葉の円盤状組織に移動させた。標的ＰＣ０１０では４日目に、標的ＰＣ０２７では５日目に、昆虫を未処理葉へ移動させた。生存する昆虫の数はＰＣ０１０では２、４、７、８、９および１１日目に、ＰＣ０２７では２、５、８、９および１２日目に評価した。生存幼虫のパーセンテージは０日（評価開始）に対して計算した。 図１−ＥＶ：ｄｓＲＮＡで処理されたマメ葉の円盤状組織でのＥ．ヴァリヴェスティス(E. varivestis)幼虫の生存を示す。 新生児幼虫に１μｇ／μｌのｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐコントロール）の２５μｌの局所添加溶液で処理したマメ葉の円盤状組織を与えた。２日後、昆虫を新鮮なｄｓＲＮＡ処理された葉の円盤状組織上に移動させた。４日目に１つの処理から得た幼虫を集め、新鮮な未処理のマメ葉を入れたプラスチックボックス中へ置いた。２、４、６、８および１０日目に死亡率についてこの昆虫を評価した。生存する幼虫のパーセンテージは０日（評価開始）に対して計算した。標的５：配列番号５７６；標的１０：配列番号５８６；標的１５：配列番号５９１；標的１６：配列番号５９６；ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ：配列番号２３５。 図２−ＥＶ：Ｅ．ヴァリヴェスティス(E. varivesis)成虫の生存における摂取された標的ｄｓＲＮＡの効果およびサヤインゲン葉の昆虫損害に対する抵抗性を示す。（ａ）ｄｓＲＮＡで処理されたマメの葉におけるＥ．ヴァリヴェスティス(E. varivestis)成虫の生存を示す。成虫に０．１μｇ／μｌのｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐコントロール）の７５μｌの局所添加溶液で処理されたマメの葉の円盤状組織を与えた。２４時間後、昆虫を新鮮なｄｓＲＮＡ処理された葉の円盤状組織へ移動させた。さらに２４時間後、１つの処理から得た成虫を集め、ポット化された(potted)未処理全マメ植物を含むプラスチックボックス中に置いた。４、５、６、７、８および１１日目に死亡率について昆虫を評価した。生存する成虫のパーセンテージは、０日（評価の開始）に対して計算した。標的１０：配列番号５８６；標的１５：配列番号５９１；標的１６：配列番号５９６；ｇｆｐ ｄｓRNA：配列番号２３５。 図２−ＥＶ：Ｅ．ヴァリヴェスティス(E. varivesis)成虫の生存における摂取された標的ｄｓＲＮＡの効果およびサヤインゲン葉の昆虫損害に対する抵抗性を示す。（ｂ）ｄｓＲＮＡによるＥ．ヴァリヴェスティス(E. varivesis)成虫が生じるマメ葉の損害に対する抵抗性を示す。１つの処理（（ａ）参照）から得た昆虫を含む全植物を９日目に葉の損害について可視的にチェックした。（ｉ）標的１０；（ｉｉ）標的１５；（ｉｉｉ）標的１６；（ｉｖ）ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ；（ｖ）未処理。 図１−ＴＣ：標的１４のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＴ．カスタニュウム(T. castneum)幼虫の生存を示す。 新生児幼虫にｄｓＲＮＡ標的１４と小麦粉／牛乳混合物に基づく食餌１ｍｇを与えた。コントロールは食餌中の水（ｄｓＲＮＡなし）であった。１つのレプリケート当たり１０匹の１齢幼虫の、４つのレプリケートに、それぞれの処理を行った。６、１７、３１、４５および６０日目に平均パーセンテージ手段で生存について昆虫を評価した。生存幼虫のパーセンテージは０日（評価の開始）に対して計算した。エラーバーは標準偏差を示す。標的ＴＣ０１４：配列番号８７８。 図１−ＭＰ：ミズス・ペリシカエ(Myzus persicae)若虫の生存について摂取された標的２７ｄｓＲＮＡの効果を示す。 １齢幼虫を２μｇ／μｌｄｓＲＮＡ（標的２７またはｇｆｐ ｄｓＲＮＡコントロール）の５０μｌの液体食餌を含む飼育室中に置いた。１処理当たり、各飼育室に１０匹の幼虫の５つの飼育室をセットアップした。生存虫の数はバイオアッセイの開始後、８日目に評価した。エラーバーは標準偏差を示す。標的ＭＰ０２７：配列番号１０６１；ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ：配列番号２３５。 図１−ＮＬ：ｄｓＲＮＡで処理された液体人工食餌でのニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilaparvata lugens)の生存を示す。 第１幼虫段階から第２幼虫段階への若虫に、別々なバイオアッセイ：（ａ）ＮＬ００２、ＮＬ００３、ＮＬ００５、ＮＬ０１０でのｄｓＲＮＡ標的の２ｍｇ／ｍｌ溶液を補給した食餌を与えた。標的での昆虫生存を食餌のみと比較し、かつ同じ濃度でｇｆｐ ｄｓＲＮＡコントロールを含む食餌と比較した。２日毎に、ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で食餌を置き換えた。生存する昆虫の数は毎日、評価した。 図１−ＮＬ：ｄｓＲＮＡで処理された液体人工食餌でのニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilaparvata lugens)の生存を示す。 第１幼虫段階から第２幼虫段階への若虫に、別々なバイオアッセイ：（ｂ）ＮＬ００９、ＮＬ０１６でのｄｓＲＮＡ標的の２ｍｇ／ｍｌ溶液を補給した食餌を与えた。標的での昆虫生存を食餌のみと比較し、かつ同じ濃度でｇｆｐ ｄｓＲＮＡコントロールを含む食餌と比較した。２日毎に、ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で食餌を置き換えた。生存する昆虫の数は毎日、評価した。 図１−ＮＬ：ｄｓＲＮＡで処理された液体人工食餌でのニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilaparvata lugens)の生存を示す。 第１幼虫段階から第２幼虫段階への若虫に、別々なバイオアッセイ：（ｃ）ＮＬ０１４、ＮＬ０１８でのｄｓＲＮＡ標的の２ｍｇ／ｍｌ溶液を補給した食餌を与えた。標的での昆虫生存を食餌のみと比較し、かつ同じ濃度でｇｆｐ ｄｓＲＮＡコントロールを含む食餌と比較した。２日毎に、ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で食餌を置き換えた。生存する昆虫の数は毎日、評価した。 図１−ＮＬ：ｄｓＲＮＡで処理された液体人工食餌でのニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilaparvata lugens)の生存を示す。 第１幼虫段階から第２幼虫段階への若虫に、別々なバイオアッセイ：（ｄ）ＮＬ０１３、ＮＬ０１５、ＮＬ０２１でのｄｓＲＮＡ標的の２ｍｇ／ｍｌ溶液を補給した食餌を与えた。標的での昆虫生存を食餌のみと比較し、かつ同じ濃度でｇｆｐ ｄｓＲＮＡコントロールを含む食餌と比較した。２日毎に、ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で食餌を置き換えた。生存する昆虫の数は毎日、評価した。 図２−ＮＬ：異なった濃度の標的ｄｓＲＮＡ ＮＬ００２で処理された液体人工食餌でのニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilaparvata lugens)の生存を示す。 第１幼虫段階から第２幼虫段階への若虫に、１、０．２、０．０８および０．０４ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）のＮＬ００２を補給した食餌を与えた。２日毎にｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で食餌を置き換えた。生存する昆虫の数を毎日、評価した。

Claims (24)

  1. 互いに相補的な配列の２つの相補鎖を含む２本鎖ＲＮＡを発現する植物細胞であって、該相補鎖のうち１つが以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群から選択される１つのポリリボヌクレオチドを含むものであり、
    （ｉ）配列番号１、２５、４９〜５５、１６３または１６６のいずれかで示される標的遺伝子の少なくとも２１個の隣接したヌクレオチドと相補的なポリリボヌクレオチド、
    （ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする標的遺伝子の少なくとも２１個の隣接したヌクレオチドと相補的なポリリボヌクレオチド、および
    （ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のポリリボヌクレオチドと少なくとも９０％同一であるポリリボヌクレオチド、
    前記２本鎖ＲＮＡが前記標的遺伝子の発現を阻害する植物細胞。
  2. 互いに相補的な配列の２つの相補鎖を含む２本鎖ＲＮＡを発現する植物であって、該相補鎖のうち１つが以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群から選択される１つのポリリボヌクレオチドを含むものであり、
    （ｉ）配列番号１、２５、４９〜５５、１６３または１６６のいずれかで示される標的遺伝子の少なくとも２１個の隣接したヌクレオチドと相補的なポリリボヌクレオチド、
    （ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする標的遺伝子の少なくとも２１個の隣接したヌクレオチドと相補的なポリリボヌクレオチド、および
    （ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のポリリボヌクレオチドと少なくとも９０％同一であるポリリボヌクレオチド、
    前記２本鎖ＲＮＡが前記標的遺伝子の発現を阻害する植物。
  3. ２本鎖ＲＮＡがコロラドハムシの生物学的活性を阻止する、請求項１記載の植物細胞または請求項２記載の植物。
  4. 標的遺伝子はコロラドハムシの遺伝子である、請求項２記載の植物。
  5. 植物は細胞質雄性不稔である、請求項２〜４のいずれかに記載の植物。
  6. 植物はさらに、パタチン、バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫性タンパク、キセノラブドゥス(Xenorhabdus)殺虫性タンパク、フォトラブダス(Photorhabdus)殺虫性タンパク、バチルス・ラテロスポラウス(Bacillus laterosporous)殺虫性タンパク、およびバチルス・スフェアリカス(Bacillus sphearicus)殺虫性タンパクからなる群から選択される殺虫剤を含むかまたは発現する、請求項２〜４のいずれかに記載の植物。
  7. バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thuringiensis) 殺虫性タンパクは、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ１７０、Ｃｒｙ２２、二成分殺虫性タンパクＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４、二成分殺虫性タンパクＣｒｙＥＴ８０およびＣｒｙＥＴ７６、二成分殺虫性タンパクＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、および二成分殺虫性タンパクＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択される、請求項６記載の植物。
  8. 植物は、アルファルファ(alfalfa)、リンゴ(apple)、アプリコット(apricot)、朝鮮アザミ(artichoke)、アスパラガス(asparagus)、アボガド(avocado)、バナナ(banana)、オオムギ(barley)、マメ(beans)、ビート(beet)、ブラックベリー(blackberry)、ブルーベリー(blueberry)、ブロッコリ(broccoli)、芽キャベツ(brussel sprouts)、キャベツ(cabbage)、アブラナ(canola)、ニンジン(carrot)、キャッサバ(cassava)、カリフラワー(cauliflower)、穀物(cereal)、セロリ(celery)、桜(cherry)、柑橘類(citrus)、クレメンタイン(clementine)、コーヒー(coffee)、コーン(corn)、ワタ(cotton)、キュウリ(cucumber)、ナス(eggplant)、チコリ(endive)、ユーカリ(eucalyptus)、イチジク(figes)、ブドウ(grape)、グレープフルーツ(grapefruit)、落花生(groundnuts)、センナリホウズキ(ground cherry)、キウイフルーツ(kiwifruit)、レタス(lettuce)、ニラ(leek)、レモン(lemon)、ライム(lime)、パイン(pine)、トウモロコシ(maize)、マンゴー(mango)、メロン(melon)、キビ(millet)、マッシュルーム(mushroom)、ナット・オート(nut aot)、オクラ(okra)、タマネギ(onion)、オレンジ(orange)、観賞用植物または花または樹木(an ornamental plant or flower or tree)、パパイア(papaya)、パセリ(parsley)、エンドウマメ(pea)、モモ(peach)、ピーナッツ(peanut)、ピート(peat)、コショウ(pepper)、カキ(persimmon)、パイナップル(pineapple)、オオバコ(plantain)、プラム(plum)、ザクロ(pomegranate)、ジャガイモ(potato)、カボチャ(pumpkin)、ラディッキオ(radicchio)、ダイコン(radish)、ナタネ(rapeseed)、ラズベリー(raspberry)、コメ(rice)、ライ麦(rye)、サトウモロコシ(sorghum)、ダイズ(soy)、ダイズ(soy beans)、ホウレンソウ(spinach)、イチゴ(strawberry)、テンサイ(sugarbeet)、サトウキビ(sugarcane)、ヒマワリ(sunflower)、サツマイモ(sweet potato)、タンジェリン(tangerine)、茶(tea)、タバコ(tobacco)、トマト(tomato)、ツルクサ(a vine)、スイカ(watermelon)、コムギ(wheat)、トロロイモ(yams)およびズッキーニ(zucchini)を含む群から選択される、請求項２〜７のいずれかに記載の植物。
  9. 植物は、コロラドハムシによる摂取に対して抵抗性を有する、請求項２〜８のいずれかに記載の植物。
  10. 種子は、請求項２に記載の２本鎖ＲＮＡを含む、請求項２〜９のいずれかに記載の植物の種子。
  11. 再生もしくは増殖材料が、請求項２に記載の２本鎖ＲＮＡを含む、請求項２〜９のいずれかに記載の植物のための再生もしくは増殖材料。
  12. 生成物は、請求項２に記載の２本鎖ＲＮＡを含む、請求項２〜９のいずれかに記載の植物、請求項１０に記載の種子または請求項１１に記載の再生もしくは増殖材料から産生される生成物。
  13. 生成物は、食物、飼料、繊維、紙、食事、タンパク、デンプン、小麦粉、貯蔵生牧草、コーヒー、茶および油からなる群から選択される、請求項１２記載の生成物。
  14. 請求項２〜９のいずれかに記載の植物、請求項１０記載の種子、請求項１１記載の再生もしくは増殖材料、請求項１２もしくは１３記載の生成物を含む殺虫剤であって、請求項２に記載の２本鎖ＲＮＡを含む、コロラドハムシに対する殺虫剤。
  15. 請求項２に記載の２本鎖ＲＮＡを含む、請求項２〜９のいずれかに記載の植物、請求項１０記載の種子、請求項１１記載の再生もしくは増殖材料、請求項１２もしくは１３記載の生成物から誘導された植物材料を、コロラドハムシに与えることを含むコロラドハムシの成長を制御または阻止する方法。
  16. コロラドハムシに対する抵抗性を植物に獲得させる方法であって、
    制御配列に操作可能に連結された請求項１に記載の２本鎖ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に形質転換し、
    前記植物細胞から植物を再生し、そして
    ２本鎖ＲＮＡを発現するのに適した条件下で前記植物を成長させることにより、成長した植物は、非形質転換植物に比べてコロラドハムシに対して抵抗性を有することを含む、方法。
  17. 植物の収穫量を改善する方法であって、
    制御配列に操作可能に連結された請求項１に記載の２本鎖ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に形質転換し、
    前記植物細胞から植物を再生し、そして
    ２本鎖ＲＮＡを発現するのに適した条件下で前記植物を成長させることにより、コロラドハムシによる植物の摂取およびコロラドハムシの横行による植物の収穫量の減少を阻止することを含む、方法。
  18. ２本鎖ＲＮＡを発現する植物の一部を経口摂取したコロラドハムシは２本鎖ＲＮＡにより標的遺伝子の発現が抑制されるものであり、前記標的遺伝子は、コロラドハムシによる摂取、コロラドハムシの生存、コロラドハムシの細胞アポトーシス、コロラドハムシまたはコロラドハムシ細胞の分化および発達、コロラドハムシによる有性生殖、筋肉形成、筋肉痙攣、筋肉収縮、幼若ホルモン形成および／または低下、幼若ホルモン制御、イオン制御および輸送、潜在的細胞膜の維持、アミノ酸合成、アミノ酸分解、精子形成、フェロモン合成、フェロモン・センシング、アンテナ形成、羽形成、脚形成、卵形成、幼虫成熟、消化酵素形成、血リンパ合成、血リンパ維持、神経伝達、幼虫段階移行、蛹態期、蛹態期からの出現、細胞分割、エネルギー代謝、呼吸、細胞骨格の構造合成および維持、ヌクレオチド代謝、窒素代謝、水使用、水保持、および感覚性知力からなる群から選択される少なくとも１つの本質的機能を達成する、請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 請求項１に記載の２本鎖ＲＮＡを含む、コロラドハムシに抵抗性を有する遺伝子組換え植物。
  20. パタチン、バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫性タンパク、クセノラブデュス(Xenorhabdus)殺虫性タンパク、フォトラブデュス(Photorhabdus)殺虫性タンパク、バチルス・ラテロスポラウス(Bacillus laterosporous)殺虫性タンパク、およびバチルス・スフェアリカス(Bacillus sphearicus)殺虫性タンパクからなる群から選択された殺虫剤をさらに含むかまたは発現する、請求項１９に記載の遺伝子組換え植物。
  21. バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫性タンパクは、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ１７０、Ｃｒｙ２２、二成分殺虫性タンパクＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４、二成分殺虫性タンパクＣｒｙＥＴ８０およびＣｒｙＥＴ７６、二成分殺虫性タンパクＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、および二成分殺虫性タンパクＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択される、請求項２０記載の遺伝子組換え植物。
  22. 植物でのコロラドハムシの成長を阻止するための、請求項１記載の細胞、請求項２〜９のいずれかに記載の植物、請求項１０記載の種子、請求項１１に記載の再生もしくは増殖材料、請求項１２または１３記載の生成物、請求項１９〜２１のいずれかに記載の遺伝子組換え植物の使用。
  23. 植物でのコロラドハムシの横行を阻止するための、請求項１記載の細胞、請求項２〜９のいずれかに記載の植物、請求項１０記載の種子、請求項１１に記載の再生もしくは増殖材料、請求項１２または１３記載の生成物、請求項１９〜２１のいずれかに記載の遺伝子組換え植物の使用。
  24. 植物の収穫量を改良するための、請求項１記載の細胞、請求項２〜９のいずれかに記載の植物、請求項１０記載の種子、請求項１１に記載の再生もしくは増殖材料、請求項１２または１３記載の生成物、請求項１９〜２１のいずれかに記載の遺伝子組換え植物の使用。
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