KR101564842B1 - RNAi 기반 점박이응애 방제용 dsRNA, 이를 포함하는 살비제 조성물, 이를 이용한 독성 증대 방법 및 방제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TCOPB2와 TCOPE 유전자의 발현을 억제하여 점박이응애를 방제할 수 있는 단편 dsRNA 및 이들을 포함하는 조성물, 이들을 이용한 독성 증대 방법 및 방제 방법에 관한 것으로, 본 발명의 단편 dsRNA 및 조성물은 섭식을 통해 점박이응애의 체내에 들어갔을 때 점박이응애에서 주요 기능을 하는 TCOPB2와 TCOPE의 발현량을 교란하여 점박이응애의 치사를 유도하므로 점박이응애의 방제에 유용하게 사용할 수 있으며, 쉽게 내성이 생기는 화학합성 살충제를 대체할 수 있는 효과가 있다.

Description

RNAi 기반 점박이응애 방제용 dsRNA, 이를 포함하는 살비제 조성물, 이를 이용한 독성 증대 방법 및 방제 방법 {dsRNA for the control of Tetranychus urticae, acaricide composition comprising it, method of enhancing toxicity and control method for Tetranychus urticae using it}
본 발명은 점박이응애의 방제에 관한 것으로, 특히 점박이응애 방제에 유용한 dsRNA, 이를 포함하는 점박이응애 방제용 살비제 조성물, 이를 이용한 독성증대 방법 및 방제방법에 관한 것이다.
점박이응애(Tetranychus urticae)는 원예 및 화훼작물에 막대한 피해를 일으키는 미소해충이다. 점박이응애는 거미류 진드기목의 응애과에 속하며, 보통 한 해에 10회 이상 발생하고 각종 과수와 채소에 기생하여 살면서 해를 끼친다. 점박이응애는 약 0.2mm 크기로 반수배수성(haplodiploid) 양식을 지니고 있고 세대수가 짧아 다른 해충에 비해 살비제에 대한 저항성의 발달이 빠르다. 현재 점박이응애를 방제하기 위하여 약 96종의 살비제가 개발되어 있으나, 대부분의 약제에 대한 저항성 개체군이 보고되어 있는 주요 난방제해충이다.
RNAi(RNA interference) 기술이란 세포 내에 특정 유전자의 dsRNA(double stranded RNA)가 들어가게 되면 다이서(Dicer)라는 효소가 dsRNA를 인지하여 21-23bp의 길이인 siRNA(small interfering RNA)를 생성하게 되며, 이 잘려진 siRNA를 RISC(RNA-induced silencing complex)가 인지하고 결합하여 특정 서열을 가진 mRNA의 분해를 유도하여 유전자의 발현 및 단백질 합성을 억제하는 현상을 말한다.
이러한 RNAi 기술은 최근 형질전환 작물체 개발기술과 접목되어 해충군 관리의 대안으로 각광을 받고 있으며, RNAi 기술을 이용하여 주요 해충군을 관리하기 위하여 dsRNA/siRNA를 개발하고자 하는 연구가 2000년 중반부터 활발하게 진행되고 있다.
현재 전세계적으로 RNAi 기술을 이용하여 다양한 주요 해충을 방제하기 위해 치사유전자를 선별하는 연구가 진행 중에 있는데, 지금까지의 연구들은 주로 나비목과 딱정벌레목 해충을 대상으로 미세주입법(microinjection)과 인공사료(artificial diet)를 이용하여 유용한 dsRNA를 선발하고 있을 뿐 점박이응애에 대한 연구는 이루어지지 않고 있다.
1. 대한민국 특허공개 제10-2009-0031484호 2. 대한민국 특허공개 제10-2012-0001465호 3. 대한민국 특허공개 제10-2007-7011558호 4. 대한민국 특허공개 제10-2010-0127598호
1. Baum et al., 2007. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nature Biotechnology　25, 1322 - 1326. 2. Li et al., 2011. RNA interference in Nilaparvata lugens (Homoptera: Delphacidae) based on dsRNA ingestion, Pesticide Management Science, 67:852-859.
전세계적으로 RNAi 기술을 이용하여 다양한 주요 해충의 방제를 위해 치사유전자를 선별하는 연구가 진행 중에 있으나, 주로 나비목과 딱정벌레목 해충을 대상으로 미세주입법과 인공사료를 이용하여 유용한 dsRNA를 선발해 왔을 뿐 주요한 원예및 화훼 해충인 점박이응애에 대한 연구는 아직 진행되지 않고 있다.
따라서 본 발명은 RNAi 기술로 섭식을 통해 점박이응애의 생리적 주요 유전자의 발현량을 교란하여 점박이응애의 치사를 유발하는 dsRNA를 확인하고, 확인된 dsRNA를 단편화하여 각 단편 및 각 단편을 조합한 조성물을 통해 점박이응애의 치사효율을 증대시키는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 표시되는 dsRNA 중 선택된 하나로서, 점박이응애에서 TCOPB2 또는 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는, 점박이응애 방제용 dsRNA를 제공한다.
또한 본 발명은 하기 조성 중 선택된 어느 하나를 포함하는 점박이응애 방제용 dsRNA 조성물을 제공한다:
(1) 서열번호 1로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 3으로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA;
(2) 서열번호 1로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA;
(3) 서열번호 2로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 3으로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA; 및
(4) 서열번호 2로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA.
상기 dsRNA 조성물은,
서열번호 1로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA의 조성물; 또는
서열번호 2로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA의 조성물인 것이 보다 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 dsRNA 또는 dsRNA 조성물을 유효성분으로 포함하는 점박이응애 방제용 살비제 조성물을 제공한다.
상기 살비제 조성물은 섭식을 통해 점박이응애에 전달되는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 dsRNA 단편을 조합함으로써 점박이응애 방제용 dsRNA의 독성을 증대시키는 방법으로서, 상기 조합은 하기 (1) 내지 (4) 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 점박이응애 방제용 dsRNA의 독성 증대 방법을 제공한다:
(1) 서열번호 1로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 3으로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA;
(2) 서열번호 1로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA;
(3) 서열번호 2로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 3으로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA; 및
(4) 서열번호 2로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA.
상기 조합은,
서열번호 1로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA의 조합; 또는
서열번호 2로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA의 조합인 것이 보다 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 dsRNA 또는 dsRNA 조성물을 사용하여 점박이응애를 치사시키는 것을 포함하는 점박이응애의 방제방법을 제공한다.
상기 방제방법에서, 상기 dsRNA 또는 dsRNA 조성물은 섭식을 통해 점박이응애에 전달되는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 dsRNA 또는 dsRNA 조성물을 포함하는 재조합벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 식물을 제공한다.
본 발명의 dsRNA 단편 및 조성물은 섭식을 통해 점박이응애의 체내에 들어갔을 때 점박이응애에서 주요 기능을 하는 TCOPB2(b subunit of coatomer protein complex)와 TCOPE(Epsilon subunit of coatomer proteion complex)의 발현량을 교란하여 점박이응애의 치사를 유도한다. 본 발명의 dsRNA 단편은 단편만으로 전장 dsRNA와 동일 내지 유사한 효과를 나타낼 수 있고, dsRNA 단편들을 조합한 조성물은 전장 및 단편 dsRNA에 비하여 우수한 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 dsRNA 단편 및 조성물은 점박이응애의 방제에 유용하게 사용할 수 있으며, 쉽게 내성이 생기는 화학합성 살충제를 대체할 수 있는 효과가 있다. 또한 본 발명에 따른 dsRNA 독성 증대 방법은 점박이응애 방제 분야는 물론 관련 연구 분야에서 폭 넓게 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 dsRNA 단편은 종특이성이 높으므로 본 발명의 dsRNA로 형질전환된 식물은 이상적인 점박이응애 방제모델이 될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실험에 사용된 dsRNA 치사율 평가 시스템의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 2의 A는 전장 dsRNA와 단편 dsRNA의 관계를 나타낸 모식도이고, B는 독성을 증대시키기 위하여 단편 dsRNA들을 조합한 조성을 나타낸 모식도이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
1. 전장 dsRNA
점박이응애에서 주요 기능을 하고 치사효과가 있는 유전자인 TCOPB2(b subunit of coatomer protein complex, 유전자 ID : tetur24g00150)와 TCOPE(Epsilon subunit of coatomer proteion complex, 유전자 ID : tetur08g03990)를 선정하고 각 유전자에 해당하는 dsRNA인 dsTCOPB2(513bp)(서열번호 5)와 dsTCOPE(455bp)(서열번호 6)를 제조하였다.
점박이응애에 dsRNA를 효과적으로 섭취시키고 대량으로 치사유전자를 선별하기 위해 24-웰 챔버(24-well chamber)를 기반으로 한 dsRNA 치사율 평가 시스템을 제작하여 사용하였다. 이 시스템을 사용하면 점박이응애의 이탈을 막고 자연스러운 섭식 유도를 통해 dsRNA 자체의 효과를 검정할 수 있다.
제조된 dsRNA를 기주 식물체인 강낭콩잎에 침투 이행시키고, dsRNA가 흡수된 강낭콩잎을 점박이응애에게 섭취시킨 후 점박이응애의 사충율을 24시간 간격으로 5일 동안 조사하여 dsRNA가 점박이응애에 미치는 독성을 확인하였다. 독성은 반수치사시간(fifty percent lethal time, LT50)으로 평가하였다.
그 결과 dsTCOPB2의 LT50은 117.5시간이고, dsTCOPE의 LT50는 88.9시간으로 점박이응애에 대하여 높은 독성을 나타내었다. 따라서 dsTCOPB2와 dsTCOPE는 점박이응애가 이를 섭식했을 때 점박이응애의 치사를 유도하므로 점박이응애의 방제에 유용하게 사용할 수 있다.
2. 단편 dsRNA
상기 각 표적 유전자 부위를 2개로 나누어 다음과 같은 단편 dsRNA를 제조하였으며, 전장 dsRNA와 단편 dsRNA의 관계를 도 2의 A에 나타내었다:
(1) dsTCOPB2: dsTCOPB2a(262bp)(서열번호 1)와 dsTCOPB2b(235bp)(서열번호 2),
(2) dsTCOPE: dsTCOPEa(200bp)(서열번호 3)와 dsTCOPEb(252bp)(서열번호 4).
상기 단편 dsRNA에 대해 동일한 방법으로 독성을 확인하였다. 그 결과, dsTCOPB2a와 dsTCOPB2b는 LT50 값이 117.1시간과 120.6시간으로 차이가 없었으나, dsTCOPEa와 dsTCOPEb는 LT50 값이 134.9시간과 95.9 시간으로 단편에 따른 독성 차이를 나타내었다. 이는 dsTCOPB2는 양쪽 단편 모두에 독성 유발인자가 분포하는 반면, dsTCOPE는 독성유발 구역이 dsTCOPEb 단편에 주로 존재함을 나타낸다.
따라서, 전장 dsRNA 뿐 아니라 단편 dsRNA인 dsTCOPB2a, dsTCOPB2b, dsTCOPEa 및 dsTCOPEb 만으로도 점박이응애의 방제에 유용하게 사용할 수 있다.
3. 단편 dsRNA의 조성물
치사효과를 증대시키기 위하여 상기 단편들을 조합한 조성물을 다음과 같이 제조하였으며, 각 조성의 모식도를 도 2의 B에 나타내었다:
(1) dsTCOPB2a(서열번호 1) + dsTCOPEa(서열번호 3)
(2) dsTCOPB2a(서열번호 1) + dsTCOPEb(서열번호 4)
(3) dsTCOPB2b(서열번호 2) + dsTCOPEa(서열번호 3)
(4) dsTCOPB2b(서열번호 2) + dsTCOPEb(서열번호 4)
독성을 유발하는 단편들을 혼합하여 처리할 경우, 단편 dsRNA 단독으로 처리하였을 때보다 독성이 증가하였다. 특히 (2) dsTCOPB2a + dsTCOPEb의 조성물과 (4) dsTCOPB2b + dsTCOPEb의 조성물에서 LT50값이 각각 83시간와 69시간으로, 단독으로 처리한 dsRNA 단편들의 LT50값에 비해 현저하게 독성이 증가하였다.
이는 치사 유발 dsRNA의 단편을 조합하였을 때 단독처리구보다 독성이 증대됨을 나타내며, 따라서 이들 조성물을 사용하였을 때 점박이응애의 방제효과가 더 우수하다.
4. 점박이응애 방제용 살비제 조성물
본 발명의 단편 dsRNA 또는 단편 dsRNA 조성물을 유효성분으로 포함하는 점박이응애 방제용 살비제 조성물을 제조한다.
상기 살비제 조성물은 섭식을 통해 점박이응애에 전달되는 것이 바람직하다.
5. 점박이응애의 방제방법
본 발명의 단편 dsRNA 또는 단편 dsRNA의 조성물을 사용하여 점박이응애에서 TCOPB2와 TCOPE 유전자의 발현을 억제하여 점박이응애를 치사시킴으로써 점박이응애를 방제한다.
이때 dsRNA는 섭식을 통해 점박이응애에 전달되는 것이 바람직하다.
6. 재조합벡터
본 발명의 단편 dsRNA 또는 단편 dsRNA의 조성물을 벡터에 도입하여 재조합벡터를 제조한다.
재조합벡터는 당업계에서 공지된 방법들을 이용하여 제조할 수 있다.
7. 형질전환식물
상기 재조합벡터를 이용하여 형질전환된 식물을 만들 수 있다. 대상이 되는 식물은 강낭콩 등과 같이 점박이응애의 방제가 요구되는 주요 원예 및 화훼작물이 될 수 있으며, 당업계에서 공지된 방법을 이용하여 식물을 형질전환시킬 수 있다.
dsRNA는 종특이성이 높으므로, 본 발명의 형질전환식물체는 이상적인 점박이응애의 방제모델이 될 수 있다.
[실시예]
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
전장 dsRNA
1. 유전자의 선정 및 클로닝
점박이응애에서 주요 기능을 하고 치사 효과를 나타내는 유전자로서 TCOPB2와 TCOPE를 선정하였다. 참고 유전자로서 EGFP(Enhaced green fluorescent protein) 유전자를 사용하였다.
TCOPB2, TCOPE, 및 EGFP의 유전자 ID는 하기 표 1에 나타내었고, 이들 유전자의 염기서열은 BOGAS (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/bogas/overview/Tetur)에서 확인할 수 있다.
유전자 ID 표적 유전자
(Target genes)		 유전자 설명 (Gene description)
ABQ10903 EGFP Enhaced green fluorescent protein
tetur24g00150 TCOPB2 Coatomer protein complex, subunit beta 2
tetur08g03990 TCOPE Coatomer subunit epsilon
해당 유전자를 확보하기 위하여, 먼저 점박이응애 PyriF 계통으로부터 Trireagent를 이용하여 총 RNA(total RNA)를 추출하고, cDNA를 합성하였다(Superscript, Invitrogen). 합성된 cDNA를 주형(template)으로 이용하여 하기 표 2에 나타낸 프라이머를 이용하여 95℃/2min, (95℃/20sec + 57℃/20sec + 72℃/1min) × 35주기(cycles) 조건으로 PCR을 수행하여 유전자를 증폭하고 클로닝하였다.
프라이머 목록
표적
유전자		 프라이머명 올리고뉴클레오티드 서열
(Oligonucleotide sequence)		 Amplicon 크기(bp)
EGFP
 5_EGFP_dsRNA T7 promoter sequence 1 + TCGTGACCACCCTGACCTAC 526
3_EGFP_dsRNA T7 promoter sequence + TCGTCCATGCCGAGAGTGAT
TCOPB2
 5_TSSM_COPB_T7_new T7 promoter sequence + TTCGGGAATCTACAACGTTGC 513
3_TSSM_COPB_T7_new T7 promoter sequence + TCAGGTGGAGTATAAACGGCT
TCOPE
 5_T_COP_epsilon_dsRNA T7 promoter sequence + ATCTATCTGATGCTGGATCGA 455
3_T_COP_epsilon_dsRNA T7 promoter sequence + AAAGTGTATTGCCTGGTCAAC
1T7 promoter sequence(프로모터 서열) (TAATACGACTCACTATAGGGAGA)
얻어진 PCR 산물을 pLPS-B Blunt Topo vector에 결찰(ligation)시킨 후 TOP10 수용성 세포(competent cell)에 형질전환(transformation)시킨 후 해당 유전자가 존재하는 플라스미드를 확보하고 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
확인된 플라스미드를 dsRNA 합성을 위한 주형으로 사용하였다. dsRNA 합성을 위해서는 2.5㎍의 PCR 산물이 필요한데, 이를 확보하고자 프라이머로 T7 RNA 서열 테일링(T7 RNA sequence tailing)된 프라이머(Forward primer: T7 promoter sequence + TTCGGGAATCTACAACGTTGC, Reverse primer: T7 promoter sequence + TCAGGTGGAGTATAAACGGCT)를 사용하고 95℃/2min, (95℃/20sec + 57℃/20sec + 72℃/1min) × 3주기, (95℃/20sec + 57℃/20sec + 72℃/1min) × 3주기, (95℃/20sec + 57℃/20sec + 72℃/1min) × 25주기의 조건으로 PCR을 수행하였다. 그 후 필터(Amicon Ultra Centrifugal filters)로 여과하여 PCR 산물을 농축하였고 농축한 PCR 산물은 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동 후 Low DNA Mass Ladder와 비교하여 정량한 후 사용하였다.
2. 전장 dsRNA의 합성
dsRNA 합성을 위하여 각 표적 유전자에 해당하는 농축된 PCR 산물을 주형 DNA로 활용하여 시험관 내 전사(in vitro trasncription)를 수행하였다. 이때 사용된 프라이머는 상기 표 2에 나타낸 바와 같다.
50㎕ 반응액에 사용한 구성성분은 T7 RNA 중합효소 완충액(T7 RNA polymerase buffer), 100mM DTT(dithiothreitol), 100mM rNTP 믹스(mix), 2.5㎕ 리보뉴클레아제 저해제(Ribonuclease Inhibitor), 0.4㎕ T7 RNA 중합효소(polymerase), 및 2.5㎍ DNA 주형이다. 반응액을 조성한 후 37℃에서 4시간 동안 합성하였다.
합성 후 남아 있는 주형 DNA를 제거하기 위하여, 재조합(recombinant) DNaseⅠ을 넣고 37℃에서 20분 동안 배양한 후 0.5M EDTA를 넣고 80℃에서 2분 동안 배양한 다음 DNaseⅠ의 활성을 억제시켰다.
남아 있는 dsRNA는 3M 아세트산나트륨(sodium acetate)을 사용해 농축하여 분리정제한 후 후속 실험에 사용하였다. 실험에 사용할 dsRNA는 -80℃에서 보관하였으며, 실험 전의 정량은 전기영동 후 Low DNA Mass Ladder를 이용한 정량법을 이용하였다.
3. dsRNA 치사율 평가 시스템 제작
표적 유전자에 대한 dsRNA의 살충효과를 실험하기 위한 dsRNA 치사율 평가시스템(MUC screening system)을 제작하였으며, 제작과정을 도 1에 나타내었다.
24-웰 조직 배양 플레이트(24-well tissue culture plate) (길이 127.63mm × 폭 85.47mm × 높이 20.19mm)를 사용하여 폐쇄형 덮개(closed cap)가 있는 24-웰 챔버를 만들었다.
먼저 24-웰 챔버의 덮개부분은 챔버 안의 습도 조절을 위하여 덮개 옆 부분에 구멍을 내어 얇은 망으로 씌우고, 챔버의 아래 부분에는 파라필름(parafilm)으로 덮은 DR(dsRNA reservoir)을 설치하였다. 각 DR을 상기 플레이트의 각 웰에 넣은 후 dsRNA를 분주시켰다. dsRNA 주입이 마무리되면, DR 위에 지름 1.5cm의 강낭콩잎을 올리고 점박이응애를 접종한 후 덮개로 덮었다.
이 시스템을 사용하면 점박이응애가 dsRNA를 효과적으로 섭취할 수 있고 치사유전자를 대량으로 선별할 수 있다.
4. 전장 dsRNA의 독성 평가
강낭콩 잎에 침투 이행된 dsRNA를 점박이응애가 흡즙함으로 나타나는 독성 실험을 진행하였다.
점박이응애를 접종하기 12시간 전에 잎 디스크(leaf disc)를 150㎕(40ng/㎕, EGFP는 80ng/㎕)의 dsRNA에 침지시켜 dsRNA가 잎에 충분히 이행되게 한 후 점박이응애 15마리를 접종하고, 잎이 마르는 것을 방지하기 위해 24시간마다 100㎕(40ng/㎕)의 dsRNA를 보충해주었다. 이 후 0, 24, 48, 72, 96, 120시간 별로 처리구의 사충율을 관찰하였다.
각 실험은 처리구별로 5회 반복하였으며, 독성평가는 반수치사시간(LT50)으로 비교평가하였다. LT50는 SPSS의 프로빗(probit) 회귀분석을 통해 산출하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
점박이응애에 대한 dsRNA의 독성 수준 지표
표적 dsRNA N X2 df P-val Slope ±SE LT50 (h) (95%CI1)
dsEGFP 370 9.9 23 0.992 2.8 ±0.6 178.1
(134.6 ~ 336.9)
dsTCOPB2 296 34.7 18 0.010 6.2 ±0.9 117.5
(105.8 ~ 136.7)
dsTCOPE 355 37.6 23 0.028 4 ±0.5 88.9
(78.5 ~ 106.1)
195%CI는 95% 신뢰구간을 의미함.
<실시예 2>
단편 dsRNA
1. 단편의 선정 및 클로닝
치사 유전자 dsTCOPB2와 dsTCOPE dsRNA의 독성을 증대시키기 위하여 각 표적 유전자 부위를 2개의 단편으로 나누었다.
TCOPB2는 2개의 단편인 TCOPB2a(262bp)와 TCOPB2b(235bp)로 구분하였고, TCOPE도 2개의 단편인 TCOPEa(200bp)와 TCOPEb(252bp)로 구분하였다.
하기 표 4의 프라이머를 사용하여 상기 전장 유전자에서와 동일한 방법으로 PCR 산물을 얻었다.
프라이머 목록
표적
유전자		 프라이머명 올리고뉴클레오티드 서열
(Oligonucleotide sequence)		 Amplicon 크기(bp)
TCOPB2a
 5_COPB2_A T7 promoter sequence + AATCTACAACGTTGCGTTCCT 262
3_COPB2_A T7 promoter sequence + ATACTGTTCAGCCAACAAGGT
TCOPB2b
 5_COPB2_B T7 promoter sequence + GAACAAAGTAAATCAGGCCGA 235
3_COPB2_B T7 promoter sequence + GTGGAGTATAAACGGCTTCTT
TCOPEa
 5_COPE_A_new_2 T7 promoter sequence + CTATCTGATGCTGGATCGAGT 200
3_COPE_A_new_2 T7 promoter sequence + TTCCATTCAAGAGGAGAGGAG
TCOPEb
 5_COPE_B_new T7 promoter sequence + CTGTTGCCCAAATTGGTCAAG 252
3_COPE_B_new T7 promoter sequence + GCAAAGTGTATTGCCTGGTCA
2. 단편 dsRNA 합성
상기 표 4의 프라이머를 사용하여 상기 전장 dsRNA 합성에서와 동일한 방법으로 각 단편 dsRNA를 합성하였다.
3. 단편 dsRNA의 독성평가
상기 전장 dsRNA에서와 동일한 방법으로 dsTCOPB2a, dsTCOPB2b, dsTCOPEa 및 dsTCOPEb에 대한 독성실험을 진행하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
치사 dsRNA 단편의 독성 지표.
표적 dsRNA N X2 df P-val Slope±SE LT50 (h) (95%CI)
dsEGFP 370 9.9 23 0.992 2.8±0.6 178.1 (134.6 ~ 336.9)
dsTCOPB2a 355 51.5 23 0.001 4.1±0.5 117.1 (102.1 ~ 136.9)
dsTCOPB2b 385 87.1 23 0.000 4.4±0.5 120.6 (102.1 ~ 148.1)
dsTCOPEa 340 39.6 23 0.017 3.7±0.5 134.9 (117.6 ~ 163.3)
dsTCOPEb 360 98.1 23 0.000 3.7±0.4 95.9 (76.2 ~ 118.8)
상기 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, dsTCOPB2a와 dsTCOPB2b는 LT50 값이 117.1시간과 120.6시간으로 차이가 없었으나, dsTCOPEa와 dsTCOPEb는 134.9시간과 95.9 시간으로 독성 차이를 나타내었다. 이러한 결과는 dsTCOPB2는 양쪽 단편 모두에 독성 유발인자가 분포하는 반면, dsTCOPE는 독성유발 구역이 dsTCOPEb 단편에 주로 존재함을 나타낸다.
상기 결과로부터, 전장 dsRNA가 아닌 각 단편만으로 점박이응애를 효과적으로 방제할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 3>
단편 dsRNA 조성물
실시예 2의 dsRNA 단편들을 혼합하여 처리할 경우 독성이 증대되는지 확인하기 위하여, dsRNA 단편을 조합하여 다음과 같은 4종류의 조성물을 준비하였으며, 그 모식도를 도 2의 (B)에 나타내었다:
① dsTCOPB2a + dsTCOPEa
② dsTCOPB2a + dsTCOPEb
③ dsTCOPB2b + dsTCOPEa
④ dsTCOPB2b + dsTCOPEb
상기 4종류의 조성물에 대하여 점박이 응애에 대한 독성을 평가하여 LT50을 산출하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
치사 dsRNA 조성물의 독성 지표.
표적 dsRNA N X2 df P-val Slope±SE LT50 (h) (95%CI)
dsEGFP 370 9.9 23 0.992 2.8±0.6 178.1 (134.6 ~ 336.9)
dsTCOPB2a+dsTCOPEa 400 75.0 23 0.000 4±0.4 112.3 (95.7 ~ 134.5)
dsTCOPB2a+dsTCOPEb 213 21.8 13 0.059 6.8±0.8 69 (61.2 ~ 76.8)
dsTCOPB2b+dsTCOPEa 380 43.4 23 0.006 4.5±0.4 91.9 (81.2 ~ 102.9)
dsTCOPB2b+dsTCOPEb 264 26.7 18 0.084 4.4±0.5 83 (73 ~ 93.8)
표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 단편 dsRNA를 조합하여 처리한 경우 단편 dsRNA 단독으로 처리한 경우에 비해 독성이 증가하였다. 특히 dsTCOPB2b+dsTCOPEb 조성물과 dsTCOPB2a+dsTCOPEb 조성물의 경우 LT50이 각각 83시간와 69시간으로, 단독으로 처리한 dsRNA 단편들의 LT50값에 비해 현저하게 독성이 증가하였다.
이러한 결과로부터 치사 유발 dsRNA의 단편을 조합하였을 때 단독처리구보다 독성이 증대됨을 알 수 있다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> dsRNA for the control of Tetranychus urticae, acaricide composition comprising it, method of enhancing toxicity and control method for Tetranychus urticae using it <130> KP-2577 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 262 <212> RNA <213> Tetranychus urticae <400> 1 aaucuacaac guugcguucc uuucauauuu uauuuugggu gauaaagaaa aagcuuugaa 60 ucuuuuaauc gacacuaacc ggcuucccga ggcugcauuc uucgcacgaa ccuaccuucc 120 aucucaugua ccuagaguag uuaaauuaug gaaagaaaau guaauaucga aaaaugaaaa 180 auucgcucaa gccuuggcug aucccaccga auaugaaaac cuguuuccca auuuccaaga 240 caccuuguug gcugaacagu au 262 <210> 2 <211> 235 <212> RNA <213> Tetranychus urticae <400> 2 gaacaaagua aaucaggccg accaaaggca acagauuauc caaccauuca aacuaaugaa 60 gaucgagauc caaucgaaga aacucgagaa gcacuagaau cuggauuauu uguuaagaaa 120 ccauuuguau uccaugaaac aaaccaagac caacaauuaa aaucugaaga gggagagaaa 180 aaggaaauag gagauuuuga ugaggaugac gaugaagaag ccguuuauac uccac 235 <210> 3 <211> 200 <212> RNA <213> Tetranychus urticae <400> 3 cuaucugaug cuggaucgag uugaccuugc ucguaaagaa cugaaaaaaa ugcaagaaaa 60 ggaugaagaa gcaacuuuaa cucagcuugc ucaggcaugg aucaauauuc auguuggcgg 120 cgaaaaguuc caagaagcuu auuacauuua ccaagaguua gcugauaaau auggaccaac 180 uccucuccuc uugaauggaa 200 <210> 4 <211> 252 <212> RNA <213> Tetranychus urticae <400> 4 cuguugccca aauuggucaa ggaaaguacg aggaagugga aucaauuuua caacaagcuc 60 uugaaaaaga uaacaacaac cccgaaacac ugauaaacuu gauucauguu ucucaucaac 120 uugguaaacc gccggaaguu uguaaccgau uccucaguca gcuuaaagau ucuaacagca 180 uucauccuua uguuaaugau cuucagucua aagagaauga guucgaaagg uugaccaggc 240 aauacacuuu gc 252 <210> 5 <211> 513 <212> RNA <213> Tetranychus urticae <400> 5 uucgggaauc uacaacguug cguuccuuuc auauuuuauu uugggugaua aagaaaaagc 60 uuugaaucuu uuaaucgaca cuaaccggcu ucccgaggcu gcauucuucg cacgaaccua 120 ccuuccaucu cauguaccua gaguaguuaa auuauggaaa gaaaauguaa uaucgaaaaa 180 ugaaaaauuc gcucaagccu uggcugaucc caccgaauau gaaaaccugu uucccaauuu 240 ccaagacacc uuguuggcug aacaguauuu aaaugaacaa aguaaaucag gccgaccaaa 300 ggcaacagau uauccaacca uucaaacuaa ugaagaucga gauccaaucg aagaaacucg 360 agaagcacua gaaucuggau uauuuguuaa gaaaccauuu guauuccaug aaacaaacca 420 agaccaacaa uuaaaaucug aagagggaga gaaaaaggaa auaggagauu uugaugagga 480 ugacgaugaa gaagccguuu auacuccacc uga 513 <210> 6 <211> 455 <212> RNA <213> Tetranychus urticae <400> 6 aucuaucuga ugcuggaucg aguugaccuu gcucguaaag aacugaaaaa aaugcaagaa 60 aaggaugaag aagcaacuuu aacucagcuu gcucaggcau ggaucaauau ucauguuggc 120 ggcgaaaagu uccaagaagc uuauuacauu uaccaagagu uagcugauaa auauggacca 180 acuccucucc ucuugaaugg aauugcuguu gcccaaauug gucaaggaaa guacgaggaa 240 guggaaucaa uuuuacaaca agcucuugaa aaagauaaca acaaccccga aacacugaua 300 aacuugauuc auguuucuca ucaacuuggu aaaccgccgg aaguuuguaa ccgauuccuc 360 agucagcuua aagauucuaa cagcauucau ccuuauguua augaucuuca gucuaaagag 420 aaugaguucg aaagguugac caggcaauac acuuu 455

Claims (11)

  1. 서열번호 1 내지 4로 표시되는 dsRNA 중 선택된 하나로서, 점박이응애에서 TCOPB2(b subunit of coatomer protein complex) 또는 TCOPE(Epsilon subunit of coatomer proteion complex) 유전자의 발현을 억제하는, 점박이응애 방제용 dsRNA.
  2. 하기 조성 중 선택된 어느 하나를 포함하는 점박이응애 방제용 dsRNA 조성물:
    (1) 서열번호 1로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2(b subunit of coatomer protein complex) 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 3으로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE(Epsilon subunit of coatomer proteion complex) 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA;
    (2) 서열번호 1로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA;
    (3) 서열번호 2로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 3으로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA; 및
    (4) 서열번호 2로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은,
    서열번호 1로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA의 조성물; 또는
    서열번호 2로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA의 조성물인 것을 특징으로 하는 점박이응애 방제용 dsRNA 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 dsRNA 또는 dsRNA 조성물을 유효성분으로 포함하는 점박이응애 방제용 살비제 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 살비제 조성물은 섭식을 통해 점박이응애에 전달되는 것을 특징으로 하는 살비제 조성물.
  6. dsRNA 단편을 조합함으로써 점박이응애 방제용 dsRNA의 독성을 증대시키는 방법으로서, 상기 조합은 하기 (1) 내지 (4) 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 점박이응애 방제용 dsRNA의 독성 증대 방법:
    (1) 서열번호 1로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2(b subunit of coatomer protein complex) 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 3으로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE(Epsilon subunit of coatomer proteion complex) 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA;
    (2) 서열번호 1로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA;
    (3) 서열번호 2로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 3으로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA; 및
    (4) 서열번호 2로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 조합은,
    서열번호 1로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA의 조합; 또는
    서열번호 2로 표시되며 점박이응애에서 TCOPB2 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA와, 서열번호 4로 표시되며 점박이응애에서 TCOPE 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA의 조합인 것을 특징으로 하는 점박이응애 방제용 dsRNA의 독성 증대 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 dsRNA 또는 dsRNA 조성물을 사용하여 점박이응애를 치사시키는 것을 포함하는 점박이응애의 방제방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 dsRNA 또는 dsRNA 조성물은 섭식을 통해 점박이응애에 전달되는 것을 특징으로 하는 점박이응애의 방제방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 dsRNA 또는 dsRNA 조성물을 포함하는 재조합벡터.
  11. 제10항의 재조합벡터로 형질전환된 식물.
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