KR20210021682A

KR20210021682A - Tlr6 또는 cope 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 총채벌레목 해충의 방제용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210021682A
Application number: KR1020190100878A
Authority: KR
Inventors: 이시혁; 김주현; 김경문; 한승희
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2019-08-19
Filing date: 2019-08-19
Publication date: 2021-03-02
Also published as: KR102226556B1

Abstract

본 발명은 Toll-like receptor 6(TLR6) 단백질; 또는 Coatomer protein subunit epsilon(COPE) 단백질;의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 총채벌레목 해충의 방제용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 총채벌레목 해충의 방제 방법에 관한 것으로, 본 발명에서 확보한 총채벌레의 치사 유전자는 총채벌레 맞춤형 방제에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

TLR6 또는 COPE 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 총채벌레목 해충의 방제용 조성물 및 이의 용도{Composition for controlling thrips comprising TLR6 or COPE protein inhibitors as effective component and uses thereof}

본 발명은 TLR6(Toll-like receptor 6) 또는 COPE(Coatomer protein subunit epsilon) 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 총채벌레목 해충의 방제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

꽃노랑총채벌레(Frankliniella occidentalis)는 곤충강 총채벌레목 총채벌레과에 속하며 1~2 mm 크기의 흡즙성 해충이다. 이들은 다양한 원예 및 화훼작물을 직접적으로 가해하여 상품가치를 저하시킬 뿐만 아니라 여러 식물 바이러스(토마토반점위조바이러스 등)의 매개체로 작용하여 다양한 작물에 막대한 피해를 입힌다. 꽃노랑총채벌레는 웅성단위생식(arrhenotoky)의 생식 특성을 가지고 있으며, 번식력이 강하고 세대가 짧아 새로운 환경에 단시간 내 적응이 가능하다. 꽃노랑총채벌레의 밀도조절을 위하여 전세계적으로 네오니코티노이드(neonicotinoid), 스피노신(spinosyn), 아버멕틴(avermectin) 등의 화학적 방제제를 이용해왔으나, 최근 수십 년 간의 남용으로 인하여 꽃노랑총채벌레는 다양한 종류의 살충제에 저항성을 가지게 되었다. 따라서 효과적인 방제를 위해 RNAi(RNA interference) 등의 대안적인 전략이 필요한 실정이다.

현재 RNAi를 이용한 해충방제 연구는 주로 딱정벌레목과 나비목 해충을 대상으로 이루어지고 있으며, 꽃노랑총채벌레의 경우 기존에 미세주입법과 dsRNA 발현 공생미생물을 이용한 연구가 진행된 바 있으나, 이 방법들은 다양한 종류의 dsRNA의 방제효과를 검증하기에는 비용적인 측면에서 효과적이지 않다는 단점이 있다.

한편, 한국공개특허 제2017-0068567호에는 '인시류 해충에 대해서 유독성이거나 저해성인 신규한 키메릭 살곤충 단백질'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1974265호에는 '총채벌레 방제용 미생물 살충제'가 개시되어 있으나, 본 발명의 TLR6 또는 COPE 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 총채벌레목 해충의 방제용 조성물 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 화학 살충제에 대한 저항성이 발달하여 기존의 살충제로 방제가 어려운 꽃노랑총채벌레에 대한 대체 방제기법으로서 섭식 RNAi 기반 방제 시스템을 확립하고자 꽃노랑총채벌레의 전사체 정보를 바탕으로 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)를 대상으로 dsRNA를 제작하고 이를 총채벌레에 섭식시켜 생물검정을 진행하였다. 그 결과, 테스트한 57종의 유전자 중 TLR6(Toll-like receptor 6)와 COPE(Coatomer protein subunit epsilon) 유전자를 대상으로 제작된 dsRNA가 총채벌레에 대해 높은 치사효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Toll-like receptor 6(TLR6) 단백질; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 Coatomer protein subunit epsilon(COPE) 단백질;의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 총채벌레목 해충의 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 총채벌레목 해충의 방제용 조성물을 총채벌레 발생지에 처리하는 단계를 포함하는, 총채벌레목 해충의 방제 방법을 제공한다.

본 발명의 RNAi 기반 총채벌레 방제기술은 천적 및 기타 환경요인에 무해한 총채벌레 맞춤형 방제를 가능하게 하며, 고도의 선택적인 방제법으로서 친환경적으로 해충 관리를 가능케 한다. 특히, 본 발명에서 확보한 총채벌레의 치사 유전자군은 향후 선진국과의 특허 경쟁에서 우위를 점할 수 있을 뿐만 아니라, 총채벌레를 매개로 한 병원체의 증식 및 전파 억제에도 활용이 가능하다. 또한 본 발명의 기술을 식물 육종 분야와 접목하여 다양한 상업적 응용 역시 기대할 수 있다.

도 1은 본 발명의 dsRNA 생물검정에 이용된 dsRNA 섭식 전달 시스템의 제작 및 조립 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 섭식을 통한 dsRNA의 전달(delivery) 검증을 위해 다양한 농도의 dsRNA로 처리된 엽절편을 식이한 꽃노랑총채벌레의 120시간 뒤 qPCR 결과이다.
도 3은 57종의 dsRNA에 대한 독성 지표(TI) 분석 결과이다. Group A: TI > 0.4, Group B: 0.4 ≥ TI > 0.25, Group C: TI ≤ 0.25.
도 4는 dsRNA를 섭식한 살충제 민감성(A) 및 살충제 저항성(B) 꽃노랑총채벌레의 TLR6, apoLp, COPE 또는 SAM50 유전자 발현 수준을 분석한 qPCR 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Toll-like receptor 6(TLR6) 단백질; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 Coatomer protein subunit epsilon(COPE) 단백질;의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 총채벌레목 해충의 방제용 조성물을 제공한다.

총채벌레(thrips)는 원예 및 화훼 작물에 막대한 피해를 유발하는 미소해충으로, 점박이응애와 마찬가지로 크기가 0.3~0.5 mm이고 반배수성(haplodiploid) 양식을 지니고 있으며, 세대수가 짧아 다른 해충에 비해 살충제 저항성 발달이 빠른 특징이 있다.

본 발명의 총채벌레목 해충 방제용 조성물에 있어서, 상기 TLR6 또는 COPE 단백질은 각각 서열번호 1 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 TLR6 또는 COPE 단백질의 범위는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명에 따른 총채벌레목 해충의 방제용 조성물에 있어서, 상기 TLR6 또는 COPE 단백질의 발현 억제제는, 바람직하게는 TLR6 또는 COPE 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 dsRNA(double stranded RNA), siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 TLR6 또는 COPE 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 dsRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 TLR6 또는 COPE 유전자는 각각 GenBank accession number XM_026424128.1 및 XM_026418702.1의 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 TLR6 또는 COPE 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 dsRNA는 서열번호 2 또는 4의 염기서열로 이루어진 것이 더 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 상기 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기서열은 dsRNA에서 센스(sense) 가닥의 염기서열을 의미하는 것으로, 표적 TLR6 또는 COPE에 결합하는 안티센스(antisense) 가닥은 상기 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기서열과 상보적인 서열로 이루어진 것일 수 있다.

TLR6 또는 COPE 유전자 표적 dsRNA 서열

표적 유전자	dsRNA 서열
TLR6	CGTCAACCGTGACACCTTCTCGGGCCTCGTCCGCCTCGTCGTGCTCAACCTGGCCCACAACGTCATCACGCGCGTGGACGCTCAGGTGTTCCAAGACCTGTACAGCCTGCAGATCCTCAGCCTGGACCATAACGGCATCGAGGTGATCGCGGAGGGCGCCTTCTCTGCTCTCAGCAACCTGCACGCCCTCACCCTCTCCCACAACAACCTGGTGCGCCTCGAGTCGTACCACTTCTCTGGGCTGTACGTGCTGCACCAGCTGTATGTGGACCACAACCGCCTGCAGGCCGTGCACGCGCAGGCCTTCGAGAACTGCTCCAACATGCAGGACCTGAGCATGGCCGGCAACAACCTGACCGAGGTCCCCGCGGGCCTGACGCACCTGCACTTCCTCAAGACGCTGGACATGGGCGAGAACCGCATCACGACGCTGTCTAACGAGTCGTTCCACGGACTGGACCAGCTGTACGGCTTGCGCCTCATAGACAACCGGGT (서열번호 2)
COPE	CCGAGCTTACATTGCACAGAAAAAGTTCAGAGTTGTCCTCGATGAAGTACACAGTGGTTCACCTCCACCTCTACTCCCAATTCGCCTTCTTGCCGAATACTTTGGGTCTCCTCAAAGAAGGATTGAATTAGTTCAGCAGTTAGAGCAAATGCTGTCAAGCGGAGTGACAGGCTACAAACATTTGCTGATTCTCACAGCTGCCACTATTTACTGTCAAGAGGGTAATTATGAAGCAGCTCTTCGAGTTCTCCATCAAGGGGATCATTTAGAATATAATGCTTTAAATCTCCACATCTATTTGCGAATGGATCGTAAGGACCTTGCTAGAAAAGAGCTCAAAATCATGCAAGAACGCGATGATGATGCCACTTTAACTCAGTTGTCCCAAGCCTGGCTGAATATTGCATTAGGAGGAGAAAAGATGCTCCAGGATGCTTACTATATCTTTCAGGAGATGGTAGACAAGTATGGATCTACATCTTTGCTGCTGAATGGACAAG (서열번호 4)

RNA 간섭(RNA interference; RNAi)이란 본래 동물이나 식물 등의 진핵생물에서 바이러스 면역에 관여하는 시스템이다. RNAi 기술은 이중가닥 RNA(dsRNA)가 세포내로 유입되어 일어나는 유전자 침묵(gene silencing) 현상이다. dsRNA가 세포 내로 전달되면 dsRNA를 20개 내외의 뉴클레오티드로 절단하는 기능을 하는 다이서(Dicer) 효소에 의해 dsRNA가 인지되면서 반응은 개시된다. 절단된 dsRNA는 siRNA라 불리며 다양한 종류의 핵산분해 효소와 함께 RISC(RNA-induced silencing complex)를 형성하게 된다. 그 후 RISC 내로 로딩된 siRNA의 안티센스 가닥(가이드 가닥)에 의해, 상보적인 서열을 가진 목적 mRNA의 서열 부위가 절단되고 그로 인해 mRNA의 빠른 분해가 일어나게 되어 목적 mRNA에 의해 코딩된 단백질의 생성이 억제된다. RNA 간섭은 유전자 특이적이며 강력한 영향력을 가지기 때문에 특정한 유전자를 표적으로 한 dsRNA를 합성하여 원하는 유전자의 발현을 억제할 수 있다는 이점으로 농업해충방제, 형질전환식물 등 다양한 분야에서 활용되고 있다.

또한, 본 발명에 따른 총채벌레목 해충의 방제용 조성물에 있어서, 상기 TLR6 또는 COPE 단백질의 활성 억제제는 TLR6 또는 COPE 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 항체는 본 발명의 TLR6 또는 COPE 단백질에 상보적으로 결합할 수 있는 것으로, 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 상기 다클론 항체는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있으며, 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 상기 단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV(Epstein-barr virus)-하이브리도마 기술이 포함된다.

본 발명에 따른 총채벌레목 해충의 방제용 조성물에 있어서, 상기 총채벌레목 해충은 꽃노랑총채벌레(Frankliniella occidentalis), 담배총채벌레(F. tenuicornis), 대만총채벌레(F. intonsa), 백합총채벌레(F. lilivora), 오이총채벌레(Thrips palmi Karny) 또는 파총채벌레(Thrips tabaci Lindeman)일 수 있고, 바람직하게는 꽃노랑총채벌레일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 총채벌레목 해충의 방제용 조성물은 예를 들어, 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 총채벌레목 해충의 방제용 조성물은 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

적합한 고형 담체 물질은 원칙적으로, 모두 다공성이고, 농업적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 광물토류(예컨대 실리카, 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 고령토, 석회암, 석회, 초크, 보울, 황토, 점토류, 백운석, 규조 토류, 황산칼슘, 황산 마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄 합성물질), 비료(예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아), 식물성 제품(예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목분(wood meal) 및 견과 껍질 가루) 또는 셀룰로오스 분말일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 고형 담체는 1종류 또는 2종류 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.

본 발명은 또한, 상기 총채벌레목 해충의 방제용 조성물을 총채벌레 발생지에 처리하는 단계를 포함하는, 총채벌레목 해충의 방제 방법을 제공한다. 본 발명의 총채벌레목 해충의 방제용 조성물은 총채벌레의 Toll-like receptor 6(TLR6) 단백질; 또는 Coatomer protein subunit epsilon(COPE) 단백질;의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 것으로, 상기 TLR6 또는 COPE 단백질의 발현 또는 활성을 억제하여 총채벌레의 치사(lethal)를 유도할 수 있다.

본 발명의 방제 방법에 있어서, 상기 처리는 총채벌레를 방제하기 위해 방제용 조성물을 물로 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 총채벌레 발생지에 살포하거나, 총채벌레에 섭식시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 '유효량'은 유익한 또는 원하는 결과를 일으키기에 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 방제 방법에 따른 총채벌레목 해충은 전술한 것과 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 총채벌레 준비

살충제 민감성 꽃노랑총채벌레(Frankliniella occidentalis)는 농촌진흥청으로부터 분양받았으며, 25±1℃의 온도, 55±5%의 상대습도 및 16시간 명/8시간 암의 광주기 조건으로 강낭콩(Phaseolus vulgaris) 떡잎을 먹이로 공급하며 키웠다. 1,100배의 에마멕틴 벤조에이트(emamectin benzoate), 50배의 스피노사드(spinosad) 및 40배의 클로르페나피르(chlorfenapyr)에 저항성을 보이는 다중 살충제 저항성 꽃노랑총채벌레는 경기도 농업기술원의 온실 내 국화 식물체로부터 수집하였다.

2. 유전자 선정 및 dsRNA 주형 제작

농촌진흥청으로부터 분양받은 암컷 성체와 약충 각 50마리로부터 유리 균질기와 TRI 시약(Molecular Research Center, Inc., 미국)을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. DNase I을 처리하여 잔존하는 게노믹 DNA를 제거하였다. 추출한 RNA는 mRNA 준비에 사용하였고, cDNA 라이브러리는 일루미나사의 TruSeq Stranded mRNA LT Sample Preparation Kit를 사용하여 제작하였다. 다중 cDNA 라이브러리는 NovaSeq 6000 Sequence System(Illumina, 미국)을 이용하여 paired-end sequenced로 준비하였다. Trimmed 리드 서열들을 HISTAT2 프로그램(Illumina)과 Human Genome Sequencing Center(HGSC)의 정보를 사용하여 꽃노랑총채벌레의 참조 게놈 서열과 맵핑하고, 맵핑한 리드의 전사체 어셈블리는 StringTie 프로그램(Center for computational biology, Johns Hopkins Univ.)과 FPKM(Fragment per kilobase of transcript per million mapped reads) 값을 산출하여 진행하였다. FPKM 값[log2(FPKM+1)]의 Quantile normalization 후, 암컷 성체와 약충간 DGE(differential gene expression)를 분석하였다.

T7 프로모터 서열을 포함하는 ~500 bp 크기의 dsRNA 주형은 E-RNAi dsRNA designing 프로그램(https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai 3/)을 이용하여 디자인하였다. 각 유전자의 dsRNA 제작 전 주형(template)이 되는 DNA를 확보하기 위하여, 암컷 꽃노랑총채벌레로부터 추출한, DNase I가 처리된 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA와, dsRNA 표적부위를 포함하며 양 끝에 T7 프로모터 서열을 추가한 프라이머(표 2 내지 표 5)를 이용하여 PCR을 수행하여 dsRNA 제작을 위한 주형 DNA를 증폭하였다. PCR 증폭 조건은 하기와 같다: 95℃/3분 → [95℃/30초 → 56℃/30초 → 72℃/1분] × 5주기(cycles) → [95℃/30초 → 70℃/30초 → 72℃/1분] × 35주기.

3. dsRNA 합성

dsRNA 합성은 상기 방식으로 증폭한 PCR 산물을 주형으로 하여 Megascript T7 transcription kit(Invitrogen, 미국)을 사용하여 시험관 내 전사(in vitro transcription)로 진행하였다. T7 RNA 중합효소 완충액 2 ㎕, rATP·rGTP·rCTP·rUTP 각각 2 ㎕, T7 RNA 중합효소 2 ㎕ 및 200 ng의 DNA 주형 8 ㎕를 이용, 20 ㎕ 반응액을 혼합하여 37℃에서 15시간 합성을 진행하였다. dsRNA 합성이 완료된 후 DNase I를 37℃에서 15분간 처리하여 남아있는 DNA 주형을 제거한 후, dsRNA는 리튬 클로라이드 침전법(Lithium chloride precipitation)을 이용해 분리정제하여 물(nuclease-free water)에 녹여 -70℃에 보관하였다. 실험 전 해당 dsRNA의 농도를 분광광도계를 이용하여 측정 후 사용하였다.

4. dsRNA 생물검정 시스템 제작

본 발명에서 이용한 dsRNA 생물검정 용기(bioassay chamber)는 3D 프린터로 일괄 제작하였다. 용기는 도 1과 같이 하단에서 상단의 순서로 유닛(unit) C, B, A 세 부분으로 이루어져 있으며, 조립시 내부가 모두 이어지는 36 mm 높이의 원통형이 된다. 생물검정시, 유닛 C 내부의 지름 16 mm, 깊이 1 mm의 원통형 공간에 dsRNA 용액 150 ㎕를 넣고 강낭콩 엽절편(leaf disc)를 뒤집어 올린 후 위아래가 뚫린 원기둥 형태의 유닛 B를 조립한다. 그 후, 엽절편 위에 총채벌레 10마리를 접종하고 유닛 A로 닫아 이용한다. 상기와 같이 제작된 dsRNA 생물검정 시스템은 제조된 dsRNA가 기주 식물체인 강낭콩 엽절편에 침투 및 이행되고, dsRNA가 흡수된 강낭콩 엽절편을 총채벌레가 섭취하여 dsRNA가 전달되는 시스템이다.

5. quantitative RCR(qPCR)

엽절편의 섭식을 통해 dsRNA가 총채벌레로 전달되는지 확인하기 위해, 우화 후 2-3일째의 암컷 총채벌레 10마리를 이용하여, 5가지 농도(0, 50, 100, 200 및 500 ng/㎕)의 Amace1 dsRNA 용액을 엽절편에 처리한 후 섭식시켰다. 120 시간 후 총채벌레를 회수하고 dsRNA 섭식의 상대적인 양을 qRCR을 통해 측정하였다. 꽃노랑총채벌레의 RPS32(ribosomal protein small subunit 32) 유전자를 내부 참조 유전자로 사용하였다.

또한, 선발된 유전자를 표적으로 하는 dsRNA의 독성평가(총채벌레에 대한 dsRNA의 치사 효과) 후에 총채벌레로부터 총 RNA를 추출하여 효적 유전자의 발현 수준을 quantitative RCR로 분석하였다. qRCR에 사용된 프라이머의 정보는 하기 표 6과 같다.

6. 통계처리

모든 통계학적 분석은 GraphPad Prism (Ver.6, GraphPad Inc., 미국) 프로그램을 이용하였으며, 유의성 검증은 one-way ANOVA 후 Tukey's test 또는 Student's t test로 결정하였다.

실시예 1. 표적 유전자 선발

약충과 성충의 전사체 분석 결과에서 꽃노랑총채벌레에서 생명활동에 필수적인 기능을 하는 하우스키핑 유전자 중 약충과 성충에서 유사한 발현 수준(1.7배 이하)을 보이는 57개의 유전자를 선정하였다. 선발된 유전자들은 세포 신호 전달, 소화, 배설, 면역 반응, 대사, 변태, 단백질 분해, 단백질 발현, 구조 및 수송 단백질 등으로 분류되었다. 기능이 확인되지 않는 6개의 꽃노랑총채벌레 특이적 유전자도 포함되어 있다. 해당 유전자들은 표 7에 나타낸 바와 같고, 각 유전자의 염기서열은 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy)에서 확인 가능하다. 실험 대조군에는 꿀벌 Amace1(acetylcholinesterase 1) 유전자를 이용하였다.

실시예 2. 생물검정 시스템을 이용한 dsRNA의 독성평가

섭식을 통한 dsRNA의 전달(delivery) 검증을 위해 꿀벌 Amace1 유전자에 대한 dsRNA를 다양한 농도로 처리한 엽절편을 식이한 꽃노랑총채벌레로부터 총 RNA를 추출하고, 상기 추출한 RNA를 시료로 하여 Amace1 유전자의 수준을 qPCR로 분석하였다. 그 결과, dsRNA 농도 의존적으로 dsRNA가 검출되는 것을 알 수 있었고(도 2), 섭식에 의해 dsRNA가 총채벌레내로 효과적으로 전달될 수 있음을 알 수 있었다.

dsRNA의 독성은 우화한지 2-3일된 살충제 감수성 총채벌레와 저항성 총채벌레를 이용하여 평가하였다. 상기 dsRNA 생물검정 시스템으로 총채벌레에 dsRNA를 섭식(100 ng/㎕ 용액 150 ㎕, 15 ㎍ dsRNA/chamber)시킴으로써 독성평가를 진행하였고, 매 24시간마다 치사율을 확인하여 dsRNA의 치사력을 측정하였다. 총 120시간 동안 치사율을 확인하였고, 대조군(꿀벌의 Amace1 dsRNA 섭식)의 치사율을 반영한 보정치사율(corrected mortality)과 그에 대한 반수치사시간(LT₅₀)을 계산하였다. 또한, 보정치사율과 반수치사시간을 모두 반영하는 독성 지표(toxicity index, 보정치사율/반수치사시간)를 도입하여 dsRNA 간의 치사효과를 비교하였다.

그 결과 도 3에서 확인되는 것과 같이, TLR6, apoLp, COPE 또는 SAM50 유전자를 표적으로 하는 dsRNA를 처리한 군에서 독성 지표가 높게 확인되었다. 특히, 상기 4개의 유전자는 살충제 감수성 및 저항성 총채벌레 모두에 대해서 우수한 독성 지표를 나타내어, 총채벌레 방제를 위한 신규한 치사 유전자 후보가 될 수 있음을 유추할 수 있었다(표 8).

dsRNA 생물검정 120 시간 후의 치사율, LT₅₀ 및 독성 지표 분석

Target gene	Insecticide-susceptible F. occidentalis			Insecticide-resistant F. occidentalis
Target gene	Corrected Mortality (%)	LT₅₀	Toxicity Index (TI)^a	Corrected Mortality (%)	LT₅₀	Toxicity Index (TI)^a
TLR6	58.7	105.1	0.558	57.8	97.2	0.594
apoLp	56.3	107.4	0.525	57.8	105.5	0.548
COPE	55.0	118.9	0.463	47.6	131.5	0.362
SAM50	52.0	124.9	0.416	61.0	100.2	0.609
^a Toxicity Index (TI) = Corrected mortality (%) at 120 h post-treatment / LT₅₀

또한, 각각의 유전자에 대한 mRNA의 상대적 발현수준을 확인한 결과, 도 4에 개시된 것과 같이 살충제 감수성 및 저항성 총채벌레 모두에서 TLR6, apoLp, COPE 또는 SAM50 유전자의 발현 수준이 dsRNA 섭식에 의해 감소된 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 통해 총채벌레의 방제를 위해 dsRNA를 섭식시키는 것이 효과적이며, TLR6, apoLp, COPE 또는 SAM50 유전자의 발현 저해는 살충제 저항성 총채벌레에 대해서도 높은 치사 효과를 나타내므로, 상기 유전자들의 발현을 저해하는 물질을 이용하여 총채벌레 방제제를 개발할 수 있음을 시사하였다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Composition for controlling thrips comprising TLR6 or COPE protein inhibitors as effective component and uses thereof <130> PN19226 <160> 144 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1380 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Frankliniella occidentalis <400> 1 Met Ala Asn Ala Lys Thr Thr Met Met Leu Leu Trp Ile Ser Ala Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ala Cys Ala Ala Ala Arg Ser Val Val Leu Pro Ser Asp Ala 20 25 30 Pro Arg Asp Cys Glu Trp Val Pro Gly Ala Glu Ala Ala Asp Gly Ala 35 40 45 Asp Val Ser Leu Ser Glu Ser Ala Ala Val Leu Ala Cys Lys Leu Arg 50 55 60 Thr Ile Gly Gly Thr Asp Gly Leu Leu Ala Asn Leu Thr Ala Gln Gln 65 70 75 80 Ala Glu Arg Val Thr Ala Leu Arg Leu Glu Cys Ser Asp Val Leu Phe 85 90 95 Phe Glu Ser Ser Leu Glu Glu Pro Arg His Ala Gly Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Phe Leu Gly Gln Leu Arg Ala Leu Arg Arg Leu Ser Ile Glu His Cys 115 120 125 Lys Ile Arg Tyr Val Pro Gly Ser Val Leu Ala Pro Leu Arg Asp Leu 130 135 140 Arg His Leu Ser Ile Arg Thr His Asn Thr Asp Trp Ser Ala Met Ala 145 150 155 160 Met Glu Phe Asn Ser Glu Ser Phe Arg Gly Leu Ala Glu Leu Arg Ser 165 170 175 Leu Asp Leu Ala Asp Asn Asn Val Trp Thr Met Pro Pro Glu Leu Phe 180 185 190 Cys Pro Leu Ser Gly Leu Thr His Leu Asn Leu Ser Arg Asn Lys Leu 195 200 205 Gln Asn Ala Met Glu Leu Gly Phe Ser Asp Trp Gly Glu Gly Pro Ala 210 215 220 Ala Pro Gly Lys Ser Cys Asn Ala Ala Leu Glu Glu Leu Asp Leu Ser 225 230 235 240 Ser Asn Ala Leu Thr Ala Leu Pro Asp Asn Gly Phe Thr Ser Leu Arg 245 250 255 Ser Leu Gln Lys Leu Phe Leu Gln Asp Asn Ala Ile Ala Ala Leu Ala 260 265 270 Asp Arg Ala Phe Val Gly Leu Val Ala Leu Gln Thr Leu Asn Val Ser 275 280 285 Ser Asn Arg Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Leu Phe Gln Ser Ser Arg 290 295 300 Asp Leu Arg Glu Leu His Leu His Asn Asn Ser Ile Ser Val Leu Ala 305 310 315 320 Pro Gly Leu Leu Glu Gly Leu Asp Gln Leu Gln Val Leu Asp Leu Ser 325 330 335 Gly Asn Glu Leu Ser Ser Ser Cys Val Asn Arg Asp Thr Phe Ser Gly 340 345 350 Leu Val Arg Leu Val Val Leu Asn Leu Ala His Asn Val Ile Thr Arg 355 360 365 Val Asp Ala Gln Val Phe Gln Asp Leu Tyr Ser Leu Gln Ile Leu Ser 370 375 380 Leu Asp His Asn Gly Ile Glu Val Ile Ala Glu Gly Ala Phe Ser Ala 385 390 395 400 Leu Ser Asn Leu His Ala Leu Thr Leu Ser His Asn Asn Leu Val Arg 405 410 415 Leu Glu Ser Tyr His Phe Ser Gly Leu Tyr Val Leu His Gln Leu Tyr 420 425 430 Val Asp His Asn Arg Leu Gln Ala Val His Ala Gln Ala Phe Glu Asn 435 440 445 Cys Ser Asn Met Gln Asp Leu Ser Met Ala Gly Asn Asn Leu Thr Glu 450 455 460 Val Pro Ala Gly Leu Thr His Leu His Phe Leu Lys Thr Leu Asp Met 465 470 475 480 Gly Glu Asn Arg Ile Thr Thr Leu Ser Asn Glu Ser Phe His Gly Leu 485 490 495 Asp Gln Leu Tyr Gly Leu Arg Leu Ile Asp Asn Arg Val Arg Thr Val 500 505 510 Pro Lys Asp Thr Phe Ser Ala Leu Pro Ser Leu Gln Ile Leu Asn Leu 515 520 525 Ala Asp Asn Gln Val Glu Thr Val Glu Arg Gly Ala Phe Gly Thr Ser 530 535 540 Pro Thr Leu His Ala Ile Arg Leu Asp Gly Asn Arg Leu Thr Asp Ile 545 550 555 560 Ser Asp Met Phe His Asp Leu Pro Gly Leu Val Trp Leu Asn Val Ser 565 570 575 Ala Asn Ala Ile Ala Trp Phe Asp Tyr Ala Leu Leu Pro Asn Ser Leu 580 585 590 Glu Trp Leu Asp Met His Gln Asn Arg Ile Glu Arg Leu Lys Asn Tyr 595 600 605 Phe Glu Lys Asp Gly Glu Leu Gln Ile Lys Met Leu Asp Ala Ser Tyr 610 615 620 Asn Leu Ile Thr Glu Ile Gly Glu Ser Asn Val Pro Asn Ser Val Glu 625 630 635 640 Thr Leu Leu Leu Asn Asn Asn His Ile Arg Glu Val Arg Pro Asn Thr 645 650 655 Phe Ala Arg Lys Thr Asn Leu Ser Arg Val Val Leu Tyr Ala Asn Arg 660 665 670 Ile Glu Lys Met Glu Leu Ala Ala Leu His Leu Ala Pro Val Pro Glu 675 680 685 Asp Arg Glu Leu Pro Gln Phe Phe Ile Gly Gly Asn Pro Phe Tyr Cys 690 695 700 Asp Cys Thr Met Glu Trp Leu Gln Arg Ile Asn Gln Leu Ser His Leu 705 710 715 720 Arg Gln His Pro Arg Val Leu Asp Leu Asp Ser Val Thr Cys Arg Leu 725 730 735 Ala His Ser Arg Gly Ser Pro Thr Arg Pro Leu Leu Asp Leu Val Pro 740 745 750 Ala Gln Phe Leu Cys Pro Tyr Glu Thr His Cys Phe Ala Leu Cys His 755 760 765 Cys Cys Glu Phe Asp Ala Cys Asp Cys Glu Met Thr Cys Pro Asp Asn 770 775 780 Cys Thr Cys Tyr His Asp His Ser Trp Ala Ser Asn Val Val Asp Cys 785 790 795 800 Ser Asn Ala Gly Tyr Gln Gln Val Pro Gln Gly Ile Pro Met Asp Ala 805 810 815 Thr Glu Ile Tyr Leu Asp Gly Asn Asn Leu Thr Asp Leu Gly Ser His 820 825 830 Val Phe Ile Gly Lys Lys Lys Leu Gln Val Leu Tyr Leu Asn Gly Ser 835 840 845 Arg Ile Asp Thr Ile His Asn Arg Thr Phe Asn Gly Ala Thr Ser Leu 850 855 860 Arg Val Leu His Met Glu Asn Asn His Leu Gln Glu Leu Arg Gly Glu 865 870 875 880 Glu Phe Asp Pro Leu Lys Asn Leu Asn Glu Leu Tyr Leu Asp His Asn 885 890 895 Ala Ile Thr Lys Val Gly Asn Lys Thr Phe Ala Ala Met Arg Glu Leu 900 905 910 Glu Val Leu Arg Leu Asp Asp Asn Lys Ile Glu Asp Phe Lys Pro Trp 915 920 925 Gln Gln Leu Ala Ala Ala Ser Glu Gly Gly Arg Leu Ala Gln Val Ser 930 935 940 Leu Asp Gly Asn Leu Trp Thr Cys Asp Cys Glu His Val Pro Gln Ile 945 950 955 960 Glu Ala Trp Leu Arg Asp Asn Thr Asn Val Ala Val Ser Met Arg Cys 965 970 975 Ala Gly Ser Thr Glu Thr Leu Gln Glu Val Val Ala Arg Cys Ser Ser 980 985 990 Asp Ala Ser Gln Asn Val Val Ala Thr Ser Val Val Gln Arg Gly Thr 995 1000 1005 Val Tyr Thr Ala Pro Leu Leu Asn His Asp Tyr Val Thr Ile Val Ala 1010 1015 1020 Ala Thr Leu Ala Gly Val Val Val Val Leu Leu Val Leu Ala Leu Val 1025 1030 1035 1040 Phe Ile Phe Arg His Asp Val Arg Leu Trp Ala Tyr Ala Arg Tyr Gly 1045 1050 1055 Val Arg Ile Leu Ser Asp Pro Ala Ala Glu Ala Gly Asp Glu Lys Asp 1060 1065 1070 Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Tyr Ser Val Lys Asp Glu Asp Phe 1075 1080 1085 Val Ser Gln Val Val Ala Ala Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Ser Leu 1090 1095 1100 Cys Leu His Tyr Arg Asp Ile His Leu Met Ser Gly Gly Ala Ser Tyr 1105 1110 1115 1120 Leu Ala Asp Ala Val Leu Gly Ala Ser Asp Ala Ser Arg Arg Val Val 1125 1130 1135 Leu Val Leu Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asn Glu Trp Ala Arg Pro Glu 1140 1145 1150 Phe Arg Ala Ala Leu Gln Ala Ser Leu Glu Gln Lys Arg Ala Ala Met 1155 1160 1165 Arg Arg His Lys Val Ile Leu Leu Leu Thr Thr Ala Leu Asp Ala Val 1170 1175 1180 Thr Leu Asp Pro Glu Leu Gln Leu Leu Leu Arg Thr Cys Thr Val Ile 1185 1190 1195 1200 Ser Trp Gly Glu Lys Arg Phe Trp Glu Lys Leu Arg Tyr Ala Met Pro 1205 1210 1215 Asp Val Ala Leu Gln Gln Arg Lys Lys Arg Ala Ala Ala Ala Pro Val 1220 1225 1230 Thr Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val Glu Gly Gly Pro Ala Arg Tyr Thr 1235 1240 1245 Ala Ala Pro Thr Ser Leu Asp Ala Trp Tyr Lys Tyr Ser Val Pro Gln 1250 1255 1260 His Phe Met Gln Pro Gly Val His Ser Ala Cys Ala Leu Arg His His 1265 1270 1275 1280 Glu Asp Asp Arg Ala Ser Thr Ala Ser Pro His His Gln Asp Gln Ala 1285 1290 1295 Gln Gln Gln Leu Tyr Asn Tyr Ala Thr Ala Pro Ser Glu Gln Ser Gln 1300 1305 1310 His Ser Tyr Val Ser Ile Asp Arg His Asn Pro Tyr Gly Leu His His 1315 1320 1325 Ser Phe Arg Arg Gln Arg Asp Ser His Val Tyr Ser Thr Ile Pro Asp 1330 1335 1340 Thr Ser Cys Gln Pro Ala Leu Cys Arg Leu Ala Asn Gly Glu Phe Ala 1345 1350 1355 1360 Val Ile Gln Ala Ala Pro Gly Gln Cys Pro Gly Gly Ala Pro Gly Arg 1365 1370 1375 Thr Tyr Phe Val 1380 <210> 2 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA for TLR6 <400> 2 cgtcaaccgt gacaccttct cgggcctcgt ccgcctcgtc gtgctcaacc tggcccacaa 60 cgtcatcacg cgcgtggacg ctcaggtgtt ccaagacctg tacagcctgc agatcctcag 120 cctggaccat aacggcatcg aggtgatcgc ggagggcgcc ttctctgctc tcagcaacct 180 gcacgccctc accctctccc acaacaacct ggtgcgcctc gagtcgtacc acttctctgg 240 gctgtacgtg ctgcaccagc tgtatgtgga ccacaaccgc ctgcaggccg tgcacgcgca 300 ggccttcgag aactgctcca acatgcagga cctgagcatg gccggcaaca acctgaccga 360 ggtccccgcg ggcctgacgc acctgcactt cctcaagacg ctggacatgg gcgagaaccg 420 catcacgacg ctgtctaacg agtcgttcca cggactggac cagctgtacg gcttgcgcct 480 catagacaac cgggt 495 <210> 3 <211> 304 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Frankliniella occidentalis <400> 3 Met Thr Pro Arg Gln Gln Gly Asp Val Asp Glu Leu Phe Asp Val Lys 1 5 10 15 Asn Ser Phe Phe Ile Gly Asn Tyr Thr Gln Cys Ile Lys Glu Ala Glu 20 25 30 Asn Asn Asp Lys Val Ser Thr Glu Glu Leu Arg Phe Glu Arg Leu Gly 35 40 45 Phe Met Tyr Arg Ala Tyr Ile Ala Gln Lys Lys Phe Arg Val Val Leu 50 55 60 Asp Glu Val His Ser Gly Ser Pro Pro Pro Leu Leu Pro Ile Arg Leu 65 70 75 80 Leu Ala Glu Tyr Phe Gly Ser Pro Gln Arg Arg Ile Glu Leu Val Gln 85 90 95 Gln Leu Glu Gln Met Leu Ser Ser Gly Val Thr Gly Tyr Lys His Leu 100 105 110 Leu Ile Leu Thr Ala Ala Thr Ile Tyr Cys Gln Glu Gly Asn Tyr Glu 115 120 125 Ala Ala Leu Arg Val Leu His Gln Gly Asp His Leu Glu Tyr Asn Ala 130 135 140 Leu Asn Leu His Ile Tyr Leu Arg Met Asp Arg Lys Asp Leu Ala Arg 145 150 155 160 Lys Glu Leu Lys Ile Met Gln Glu Arg Asp Asp Asp Ala Thr Leu Thr 165 170 175 Gln Leu Ser Gln Ala Trp Leu Asn Ile Ala Leu Gly Gly Glu Lys Met 180 185 190 Leu Gln Asp Ala Tyr Tyr Ile Phe Gln Glu Met Val Asp Lys Tyr Gly 195 200 205 Ser Thr Ser Leu Leu Leu Asn Gly Gln Ala Ala Cys Phe Met Gly Gln 210 215 220 Gly Lys Tyr Gln Glu Ala Gln Ser Val Leu Gln Glu Ala Leu Asp Lys 225 230 235 240 Asp Ser Asn Ala Pro Asp Thr Leu Ile Asn Met Thr Ala Leu Ser His 245 250 255 Tyr Leu Gly Lys Ala Pro Glu Val Ala Asn Arg Tyr Leu Ser Gln Leu 260 265 270 Gln Asp Ser His Ala Asp Asn Asp Phe Val Lys Glu Tyr Asn Gln Lys 275 280 285 Thr Ser Glu Phe Gln Arg Leu Cys Lys Gln Tyr Ser Val Thr Ser Ser 290 295 300 <210> 4 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA for COPE <400> 4 ccgagcttac attgcacaga aaaagttcag agttgtcctc gatgaagtac acagtggttc 60 acctccacct ctactcccaa ttcgccttct tgccgaatac tttgggtctc ctcaaagaag 120 gattgaatta gttcagcagt tagagcaaat gctgtcaagc ggagtgacag gctacaaaca 180 tttgctgatt ctcacagctg ccactattta ctgtcaagag ggtaattatg aagcagctct 240 tcgagttctc catcaagggg atcatttaga atataatgct ttaaatctcc acatctattt 300 gcgaatggat cgtaaggacc ttgctagaaa agagctcaaa atcatgcaag aacgcgatga 360 tgatgccact ttaactcagt tgtcccaagc ctggctgaat attgcattag gaggagaaaa 420 gatgctccag gatgcttact atatctttca ggagatggta gacaagtatg gatctacatc 480 tttgctgctg aatggacaag 500 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 taatacgact cactataggg ggagacggag gacgtggat 39 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 taatacgact cactataggg gtcgagtata cgcctccctg 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 taatacgact cactataggg gagcgctacc gcatcttagt 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 taatacgact cactataggg tcctcctcct gttctcttgc 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 taatacgact cactataggg cctagcctgg ttgtgcatct 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 taatacgact cactataggg tcaacatggt ttctggcaaa 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 taatacgact cactataggg tggatactac gaccatcgcc 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 taatacgact cactataggg tcttcccatc gtcccacttc 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 taatacgact cactataggg aacaaacgac tgtccttgcc 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 taatacgact cactataggg gcgtctttgg tggcagtaag 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 taatacgact cactataggg tttggaaaga gcccgtaaaa 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 taatacgact cactataggg aatcatcggt tgagcttccc 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 taatacgact cactataggg gaccatggcc atcacttacc 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 taatacgact cactataggg tttgaatgag accagtggca 40 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 taatacgact cactataggg catcgctcgt ccttcgttat g 41 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 taatacgact cactataggg gttccatcat acggtgactc 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 taatacgact cactataggg gcgagataaa ccaatgtggc 40 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 taatacgact cactataggg cgacaacaca cctctcagga 40 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 taatacgact cactataggg aggcgaatgg tcagcttatg 40 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 taatacgact cactataggg gtgaaatgct tcccttctcg 40 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 taatacgact cactataggg agaggatagc gcaagagctg 40 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 taatacgact cactataggg aaaaagattt ttcggccacc 40 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 taatacgact cactataggg acaatacaga acctggcgct 40 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 taatacgact cactataggg cacgaagtcg tccaaacctc 40 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 taatacgact cactataggg ggagctgaac ggcattaagt 40 <210> 30 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 taatacgact cactataggg gatgagaacg tagcaacgca 40 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 taatacgact cactataggg gctctgttcg acaacaacga 40 <210> 32 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 taatacgact cactataggg gaacgcgtcg tactggaagt 40 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 taatacgact cactataggg cgtcaaccgt gacaccttc 39 <210> 34 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 taatacgact cactataggg acccggttgt ctatgaggc 39 <210> 35 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 taatacgact cactataggg agcttcacga ctgtggcctt g 41 <210> 36 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 taatacgact cactataggg cagacagcgt ccttgcagta 40 <210> 37 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 taatacgact cactataggg acaaacacag caacgaatgc 40 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 taatacgact cactataggg attgcatttt tcgcaggaga 40 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 taatacgact cactataggg cctgaggtcg atatggcatt 40 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 taatacgact cactataggg ttgctctttg gtggttcctt 40 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 taatacgact cactataggg gctactttcg cccacatctc 40 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 taatacgact cactataggg attgcaccag tgtcatcagg 40 <210> 43 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 taatacgact cactataggg aggtggtggt tactgggtag g 41 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 taatacgact cactataggg tcgtctgacc aagggaagag 40 <210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 taatacgact cactataggg ggatgtctgg ctcagctatg 40 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 taatacgact cactataggg gtgtaattgc caggttctgc 40 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 taatacgact cactataggg ttcaggctga tgagatggtg 40 <210> 48 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 taatacgact cactataggg acagtggatc gcttctgacc 40 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 taatacgact cactataggg caagatccgt caccgtaagc 40 <210> 50 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 taatacgact cactataggg agtactcgac ccggtagcct 40 <210> 51 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 taatacgact cactataggg tgtttctttc tccaggtcgg 40 <210> 52 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 taatacgact cactataggg caaacaaaac ttgccctgct 40 <210> 53 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 taatacgact cactataggg tttgagcacc actgagcaac 40 <210> 54 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 taatacgact cactataggg tccaccggaa agtctcaaag 40 <210> 55 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 taatacgact cactataggg gcagaaggag aagtgggaga 40 <210> 56 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 taatacgact cactataggg tcatgctcat gccaggtcta 40 <210> 57 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 taatacgact cactataggg ctgacggtaa gggatccaaa 40 <210> 58 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 taatacgact cactataggg tcaccaggga cagttgctat c 41 <210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 taatacgact cactataggg ggccaaagac aagaagaagc 40 <210> 60 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 taatacgact cactataggg ccatttcacg ctccatttct 40 <210> 61 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 taatacgact cactataggg caagaaccat cgtcaccaaa 40 <210> 62 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 taatacgact cactataggg gaaagcacga gtcacaccct 40 <210> 63 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 taatacgact cactataggg tggcgtgtga agaaaactgt 40 <210> 64 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 taatacgact cactataggg ctcctgcttg aattcgcatc 40 <210> 65 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 taatacgact cactataggg accatcgtca ccaaaccagt 40 <210> 66 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 taatacgact cactataggg tacggaaagc acgagtcaca 40 <210> 67 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 taatacgact cactataggg agcagcagca acaactcaag 40 <210> 68 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 taatacgact cactataggg ctccccagtg tgagttcgag 40 <210> 69 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 taatacgact cactataggg gagcagtggg agaacacca 39 <210> 70 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 taatacgact cactataggg gacgtgtacg tgtcccagg 39 <210> 71 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 taatacgact cactataggg ggagatcata gacattgtta 40 <210> 72 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 taatacgact cactataggg ctgtcaggtc aacattcaaa 40 <210> 73 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 taatacgact cactataggg ggtaccatgg actctgtccg 40 <210> 74 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 taatacgact cactataggg catggtgagg gaaacgagat 40 <210> 75 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 taatacgact cactataggg tgtgaatctg ctctcttcca 40 <210> 76 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 taatacgact cactataggg catcccttgt gctgctgtaa 40 <210> 77 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 taatacgact cactataggg tcagctggtc ttcgaccttt 40 <210> 78 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 taatacgact cactataggg ggtgaagggt aaggctgtga 40 <210> 79 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 taatacgact cactataggg gtcgtgccgt cgtgtttat 39 <210> 80 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 taatacgact cactataggg gatatgctaa cccgaagca 39 <210> 81 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 taatacgact cactataggg cagagggact ccatcagat 39 <210> 82 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 taatacgact cactataggg gccctctagt atgaggctc 39 <210> 83 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 taatacgact cactataggg cttaaacacc cccgaaaaca 40 <210> 84 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 taatacgact cactataggg aaatctcagg gccaaggaat 40 <210> 85 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 taatacgact cactataggg agacagtccg tgtctgggat 40 <210> 86 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 taatacgact cactataggg gaatcatgac cagcagcaaa 40 <210> 87 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 taatacgact cactataggg cttggtctgc gatgcttaca 40 <210> 88 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 taatacgact cactataggg ctgcagcttc ataacgcaca 40 <210> 89 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 taatacgact cactataggg ccgagcttac attgcacaga 40 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 taatacgact cactataggg cttgtccatt cagcagcaaa 40 <210> 91 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 taatacgact cactataggg tgttggggtt gttgatgtgt 40 <210> 92 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 taatacgact cactataggg cctccatgat gattcctcca 40 <210> 93 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 taatacgact cactataggg agagcaatcc agaagccaaa 40 <210> 94 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 94 taatacgact cactataggg taccaaaggc tcaacagcag 40 <210> 95 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 95 taatacgact cactataggg ctgaggttta tgcctccgtt 40 <210> 96 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 taatacgact cactataggg attgacgatg gacttcaggg 40 <210> 97 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 taatacgact cactataggg gagtcctcgc tggaggaag 39 <210> 98 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 taatacgact cactataggg gcttgggtgg acctaacgat 40 <210> 99 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 taatacgact cactataggg gtgtcagcca acaacgagaa 40 <210> 100 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 taatacgact cactataggg caaacagcaa caatggaacg 40 <210> 101 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 taatacgact cactataggg gtacacattc gtgtttgccg 40 <210> 102 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 taatacgact cactataggg atttgtgcaa ctgtgccatc 40 <210> 103 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 taatacgact cactataggg agagcagctt tctgtgattg g 41 <210> 104 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 104 taatacgact cactataggg atctgttcac ttcgacccca 40 <210> 105 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 taatacgact cactataggg gcccagcttt tcttgacttt t 41 <210> 106 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 taatacgact cactataggg aaggcactga agcaaccatt 40 <210> 107 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 taatacgact cactataggg acctcagcac accagaggac 40 <210> 108 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 108 taatacgact cactataggg gaagtatcca ttgtctgcgc t 41 <210> 109 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 109 taatacgact cactataggg gatggtcttc cacgctgttc 40 <210> 110 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 110 taatacgact cactataggg cctgtagtca ccgtcaggct 40 <210> 111 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 111 taatacgact cactataggg gtagcggtgc cttattcagc 40 <210> 112 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 112 taatacgact cactataggg atgttcagcc atggcgtagt 40 <210> 113 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 113 taatacgact cactataggg ccacgttcaa gatcagcatc 40 <210> 114 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 114 taatacgact cactataggg ccagttgttg gtgaccagg 39 <210> 115 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 115 taatacgact cactataggg gtgcctacgg tgtctgtgaa 40 <210> 116 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 116 taatacgact cactataggg cccctgggaa cttaattcgt 40 <210> 117 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 117 taatacgact cactataggg tgagtgtgtc aactggcagc 40 <210> 118 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 118 taatacgact cactataggg ttcctgaccg gcatctttta 40 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 119 ccgcctcact gacatatctg 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 120 tgcggttctg gtgcatgtcg 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 121 atcctcttgg ttccagctgc 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 122 agtcaagggg gttgagagtg 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 123 agaagcccag tctgttctcc 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 124 gctgactaag gtagcggttg 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 125 ggcagaacat gcgacttgca 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 126 cctattccaa actgcaaccc 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 127 ccagtaggag caccagttca 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 128 cgaggttgcg tactatctcc 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 129 gtcgggctga tcatgttgac 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 130 cttccagttc cttcacgagg 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 131 gcactgtgtt tgtgccacac 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 132 cgtgaggtaa tgaagtagcc 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 133 tatgtgcacc tacgtgtggg 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 134 gcgaagtgtg tatccatggc 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 135 cgaggtcaag aacatcgtgg 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 136 tggacgtgat gaggttctgc 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 137 ctggctggtc agccattatc 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 138 gcatgagatt cccactcttc 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 139 agctgatcgt ttcccaagcc 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 140 gcaggagctt cacagtaacc 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 141 cttgggcttt gcgaccgaac 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 142 tcgacacgag gcgcacgttg 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 143 ttggaaactc cgtggctgtg 20 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 144 attcggccag agccaacatc 20

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 TLR6(Toll-like receptor 6) 단백질; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 COPE(Coatomer protein subunit epsilon) 단백질;의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 총채벌레목 해충의 방제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 TLR6 또는 COPE 단백질의 발현 억제제는 TLR6 또는 COPE 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 dsRNA, siRNA, shRNA 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 총채벌레목 해충의 방제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 TLR6 또는 COPE 단백질의 활성 억제제는 TLR6 또는 COPE 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머인 것을 특징으로 하는 총채벌레목 해충의 방제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 총채벌레목 해충은 꽃노랑총채벌레(Frankliniella occidentalis), 담배총채벌레(F. tenuicornis), 대만총채벌레(F. intonsa), 백합총채벌레(F. lilivora), 오이총채벌레(Thrips palmi Karny) 또는 파총채벌레(Thrips tabaci Lindeman)인 것을 특징으로 하는 총채벌레목 해충의 방제용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 총채벌레목 해충의 방제용 조성물을 총채벌레 발생지에 처리하는 단계를 포함하는, 총채벌레목 해충의 방제 방법.
제5항에 있어서, 상기 총채벌레목 해충의 방제용 조성물을 총채벌레목 해충에 섭식시키는 것을 특징으로 하는, 총채벌레목 해충의 방제 방법.