CN115484815A - 用于在大豆中表达rna指导的核酸酶和dna结合蛋白的改进多核苷酸 - Google Patents

用于在大豆中表达rna指导的核酸酶和dna结合蛋白的改进多核苷酸 Download PDF

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CN115484815A CN202180025334.2A CN202180025334A CN115484815A CN 115484815 A CN115484815 A CN 115484815A CN 202180025334 A CN202180025334 A CN 202180025334A CN 115484815 A CN115484815 A CN 115484815A
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Abstract

披露了获得植物细胞、植物和植物部分的方法，这些植物细胞、植物和植物部分包括大豆植物细胞、植物和植物部分，包含提供编码的RNA指导的核酸内切酶(RGE)、RNA指导的切口酶(RGN)和RNA指导的DNA结合蛋白的增加的表达的合成的多核苷酸。还提供了包含合成的多核苷酸的大豆植物细胞、植物和植物部分，这些合成的多核苷酸提供编码的RNA指导的核酸内切酶(RGE)、RNA指导的切口酶(RGN)和RNA指导的DNA结合蛋白的增加的表达。

Description

用于在大豆中表达RNA指导的核酸酶和DNA结合蛋白的改进多 核苷酸
相关申请的引用
该国际专利申请要求2020年9月8日提交的美国临时专利申请号63/075,395；2020年8月31日提交的美国临时专利申请号63/072,585；2020年3月30日提交的美国临时专利申请号63/001,806的权益；其各自通过引用以其整体并入本文。
序列表的并入
包含名为“10071WO01”的文件的序列表(该文件为793,473字节(在
Figure BDA0003867941360000011
中测量))包含188个生物序列，创建于2021年3月16日，通过USPTO的EFS系统以电子方式提交，并通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本披露总体上涉及包含合成的多核苷酸的方法和组合物，其提供编码的RNA指导的核酸内切酶(RGE)、RNA指导的切口酶(RGN)和核酸酶缺陷型受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)在大豆细胞、植物和植物部分中增加的表达。
背景技术
针对噬菌体和病毒的细菌获得性免疫的CRISPR/Cas系统已被应用于基因组修饰和基因表达控制的有效新技术。CRISPR/Cas系统组分表达的改进可以提供改进的基因组修饰频率和改进的基因表达控制。
衍生自不同物种的基因在同义密码子的平均使用方面可能有很大差异。在植物中，双子叶植物通常具有比单子叶植物更低GC含量的编码序列。在设计具有目标编码蛋白质的最佳表达的转基因时，通常设计转基因的核酸以模拟预期宿主的密码子使用。
发明内容
修饰植物基因组中的内源植物基因(例如大豆基因组中的大豆基因的方法)包括：向包含编码RNA指导的核酸内切酶(RGE)或RNA指导的切口酶(RGN)的合成的多核苷酸的大豆植物细胞中引入针对该内源大豆基因中的靶编辑位点的指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸和任选地与该靶编辑位点具有同源性的供体模板DNA分子，其中所述合成的多核苷酸：(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％、48％或50％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码RGE或RGN的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或i、ii和iii的任何组合；以及选择包含该内源植物基因或大豆基因修饰的经修饰的植物细胞或大豆植物细胞、植物或大豆植物、植物部分或大豆植物部分、植物组织或大豆组织、或植物愈伤组织或大豆愈伤组织。
提供了修饰大豆基因组中的内源大豆基因的方法，这些方法包括向大豆植物细胞中引入：编码RNA指导的核酸内切酶(RGE)(例如Cas12j RGE)或RNA指导的切口酶(RGN)的合成的多核苷酸，其中所述合成的多核苷酸具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％、48％或50％，具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度，具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码RGE或RGN的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，或所述GC含量、所述Tm和所述较低sCAI的任何组合；指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸，该指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸针对该内源大豆基因中的靶编辑位点；和任选地与该靶编辑位点具有同源性的供体模板DNA分子；并且选择包含内源大豆基因修饰的经修饰的大豆植物细胞、大豆植物、大豆植物部分、大豆组织或大豆愈伤组织。
提供了修饰大豆基因组中内源大豆基因表达的方法，这些方法包括：向大豆植物细胞中引入：(i)编码包含核酸酶缺陷型受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)的蛋白质的合成的多核苷酸；例如，Cas12j ndRGDBP)，其中所述合成的多核苷酸具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％、48％或50％，具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度，具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，或所述GC含量、Tm和sCAI的任何组合；和(ii)指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸，该指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸针对内源大豆基因中的靶结合位点；并且选择其中内源大豆基因的表达已经被修饰的经修饰的大豆植物细胞、大豆植物、大豆植物部分、大豆组织或大豆愈伤组织。
大豆植物细胞包含编码蛋白质的合成的多核苷酸，该蛋白质包含RNA指导的核酸内切酶(RGE；例如，Cas12j RGE)、RNA指导的切口酶(RGN)或核酸酶缺陷型的受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDB；例如，Cas12j ndRGDB)，其中所述多核苷酸：具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％、48％或50％；具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码RGE的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或该GC含量、Tm和sCAI的任何组合。还提供了大豆植物、包括种子或豆荚的大豆植物部分，以及包括包含大豆细胞的分生组织、胚胎组织和/或愈伤组织的大豆组织。
还披露了用于获得本文披露的任何上述或以其他方式提供的大豆植物细胞的方法，该方法包括：(a)将编码包含该RNA指导的核酸内切酶(RGE)、该RNA指导的切口酶(RGN)或该核酸酶缺陷型受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)的蛋白质的合成的多核苷酸引入该大豆植物细胞，其中所述多核苷酸具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％、48％或50％；具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码RGE的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；所述GC含量、Tm和较低sCAI的任何组合；以及(b)选择包含该合成的多核苷酸的大豆植物细胞。
提供了包含失活性Cas12j突变的分离的和重组的核酸。
附图说明
图1描绘了大豆(Glycine max或soybean)的密码子使用数据库表，来自万维网上的https网站“kazusa.or.jp/codon/”。
图2显示了对来自表达载体的大豆细胞表达的核酸酶水平的蛋白质印迹检测，该表达载体含有：GC含量约为37.5％的CasSoy_1.1.1大豆密码子优化的参考多核苷酸(SCORP)(左侧)或具有GC含量约为49.5％的编码序列的测试Cas Soy1.1.S多核苷酸(中间)。模拟转染的对照大豆细胞在右侧。
图3显示了用双子叶植物优化(左侧)和大豆优化(中间)表达载体转化的番茄和大豆原生质体的基因组编辑效率。模拟转染阴性对照在右侧。
具体实施方式
定义
在本文使用的情况下，术语“和/或”应当被视为具有或不具有其他指定特征情况下两个或更多个指定特征或组分中的每一个的特定披露。因此，如在本文“A和/或B”等短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、和“B”(单独)。同样地，如在“A、B、和/或C”等短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施例中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
如本文所用，术语“Cas12j”和“CasΦ”在本文中可互换使用以指代RNA定向核酸酶的相同分组。
如本文所用，术语“Cpf1”和“Cas12a”在本文中可互换使用以指代RNA定向核酸酶的相同分组。
如本文所用，术语“Cas12e”和“CasX”在本文中可互换使用以指代RNA定向核酸酶的相同分组。
如本文所用，短语“供体模板DNA分子”是指与靶编辑位点具有同源性的dsDNA或ssDNA分子。供体模板DNA分子可用于通过同源定向修复来编辑基因组中的靶编辑位点。
如本文所用，“异源”是指分别未在天然核酸或蛋白质中发现的核苷酸或多肽序列。例如，相对于RGE、RGN或ndRGDBP多肽，异源多肽包含来自不同于RGE、RGN或ndRGDBP多肽的蛋白质的氨基酸序列。在一些情况下，来自一个物种的RGE、RGN或ndRGDBP蛋白的一部分与来自不同物种的Cas蛋白的一部分融合。因此，可以认为来自每个物种的Cas序列相对于彼此是异源的。作为另一个实例，可以将RGE、RGN或ndRGDBP蛋白(例如，dCas蛋白)融合到来自非Cas蛋白(例如，组蛋白去乙酰化酶)的活性结构域，并且活性结构域的序列可以考虑为异源多肽(与Cas蛋白异源)。
如本文所用，术语“包括(include、includes和including)”应被解释为至少具有它们所指的特征而不排除任何另外的未指定特征。
如本文所用，术语“相应(correspond，corresponding)”等，当在任何给定RGE、RGN或ndRGDBP多肽中相对于参考RGE、RGN或ndRGDBP的氨基酸位置、突变和/或取代的上下文中使用时，均指当使用成对比对算法(例如，具有默认参数的CLUSTAL O 1.2.4)将给定的RGE、RGN或ndRGDBP多肽与参考RGE、RGN或ndRGDBP多肽序列进行比对时，与参考多肽序列中的氨基酸残基具有同一性或相似性的给定RGE、RGN或ndRGDBP序列中氨基酸残基的位置、突变和/或取代。
如本文所用，术语“包括(include、includes和including)”应被解释为至少具有它们所指的特征而不排除任何另外的未指定特征。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA，基因组DNA，cDNA，DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合体。术语“多核苷酸”和“核酸”应理解为包括(如适用于所描述的实施例)单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括基因编码和非基因编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有经修饰的肽骨架的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于，具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合蛋白(这些融合蛋白具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基)；经免疫标记的蛋白；等等。
如本文所用，如应用于核酸、蛋白质、细胞或生物体的术语“天然存在的”是指在自然界中发现的核酸、细胞、蛋白质或生物体。
如本文所用，术语“分离的”意在描述处于与多核苷酸、多肽或细胞天然存在的环境不同的环境中的多核苷酸、多肽或细胞。分离的经基因修饰的宿主细胞可以存在于经基因修饰的宿主细胞的混合群体中。
如本文所用，术语“外源核酸”是指在自然界中给定的细菌、生物体或细胞中通常或天然不存在和/或不由其产生的核酸。如本文所用，术语“内源核酸”是指通常在自然界中给定的细菌、生物体或细胞中存在和/或由其产生的核酸。“内源核酸”也称为“天然核酸”或对给定细菌、生物体或细胞“天然”的核酸。
如本文所用，“重组”是指特定核酸(DNA或RNA)是克隆、限制性酶切和/或连接步骤的各种组合的产物，产生具有结构编码或非编码序列(其与自然系统中发现的内源性核酸不同)的构建体。通常，编码结构编码序列的DNA序列可以从cDNA片段和短寡核苷酸接头或从一系列合成的寡核苷酸组装，以提供合成的核酸，该合成的核酸能够从包含在细胞中或在无细胞转录和翻译系统中的重组转录单元表达。此类序列可以以不受内部非翻译序列或内含子(其通常存在于真核基因中)中断的开放阅读框的形式提供。包含相关序列的基因组DNA也可用于形成重组基因或转录单位。非翻译DNA序列可以存在于开放阅读框的5'或3'处，其中此类序列不干扰编码区的操作或表达，并且确实可以通过各种机制调节期望产物的产生(参见“DNA调节序列”，见下文)。
因此，例如，术语“重组”多核苷酸或“重组”核酸是指非天然存在的，例如，通过人工干预将另外两个分开的序列区段人工组合制成。这种人工组合通常通过化学合成手段或通过人工操作分离的核酸区段(例如通过基因工程技术)来完成。通常这样做是为了用编码相同或保守氨基酸的冗余密码子替换密码子，同时通常引入或去除序列识别位点。可替代地，将所期望功能的核酸区段连接在一起以产生所期望的功能组合。这种人工组合通常通过化学合成手段或通过人工操作分离的核酸区段(例如通过基因工程技术)来完成。
类似地，术语“重组”多肽是指非天然存在的多肽，例如，通过人工干预将两个原本分开的氨基序列区段人工组合制成。因此，例如，包含异源氨基酸序列的多肽是重组的。
短语“大豆密码子适应指数”(sCAI)是指根据图1的大豆密码子偏倚表计算的给定多核苷酸编码序列的密码子适应指数。在某些实施例中，本主题的合成的多核苷酸和参考多核苷酸的sCAI可以从http:internet site“genomes.urv.es/CAIcal/”(Puigbo等人Biology Direct[生物指导],3:38)使用图1的大豆密码子偏倚表获得。在某些实施例中，本主题的合成的多核苷酸和参考多核苷酸的sCAI可以根据以下公式计算，其中相对同义密码子使用值是根据Sharp和Li.1987.Nucleic Acids Research[核酸研究].15(3)；1281-1295由以下公式从图1的大豆密码子偏倚表计算得出的。
CAI＝CAI观察/CAI最大
Figure BDA0003867941360000071
Figure BDA0003867941360000072
其中RSCU(相对同义密码子使用)是基因中第k个密码子的RSCU值，RSCUk最大是基因中第k个密码子编码的氨基酸的最大RSCU值，并且L是基因中密码子的数量；并且其中根据以下公式计算RCSU
Figure BDA0003867941360000073
其中Xij是第i个氨基酸的第j个密码子的出现次数，ni是第i个氨基酸的替代密码子的数量(从1到6)。
短语“大豆密码子优化的参考多核苷酸”或首字母缩略词“SCORP”是指编码多肽的多核苷酸，其中参考多核苷酸的序列是通过Puigbo P.等人2007 OPTIMIZER:A web serverfor optimizing the codon usage of DNA sequences[OPTIMIZER:用于优化DNA序列密码子使用的网络服务器].Nucleic Acids Research[核酸研究],35:W126-W131中提出的OPTIMIZER程序和图1中提出的大豆密码子偏倚表从多肽序列生成。
“构建体”或“载体”是指重组核酸，通常是重组DNA，其已经为表达和/或增殖一个或多个特定多核苷酸序列的目的而产生，或将用于构建其他重组多核苷酸序列。
本文可互换使用的术语“DNA调节序列”、“控制元件”和“调节元件”是指转录和翻译控制序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号等，其提供和/或调节宿主细胞中编码序列的表达和/或编码多肽的产生。
如本文所用的短语“靶位点”或“靶编辑位点”是指以下多核苷酸序列的任何或所有：(i)由与指导RNA复合的RGE或RGN结合；(ii)包含与指导RNA复合的RGE或RGN的核酸内切酶或切口酶切割位点；和/或(iii)由与邻近RGE的核酸内切酶切割位点的序列具有同源性的供体模板DNA分子结合。
如本文所用的短语“靶DNA结合位点”是指由与指导RNA复合的ndRGDBP结合的多核苷酸序列。
术语“转化”在本文中与“遗传修饰”可互换使用，是指在将新核酸(例如，细胞外源性DNA)引入细胞后在细胞中诱导的永久性或瞬时遗传变化。遗传改变(“修饰”)可以通过将新核酸掺入宿主细胞的基因组中，或通过将新核酸瞬时或稳定地维持为附加型元件来实现。当细胞是真核细胞时，通常通过将新DNA引入细胞的基因组中来实现永久性遗传改变。在原核细胞中，可以将永久性变化引入染色体或通过诸如质粒和表达载体的染色体外元件引入，这些元件可能包含一种或多种选择标记以帮助它们在重组宿主细胞中的维持。合适的遗传修饰方法包括病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等。方法的选择通常取决于被转化细胞的类型和发生转化的环境(例如，体外、离体或体内)。这些方法的一般性讨论可以在Ausubel等人,Short Protocols inMolecular Biology[分子生物学简短方案],第3版,约翰·威利父子出版社(Wiley&Sons),1995中找到。
“可操作地连接”是指一种并列关系，其中如此描述的组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。如本文所用，术语“异源启动子”和“异源控制区”是指通常不与自然界中的特定核酸相关联的启动子和其他控制区。例如，“与编码区异源的转录控制区”是在自然界中通常不与编码区相关联的转录控制区。在其他实例中，两个或更多个编码不同多肽组分的不同多核苷酸序列可以可操作地连接。当两个不同的多肽组分(例如RGE、RGN或ndRGDBP和异源多肽)可操作地连接时，产生了融合多肽，其中每个不同的多肽组分可以执行其预期功能。在某些实施例中，这样的融合多肽可以通过可操作地连接的多核苷酸的转录和翻译或通过可操作地连接的多核苷酸(例如，其中多核苷酸是RNA分子)的翻译来产生。
如本文所用，“宿主细胞”表示体内或体外真核细胞、原核细胞或来自作为单细胞实体培养的多细胞生物体(例如细胞系)的细胞，这些真核或原核细胞可以被或已经被用作核酸(例如，表达载体)的受体，并且包括已经被核酸进行基因修饰的原始细胞的后代。可以理解，由于自然的、偶然的或故意的突变，单个细胞的子代可能不一定在形态上或在基因组或总DNA互补序列方面与原始亲代完全相同。“重组宿主细胞”(也称为“经基因修饰的宿主细胞”)是其中已引入异源核酸例如表达载体的宿主细胞。例如，主题原核宿主细胞是经基因修饰的原核宿主细胞(例如，细菌)，这是通过将异源核酸(例如对原核宿主细胞来说是外来的(通常在自然界中不存在)的外源核酸，或在原核宿主细胞中通常不存在的重组核酸)引入合适的原核宿主细胞；并且主题真核宿主细胞是经基因修饰的真核宿主细胞，这是通过将异源核酸(例如对真核宿主细胞来说是外来的外源核酸，或在真核宿主细胞中通常不存在的重组核酸)引入合适的真核宿主细胞。
术语“保守氨基酸取代”是指蛋白质中具有相似侧链的氨基酸残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸由丝氨酸和苏氨酸组成；具有含酰胺侧链的一组氨基酸由天冬酰胺和谷氨酰胺组成；具有芳香族侧链的一组氨基酸由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸组成；具有碱性侧链的一组氨基酸由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成；具有含硫侧链的一组氨基酸由半胱氨酸和甲硫氨酸组成。示例性的保守氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
多核苷酸或多肽与另一个多核苷酸或多肽具有一定百分比“序列同一性”，意思是当对齐时，碱基或氨基酸百分比相同，且在比较两个序列时处于相同的相对位置。序列相似性可以以多种不同方式确定。为了确定序列同一性，可以使用可在万维网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST上获得的方法和计算机程序(包括BLAST)来比对序列。参见，例如，Altschul等人(1990),/.Mol.Biol.[分子生物学]215:403-10。另一种比对算法是FASTA，可从美国威斯康星州麦迪逊市的遗传学计算组(GCG)(牛津分子集团公司(OxfordMolecular Group,Inc.)的全资子公司)包中获得。其他用于比对的技术描述于以下中：Methods in Enzymology[酶学中的方法],第266卷:Computer Methods forMacromolecular Sequence Analysis[大分子序列分析的计算机方法](1996),编辑Doolittle,学术出版社(Academic Press,Inc.),Harcourt Brace&Co.公司的分公司,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国。特别感兴趣的是允许序列中存在缺口的比对程序。史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)是允许序列比对中出现缺口的算法。参见Meth.Mol.Biol.[分子生物学方法]70:173-187(1997)。此外，使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序可用于比对序列。参见/.Mol.Biol.[分子生物学]48:443-453(1970)。CLUSTAL和MUSCLE是其他常用的比对程序。
如本文所用，术语“治疗”(“treatment”、“treating”)等是指获得所期望的性状、药理和/或生理效果。效果可以是赋予期望的性状(例如提高的产率、对昆虫、真菌、细菌病原体和/或线虫的抗性、除草剂耐受性、非生物胁迫耐受性(例如，干旱、寒冷、盐和/或热耐受性)、蛋白质数量和/或质量、淀粉数量和/或质量、脂质数量和/或质量、次生代谢物数量和/或质量等，所有这些都与缺乏该修饰的对照植物相比。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的和/或就疾病和/或归因于该疾病的副作用的部分或完全治愈而言，可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对植物或哺乳动物例如人疾病的任何治疗，并且包括：(a)在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中预防该疾病发生；(b)抑制该疾病，例如阻止其发展；和(c)缓解该疾病，例如导致该疾病消退。
如本文所用，“Tm”是使用以下公式计算的双链DNA序列的熔化温度：
Tm(℃)＝(7.35×E)+[17.34×ln(长度)]+[4.96×ln(浓度)]+[0.89×ln(DNA)]-25.42
其中Tm＝预测的熔化温度；E＝DNA强度参数/碱基＝累积DNA强度参数/DNA序列长度；Len＝核苷酸序列长度(碱基对数)；Conc＝[Na+]溶液浓度(摩尔)＝0.16M；DNA＝总核苷酸链浓度＝0.0001g/mL，根据Khandelwal G,Bhyravabhotla J(2010)PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]5(8):e12433.doi.org/10.1371/journal.pone.0012433的方法。
应当理解，本披露限于所描述的特定实施例，因为这样当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅是为了描述具体实施例的目的，而并不意图是限制性的，因为本披露的范围仅由所附权利要求限定。
除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本披露的实践或测试，但现在描述了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以披露和描述与引用该出版物相关的方法和/或材料。
必须注意的是，如本文和所附权利要求所用，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“合成的多核苷酸”或“本主题的合成的多核苷酸”包括多个这样的多核苷酸并且提及“指导RNA”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种指导RNA及其等价物，等等。还应注意，可以起草权利要求以排除任何任选要素。因此，此陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。
应当理解，为清楚起见在单独的实施例的上下文中描述的本披露的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的本披露的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合来提供。与本披露有关的实施例的所有组合都被本披露特别地包含并且在本文中披露，就好像每一种组合都被单独且明确地披露一样。此外，各种实施例及其要素的所有子组合也被本披露特别地包括并且在本文中披露，就好像每个这样的子组合在本文中单独且明确地披露一样。
在任何前述定义与通过引用并入本文的任何专利或非专利参考文献、本文引用的任何专利或非专利参考文献或在别处找到的任何专利或非专利参考文献中提供的定义不一致的程度情况下，应当理解，在此将使用该前述定义。
描述
本披露提供了大豆植物细胞、植物和植物部分(例如，种子、胚和/或分生组织)，其包含合成的多核苷酸，该合成的多核苷酸提供编码的RNA指导的核酸内切酶(RGE)、RNA指导的切口酶(RGN)和核酸酶缺陷型受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)的增加的表达。本披露还提供了植物细胞、植物和植物部分(例如，种子、胚和/或分生组织)，例如大豆或玉米植物细胞、植物和植物部分，其包含合成的多核苷酸，该合成的多核苷酸提供编码的RNA指导的核酸内切酶(RGE)和核酸酶缺陷型受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)的增加的表达。还提供了使用合成的多核苷酸和植物或植物材料(例如包含合成的核苷酸的大豆细胞、大豆植物和大豆植物部分)以在那些植物或植物材料(例如，大豆细胞、大豆植物和大豆植物部分)中获得改善的基因组修饰频率和改善的基因表达控制的方法。还提供了制备包含合成的多核苷酸的植物或植物材料(例如大豆细胞、大豆植物和大豆植物部分)的方法。还提供了包含植物细胞(例如大豆细胞)和合成的多核苷酸的组合物。在某些实施例中，编码RGE、RGN、ndRDGP或包含它们的融合多肽的合成的多核苷酸的表达与编码相同RGE、RGN、ndRDGP或融合多肽的大豆密码子优化的参考多核苷酸(SCORP)的表达相比增加。这种表达的增加可以反映为与包含编码RGE、RGN、ndRDGP或融合多肽的SCORP的对照大豆细胞、大豆植物和大豆植物部分相比，在大豆细胞、大豆植物和大豆植物部分中RGE、RGN、ndRDGP或融合多肽的积累和/或生物活性(例如修饰序列的频率和/或内源大豆基因的表达)增加。
编码本文披露的RGE、RGN和ndRGDBP的本主题的合成的多核苷酸可以通过一个或多个特征与大豆密码子优化的参考多核苷酸(SCORP)区分开来，该一个或多个特征包括与SCORP相比增加的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量，与SCORP相比增加的熔解温度(Tm)，大豆密码子适应指数(sCAI)低于SCORP的sCAI，或这样的GC含量增加、Tm增加和sCAI减少的任何组合。在某些实施例中，本主题的合成的多核苷酸的GC含量为约46％至约47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％或56％。在某些实施例中，与SCORP的GC含量相比，GC含量增加至少约6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％或13％。在某些实施例中，与SCORP的GC含量相比，GC含量增加至少约6％、7％或8％至约9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。在某些实施例中，与SCORP的Tm相比，Tm增加至少约2、3、4、5或6摄氏度。在某些实施例中，与SCORP的Tm相比，Tm含量增加至少约2或3至约4、5或6摄氏度。在某些实施例中，与SCORP的sCAI相比，sCAI降低至少约0.01、0.02、0.03、0.04或0.05。在某些实施例中，与SCORP的sCAI相比，sCAI降低至少约0.01或0.02至约0.03、0.04或0.05。
编码本文披露的RGE、RGN和ndRGDBP的本主题的合成的多核苷酸可以与一种或多种不同的编码异源多肽的多核苷酸序列可操作地连接。在某些实施例中，本主题的合成的多核苷酸与编码核定位信号(NLS)、叶绿体转运肽(CTP)、表位标签(ST)、转录激活结构域(TAD)、转录阻遏结构域(TRD)的第二多核苷酸；或其组合可操作地连接。在其他实施例中，本主题的合成的多核苷酸(或进一步包含可操作地连接的第二多核苷酸的本主题的合成的多核苷酸)可操作地连接至编码具有修饰靶DNA的酶活性的异源多肽的第三多核苷酸序列。在某些实施例中(例如，对于大豆)，编码不同多肽的任何上述不同、第二或第三多核苷酸也可以通过一个或多个特征与编码这些相同的不同肽的大豆密码子优化的参考多核苷酸(SCORP)区分开来，该一个或多个特征包括与SCORP相比增加的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量，与SCORP相比增加的熔解温度(Tm)，大豆密码子适应指数(sCAI)低于SCORP的sCAI，或这样的GC含量增加、Tm增加和sCAI减少的任何组合。这样的不同的、第二或第三多核苷酸(其包含与SCORP相比增加的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量、与SCORP相比增加的熔化温度(Tm)、低于SCORP的sCAI的大豆密码子适应指数(sCAI))可以通过不同多肽的“反向翻译”或“逆向翻译”(即使用蛋白质序列和具有比图1的大豆密码子偏倚表更多的富含GC的密码子的密码子使用表来生成DNA序列)获得。将接受多肽序列和密码子偏倚表作为输入以生成多肽序列的逆向翻译或反向翻译程序包括万维网互联网站点“bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html”(Stothard P(2000)Biotechniques 28:1102-1104)和万维网网站“ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/”上的“EMBOSS Backtranseq”功能(Madeira等人Nucleic Acids Research[核酸研究],2019年6月30日,47(W1):W636-W641 DOI:10.1093/nar/gkz268)。在某些实施例中，前述不同的、第二或第三多核苷酸的GC含量为约46％至约47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、或56％。在某些实施例中，与SCORP的GC含量相比，前述不同的、第二或第三多核苷酸的GC含量增加至少约6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％或13％。在某些实施例中，与SCORP的GC含量相比，前述不同的、第二或第三多核苷酸的GC含量增加至少约6％、7％或8％至约9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。在某些实施例中，与SCORP的Tm相比，前述不同的、第二或第三多核苷酸的Tm增加至少约2、3、4、5或6摄氏度。在某些实施例中，与SCORP的Tm相比，前述不同的、第二或第三多核苷酸的Tm含量增加至少约2或3至约4、5或6摄氏度。在某些实施例中，与SCORP的sCAI相比，前述不同的、第二或第三多核苷酸的sCAI降低至少约0.01、0.02、0.03、0.04或0.05。在某些实施例中，与SCORP的sCAI相比，sCAI降低至少约0.01或0.02至约0.03、0.04或0.05。
本文提供的针对大豆的本主题的合成的多核苷酸和编码某些RGE的相应SCORP的非限制性实例列于下表1-12中(以及在此提供的序列表中列出的SEQ ID NO的相应序列中)。还提供了编码RGE、RGN、ndRGDBP多肽的合成多核苷酸，其在下表1-12中(以及在此提供的序列表中列出的SEQ ID NO的相应序列中)列出的合成的多核苷酸中包含一个、两个、三个或更多个核苷酸插入、缺失和/或取代。
表1.SpCas9编码的蛋白质、SCORP和本主题的合成的多核苷酸
Figure BDA0003867941360000141
Figure BDA0003867941360000151
表2.SaCas9编码的蛋白质、SCORP和本主题的合成的多核苷酸
Figure BDA0003867941360000152
表3.FnCpf1编码的蛋白质、SCORP和本主题的合成的多核苷酸
Figure BDA0003867941360000153
Figure BDA0003867941360000161
表4.CasJ编码的蛋白质、SCORP和本主题的合成的多核苷酸
Figure BDA0003867941360000162
Figure BDA0003867941360000171
表5.AsCpf1编码的蛋白质、SCORP和本主题的合成的多核苷酸
Figure BDA0003867941360000172
表6.Cms1编码的蛋白质、SCORP和本主题的合成的多核苷酸
Figure BDA0003867941360000173
Figure BDA0003867941360000181
表7.LbCpf1编码的蛋白质、SCORP和本主题的合成的多核苷酸
Figure BDA0003867941360000182
Figure BDA0003867941360000191
表8.MAD7编码的蛋白质、SCORP和本主题的合成的多核苷酸
Figure BDA0003867941360000192
表9.CasX编码的蛋白质、SCORP和本主题的合成的多核苷酸
Figure BDA0003867941360000193
Figure BDA0003867941360000201
表10.Cas12j-1编码的蛋白质、SCORP和本主题的合成的多核苷酸
Figure BDA0003867941360000202
Figure BDA0003867941360000211
表11.Cas12j-2编码的蛋白质、SCORP和本主题的合成的多核苷酸
Figure BDA0003867941360000212
表12.Cas12j-3编码的蛋白质、SCORP和本主题的合成的多核苷酸。
Figure BDA0003867941360000221
*根据Khandelwal G,Bhyravabhotla J(2010)PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]5(8):e12433.doi.org/10.1371/journal.pone.0012433的方法计算Tm，其中Conc＝[Na+]溶液浓度(摩尔)＝0.16M；DNA＝总核苷酸链浓度＝0.0001g/mL。
**根据http:internet site“genomes.urv.es/CAIcal/”上的程序(Puigbo等人Biology Direct[生物指导]，3:38)使用图1的大豆密码子偏倚表计算sCAI。
SEQ ID NO:156-165、166-175和176-185代表针对单子叶植物表达优化的核酸序列，例如分别编码Cas12j-1、Cas12j-2和Cas12j-3的玉米优化的核酸序列。
本主题的合成的多核苷酸和SCORP可以编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽(该术语可与术语“RGE、RGN或ndRGDBP蛋白”互换使用)，其可以结合和/或修饰(例如，切割、切口、甲基化、去甲基化等)靶核酸和/或与靶核酸相关的多肽(例如，组蛋白尾的甲基化或乙酰化)(例如，在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP蛋白包括具有活性的融合配偶体，在一些情况下，RGE或RGN提供核酸酶活性)。在一些情况下，RGE蛋白是天然存在的蛋白质(例如，天然存在于原核细胞中)。在其他情况下，RGE、RGN或ndRGDBP蛋白不是天然存在的多肽(例如，RGE、RGN或ndRGDBP蛋白是变体RGE、RGN或ndRGDBP蛋白、嵌合蛋白、RGE、RGN、或ndRGDBP融合多肽等)。
在一些实施例中，由本主题的合成的多核苷酸编码的RGE蛋白和SCORP可以编码天然存在的(野生型)蛋白。天然存在的RGE蛋白的序列的非限制性实例在SEQ ID NO:1、13、25、37、49、61、73、85、97、120、132和144中列出。然而，本主题的合成的多核苷酸和SCORP是非天然存在的(人工)多核苷酸。在某些实施例中，由本主题的合成的多核苷酸编码的RGE蛋白质和SCORP是与天然存在的RGE蛋白质相比包含一个或多个氨基酸残基的插入、缺失和/或取代的非天然存在的多肽。在某些实施例中，与天然存在的RGE蛋白质相比，由本主题的合成的多核苷酸编码的RGN或ndRGDBP蛋白质和SCORP是包含一个或多个氨基酸残基的插入、缺失和/或取代的非天然存在的多肽。
在一些实施例中，合成的多核苷酸在以下任一种的全长上具有至少70％、76％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性：(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI和/或GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI和/或GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI和/或GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI和/或GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(v)选自由SEQ IDNO:51-60组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI和/或GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI和/或GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI和/或GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI和/或GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI和/或GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；:(x)选自由SEQ ID NO:122-131组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI和/或GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于50％，例如大于55％、56％、57％或58％；(xi)选自由SEQ IDNO:134-143组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI和/或GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于50％，例如大于56％、57％、58％、59％或60％；(xii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI和/或GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于45％，例如大于50％、51％、52％、53％或54％。
在一些情况下，由本主题的合成的多核苷酸和SCORP编码的RGE、RGN或ndRGDBP蛋白编码与如SEQ ID NO:1、13、25、37、49、61、73、85、97、120、132或144所示的RGE、RGN或ndRGDBP蛋白序列具有20％或更多序列同一性(例如，30％或更多、40％或更多、50％或更多，60％或更多、70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或100％序列同一性)的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO:1、13、25、37、49、61、73、85、97、120、132或144具有100％序列同一性的蛋白质是RGE。例如，在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP蛋白编码与如SEQ ID NO:1、13、25、37、49、61、73、85或97所示的RGE、RGN或ndRGDBP蛋白序列具有50％或更多序列同一性(例如，60％或更多、70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或100％序列同一性)的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO:1、13、25、37、49、61、73、85、97、120、132或144具有100％序列同一性的蛋白质是RGE。在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP蛋白编码与如SEQ ID NO:1、13、25、37、49、61、73、85、97、120、132或144所示的RGE、RGN或ndRGDBP蛋白序列具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或100％序列同一性)的氨基酸序列。其中与SEQ ID NO:1、13、25、37、49、61、73、85、97、120、132或144具有100％序列同一性的蛋白质是RGE。在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP蛋白编码与如SEQ ID NO:1、13、25、37、49、61、73、85、97、120、132或144所示的RGE、RGN或ndRGDBP蛋白序列具有90％或更多序列同一性(例如，95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、99.5％、99.8％、99.9％或100％序列同一性)的氨基酸序列。其中与SEQ ID NO:1、13、25、37、49、61、73、85、97、120、132或144具有100％序列同一性的蛋白质是RGE。在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP蛋白编码具有如SEQ ID NO:1、13、25、37、49、61、73、85、97、120、132或144所示的RGE、RGN或ndRGDBP蛋白序列的氨基酸序列。在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP蛋白编码具有如SEQ ID NO:1、13、25、37、49、61、73、85、97、120、132或144所示的RGE、RGN或ndRGDBP蛋白序列的氨基酸序列，除了序列编码降低蛋白质的天然存在的催化活性的氨基酸取代(例如，1、2、3或更多个氨基酸取代)(例如，在如下所述的氨基酸位置)。进一步包含另外的异源肽序列的RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽可以进一步包含任何上述RGE、RGN或ndRGDBP蛋白。
RGE蛋白包括3个部分RuvC结构域(RuvC-I、RuvC-II和RuvC-III，在本文中也称为亚结构域)，它们与RGE蛋白的一级氨基酸序列不连续，但一旦蛋白质产生并折叠则形成RuvC结构域。在一些情况下，(主题组合物和/或方法的)RGE蛋白包括分裂的RuvC结构域(例如，3个部分RuvC结构域-RuvC-I、RuvC-II和RuvC-III)。
与相应的野生型RGE蛋白的氨基酸序列相比，变体RGE、RGN或ndRGDBP蛋白具有至少一个氨基酸不同的氨基酸序列(例如，具有缺失、插入、取代、融合)。切割双链靶核酸的一条链但不切割另一条链的RGN蛋白在本文中称为“RGN”或“切口酶”(例如，“切口酶CasJ”)。基本上不具有核酸酶活性的Cas蛋白在本文中被称为ndRGDBP或死Cas蛋白(“dCas”)(需要注意的是，在某些实施例中，核酸酶活性可以由可操作地连接到ndRGDBP的异源多肽提供)。对于本文所述的任何RGE、RGN或ndRGDBP变体蛋白(例如，切口酶Cas、dCas、嵌合Cas、Cas融合多肽)，RGE、RGN或ndRGDBP变体可包括具有上述相同参数(例如，存在的结构域、同一性百分比等)的RGE、RGN或ndRGDBP蛋白质序列。
在某些实施例中，编码的ndRGDBP获自RGE，例如，相对于天然存在的催化活性RGE序列突变，并与相应的天然发生的序列相比时表现出降低的核酸内切酶活性(例如，表现出90％或更少，80％或更少、70％或更少、60％或更少、50％或更少、40％或更少、30％或更少、20％或更少、10％或更少、5％或更少、或1％或更少核酸内切酶活性)。在一些情况下，编码的ndRGDBP是催化方面的“死”蛋白(基本上没有核酸内切酶活性)，可以称为“dCas”。在一些情况下，编码的RGN仅切割双链靶核酸(例如双链靶DNA)的一条链。如本文更详细描述的，在一些情况下，编码的RGE、RGN或ndRGDBP融合(例如，缀合或可操作地连接)到具有目的活性(例如，目的催化活性)的异源多肽以形成融合蛋白(例如嵌合Cas蛋白或Cas融合多肽)。
Cas9 RGE(SEQ ID NO:1)的保守催化残基包括上面鉴定的RuvC亚结构域残基。根据SEQ ID NO:1编号的D10和/或H840是可以突变的残基，例如作为D10A或H840A，以降低Cas9多肽的催化活性并提供ndRGDBP。因此，在一些情况下，当一个或多个上述氨基酸(或任何Cas9蛋白的一个或多个相应氨基酸)发生突变(例如，被丙氨酸取代)时，Cas9蛋白具有降低的活性。在一些情况下，变体Cas9蛋白是催化方面的“死”蛋白(无催化活性)，被称为“dCas9”。dCas9蛋白可以与提供活性的融合配偶体融合，并且在一些情况下，dCas9(例如，没有提供催化活性的融合配偶体-但在真核细胞中表达时可以具有NLS的情况下)可以结合靶DNA并可以阻断RNA聚合酶从靶DNA翻译或其他内源DNA结合或加工蛋白质的功能。在一些情况下，仅切割双链靶核酸(例如双链靶DNA)的一条链的切口酶或RGN可以通过突变SEQ IDNO:1的Cas9蛋白的一个或多个残基和/或催化残基来获得。在某些实施例中，Cas9 RGN可以包含残基D10中的突变(例如，D10A)。Cas9融合多肽可以包含上述Cas9 RGE、ndDBP或RGN蛋白和异源多肽中的任何。
FnCpf1 RGE(SEQ ID NO:25)的保守催化残基包括上面鉴定的RuvC亚结构域残基。根据SEQ ID NO:25编号的D917、E1006、E1028、D1255和/或N1257是可以突变的残基，例如D917A、E1006A、E1028A、D1255A和/或N1257A，以降低FnCpf1多肽的催化活性并提供ndRGDBP。因此，在一些情况下，当一个或多个上述氨基酸(或任何FnCpf1蛋白的一个或多个相应氨基酸)发生突变(例如，被丙氨酸取代)时，FnCpf1蛋白具有降低的活性。在一些情况下，变体FnCpf1蛋白是催化方面的“死”蛋白(无催化活性)，被称为“dFnCpf1”。dFnCpf1蛋白可以与提供活性的融合配偶体融合，并且在一些情况下，dFnCpf1(例如，没有提供催化活性的融合配偶体-但在真核细胞中表达时可以具有NLS的情况下)可以结合靶DNA并可以阻断RNA聚合酶从靶DNA翻译或其他内源DNA结合或加工蛋白质的功能。在一些情况下，仅切割双链靶核酸(例如双链靶DNA)的一条链的切口酶或RGN可以通过突变SEQ ID NO:25的FnCpf1蛋白的一个或多个残基和/或催化残基来获得。在某些实施例中，FnCpf1 RGN可以包含残基R1226中的突变(例如，R1226A)。FnCpf1融合多肽可以包含上述FnCpf1 RGE、ndDBP或RGN蛋白和异源多肽中的任何。
CasJ RGE(SEQ ID NO:37)的保守催化残基包括上面鉴定的RuvC亚结构域残基。根据SEQ ID NO:37编号的D901、E1128和D1298是可以突变的残基，例如D901A、E1128A或D1298A，以降低CasJ多肽的催化活性并提供ndRGDBP。因此，在一些情况下，当一个或多个上述氨基酸(或任何CasJ蛋白的一个或多个相应氨基酸)发生突变(例如，被丙氨酸取代)时，CasJ蛋白具有降低的活性。在一些情况下，变体CasJ蛋白是催化方面的“死”蛋白(无催化活性)，被称为“dCasJ”。dCasJ蛋白可以与提供活性的融合配偶体融合，并且在一些情况下，dCasJ(例如，没有提供催化活性的融合配偶体-但在真核细胞中表达时可以具有NLS的情况下)可以结合靶DNA并可以阻断RNA聚合酶从靶DNA翻译或其他内源DNA结合或加工蛋白质的功能。在一些情况下，仅切割双链靶核酸(例如双链靶DNA)的一条链的切口酶或RGN可以通过突变SEQ ID NO:37的CasJ蛋白的一个或多个残基和/或催化残基来获得。在某些实施例中，CasJ RGN可以包含残基E1128和/或D1298(例如E1128A和/或D1298A)中的突变。CasJ融合多肽可以包含上述CasJ RGE、ndDBP或RGN蛋白和异源多肽中的任何。
LbCpf1 RGE(SEQ ID NO:73)的保守催化残基包括上面鉴定的RuvC亚结构域残基。根据SEQ ID NO:73编号的D832、E925和/或D1148是可以突变的残基，例如D832A、E925A和/或D1148A，以降低LbCpf1多肽的催化活性并提供ndRGDBP。因此，在一些情况下，当一个或多个上述氨基酸(或任何LbCpf1蛋白的一个或多个相应氨基酸)发生突变(例如，被丙氨酸取代)时，LbCpf1蛋白具有降低的活性。在一些情况下，变体LbCpf1蛋白是催化方面的“死”蛋白(无催化活性)，被称为“dLbCpf1”。dLbCpf1蛋白可以与提供活性的融合配偶体融合，并且在一些情况下，dLbCpf1(例如，没有提供催化活性的融合配偶体-但在真核细胞中表达时可以具有NLS的情况下)可以结合靶DNA并可以阻断RNA聚合酶从靶DNA翻译或其他内源DNA结合或加工蛋白质的功能。在一些情况下，仅切割双链靶核酸(例如双链靶DNA)的一条链的切口酶或RGN可以通过突变SEQ ID NO:73的LbCpf1蛋白的一个或多个残基和/或催化残基来获得。在某些实施例中，LbCpf1 RGN可以包含残基R1138中的突变(例如，R1138A)。LbCpf1融合多肽可以包含上述LbCpf1 RGE、ndDBP或RGN蛋白和异源多肽中的任何。
Cas12j-1RGE(SEQ ID NO:120)的保守催化残基包括RuvC亚结构域残基。根据SEQID NO:120编号的D371、E579和/或D673是可以突变的残基。C640、C643、C646、C661和/或C664也可以被突变以降低催化活性。示例性突变是D371A、E579A、D673A、C640A、C643A、C646A、C661A、C664A、C640S、C643S、C646S、C661S和C664S，以降低Cas12j-1多肽的催化活性并提供ndRGDBP。因此，在一些情况下，当一个或多个上述氨基酸(或Cas12j-1蛋白的一个或多个相应氨基酸)发生突变(例如，被丙氨酸或丝氨酸取代)时，Cas12j-1蛋白具有降低的活性。在一些情况下，变体Cas12j-1蛋白是催化方面的“死”蛋白(无催化活性)，被称为“dCas12j-1”。dCas12j-1蛋白可以与提供活性的融合配偶体融合，并且在一些情况下，dCas12j-1(例如，没有提供催化活性的融合配偶体-但在真核细胞中表达时可以具有NLS的情况下)可以结合靶DNA并可以阻断RNA聚合酶从靶DNA翻译或其他内源DNA结合或加工蛋白质的功能。Cas12j-1融合多肽可以包含上述Cas12j-1RGE或ndDBP蛋白和异源多肽中的任何。
Cas12j-2RGE(SEQ ID NO:132)的保守催化残基包括上面鉴定的RuvC亚结构域残基。根据SEQ ID NO:132编号的D394、E606和/或D697是可以突变的残基。C667、C670、C673、C685和C688也可以被突变以降低催化活性。示例性突变是D394A、E606A、D697A、C667A、C670A、C673A、C685A、C688A、C667S、C670S、C673S、C685S和C688S，以降低Cas12j-2多肽的催化活性并提供ndRGDBP。因此，在一些情况下，当一个或多个上述氨基酸(或Cas12j-2蛋白的一个或多个相应氨基酸)发生突变(例如，被丙氨酸或丝氨酸取代)时，Cas12j-2蛋白具有降低的活性。在一些情况下，变体Cas12j-2蛋白是催化方面的“死”蛋白(无催化活性)，被称为“dCas12j-2”。dCas12j-2蛋白可以与提供活性的融合配偶体融合，并且在一些情况下，dCas12j-2(例如，没有提供催化活性的融合配偶体-但在真核细胞中表达时可以具有NLS的情况下)可以结合靶DNA并可以阻断RNA聚合酶从靶DNA翻译或其他内源DNA结合或加工蛋白质的功能。Cas12j-2融合多肽可以包含上述Cas12j-2RGE或ndDBP蛋白和异源多肽中的任何。
Cas12j-3RGE(SEQ ID NO:144)的保守催化残基包括RuvC亚结构域残基。根据SEQID NO:144编号的D413、E618和/或D710是可以突变的残基。C680、C683、C687、C698和C701也可以被突变以降低催化活性。示例性突变是D413A、E618A、D710A、C680A、C683A、C687A、C698A、C701A、C680S、C683S、C687S、C698S和C701S，以降低Cas12j-3多肽的催化活性并提供ndRGDBP。因此，在一些情况下，当一个或多个上述氨基酸(或Cas12j-3蛋白的一个或多个相应氨基酸)发生突变(例如，被丙氨酸或丝氨酸取代)时，Cas12j-3蛋白具有降低的活性。在一些情况下，变体Cas12j-3蛋白是催化方面的“死”蛋白(无催化活性)，被称为“dCas12j-3”。dCas12j-3蛋白可以与提供活性的融合配偶体融合，并且在一些情况下，dCas12j-3(例如，没有提供催化活性的融合配偶体-但在真核细胞中表达时可以具有NLS的情况下)可以结合靶DNA并可以阻断RNA聚合酶从靶DNA翻译或其他内源DNA结合或加工蛋白质的功能。Cas12j-3融合多肽可以包含上述Cas12j-3RGE或ndDBP蛋白和异源多肽中的任何。
如上所述，在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP蛋白(在一些情况下是具有野生型核酸内切酶活性的Cas9、Cas12a、Cas12e或Cas12j蛋白，并且在一些情况下是具有降低的或经修饰的切割活性的变体RGE、RGN或ndRGDBP，例如dCas或切口酶Cas)与具有目的活性(例如，目的催化活性)的异源多肽融合(缀合)以形成融合蛋白(例如，嵌合Cas或Cpf1蛋白或Cas或Cpf1融合多肽)。可融合RGE、RGN或ndRGDBP Cas蛋白的异源多肽在本文中称为“融合配偶体”。在某些实施例中，编码RGE、RGN或ndRGDBP的主题多核苷酸可操作地连接至编码异源多肽或融合配偶体的多核苷酸。在某些实施例中，编码异源多肽或融合配偶体的多核苷酸：(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％、48％或50％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码异源多肽的第二大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合。与由主题多核苷酸编码的RGE、RGN或ndRGDBP融合的异源多肽包括具有修饰靶DNA的酶活性的异源多肽、核定位信号(NLS)、叶绿体转运肽(CTP)、表位标签(ST)、转录激活结构域(TAD)、转录阻遏结构域(TRD)；或其任何组合。
在一些情况下，融合配偶体(例如异源多肽)在融合到例如由本主题的合成的多核苷酸编码的ndRGDBP或SCORP时可以调节靶DNA的转录(例如抑制转录、增加转录)。例如，在一些情况下，融合配偶体是抑制转录的蛋白质(或蛋白质的结构域)(例如，转录阻遏物，其是通过募集转录抑制蛋白、修饰靶DNA(例如甲基化)、募集DNA修饰剂、调节与靶DNA相关的组蛋白、募集组蛋白修饰剂(例如修饰组蛋白乙酰化和/或甲基化的那些等)而起作用的蛋白质)。在一些情况下，融合配偶体是增加转录的蛋白质(或蛋白质的结构域)(例如，转录激活物，其是通过募集转录激活蛋白、修饰靶DNA(例如去甲基化)、募集DNA修饰剂、调节与靶DNA相关的组蛋白、募集组蛋白修饰剂(例如修饰组蛋白乙酰化和/或甲基化的那些等)而起作用的蛋白质)。
在一些情况下，嵌合RGE、RGN或ndRGDBP蛋白或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽包括具有修饰靶核酸的酶活性(例如，核酸酶活性、甲基转移酶活性、去甲基化酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨基活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性)的异源多肽。
在一些情况下，嵌合RGE、RGN或ndRGDBP蛋白或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽包括具有修饰与靶核酸相关的多肽(例如组蛋白)的酶活性(例如甲基转移酶活性、去甲基化酶活性、乙酰转移酶活性、去乙酰化酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、肉豆蔻酰化活性或去肉豆蔻酰化活性)的异源多肽。
可用于增加靶内源基因转录的异源多肽的实例可包括转录激活物结构域(TAD)，例如玉蜀黍c1VP16、VP64、VP48、VP160、p65亚结构域(例如，来自NFkB)、EDLL的TAD和/或TAL激活结构域(例如，对于在植物中的活性)；组蛋白赖氨酸甲基转移酶，例如SET1A、SET1B、MLL1至5、ASH1、SYMD2、NSDl等；组蛋白赖氨酸去甲基化酶，例如JHDM2a/b、UTX、JMJD3等；组蛋白乙酰转移酶，例如GCN5、PCAF、CBP、p300、TAF1、TIP60/PLIP、MOZ/MYST3、MORF/MYST4、SRCl、ACTR、P160、CLOCK等；和DNA去甲基化酶，例如十-十一易位(TET)双加氧酶1(TET1CD)、TET1、DME、DML1、DML2、ROS1等。在某些实施例中，可以使用多个VP64 TAD(Lowder等人,MolPlant.[分子植物学]2018；11(2):245-256)。可用于本文提供的ATF中的强效植物TAD的另一个实例是在AP2/ERF转录因子中发现的EDLL基序(Tiwari等人,Plant J.[植物杂志]2012；70(5):855-65)。可用于本文提供的ATF中的强效植物TAD的又一个实例是杂合VP64-p65-Rta三部分激活物(VPR；SEQ ID NO:109；Chavez等人,Nat Methods.[自然方法]2015；12(4):326-8)。在某些实施例中，上述异源肽可融合至结合靶内源基因的ndRGDBP。在某些实施例中，这样的ndRDBP还可以融合至合适的靶向肽，例如核定位信号(NLS；当靶向核基因时)或叶绿体转运肽(CTP；当靶向质体基因组中的基因时)。
可用于降低转录的异源多肽的实例可包括转录阻遏结构域(TRD)，包括Krüppel相关框(KRAB或SKD)；KOX1抑制结构域；Mad mSIN3交互结构域(SID)；ERF阻遏结构域(ERD；Dong CJ,Liu JY.BMC Plant Biol[BMC植物生物学].2010年3月16日；10:47.)或SRDX抑制结构域(Figueroa P,Browse J.Plant J[植物杂志].2015年3月；81(6):849-60)用于植物中的抑制，等等；组蛋白赖氨酸甲基转移酶，例如Pr-SET7/8、SUV4-20H1、RIZl等；组蛋白赖氨酸去甲基化酶，例如JMJD2A/JHDM3A、JMJD2B、JMJD2C/GASC1、JMJD2D、JARID1A/RBP2、JARIDlB/PLU-1、JARID1C/SMCX、JARID1D/SMCY等；组蛋白赖氨酸去乙酰化酶，例如HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9、SIRT1、SIRT2、HDAC11等；DNA甲基化酶，例如Hhal DNA m5c-甲基转移酶(M.Hhal)、DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)、DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)、MET1、DRM3(植物)、ZMET2、CMT1、CMT2(植物)等；以及外周招募元件，如Lamin A、Lamin B等。在某些实施例中，上述异源肽可融合至结合靶内源基因的ndRGDBP。在某些实施例中，这样的ndRDBP还可以融合至合适的靶向肽，例如核定位信号(NLS；当靶向核基因时)或叶绿体转运肽(CTP；当靶向质体基因组中的基因时)。
在一些情况下，用于RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽中的融合配偶体具有修饰靶核酸(例如，ssRNA、dsRNA、ssDNA、dsDNA)的酶活性。融合配偶体可以提供的酶活性的实例包括但不限于：核酸酶活性(例如由限制酶(例如，Fokl核酸酶)提供的活性)、甲基转移酶活性(例如由甲基转移酶(例如，Hhal DNA m5c-甲基转移酶，M.Hhal)、DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)、DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)、MET1、DRM3(植物)、ZMET2、CMT1、CMT2(植物)等)提供的活性)；去甲基化酶活性(例如由去甲基化酶(例如，十-十一易位(TET)双加氧酶1(TET1CD)、TET1、DME、DML1、DML2、ROS 1等)提供的活性)、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨基活性(例如由脱氨酶(例如胞嘧啶脱氨酶例如大鼠APOBEC1)提供的活性)、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性(例如由整合酶和/或解离酶(例如，Gin转化酶，例如Gin转化酶的高活性突变体GinH106Y；人免疫缺陷病毒1型整合酶(IN)；Tn3解离酶；等)提供的活性)、转座酶活性、重组酶活性(例如由重组酶(例如，Gin重组酶的催化结构域)提供的活性)、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性和糖基化酶活性)。
在一些情况下，用于RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽中的融合配偶体具有修饰与靶核酸(例如，ssRNA、dsRNA、ssDNA、dsDNA)相关的蛋白质(例如，组蛋白、RNA结合蛋白、DNA结合蛋白等)的酶活性。融合配偶体可以提供的酶活性(修饰与靶核酸相关的蛋白质)的实例包括但不限于：甲基转移酶活性(例如由组蛋白甲基转移酶(HMT)(例如，杂色抑制子3-9同源物1(SUV39H1，也称为KMTIA)、常染色质组蛋白赖氨酸甲基转移酶2(G9A，也称为KMT1C和EHMT2)、SUV39H2、ESET/SETDB 1等、SET1A、SET1B、MLL1至5、ASH1、SYMD2、NSD1、DOT1L、Pr-SET7/8、SUV4-20H1、EZH2、RIZl)提供的活性)、去甲基化酶活性(例如由组蛋白去甲基化酶(例如，赖氨酸去甲基化酶1A(KDM1A，也称为LSD1)、JHDM2a/b、JMJD2A/JHDM3A、JMJD2B、JMJD2C/GASC1、JMJD2D、JARID1A/RBP2、JARIDlB/PLU-1、JARID1C/SMCX、JARID1D/SMCY、UTX、JMJD3等)提供的)、乙酰转移酶活性(例如由组蛋白乙酰化酶转移酶(例如人乙酰转移酶p300的催化核心/片段、GCN5、PCAF、CBP、TAF1、TIP60/PLIP、MOZ/MYST3、MORF/MYST4、HB01/MYST2、HMOF/MYST1、SRC1、ACTR、P160、CLOCK等)提供的)、去乙酰化酶活性(例如由组蛋白去乙酰化酶(例如HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9、SIRT1、SIRT2、HDAC11等)提供的)、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、肉豆蔻酰化活性和去肉豆蔻酰化活性。
在RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽中使用的合适融合配偶体的另一个实例是二氢叶酸还原酶(DHFR)去稳定结构域(例如，以产生化学可控的嵌合RGE、RGN或ndRGDBP蛋白或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽)和叶绿体转运肽。
在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽包含：a)RGE、RGN或ndRGDBP多肽；和b)叶绿体转运肽。因此，例如，CRISPR-RGE、RGN或ndRGDBP复合物可以靶向叶绿体。在一些情况下，这种靶向可以通过存在称为叶绿体转运肽(CTP)或质体转运肽的N末端延伸来实现。如果要在植物质体(例如叶绿体)中使表达的多肽区室化，则来自细菌来源的染色体转基因必须具有编码CTP序列的序列，该CTP序列与编码表达的多肽的序列融合。
因此，外源多肽向叶绿体的定位通常是通过将编码CTP序列的多核苷酸序列可操作地连接到编码外源多肽的多核苷酸的5'区来实现的。在易位到质体的过程中，CTP在加工步骤中被去除。然而，加工效率可能会受到CTP的氨基酸序列和肽氨基末端附近的序列的影响。已经描述的用于靶向叶绿体的其他选择是玉蜀黍cab-m7信号序列(美国专利号7,022,896，WO 97/41228)豌豆谷胱甘肽还原酶信号序列(WO 97/41228)和US 2009029861中描述的CTP。
本文披露的RGE、RGN或ndRGDBP多肽可进一步包含至少一种质体靶向信号肽、至少一种线粒体靶向信号肽或将RGE、RGN或ndRGDBP多肽靶向质体和线粒体的信号肽。质体、线粒体和双靶向信号肽定位信号是本领域已知的(参见，例如，Nassoury和Morse(2005)Biochim Biophys Acta[生物化学与生物物理学学报]1743:5-19；Kunze和Berger(2015)Front Physiol[生理学前沿]dx.doi.org/10.3389/fphys.2015.00259；Herrmann和Neupert(2003)IUBMB Life[IUBMB生命]55:219-225；Soll(2002)Curr Opin Plant Biol[植物生物学新见]5:529-535；Carrie和Small(2013)Biochim Biophys Acta[生物化学与生物物理学学报]1833:253-259；Carrie等人(2009)FEBS J[欧洲生化学会联合会杂志]276:1187-1195；Silva-Filho(2003)Curr Opin Plant Biol[植物生物学新见]6:589-595；Peeters和Small(2001)Biochim Biophys Acta[生物化学与生物物理学学报]1541:54-63；Murcha等人(2014)JExp Bot[实验植物学杂志]65:6301-6335；Mackenzie(2005)TrendsCell Biol[细胞生物学趋势]15:548-554；Glaser等人(1998)Plant Mol Biol[植物分子生物学]38:311-338)。质体、线粒体或双靶向信号肽可位于RGE、RGN或ndRGDBP多肽的N末端、C末端或内部位置。
在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽可包含：a)RGE、RGN或ndRGDBP多肽；和b)内体逃逸肽(EEP)。在一些情况下，内体逃逸多肽包含SEQ ID NO:110或SEQ ID NO:111的氨基酸序列。
对于在与Cas9、锌指和/或TALE蛋白融合的上下文中(用于位点特异性靶核酸修饰、转录调节和/或靶蛋白修饰，例如，组蛋白修饰)使用的以上融合配偶体中的一些(或更多)的实例参见例如：Nomura等人J Am Chem Soc.[美国化学学会杂志]2007年7月18日；129(28):8676-7；Rivenbark等人,Epigenetics.[表观遗传学]2012年4月；7(4):350-60；Nucleic Acids Res.[核酸研究]2016年7月8日；44(12):5615-28；Gilbert等人,Cell.[细胞]2013年7月18日；154(2):442-51；Kearns等人,Nat Methods.[自然方法]2015年5月；12(5):401-3；Mendenhall等人,Nat Biotechnol.[自然生物技术]2013年12月；31(12):1133-6；Hilton等人,Nat Biotechnol.[自然生物技术]2015年5月；33(5):510-7；Gordley等人,Proc Natl Acad Sci U S A.[美国国家科学院院刊]2009年3月31日；106(13):5053-8；Akopian等人,Proc Natl Acad Sci U S A.[美国国家科学院院刊]2003年7月22日；100(15):8688-91；Tan等人,J Virol.[病毒学杂志]2006年2月；80(4):1939-48；Tan等人,ProcNatl Acad Sci US A[美国国家科学院院刊].2003年10月14日；100(21):11997-2002；Papworth等人,Proc Natl Acad Sci U S A[美国国家科学院院刊].2003年2月18日；100(4):1621-6；Sanjana等人,Nat Protoc[自然实验手册].2012年1月5日；7(l):171-92；Beerli等人,Proc Natl Acad Sci U S A[美国国家科学院院刊].1998年12月8日；95(25):14628-33；Snowden等人,Curr Biol[当代生物学].2002年12月23日；12(24):2159-66；Xu等人,Cell Discov[细胞发现].2016年5月3日；2:16009；Komor等人,Nature[自然].2016年4月20日；533(7603):420-4；Chaikind等人,Nucleic Acids Res[核酸研究].2016年8月11日；Choudhury等人,Oncotarget[肿瘤靶标].2016年6月23日；Du等人,Cold Spring HarbProtoc[冷泉港实验方案].2016年1月4日；Pham等人,Methods Mol Biol[分子生物学方法].2016；1358:43-57；Balboa等人,Stem Cell Reports[干细胞报告].2015年9月8日；5(3):448-59；Hara等人,Sci Rep[科学报告].2015年1月9日；5:11221；Piatek等人,PlantBiotechnol J[植物生物技术杂志].2015年5月；13(4):578-89；Hu等人,Nucleic AcidsRes[核酸研究].2014年4月；42(7):4375-90；Cheng等人,Cell Res[细胞研究].2013年10月；23(10):1163-71；Cheng等人,Cell Res[细胞研究].2013年10月；23(10):l 163-71；和Maeder等人,Nat Methods[自然方法].2013年10月；10(10):977-9。
可用于RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽中的其他合适的异源多肽包括但不限于直接和/或间接提供增加的靶核酸转录和/或翻译的多肽(例如，转录激活物或其片段，其是募集转录激活物、小分子/药物反应性转录和/或翻译调节剂、翻译调节蛋白等的蛋白质或其片段)。实现增加或减少转录的异源多肽的非限制性实例包括转录激活结构域和转录阻遏结构域。在一些这样的情况下，嵌合RGE、RGN或ndRGDBP多肽或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽被指导核酸(指导RNA)靶向到靶核酸中的特定位置(即序列)并发挥基因座特异性调节作用，例如阻断RNA聚合酶与启动子的结合(这选择性抑制转录激活物功能)，和/或修饰局部染色质状态(例如，当使用修饰靶核酸或修饰与靶核酸相关联的多肽的融合序列时)。在一些情况下，这些变化是短暂的(例如，转录抑制或激活)。在一些情况下，这些变化是可遗传的(例如，当对靶核酸或与靶核酸相关的蛋白质(例如核小体组蛋白)进行表观遗传修饰时)。
当靶向ssRNA靶核酸时使用的异源多肽的非限制性实例包括但不限于：剪接因子(例如，RS结构域)；蛋白质翻译组分(例如，翻译起始、延伸和/或释放因子；例如，eIF4G)；RNA甲基化酶；RNA编辑酶(例如RNA脱氨酶，例如作用于RNA(ADAR)的腺苷脱氨酶，包括A到I和/或C到U编辑酶)；解旋酶；RNA结合蛋白；等。应当理解，异源多肽可以包括整个蛋白质，或者在一些情况下可以包括蛋白质的片段(例如，功能结构域)。
主题嵌合RGE、RGN或ndRGDBP多肽或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的异源多肽可以是能够与ssRNA相互作用的任何结构域(为了本披露的目的，其包括分子内和/或分子间二级结构(例如，双链RNA双链体，如发夹、茎环等)，无论是瞬时的还是不可逆的相互作用，直接或间接的相互作用，包括但不限于选自以下组的效应子结构域：核酸内切酶(例如来自SMG5和SMG6等蛋白质的RNA酶III、CRR22 DYW结构域、Dicer和PIN(PilT N末端)结构域)；负责刺激RNA切割的蛋白质和蛋白质结构域(例如CPSF、CstF、CFIm和CFIIm)；核酸外切酶(例如XRN-1或核酸外切酶T)；去腺苷化酶(例如HNT3)；负责无义介导的RNA衰变的蛋白质和蛋白质结构域(例如UPF1、UPF2、UPF3、UPF3b、RNP SI、Y14、DEK、REF2和SRml60)；负责稳定RNA的蛋白质和蛋白质结构域(例如PABP)；负责阻遏翻译的蛋白质和蛋白质结构域(例如Ago2和Ago4)；负责刺激翻译的蛋白质和蛋白质结构域(例如Staufen)；负责(例如，能够)调节翻译的蛋白质和蛋白质结构域(例如，翻译因子，例如起始因子、延伸因子、释放因子等，例如，eIF4G)；负责RNA的多聚腺苷酸化的蛋白质和蛋白质结构域(例如PAP1、GLD-2和Star-PAP)；负责RNA的多尿苷酸化的蛋白质和蛋白质结构域(例如CI Dl和末端尿苷酸转移酶)；负责RNA定位的蛋白质和蛋白质结构域(例如来自IMPl、ZBPl、She2p、She3p和Bicaudal-D)；负责RNA的核保留的蛋白质和蛋白质结构域(例如Rrp6)；负责RNA的核输出的蛋白质和蛋白质结构域(例如TAP、NXF1、THO、TREX、REF和Aly)；负责阻遏RNA剪接的蛋白质和蛋白质结构域(例如PTB、Sam68和hnRNP Al)；负责刺激RNA剪接的蛋白质和蛋白质结构域(例如富含丝氨酸/精氨酸(SR)的结构域)；负责降低转录效率的蛋白质和蛋白质结构域(例如FUS(TLS))；以及负责刺激转录的蛋白质和蛋白质结构域(例如CDK7和HIV Tat)。可替代地，效应子结构域可选自包含以下的组：核酸内切酶；能够刺激RNA切割的蛋白质和蛋白质结构域；核酸外切酶；去腺苷化酶；具有无义介导的RNA衰变活性的蛋白质和蛋白质结构域；能够稳定RNA的蛋白质和蛋白质结构域；能够阻遏翻译的蛋白质和蛋白质结构域；能够刺激翻译的蛋白质和蛋白质结构域；能够调节翻译的蛋白质和蛋白质结构域(例如，翻译因子，例如起始因子、延伸因子、释放因子等，例如，eIF4G)；能够使RNA多聚腺苷酸化的蛋白质和蛋白质结构域；能够使RNA多尿苷酸化的蛋白质和蛋白质结构域；具有RNA定位活性的蛋白质和蛋白质结构域；能够使RNA在核内保留的蛋白质和蛋白质结构域；具有RNA核输出活性的蛋白质和蛋白质结构域；能够阻遏RNA剪接的蛋白质和蛋白质结构域；能够刺激RNA剪接的蛋白质和蛋白质结构域；能够降低转录效率的蛋白质和蛋白质结构域；以及能够刺激转录的蛋白质和蛋白质结构域。另一种合适的异源多肽是PUF RNA结合结构域，其在WO 2012068627中有更详细的描述，该文献通过引用以其整体并入本文。
可(整体或作为其片段)用作嵌合RGE、RGN或ndRGDBP多肽或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的异源多肽的一些RNA剪接因子具有模块化结构，其中具有单独的序列特异性RNA结合模块和剪接效应子结构域。例如，富含丝氨酸/精氨酸(SR)的蛋白家族的成员包含与前mRNA中的外显子剪接增强子(ESE)结合的N末端RNA识别基序(RRM)和促进外显子包含的C末端RS结构域。作为另一个实例，hnRNP蛋白hnRNP Al通过其RRM结构域与外显子剪接沉默子(ESS)结合，并通过C末端的富含甘氨酸的结构域抑制外显子包含。一些剪接因子可以通过与两个替代位点之间的调节序列结合来调节剪接位点(ss)的替代使用。例如，ASF/SF2可以识别ESE并促进使用内含子近端位点，而hnRNP Al可以结合ESS并将剪接转向使用内含子远端位点。这些因子的一种应用是产生调节内源基因，特别是疾病相关基因的可变剪接的ESF。例如，Bcl-xpre-mRNA在两个可变5'剪接位点情况下产生两个剪接异构体，以编码功能相反的蛋白质。长剪接异构体Bcl-xL是有效的凋亡抑制剂，在长寿命的有丝分裂后细胞中表达，在许多癌细胞中上调，保护细胞免受凋亡信号的影响。短异构体Bcl-xS是促凋亡异构体，在具有高周转率的细胞(例如，发育中的淋巴细胞)中以高水平表达。两种Bcl-x剪接异构体的比例由位于核心外显子区域或外显子延伸区域(即，在两个可变5'剪接位点之间)的多个cc元件调节。对于更多实例，参见WO 2010075303，其通过引用以其整体并入本文。
其他合适的融合配偶体或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽包括但不限于作为边界元件(例如CTCF)的蛋白质(或其片段)、提供外周募集的蛋白质及其片段(例如，Lamin A、Lamin B等)、蛋白质对接元件(例如，FKBP/FRB、Pill/Abyl等)。
可以用于在编码嵌合RGE、RGN或ndRGDBP多肽或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸中适用的各种其他合适的异源多肽(或其片段)的实例但不限于以下申请中描述的那些(这些出版物涉及其他CRISPR核酸内切酶，例如Cas9，但所描述的融合配偶体也可以与RGE、RGN或ndRGDBP一起使用)：PCT专利申请：WO 2010075303、WO2012068627和WO 2013155555，例如可以在以下美国专利和专利申请中找到：8,906,616；8,895,308；8,889,418；8,889,356；8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945；8,697,359；20140068797；20140170753；20140179006；20140179770；20140186843；20140186919；20140186958；20140189896；20140227787；20140234972；20140242664；20140242699；20140242700；20140242702；20140248702；20140256046；20140273037；20140273226；20140273230；20140273231；20140273232；20140273233；20140273234；20140273235；20140287938；20140295556；20140295557；20140298547；20140304853；20140309487；20140310828；20140310830；20140315985；20140335063；20140335620；20140342456；20140342457；20140342458；20140349400；20140349405；20140356867；20140356956；20140356958；20140356959；20140357523；20140357530；20140364333；和20140377868；所有这些都通过引用以其整体并入本文。
在一些情况下，异源多肽(融合配偶体)或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽提供亚细胞定位，例如，异源多肽包含亚细胞定位序列(例如，用于靶向核的核定位信号(NLS)，将融合蛋白保持在核外的序列(例如核输出序列(NES))，将融合蛋白保持在细胞质中的序列，用于靶向线粒体的线粒体定位信号，用于靶向叶绿体的叶绿体定位信号，ER保留信号等)。在一些实施例中，RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽不包括NLS，使得蛋白质不靶向细胞核(这可能是有利的，例如，当靶核酸是存在于胞质溶胶中的RNA时)。在一些实施例中，异源多肽可以提供标签或表位标签(例如，异源多肽是可检测的标记)以便于追踪和/或纯化(例如，荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白(GFP)，YFP、RFP、CFP、mCherry、tdTomato、mScarlett等；组氨酸标签，例如6XHis标签；血凝素(HA)标签；FLAG标签；Myc标签；等等)。
在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP可操作地连接到核定位信号(NLS)(例如，在一些情况下，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个NLS)。因此，在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽包括一个或多个NLS(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个NLS)。在一些情况下，一个或多个NLS(2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个NLS)位于N末端和/或C末端处或附近(例如，在50个氨基酸内)。在一些情况下，一个或多个NLS(2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个NLS)位于N末端处或附近(例如，在50个氨基酸内)。在一些情况下，一个或多个NLS(2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个NLS)位于C末端处或附近(例如，在50个氨基酸内)。在一些情况下，一个或多个NLS(3个或更多个、4个或更多个或5个或更多个NLS)位于N末端和C末端两者处或附近(例如，在50个氨基酸内)。在一些情况下，NLS位于N末端，NLS位于C末端。
NLS的非限制性实例包括包含至少4个连续碱性氨基酸的NLS，例如SV40大T抗原NLS(PKKKRKV；SEQ ID NO:112)、玉蜀黍不透明-2核定位信号(SEQ ID NO:113)和扩展的SV40大T抗原NLS(SEQ ID NO:114)。一般来说，NLS(或多个NLS)具有足够的强度来驱动RGE、RGN或ndRGDBP蛋白在真核细胞的细胞核中以可检测的量积累。可以通过任何合适的技术来检测核中的积累。例如，可检测标记可与RGE、RGN或ndRGDBP蛋白融合，从而可可视化细胞内的位置。细胞核也可以从细胞中分离出来，然后可以通过任何合适的检测蛋白质的方法(例如免疫组织化学、蛋白质印迹或酶活性测定)来分析其内容物。也可以间接确定细胞核中的积累。
在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽包括“蛋白质转导结构域”或PTD(也称为CPP-细胞穿透肽)，它是指促进穿过脂质双层、胶束、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、多核苷酸、碳水化合物或有机或无机化合物。附着在另一个分子(其范围可以从小的极性分子到大的大分子和/或纳米颗粒)上的PTD促进分子穿过膜，例如从细胞外空间到细胞内空间，或从细胞质到细胞器内。在一些实施例中，PTD与多肽的氨基末端共价连接(例如，连接至RGE、RGN或ndRGDBP)以产生融合蛋白。在一些实施例中，PTD共价连接至多肽的羧基末端(例如，连接至野生型RGE、RGN或ndRGDBP以生成融合蛋白，或连接至变体RGE、RGN或ndRGDBP蛋白(例如RGE、RGN或ndRGDBP，切口酶RGE、RGN或ndRGDBP，或嵌合RGE、RGN或ndRGDBP蛋白或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽)以生成融合蛋白)。在一些情况下，PTD在合适的插入位点插入RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽内部(即，不在RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的N末端或C末端)。在一些情况下，主题RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽包括(缀合至、融合至)一个或多个PTD(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个PTD)。在一些情况下，PTD包括核定位信号(NLS)(例如，在一些情况下，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个NLS)。因此，在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽包括一个或多个NLS(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个NLS)。在一些实施例中，PTD与核酸(例如，RGE、RGN或ndRGDBP指导核酸，编码RGE、RGN或ndRGDBP指导核酸的多核苷酸，编码RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的多核苷酸，供体模板DNA分子等)共价连接。PTD的实例包括但不限于最小十一肽蛋白转导结构域(对应于HIV-1TAT的包含YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:115)的残基47-57；包含足以直接进入细胞的若干个精氨酸(例如、3、4、5、6、7、8、9、10或10-50个精氨酸)的聚精氨酸序列；VP22结构域(Zender等人(2002)Cancer Gene Ther[癌症基因疗法].9(6):489-96)；果蝇触角蛋白转导结构域(Noguchi等人(2003)Diabetes[糖尿病]52(7):1732-1737)；截短的人降钙素肽(Trehin等人(2004)Pharm.Research[药物研究]21:1248-1256)；聚赖氨酸(Wender等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]97:13003-13008)；运输蛋白；示例性PTD包括但不限于3个精氨酸残基至50个精氨酸残基的精氨酸均聚物。在一些实施例中，PTD是可激活的CPP(ACPP)(Aguilera等人(2009)IntegrBiol[整合生物学](Camb)6月；1(5-6):371-381)。ACPP包含通过可切割的接头连接到匹配的聚阴离子(例如，Glu9或“E9”)的聚阳离子CPP(例如，Arg9或“R9”)，这将净电荷降低到几乎为零，从而抑制细胞的粘附和摄取。接头断裂后，聚阴离子被释放，局部暴露聚精氨酸及其固有的粘附性，从而“激活”ACPP穿过膜。
在一些实施例中，主题RGE、RGN或ndRGDBP蛋白可以通过接头多肽(例如，一个或多个接头多肽)融合至融合配偶体。接头多肽可以具有多种氨基酸序列中的任一种。蛋白质可以通过通常具有柔性性质的间隔肽连接，但不排除其他化学连接。合适的接头包括长度在4个氨基酸和40个氨基酸之间，或在4个氨基酸和25个氨基酸之间的多肽。这些接头可以通过使用合成的、编码接头的寡核苷酸来产生以偶联蛋白质，或者可以由编码融合蛋白的核酸序列编码。可以使用具有一定程度柔性的肽接头。连接肽实际上可以具有任何氨基酸序列，记住优选的接头将具有产生通常是柔性的肽的序列。使用小氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸，可用于产生柔性肽。这种序列的产生对于本领域技术人员来说是常规的。多种不同的接头是可商购的并且被认为适合使用。
接头多肽的实例包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，((GS)n、GSGGSn(SEQ ID NO:116)、GGSGGSn(SEQ ID NO:117)和GGGSn(SEQ ID NO:118)，其中n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物。普通技术人员将认识到与任何所需元件缀合的肽的设计可以包括全部或部分柔性的接头，使得接头可以包括柔性接头以及赋予较低柔性结构的一个或多个部分。
可以说RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA包括两个区段，靶向区段和蛋白质结合区段。RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的靶向区段包括与靶核酸(例如，靶ssRNA、靶ssDNA、双链靶DNA的互补链等)内的特定序列(靶位点)互补(并因此杂交)的核苷酸序列(指导序列)。靶核酸(例如基因组DNA)的位点特异性结合和/或切割可以发生在由RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA(RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的指导序列)和靶核酸之间的碱基配对互补性确定的位置处(例如，靶基因座的靶序列)。用于Cas9和Cas12 RGE、RGN和ndDBP的指导RNA的设计在Robb,G.B.Genome editing with CRISPR-Cas:an overview.[使用CRISPR-Cas进行基因组编辑：概述]Current Protocols Essential Laboratory Techniques[当前方案基本实验室技术],19,e36.doi:10.1002/cpet.36；(2019)中进行了阐述。
蛋白质结合区段(或“蛋白质结合序列”)与RGE、RGN或ndRGDBP多肽相互作用(结合)。
在一些情况下，蛋白质结合区段由具有17-20或16-36个核苷酸的短序列组成，例如具有18或19或约24至29个核苷酸的序列。该蛋白质结合区段形成长度为五对残基的双链RNA双链体。5'末端在第一个RNA双链残基的上游有大约3个或9-14个残基。具有4-5个残基的茎结构将双链区分开。参见Pausch等人,Science[科学]369,333-337(2020)。
在一些情况下，主题RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的蛋白质结合区段包括两个互补的核苷酸段，它们彼此杂交以形成双链RNA双链体(dsRNA双链体)。在一些实施例中，本主题的合成的多核苷酸编码蛋白，该蛋白与如SEQ ID NO:37所示的RGE、RGN或ndRGDBP CasJ蛋白序列具有20％或更多序列同一性(例如，30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或100％序列同一性)，蛋白质结合区段可以由例如由SEQ ID NO:119的DNA分子编码的RNA构成。在一些实施例中，本主题的合成的多核苷酸编码蛋白，该蛋白与如SEQID NO:120所示的RGE或ndRGDBP Cas12j-1蛋白序列具有20％或更多序列同一性(例如，30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或100％序列同一性)，蛋白质结合区段可以由例如由SEQ ID NO:186的DNA分子或其3’片段编码的RNA构成。
在一些实施例中，本主题的合成的多核苷酸编码蛋白，该蛋白与如SEQ ID NO:132所示的RGE或ndRGDBP Cas12j-2蛋白序列具有20％或更多序列同一性(例如，30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或100％序列同一性)，蛋白质结合区段可以由例如由SEQ ID NO:187的DNA分子或其3’片段编码的RNA构成。
在一些实施例中，本主题的合成的多核苷酸编码蛋白，该蛋白与如SEQ ID NO:144所示的RGE或ndRGDBP Cas12j-3蛋白序列具有20％或更多序列同一性(例如，30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或100％序列同一性)，蛋白质结合区段可以由例如由SEQ ID NO:188的DNA分子或其3’片段编码的RNA构成。
RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA和RGE、RGN或ndRGDBP蛋白，例如融合RGE、RGN或ndRGDBP多肽，形成复合物(例如，通过非共价相互作用结合)。RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA通过包括靶向区段向复合物提供靶特异性，该靶向区段包括指导序列(与靶核酸序列互补的核苷酸序列)。复合物的RGE、RGN或ndRGDBP蛋白提供位点特异性活性(例如，由RGE、RGN或ndRGDBP蛋白或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽提供的切割活性和/或在嵌合RGE、RGN或ndRGDBP蛋白或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的情况下由融合配偶体提供的活性)。换言之，RGE、RGN或ndRGDBP蛋白通过其与RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的缔合而被指导至靶核酸序列(例如，靶序列)。
可以制备也称为RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的“靶向序列”的“指导序列”，使得RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA可以使RGE、RGN或ndRGDBP蛋白(例如天然存在的RGE、RGN或ndRGDBP蛋白、融合RGE、RGN或ndRGDBP多肽(例如，嵌合RGE、RGN或ndRGDBP)等)靶向任何期望的靶核酸的任何期望序列，除了可以考虑原型间隔区相邻基序(PAM)序列之外(例如，如本文所述)。通常，指导RNA的靶向序列通常包含约18或19至约21或22个核苷酸的序列，其对应于紧邻PAM的5’末端的序列(例如对于Cas9和类似的RNA定向核酸酶)或约20、21、22、23或24个核苷酸的序列，其对应于紧邻PAM的3’末端的序列(例如对于Cas12a(即Cpf1)和类似的RNA定向核酸酶)。因此，例如，RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA可以具有与真核细胞中的核酸(例如，病毒核酸、真核核酸(例如，真核染色体、染色体序列、真核RNA等)等)中的序列互补(例如，可以杂交)的指导序列酸。
在本主题的合成的多核苷酸编码与如SEQ ID NO:37所示的RGE、RGN或ndRGDBPCasJ蛋白质序列具有20％或更多序列同一性(例如，30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或100％序列同一性)的蛋白质的情况下，CasJ RGE、RGN或ndRGDBP的PAM紧邻靶DNA的非互补链的靶序列的5'(互补链与指导RNA的指导序列杂交，而非互补链不直接与指导RNA杂交并且是互补链的反向互补链)。在一些实施例中(例如，当使用前述CasJ蛋白时)，非互补链的PAM共有序列富含T。PAM序列的实例包括但不限于TTN、CTN、TCN、CCN、TTTN、TCTN、TTCN、CTTN、ATTN、TCCN、TTGN、GTTN、CCCN、CCTN、TTAN、TCGN、CTCN、ACTN、GCTN、TCAN、GCCN和CCGN(其中N定义为任何核苷酸)。
在本主题的合成的多核苷酸编码与如SEQ ID NO:120、132或144所示的RGE或ndRGDBP Cas12j蛋白质序列具有20％或更多序列同一性(例如，30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或100％序列同一性)的蛋白质的情况下，Cas12jRGE或ndRGDBP的PAM紧邻靶DNA的非互补链的靶序列的5'(互补链与指导RNA的指导序列杂交，而非互补链不直接与指导RNA杂交并且是互补链的反向互补链)。在一些实施例中，例如当使用Cas12j-1蛋白(SEQ ID NO:120)时，非互补链的PAM共有序列是5'-VTTR-3'(其中V是A、C或G，且R是A或G)。在一些实施例中，例如当使用Cas12j-2蛋白(SEQ ID NO:132)时，非互补链的PAM共有序列是5'-TBN-3'(其中B是G、T或C，且N是A、T、C或G)。在一些实施例中，例如当使用Cas12j-3蛋白(SEQ ID NO:144)时，非互补链的PAM共有序列是VTTN。
在一些实施例中，主题RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA也可以说包括“激活物”和“靶向物”(例如，分别为“激活物-RNA”和“靶向物-RNA”)。当“激活物”和“靶向物”是两个单独的分子时，指导RNA在本文中称为“双指导RNA”、“dgRNA”、“双分子指导RNA”或“双分子指导RNA”。(例如，“RGE、RGN或ndRGDBP双指导RNA”)。在一些实施例中，激活物和靶向物彼此共价连接(例如，通过间插核苷酸)，并且指导RNA在本文中被称为“单指导RNA”、“sgRNA”、“单分子指导RNA、”或“独分子指导RNA”(例如，“RGE、RGN或ndRGDBP单指导RNA”)。因此，主题RGE、RGN或ndRGDBP单指导RNA包含彼此连接(例如，通过间插核苷酸)的靶向物(例如，靶向物-RNA)和激活物(例如，激活物-RNA)，并且可以彼此杂交形成指导RNA的蛋白质结合区段的双链RNA双链体(dsRNA双链体)，从而产生茎环结构。因此，靶向物和激活物各自具有形成双链体的区段，其中靶向物的形成双链体的区段和激活物的形成双链体的区段彼此互补并彼此杂交。
在一些实施例中，RGE、RGN或ndRGDBP单指导RNA的接头是一段核苷酸。在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP单指导RNA的靶向物和激活物通过间插核苷酸彼此连接，并且接头可以具有3到20个核苷酸(nt)的长度(例如，3到15、3到12、3到10、3到8、3到6、3到5、3到4、4到20、4到15、4到12、4到10、4到8、4到6或4到5nt)。在一些实施例中，RGE、RGN或ndRGDBP单指导RNA的接头可具有3至100个核苷酸(nt)的长度(例如，3到80、3到50、3到30、3到25、3到20、3到15、3到12、3到10、3到8、3到6、3到5、3到4、4至100、4到80、4到50、4到30、4到25、4到20、4到15、4到12、4到10、4到8、4到6或4到5nt)。在一些实施例中，RGE、RGN或ndRGDBP单指导RNA的接头可具有3至10个核苷酸(nt)的长度(例如，3到9、3到8、3到7、3到6、3到5、3到4、4到10、4到9、4到8、4到7、4到6或4到5nt)。
主题RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的靶向区段包括指导序列(即，靶向序列)，其是与靶核酸中的序列(靶位点)互补的核苷酸序列。换言之，RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的靶向区段可以与靶核酸(例如，双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)或双链RNA(dsRNA))以序列特异性方式通过杂交(即碱基配对)相互作用。RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的指导序列可以被修饰(例如，通过基因工程)/设计以与靶核酸(例如，真核靶核酸，如基因组DNA)内任何期望的靶序列杂交(例如，同时考虑PAM，例如，当靶向dsDNA靶时)。
在一些实施例中，指导序列与靶核酸的靶位点之间的互补性百分比为60％或更多(例如，65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或100％)。在一些情况下，指导序列与靶核酸的靶位点之间的互补性百分比为80％或更多(例如，85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或100％)。在一些情况下，指导序列与靶核酸的靶位点之间的互补性百分比为90％或更多(例如，95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或100％)。在一些情况下，指导序列与靶核酸的靶位点之间的互补性百分比为100％。
在一些情况下，指导序列和靶核酸的靶位点之间的互补性百分比在靶核酸的靶位点的七个连续最3'核苷酸上为100％。
本披露提供了一种或多种核酸，其包含以下中的一种或多种：供体模板DNA分子序列(用于靶基因的同源定向修复)，编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽等的本主题的合成的多核苷酸序列，RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA，和编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列(在双指导RNA形式的情况下可以包括两个单独的核苷酸序列，或者在单指导RNA形式的情况下可以包括单个核苷酸序列)。本披露提供了包含编码由本主题的合成的多核苷酸编码的RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的核苷酸序列的核酸。本披露提供了包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽的本主题的合成的多核苷酸序列的重组表达载体。本披露提供了包含编码RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸的重组表达载体。本披露提供了包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽的本主题的合成的多核苷酸的重组表达载体。本发明提供了重组表达载体，其包含：a)编码RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸；和b)编码一种或多种RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列。在一些情况下，编码RGE、RGN或ndRGDBP蛋白的本主题的合成的多核苷酸和/或编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列可操作地连接到在所选细胞类型(例如、原核细胞、真核细胞、植物细胞(包括大豆植物细胞)、动物细胞、哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、啮齿动物细胞、人细胞等)中可操作的启动子。
本披露提供了一种或多种重组表达载体，其(在一些情况下在不同的重组表达载体中，并且在一些情况下在相同的重组表达载体中)包括：(i)供体模板DNA分子的核苷酸序列(其中供体模板DNA分子包含与靶核酸(例如，靶基因组)的靶序列具有同源性的核苷酸序列)；(ii)编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列，该指导RNA与靶向的基因组的靶基因座的靶序列杂交(例如，单或双指导RNA)(例如，可操作地连接至在靶细胞如真核细胞中可操作的启动子)；和(iii)编码RGE、RGN或ndRGDBP蛋白的本主题的合成的多核苷酸(例如，可操作地连接至在靶细胞如真核细胞或大豆细胞中可操作的启动子)。本披露提供了一种或多种重组表达载体，其(在一些情况下在不同的重组表达载体中，并且在一些情况下在相同的重组表达载体中)包括：(i)供体模板DNA分子的核苷酸序列(其中供体模板DNA分子包含与靶核酸(例如，靶基因组)的靶序列具有同源性的核苷酸序列)；和(ii)编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核酸，该指导RNA与靶向的基因组的靶基因座的靶序列杂交(例如，单或双指导RNA)(例如，可操作地连接至在靶细胞如真核细胞中可操作的启动子)。本披露提供了一种或多种重组表达载体，其(在一些情况下在不同的重组表达载体中，并且在一些情况下在相同的重组表达载体中)包括：(i)编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的本主题的合成的多核苷酸，该指导RNA与靶向的基因组的靶基因座的靶序列杂交(例如，单或双指导RNA)(例如，可操作地连接至在靶细胞如大豆植物细胞中可操作的启动子)；和(ii)编码RGE、RGN或ndRGDBP蛋白的本主题的合成的多核苷酸(例如，可操作地连接至在靶细胞如真核细胞中可操作的启动子)。
取决于所利用的宿主/载体系统，可以在表达载体中使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等。
在一些实施例中，编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的本主题的合成的多核苷酸可操作地连接至控制元件，例如转录控制元件，例如启动子。在一些实施例中，编码RGE、RGN或ndRGDBP蛋白或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸可操作地连接至控制元件，例如转录控制元件，例如启动子。
转录控制元件可以是启动子。在一些情况下，启动子是组成型活性启动子。在一些情况下，启动子是调节型启动子。在一些情况下，启动子是诱导型启动子。在一些情况下，启动子是组织特异性启动子。在一些情况下，启动子是细胞类型特异性启动子。在一些情况下，转录控制元件(例如，启动子)在靶向的细胞类型或靶向的细胞群中起作用。
在一些实施例中，编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA和/或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施例中，编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA和/或RGE、RGN或ndRGDBP融合蛋白的本主题的合成的多核苷酸可操作地连接至组成型启动子。
将核酸(例如，包含供体模板DNA分子序列、编码RGE、RGN或ndRGDBP蛋白的一种或多种本主题的合成的多核苷酸和/或RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA等的核酸)引入宿主细胞中的方法在本领域中是已知的，并且可以使用任何方便的方法将核酸(例如，表达构建体)引入细胞中。合适的方法包括例如病毒感染、转染、脂质体转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒-介导的核酸递送等。
将重组表达载体引入细胞可以在任何培养基中以及在任何促进细胞存活的培养条件下进行。将重组表达载体引入靶细胞可以在体内或离体进行。将重组表达载体引入靶细胞可以在体外进行。
在一些实施例中，编码RGE、RGN或ndRGDBP蛋白的本主题的合成的多核苷酸可以作为RNA提供。RNA可以通过直接化学合成提供，也可以在体外从DNA转录(例如，编码RGE、RGN或ndRGDBP蛋白)。一旦合成，可以通过任何众所周知的将核酸引入细胞的技术(例如，显微注射、电穿孔、转染等)将RNA引入细胞中。
可以使用成熟的转染技术向细胞提供核酸；例如，参见Angel和Yanik(2010)PLoSONE[公共科学图书馆·综合]5(7):el 1756，以及来自凯杰公司(Qiagen)的市售
Figure BDA0003867941360000491
试剂、来自Stemgent公司的StemfectTMRNA转染试剂盒，以及来自米纳斯生物公司(Mirus Bio LLC)的
Figure BDA0003867941360000492
转染试剂盒。另见Beumer等人(2008)PNAS[美国国家科学院院刊]105(50):19821-19826。
载体可以直接提供给靶宿主细胞。换言之，将细胞与包含本主题的合成的多核苷酸的载体(例如，编码RGE、RGN或ndRGDBP蛋白的重组表达载体；等)接触，以使载体被细胞摄取。使细胞与作为质粒的核酸载体接触的方法包括电穿孔、氯化钙转染、显微注射和脂转染，这些在本领域中是众所周知的。对于病毒载体递送，细胞可以与包含主题病毒表达载体(例如双生病毒载体、TMV载体等)的病毒颗粒接触，该主题病毒表达载体包含本主题的合成的多核苷酸。
用于向靶宿主细胞提供编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA和/或RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽的核酸的载体可以包括用于驱动目的核酸表达即转录激活的合适启动子。换言之，在一些情况下，目的核酸将与启动子可操作地连接。这可以包括普遍作用型启动子，例如病毒启动子(例如，CaMV35S或CaMV19S)、肌动蛋白启动子或诱导型启动子，例如在特定细胞群中具有活性或响应存在四环素等药物具有活性的启动子。通过转录激活，旨在将靶细胞中的转录增加至高于基础水平10倍、100倍、更通常为1000倍。此外，用于向细胞提供编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA和/或RGE、RGN或ndRGDBP蛋白的核酸的载体可以包括在靶细胞中编码选择标记的核酸序列，因此以鉴定已摄取RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA和/或RGE、RGN或ndRGDBP蛋白的细胞。
包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸的核酸在一些情况下是RNA。因此，可以将RGE、RGN或ndRGDBP融合蛋白作为RNA引入细胞。将RNA引入细胞的方法是本领域已知的并且可以包括例如直接注射、转染或用于引入DNA的任何其他方法。
多种化合物、载体系统(例如，细菌植物转化载体系统)和方法中的任何一种都可以用于向靶细胞(例如植物细胞，包括大豆细胞)递送包含本主题的合成的多核苷酸的RGE、RGN或ndRGDBP系统。本文提供的RGE、RGN或ndRGDBP系统包括可以包含以下的系统：(a)编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽的本主题的合成的多核苷酸，RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA和供体模板DNA分子；(b)包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽的mRNA的本主题的合成的多核苷酸；和RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA；(c)包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽的mRNA的本主题的合成的多核苷酸，RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA和供体模板DNA分子；(d)包含编码RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的mRNA的本主题的合成的多核苷酸；和RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA；(e)包含编码RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的mRNA的本主题的合成的多核苷酸，RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA和供体模板DNA分子；(f)重组表达载体，其包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽的本主题的合成的多核苷酸和编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列；(g)重组表达载体，其包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽的本主题的合成的多核苷酸，编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列，和编码供体模板DNA分子的核苷酸序列；(h)重组表达载体，其包含编码RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸和编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列；(i)重组表达载体，其包含编码RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸，编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列，和编码供体模板DNA分子的核苷酸序列；(j)包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽的本主题的合成的多核苷酸的第一重组表达载体，和包含编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列的第二重组表达载体；(k)包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽的本主题的合成的多核苷酸的第一重组表达载体，和包含编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列的第二重组表达载体；和供体模板DNA分子；(l)包含编码RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸的第一重组表达载体，和包含编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列的第二重组表达载体；(m)包含编码RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸的第一重组表达载体，和包含编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列的第二重组表达载体；和供体模板DNA分子；(n)重组表达载体，其包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽的本主题的合成的多核苷酸，编码第一RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列，和编码第二RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列；或(o)重组表达载体，其包含编码RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸，编码第一RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列，和编码第二RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列；或(a)到(o)之一的一些变体。作为非限制性实例，RGE、RGN或ndRGDBP系统可以与脂质组合。作为另一个非限制性实例，RGE、RGN或ndRGDBP系统可以与颗粒组合，或配制成颗粒。作为另一个非限制性实例，RGE、RGN或ndRGDBP系统可包含在植物细胞中或递送至植物细胞(例如大豆植物细胞)。
将核酸引入宿主细胞的方法是本领域已知的，并且可以使用任何方便的方法将本主题的合成的多核苷酸(例如，表达构建体/载体)或包含它们的RGE、RGN或ndRGDBP系统引入靶细胞(例如，原核细胞、真核细胞、植物细胞(例如大豆植物细胞)、动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞等)。合适的方法包括例如病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、脂转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微量注射、纳米颗粒介导的核酸递送(参见，例如，Panyam等人Adv Drug Deliv Rev.[药物递送综述进展]2012年9月13日.pii:S0169-409X(12)00283-9.doi:10.1016/j.addr.2012.09.023)，等。在植物中，可以使用以下：细菌介导的(例如，农杆菌属物种(Agrobacterium sp.)、根瘤菌属物种(Rhizobium sp.)、中华根瘤菌属物种(Sinorhizobium sp.)、中生根瘤菌属物种(Mesorhizobium sp.)、慢生根瘤菌属物种(Bradyrhizobium sp.)、固氮菌属物种(Azobacter sp.)、叶杆菌属物种(Phyllobacterium sp.))用包含本主题的合成的多核苷酸的核酸对植物(例如，大豆)细胞、原生质体、胚胎、愈伤组织或组织的转染或转化；参见例如Broothaerts等人(2005)Nature[自然],433:629-633。
在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽或RGE、RGN或ndRGDBP系统可以作为核酸(例如，mRNA、DNA、质粒、表达载体、病毒载体、等)递送，该核酸编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽和/或RGE、RGN或ndRGDBP系统的其他组分。可以通过任何方便的方法将RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽引入细胞(提供给细胞)；这样的方法是本领域普通技术人员已知的。作为说明性实例，可将编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽的本主题的合成的多肽直接注射到细胞中(例如，有或没有RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA或编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核酸，以及有或没有供体模板DNA分子)。在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽(例如，与融合配偶体融合的RGE、RGN或ndRGDBP)作为核酸(例如，mRNA、DNA、质粒、表达载体、病毒载体等)提供，该核酸包含编码RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多肽。
在一些情况下，核酸(例如，RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA；包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽的本主题的合成的多核苷酸的核酸；RGE、RGN或ndRGDBP系统等的一种或多种组分)以颗粒或与颗粒向关联地递送至细胞(例如，靶宿主细胞，例如大豆细胞)。在一些情况下，RGE、RGN或ndRGDBP系统被递送至颗粒中的细胞或与颗粒相关联的颗粒。视情况而定，术语“颗粒”和纳米颗粒可互换使用。可以使用颗粒或脂质包膜同时递送以下：包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽的本主题的合成的多核苷酸和/或RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的重组表达载体，包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽的本主题的合成的多核苷酸的mRNA，和指导RNA。例如，编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽的本主题的合成的多核苷酸和RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA可通过颗粒递送，例如包含脂质或类脂质和亲水性聚合物的递送颗粒，例如阳离子脂质和亲水聚合物，例如其中阳离子脂质包含l,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)或l,2-双十四烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)和/或其中亲水聚合物包括乙二醇或聚乙二醇(PEG)；和/或其中所述颗粒进一步包含胆固醇(例如，来自以下的颗粒：配制品l＝DOTAP 100、DMPC 0、PEG 0、胆固醇0；配制品编号2＝DOTAP 90、DMPC 0、PEG 10、胆固醇0；配制品编号3＝DOTAP 90、DMPC 0、PEG 5、胆固醇5)。
可以使用颗粒或脂质包膜同时递送以下：包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽的本主题的合成的多核苷酸的mRNA或包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽的本主题的合成的多核苷酸和/或RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA(或核酸，例如编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的一种或多种表达载体)的重组表达载体。例如，可以使用具有被磷脂双层壳包裹的聚(β-氨基酯)(PBAE)核的可生物降解核-壳结构纳米颗粒。在一些情况下，使用基于自组装生物粘附聚合物的颗粒/纳米颗粒。
类脂质化合物(例如，如美国专利申请20110293703中所述)也可用于多核苷酸的施用，并可用于递送编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽或RGE、RGN或ndRGDBP系统的一种或多种组分的本主题的合成的多核苷酸。一方面，氨基醇类脂质化合物与待递送至细胞或受试者的药剂组合以形成微粒、纳米颗粒、脂质体或胶束。氨基醇类脂质化合物可以与其他氨基醇类脂质化合物、聚合物(合成的或天然的)、表面活性剂、胆固醇、碳水化合物、蛋白质、脂质等组合以形成颗粒。
聚(β-氨基醇)(PBAA)可用于将编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽或RGE、RGN或ndRGDBP系统的一种或多种组分的本主题的合成的多核苷酸递送至靶细胞。美国专利公开号20130302401涉及使用组合聚合制备的一类聚(β-氨基醇)(PBAA)。
可以使用基于糖的颗粒，例如GalNAc，如参考WO 2014118272(通过引用并入本文)和Nair,J K等人,2014,Journal of the American Chemical Society[美国化学会杂志]136(49),16958-16961))所描述，可用于将编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽或RGE、RGN或ndRGDBP系统的一种或多种组分的本主题的合成的多核苷酸递送至靶细胞。
在一些情况下，脂质纳米颗粒(LNP)可用于将编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽或RGE、RGN或ndRGDBP系统的一种或多种组分的本主题的合成的多核苷酸递送至靶细胞。带负电荷的聚合物(例如RNA)可以在低pH值(例如pH 4)下加载到LNP中，其中可电离的脂质显示正电荷。然而，在生理pH值下，LNP表现出低表面电荷，与较长的循环时间相适应。四种可电离的阳离子脂质已被关注，即l,2-二亚油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油酰基氧基-3-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油酰基氧基-酮基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinKDMA)和l,2-二亚油酰基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[l,3]-二氧戊环(DLinKC2-DMA)。LNP的制备并在例如Rosin等人(2011)Molecular Therapy[分子疗法]19:1286-2200)中进行了描述。可以使用阳离子脂质l,2-二亚油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLinDAP)、l,2-二亚油酰基氧基-3-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、l,2-二亚油酰基氧基酮基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinKDMA)和l,2-二亚油酰基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[l,3]-二氧戊环(DLinKC2-DM A)、(3-o-[2"-(甲氧基聚乙二醇2000)丁二酰基]-l,2-二肉豆蔻酰基-sn-乙二醇(PEG-S-DMG)和R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-l,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DOMG)。核酸(例如，RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA；编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽或RGE、RGN或ndRGDBP系统的一种或多种组分的本主题的合成的多核苷酸；等)可以封装在含有DlinDAP、DLinDMA、DLinK-DMA和DLinKC2-DMA的LNP(阳离子脂质:DSPC:CHOL:PEGS-DMG或PEG-C-DOMG的摩尔比为40:10:40:10)中。在一些情况下，掺加0.2％SP-DiOC18。
球形核酸(SNATM)构建体和其他纳米颗粒(特别是金纳米颗粒)可用于将包含本主题的合成的多核苷酸或RGE、RGN或ndRGDBP系统的一种或多种组分的核酸递送至靶细胞。参见，例如，Cutler等人,J.Am.Chem.Soc[美国化学学会杂志].2011 133:9254-9257,Hao等人,Small.2011 7:3158-3162,Zhang等人,ACS Nano[ACS纳米].2011 5:6962-6970,Cutler等人,J.Am.Chem.Soc[美国化学学会杂志].2012 134:1376-1391,Young等人,Nano Lett[纳米快报].2012 12:3867-71,Zheng等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊].2012 109:11975-80,Mirkin,Nanomedicine[纳米药物]2012 7:635-638Zhang等人,J.Am.Chem.Soc[美国化学学会杂志].2012 134:16488-1691,Weintraub,Nature[自然]2013 495:S14-S16,Choi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊].2013 110(19):7625-7630,Jensen等人,Sci.Transl.Med[科学转化医学].5,209ral52(2013)和Mirkin,等人,Small,10:186-192。
具有包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽或RGE、RGN或ndRGDBP系统的一种或多种组分的本主题的合成的多核苷酸的RNA的自组装纳米颗粒可以用聚乙烯亚胺(PEI)构建，聚乙烯亚胺被连接在聚乙二醇(PEG)远端的Arg-Gly-Asp(RGD)肽配体PEG化。
通常，“纳米颗粒”是指直径小于1000nm的任何颗粒。在一些情况下，适用于将包含本主题的合成的多核苷酸的核酸递送至靶细胞的纳米颗粒具有500nm或更小的直径，例如25nm至35nm、35nm至50nm、50nm至75nm、75nm至100nm、100nm至150nm、150nm至200nm、200nm至300nm、300nm至400nm或400nm至500nm。在一些情况下，适用于将包含本主题的合成的多核苷酸的核酸递送至靶细胞的纳米颗粒具有25nm至200nm的直径。在一些情况下，适用于将包含本主题的合成的多核苷酸的核酸递送至靶细胞的纳米颗粒具有100nm或更小的直径。在一些情况下，适用于将包含本主题的合成的多核苷酸的核酸递送至靶细胞的纳米颗粒具有35nm至60nm的直径。
适用于将包含本主题的合成的多核苷酸或RGE、RGN或ndRGDBP系统的一种或多种组分的核酸递送至靶细胞的纳米颗粒可以不同形式提供，例如，作为固体纳米颗粒(例如，金属，例如银、金、铁、钛)、非金属、基于脂质的固体、聚合物)、纳米颗粒的悬浮液或其组合。可以制备金属、电介质和半导体纳米颗粒，以及杂混结构(例如，核-壳纳米颗粒)。如果由半导体材料制成的纳米颗粒足够小(通常低于10nm)，可以发生电子能级的量子化，它们也可以被标记为量子点。这种纳米级颗粒在生物医学应用中用作药物载剂或显像剂，并且可以适用于本披露中的类似目的。
半固体和软纳米颗粒也适用于将包含本主题的合成的多核苷酸或RGE、RGN或ndRGDBP系统的一种或多种组分的核酸递送至靶细胞。半固体性质的原型纳米颗粒是脂质体。
在一些情况下，脂质体用于将本主题的合成的多核苷酸或RGE、RGN或ndRGDBP系统的一种或多种组分递送至靶细胞。脂质体是球形囊泡结构，这些球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以由几种不同类型的脂质制成；然而，磷脂最常用于生成脂质体。虽然当脂质膜与水溶液混合时脂质体的形成是自发的，但也可以通过使用均质器、超声仪或挤出装置以摇动的形式施加力来加速脂质体的形成。可以将几种其他添加剂添加到脂质体中以改变它们的结构和特性。例如，可以将胆固醇或鞘磷脂添加到脂质体混合物中，以帮助稳定脂质体结构并防止脂质体内部货物的泄漏。脂质体配制品可以主要由天然磷脂和脂质(例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱和单唾液酸神经节苷脂)构成。
稳定的核酸-脂质颗粒(SNALP)可用于将本主题的合成的多核苷酸或RGE、RGN或ndRGDBP系统的一种或多种组分递送至靶细胞。SNALP配制品可包含摩尔百分比为2:40:10:48的脂质3-N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻酰基氧基-丙基胺(PEG-C-DMA)、l,2-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、l,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)和胆固醇。可通过将D-Lin-DMA和PEG-C-DMA与双硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇和siRNA(使用25:1脂质/siRNA比率)和胆固醇/D-Lin-DMA/DSPC/PEG-C-DMA的48/40/10/2摩尔比率进行配制来制备SNALP脂质体。所得SNALP脂质体的大小约为80-100nm。SNALP可以包含合成的胆固醇(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州，美国)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(Avanti极性脂质公司(Avanti PolarLipids)，阿拉巴斯特(Alabaster)，阿拉巴马州(Ala)，美国)、3-N-[(w-甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-l,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基胺和阳离子l,2-二亚油酰基氧基-3-N,N二甲基氨基丙烷。SNALP可包含合成的胆固醇(西格玛奥德里奇公司)、l,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC；Avanti极性脂质公司)、PEG-cDMA和l,2-二亚油酰基氧基-3-(N；N-二甲基)氨基丙烷(DLinDMA)。
其他阳离子脂质，例如氨基脂质2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[l,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)可用于递送本主题的合成的多核苷酸或RGE的一种或多种组分，RGN或ndRGDBP系统到靶细胞。可以考虑具有以下脂质组合物的预制囊泡：氨基脂质、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇和(R)-2,3-双(十八烷基氧基)丙基-l-(甲氧基聚(乙二醇)2000)丙基氨基甲酸酯(PEG-脂质)，分别地摩尔比为40/10/40/10，和约为0.05(w/w)FVII siRNA/总脂质比。为确保70-90nm范围内的窄粒度分布和0.11.+-.0.04(n＝56)的低多分散指数，在添加指导RNA之前，这些颗粒可以通过80nm膜挤出多达三次。可以使用含有高效氨基脂质16的颗粒，其中四种脂质组分16、DSPC、胆固醇和PEG-脂质的摩尔比(50/10/38.5/1.5)可以进一步优化以增强体内活性。
脂质可以与RGE、RGN或ndRGDBP系统或其一种或多种组分或编码它们的核酸一起配制以形成脂质纳米颗粒(LNP)。合适的脂质包括但不限于DLin-KC2-DMA4、CI 2-200和共脂质二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇和PEG-DMG可以使用自发囊泡形成程序与本披露的RGE、RGN或ndRGDBP系统或其组分一起配制。组分摩尔比可以为约50/10/38.5/1.5(DLin-KC2-DMA或C12-200/二硬脂酰磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-DMG)。
本披露的RGE、RGN或ndRGDBP系统或其组分可以封装在PLGA微球中递送，例如在美国公开申请20130252281和20130245107和20130244279中进一步描述的那些。
超电荷电蛋白可用于将本主题的合成的多核苷酸或RGE、RGN或ndRGDBP系统的一种或多种组分递送至靶细胞。超电荷电蛋白质是一类工程化的或天然存在的蛋白质，具有异常高的正或负净理论电荷。超负电荷和超正电荷蛋白质都表现出承受热或化学诱导的聚集的能力。超正电荷蛋白质还能够穿透哺乳动物细胞。将货物与这些蛋白质(如质粒DNA、RNA或其他蛋白质)相关联，可以促进这些大分子在体外和体内功能性递送到哺乳动物细胞中。
细胞穿透肽(CPP)可用于将本主题的合成的多核苷酸或RGE、RGN或ndRGDBP系统的一种或多种组分递送至靶细胞。CPP通常具有的氨基酸组成要么包含高相对丰度的带正电荷氨基酸(例如赖氨酸或精氨酸)，要么具有包含极性/带电荷氨基酸和非极性疏水氨基酸的交替模式的序列。
本披露提供了经修饰的细胞(例如，经修饰的植物细胞或经修饰的大豆细胞)，其包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽或RGE、RGN或ndRGDBP系统的一种或多种组分的本主题的合成的多核苷酸。本披露提供了用包含编码本披露的RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽的本主题的合成的多核苷酸的mRNA进行基因修饰的经基因修饰的细胞。本披露提供了用包含编码本披露的RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽的本主题的合成的多核苷酸的重组表达载体进行基因修饰的经基因修饰的细胞。本披露提供了用重组表达载体进行基因修饰的经基因修饰的细胞(例如大豆细胞)，该重组表达载体包含：a)编码本披露的RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽的本主题的合成的多核苷酸；和b)编码本披露的RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列。本披露提供了用重组表达载体进行基因修饰的经基因修饰的细胞，该重组表达载体包含：a)编码RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸；b)编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的核苷酸序列；和c)编码供体模板DNA分子的核苷酸序列。
用作本披露的编码RGE、RGN或ndRGDBPRGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽的本主题的合成的多核苷酸和/或RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的受体的细胞可以是多种细胞中的任何，包括例如体外细胞；体内细胞；离体细胞；原代细胞；癌细胞；动物细胞；植物细胞；藻类细胞；真菌细胞；等等。在某些实施例中，细胞是大豆细胞，包括分生组织或胚胎大豆细胞。充当编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽的本主题的合成的多核苷酸和/或RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA的受体的细胞称为“宿主细胞”或“靶细胞”。
因为使用RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽的方法包括将RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽与靶核酸中的特定区域结合(通过由相关联的RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA靶向那里)，这些方法在本文中通常称为结合方法(例如，结合靶核酸的方法)。然而，应理解，在一些情况下，虽然结合方法可能仅导致靶核酸的结合，但在其他情况下，该方法可能具有不同的最终结果(例如，该方法可以导致靶核酸的修饰，例如切割/甲基化/等，调节从靶核酸的转录；调节靶核酸的翻译；基因组编辑；调节与靶核酸相关联的蛋白质；分离靶核酸；等等)。
有关获得或设计适用于某些RGE、RGN和ndRGDBP的指导RNA的合适方法的实例参见例如Pausch等人,Science[科学]369,333-337(2020)以及Jinek等人,Science[科学].2012年8月17日；337(6096):816-21；Chylinski等人,RNA Biol[RNA生物学].2013年5月；10(5):726-37；Ma等人,Biomed Res Int[国际生物医学研究].2013；2013:270805；Hou等人,ProcNatl Acad Sci U S A[美国国家科学院院刊].2013年9月24日；110(39):15644-9；Jinek等人,Elife.2013；2:e00471；Pattanayak等人,Nat Biotechnol[自然生物技术].2013年9月；31(9):839-43；Qi等人,Cell[细胞].2013年2月28日；152(5):1173-83；Wang等人,Cell[细胞].2013年5月9日；153(4):910-8；Auer等人,Genome Res[基因组研究].2013年10月31日；Chen等人,Nucleic Acids Res[核酸研究].2013年11月l日；41(20):el9；Cheng等人,CellRes[细胞研究].2013年10月；23(10):1163-71；Cho等人,Genetics[遗传学].2013年11月；195(3):1177-80；DiCarlo等人,Nucleic Acids Res[核酸研究].2013年4月；41(7):4336-43；Dickinson等人,Nat Methods[自然方法].2013年10月；10(10):1028-34；Ebina等人,Sci Rep[科学报道].2013；3:2510；Fujii等人,Nucleic Acids Res[核酸研究].2013年11月l日；41(20):el87；Hu等人,Cell Res[细胞研究].2013年11月；23(l l):1322-5；Jiang等人,Nucleic Acids Res[核酸研究].2013年11月l日；41(20):el88；Larson等人,NatProtoc[自然实验手册].2013年11月；8(l l):2180-96；Mali等人,Nat Methods[自然方法].2013年10月；10(10):957-63；Nakayama等人,Genesis[发生].2013年12月；51(12):835-43；Ran等人,Nat Protoc[自然实验手册].2013年11月；8(l l):2281-308；Ran等人,Cell[细胞].2013年9月12日；154(6):1380-9；Upadhyay等人,G3(Bethesda).2013年12月9日；3(12):2233-8；Walsh等人,Proc Natl Acad Sci U S A[美国国家科学院院刊].2013年9月24日；110(39):15514-5；Xie等人,Mol Plant[分子植物学].2013年10月9日；Yang等人,Cell[细胞].2013年9月12日；154(6):1370-9；和美国专利和专利申请：8,906,616；8,895,308；8,889,418；8,889,356；8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945；8,697,359；20140068797；20140170753；20140179006；20140179770；20140186843；20140186919；20140186958；20140189896；20140227787；20140234972；20140242664；20140242699；20140242700；20140242702；20140248702；20140256046；20140273037；20140273226；20140273230；20140273231；20140273232；20140273233；20140273234；20140273235；20140287938；20140295556；20140295557；20140298547；20140304853；20140309487；20140310828；20140310830；20140315985；20140335063；20140335620；20140342456；20140342457；20140342458；20140349400；20140349405；20140356867；20140356956；20140356958；20140356959；20140357523；20140357530；20140364333；和20140377868；其中的每一个都通过引用以其整体并入本文。
在需要将多核苷酸序列插入基因组(在该基因组中，靶序列被切割)的应用中，还可以向细胞提供供体模板DNA分子。供体模板DNA分子可以插入到被RGE或RGN蛋白切割的靶编辑位点处(例如，在dsDNA切割之后，在对靶DNA进行切口之后，在对靶DNA进行双重切口之后，等)。供体模板DNA分子可以在靶位点包含与基因组序列足够的同源性，例如，与靶位点侧翼的核苷酸序列(例如，在靶位点的约50个碱基或更少内，例如，约30个碱基内、约15个碱基内、约10个碱基内、约5个碱基内，或紧侧翼于靶位点)具有70％、80％、85％、90％、95％或100％的同源性，以支持它与其具有同源性的基因组序列之间的同源定向修复。供体和基因组序列之间的具有序列同源性的大约25、50、100或200个核苷酸，或超过200个核苷酸(或10到200个核苷酸或更多的任何整数值)可以支持同源性定向修复。供体模板DNA分子可以具有任何长度，例如10个核苷酸或更多、50个核苷酸或更多、100个核苷酸或更多、250个核苷酸或更多、500个核苷酸或更多、1000个核苷酸或更多、5000个核苷酸或更多，等。
供体模板DNA分子通常与其取代的基因组序列不相同。相反，供体模板DNA分子可以包含至少一个或多个相对于基因组序列的单碱基变化、插入、缺失、倒位或重排，只要存在足够的同源性以支持同源性定向修复(例如，对于基因校正，例如，将致病碱基对转换为非致病碱基对)。在一些实施例中，供体模板DNA分子包含侧接两个同源区的非同源序列，使得靶DNA区和两个侧翼序列之间的同源定向修复导致非同源序列插入靶区。供体模板DNA分子还可以包含载体骨架，该载体骨架含有与目的DNA区域不同源并且不打算插入目的DNA区域的序列。通常，供体模板DNA分子的一个或多个同源区将与需要重组的基因组序列具有至少50％序列同一性。在某些实施例中，存在60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.9％序列同一性。根据供体模板DNA分子的长度，可以存在1％和100％序列同一性之间的任何值。
与基因组序列相比，供体模板DNA分子可包含某些序列差异，例如限制性位点、核苷酸多态性、选择标记(例如，药物抗性基因、荧光蛋白、酶等)等，这些差异可用于评估供体序列在切割位点的成功插入，或者在一些情况下可用于其他目的(例如，显示在靶向的基因组基因座处的表达)。在一些情况下，如果位于编码区，这种核苷酸序列差异不会改变氨基酸序列，或会产生沉默的氨基酸变化(例如，不影响蛋白质结构或功能的变化)。可替代地，这些序列差异可包括侧翼重组序列，例如FLP、loxP序列等，其可在稍后时间被激活以去除标记序列。
在一些情况下，供体模板DNA分子作为单链DNA提供给细胞。在一些情况下，供体模板DNA分子作为双链DNA提供给细胞。它可以线性或环形形式引入细胞中。如果以线性形式引入，则可以通过任何方便的方法保护供体序列的末端(例如，免于核酸外切降解)。例如，一个或多个双脱氧核苷酸残基可以添加到线性分子的3'末端和/或自身互补寡核苷酸可以连接到一个或两个末端。参见，例如，Chang等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]84:4959-4963；Nehls等人(1996)Science[科学]272:886-889。保护外源多核苷酸免于降解的其他方法包括但不限于一个或多个末端氨基基团的添加和经修饰的核苷酸间键的使用，例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。作为保护线性供体序列末端的替代方案，可以在同源区之外包括另外长度的序列，其可以在不影响重组的情况下被降解。可以将供体模板DNA分子作为载体分子的一部分引入细胞中，所述载体分子具有另外的序列，例如复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，供体序列可以作为裸核酸、作为与诸如脂质体或泊洛沙姆之类的试剂复合的核酸引入，或者可以通过病毒(例如，腺病毒、AAV、双生病毒)递送，如本文其他地方针对编码RGE、RGN或ndRGDBP指导RNA，RGE、RGN或ndRGDBP肽，RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽和/或供体模板DNA分子的核酸所描述的。
如上所述，在一些情况下，包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸的核酸(例如，重组表达载体)用作转基因以生成转基因植物，该转基因植物产生RGE、RGN或ndRGDBP多肽，或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽。提供了包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸的转基因植物、植物部分(例如种子)、组织或转基因植物细胞，特别是转基因大豆植物、大豆植物部分(例如大豆种子)、大豆组织或转基因大豆植物细胞。在一些实施例中，转基因植物的基因组包含本主题的合成的多核苷酸。在一些实施例中，转基因植物对于遗传修饰是纯合的。在一些实施例中，转基因植物对于遗传修饰是杂合的。Schindele等人(FEBSLetters[欧洲生化学会联合会快报]592(2018)1954-1967)中阐述的在植物中使用基于Cas9或Cas12的RGE、RGN或ndRGDBP的方法可适用于与本文提供的本主题的合成的多核苷酸一起使用。
建立了将外源核酸引入植物细胞的方法。这样的植物细胞被认为是如上定义的“转化的”。合适的方法包括病毒感染(例如双链DNA病毒，包括双生病毒)、转染、缀合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、碳化硅晶须技术、农杆菌介导的转化等。方法的选择通常取决于被转化细胞的类型和发生转化的环境(例如，体外、离体或体内)。
基于土壤细菌根癌农杆菌的转化方法对于将外源核酸分子引入维管植物中特别有用。农杆菌的野生型形式含有Ti(致瘤)质粒，其在宿主植物中指导致瘤冠瘿生长的产生。将Ti质粒的致瘤T-DNA区域向植物基因组的转移需要Ti质粒编码的毒力基因以及T-DNA边界，其是标示了待转移的区域的一组正向DNA重复。基于农杆菌的载体是经修饰形式的Ti质粒，其中诱导肿瘤的功能被有待引入植物宿主的目的核酸序列所替代。
农杆菌介导的转化通常采用共整合载体或二元载体系统，其中Ti质粒的组分在辅助载体和穿梭载体之间划分，辅助载体永久存在于农杆菌宿主中并携带毒力基因，穿梭载体包含以T-DNA序列为边界的目的基因。多种二元载体在本领域中是众所周知的并且是可商购的，例如从克罗泰克公司(Clontech)(加利福尼亚州帕洛阿尔托(Palo Alto))可商购。本领域也熟知将农杆菌与所培养的植物细胞或创伤组织例如像叶组织、根外植体、下胚轴(hypocotyledon)、茎段或块茎共培养的方法。参见，例如，Glick和Thompson,(编辑),Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology[植物分子生物学和生物技术方法],波卡雷顿(Boca Raton),佛罗里达州:CRC出版社(1993)。
微粒介导的转化也可用于产生主题转基因植物。这种方法(最初由Klein等人(Nature[自然]327:70-73(1987))进行了描述)依赖于通过与氯化钙、亚精胺或聚乙二醇沉淀而被所希望的核酸分子包被的微弹，例如金或钨。使用装置例如生物弹射击(BIOLISTIC)PD-1000(伯乐公司(Biorad)；加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules Calif.))，将微弹颗粒以高速加速引入被子植物组织中。可以将包含编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或RGE、RGN或ndRGDBP融合多肽的本主题的合成的多核苷酸的核酸(例如，重组表达载体)引入植物中，引入的方式使得该核酸能够进入一个或多个植物细胞，例如，通过体内或离体方案进入。“体内”是指将核酸施用于植物的活体，例如渗透。“离体”是指在植物外修饰细胞或外植体，然后将这些细胞或器官再生为植物。已经描述了许多适用于植物细胞的稳定转化或适用于建立转基因植物的载体，包括在Weissbach和Weissbach,(1989)Methods for PlantMolecular Biology[植物分子生物学方法]学术出版社(Academic Press),和Gelvin等人,(1990)Plant Molecular Biology Manual[植物分子生物学手册],Kluwer学术出版社(Kluwer Academic Publishers)中描述的那些。具体实例包括那些衍生自根癌农杆菌的Ti质粒的那些，以及由Herrera-Estrella等人(1983)Nature[自然]303:209,Bevan(1984)Nucl Acid Res[核酸研究].12:8711-8721,Klee(1985)Bio/Technolo[生物/技术]3:637-642披露的那些。可替代地，可以使用非Ti载体通过使用游离DNA递送技术将DNA转移到植物和细胞中。通过使用这些方法，可以生产转基因植物，例如小麦、稻(Christou(1991)Bio/Technology[生物/技术]9:957-9和4462)和玉米(Gordon-Kamm(1990)Plant Cell[植物细胞]2:603-618)。未成熟的胚胎也可以是单子叶植物的良好靶组织，用于通过使用粒子枪进行直接DNA递送技术(Weeks等人(1993)Plant Physiol[植物生理学]102:1077-1084；Vasil(1993)Bio/Technolo[生物/技术]10:667-674；Wan和Lemeaux(1994)Plant Physiol[植物生理学]104:37-48和用于农杆菌介导的DNA转移(Ishida等人(1996)Nature Biotech[自然生物技术]14:745-750)。在美国专利申请公开号20150099648、20140283225、20140173774、20090077694、20090049567和20080229447中也阐述了转化大豆的方法，这些专利申请通过引用以其整体并入本文。将DNA引入叶绿体的方法是基因枪轰击、原生质体的聚乙二醇转化和显微注射(Danieli等人Nat.Biotechnol[自然生物技术]16:345-348,1998；Staub等人Nat.Biotechnol[自然生物技术]18:333-338,2000；O'Neill等人Plant J[植物杂志].3:729-738,1993；Knoblauch等人Nat.Biotechnol[自然生物技术]17:906-909；美国专利号5,451,513、5,545,817、5,545,818和5,576,198；国际申请号WO 95/16783；以及Boynton等人,Methods in Enzymology[酶学方法]217:510-536(1993),Svab等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:913-917(1993),和McBride等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91:7301-7305(1994))。适用于基因枪轰击、原生质体聚乙二醇转化和显微注射方法的任何载体都适合作为叶绿体转化的靶向载体。任何双链DNA载体都可以用作转化载体，特别是当引入方法不使用农杆菌时。
可以进行基因修饰的植物包括谷物、饲料作物、水果、蔬菜、油料作物、棕榈植物、林业植物和藤本植物。可以用本主题的合成的多核苷酸修饰的植物的具体实例如下：玉蜀黍、香蕉、花生、豌豆、向日葵、番茄、卡诺拉油菜、烟草、小麦、大麦、燕麦、马铃薯、豆科植物，包括大豆、豆类、花生、豌豆和扁豆；棉花、康乃馨、高粱、羽扇豆和稻。
本披露提供了转化的植物细胞、组织、植物和含有转化的植物细胞(例如大豆植物细胞)的产品。某些本主题的转化的细胞、组织和产品的特征是存在整合到基因组中的本主题的合成的多核苷酸，以及植物细胞产生RGE、RGN或ndRGDBP多肽，或RGE、RGN，或ndRGDBP融合多肽。
本披露的重组植物细胞(例如豆科植物细胞，包括大豆细胞)可作为重组细胞的群体，或作为组织、种子、整株植物、茎、果实、叶、根、花、茎、块茎、谷粒、动物饲料、植物田等使用。
编码RGE、RGN或ndRGDBP多肽或融合多肽的本主题的合成的多核苷酸可以在未知启动子(例如，当核酸随机整合到宿主细胞基因组中时)的控制下(即可操作地连接)或可以在已知启动子的控制下(即可操作地连接到)。合适的已知启动子可以是任何已知启动子并且包括组成型活性启动子、诱导型启动子、空间限制型和/或时间限制型启动子等。
实施例
本文提供的植物细胞和方法的各种实施例包括在以下实施例的非限制性列表中。
实施例集1
1.一种修饰大豆基因组中的内源大豆基因的方法，该方法包括：
(a)向包含编码RNA指导的核酸内切酶(RGE)或RNA指导的切口酶(RGN)的合成的多核苷酸的大豆植物细胞中引入针对该内源大豆基因中的靶编辑位点的指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸和任选地与该靶编辑位点具有同源性的供体模板DNA分子，其中所述合成的多核苷酸：
(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；
(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；
(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该RGE或该RGN的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，
(iv)或i、ii和iii的任何组合；并且
(b)选择包含该内源大豆基因的修饰的经修饰的大豆植物细胞、大豆植物、大豆植物部分、大豆组织或大豆愈伤组织。
2.一种修饰大豆基因组中的内源大豆基因的方法，该方法包括：
(a)向大豆植物细胞中引入：
(i)编码RNA指导的核酸内切酶(RGE)或RNA指导的切口酶(RGN)的合成的多核苷酸，其中所述合成的多核苷酸具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％，具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度，具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该RGE或该RGN的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，或所述GC含量、所述Tm和所述较低sCAI的任何组合；
(ii)指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸，该指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸针对该内源大豆基因中的靶编辑位点；以及任选地
(iii)与该靶编辑位点具有同源性的供体模板DNA分子；并且
(b)选择包含该内源大豆基因的修饰的经修饰的大豆植物细胞、大豆植物、大豆植物部分、大豆组织或大豆愈伤组织。
3.如实施例1或2所述的方法，其中该RGE包括II型Cas核酸内切酶、Cas9核酸内切酶、V型Cas核酸内切酶、Cas12a核酸内切酶、Cas12c核酸内切酶、CasX核酸内切酶或工程化的核酸内切酶。
4.如实施例1或2所述的方法，其中该RGN包含II型Cas切口酶、Cas9切口酶、V型Cas切口酶、Cas12a切口酶、Cas12c切口酶、CasX切口酶或工程化的切口酶。
5.如实施例1或2所述的方法，其中该RGN包含HNH或RuvC样核酸酶结构域中的突变，或任选地其中所述突变是：(i)SEQ ID NO:1的Cas9蛋白中的D10A突变；(ii)SEQ ID NO:25的FnCpf1蛋白中的R1226A氨基酸突变；或(iii)SEQ ID NO:73的LbCpf1蛋白中的R1138A突变。
6.如实施例1或2所述的方法，其中该合成的多核苷酸在以下中任一个的全长上具有至少76％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
7.如实施例1或2所述的方法，其中该合成的多核苷酸具有大于48％的GC含量并且在以下中任一个的全长上具有至少70％，75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
8.如实施例1或2所述的方法，其中该合成的多核苷酸具有：
(a)在选自由SEQ ID NO:3-11和12组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(b)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％或95％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(c)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％或95％序列同一性；并且具有的GC含量大于48％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
9.如实施例1或2所述的方法，其中该合成的多核苷酸编码RGE并且：
(i)该RGE是与SEQ ID NO:1具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的SpCas9核酸内切酶或其变体，并且编码该SpCas9核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
(ii)该RGE是与SEQ ID NO:13具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的SaCas9核酸内切酶或其变体，并且编码该SaCas9核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:14具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
(iii)该RGE是与SEQ ID NO:25具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的FnCpf1核酸内切酶或其变体，并且编码该FnCpf1核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:26具有至少95％序列同一性；或
(iv)该RGE是与SEQ ID NO:37具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的CasJ核酸内切酶或其变体，并且编码该CasJ核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:38具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
10.如实施例1或2所述的方法，其中该合成的多核苷酸编码该RGN，具有大于48％的GC含量，并且在以下中任一个的全长上具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN；
(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN；
(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN；或
(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN。
11.如实施例1或2所述的方法，其中该合成的多核苷酸编码该RGN并且：
(a)在选自由SEQ ID NO:3-11和12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个序列上具有超过或至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN；
(b)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个序列的全长上具有超过或至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN；或
(c)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个序列的全长上具有超过或至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；并且具有的GC含量大于48％并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN。
12.如实施例1或2所述的方法，其中：
(i)该合成的多核苷酸是与SEQ ID NO:1具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的SpCas9 RGN，并且编码该SpCas9 RGN的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ IDNO:2具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性；
(ii)该RGN是与SEQ ID NO:13具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的SaCas9 RGN，并且编码该SaCas9 ndRGDBP或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:14具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性；
(iii)该RGN是与SEQ ID NO:25具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的FnCpf1 RGN，并且编码该FnCpf1 RGN或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ IDNO:26具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性；或
(iv)该RGN是与SEQ ID NO:37具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的CasJRGN，并且编码该CasJ RGN或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:38具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性。
13.如实施例1-12中任一项所述的方法，其中该合成的多核苷酸：
(i)编码该RGE并且与在对照大豆植物细胞中修饰该内源基因的频率相比提供在该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中修饰该内源基因的频率方面的至少5倍增加，该对照大豆植物细胞具有包含编码该RGE的大豆密码子优化的参考多核苷酸的对照多核苷酸；或，
(ii)编码该RGN并与对照大豆植物细胞中内源靶序列的切口或切口相关修饰相比提供该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中的该内源靶序列的切口或切口相关修饰方面的至少2倍增加，该对照大豆植物细胞包含编码该RGN的对照大豆密码子优化的参考多核苷酸。
14.如实施例1-12或13中任一项所述的方法，其中该大豆密码子优化的参考多核苷酸具有比该合成的多核苷酸的GC含量低至少约8％、9％或10％的GC含量，或任选地其中该大豆密码子优化的参考多核苷酸具有比该合成的多核苷酸的GC含量低至少约8％至约12％的GC含量。
15.一种修饰大豆基因组中内源大豆基因的表达的方法，该方法包括：
(a)将针对该内源大豆基因中的靶DNA结合位点的指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸引入包含编码ndRGDBP的合成的多核苷酸的大豆植物细胞中，其中所述合成的多核苷酸：
(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；
(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；
(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iv)或i、ii和iii的任何组合；并且
(b)选择其中该内源大豆基因的表达已经被修饰的大豆植物细胞、大豆植物、大豆植物部分、大豆组织或大豆愈伤组织。
16.一种修饰大豆基因组中内源大豆基因的表达的方法，该方法包括：
(a)向大豆植物细胞中引入：
(i)编码包含核酸酶缺陷型受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)的蛋白质的合成的多核苷酸，其中所述合成的多核苷酸具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％，具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度，具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，或所述GC含量、Tm和sCAI的任何组合；并且
(ii)指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸，该指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸针对该内源大豆基因中的靶结合位点；并且
(b)选择其中该内源大豆基因的表达已经被修饰的经修饰的大豆植物细胞、大豆植物、大豆植物部分、大豆组织或大豆愈伤组织。
17.如实施例16所述的方法，其中该ndRGDBP包括II型Cas ndRGDBP、Cas9ndRGDBP、V型Cas ndRGDBP、Cas12a ndRGDBP、Cas12c ndRGDBP、CasX ndRGDBP或工程化的ndRGDBP。
18.如实施例16所述的方法，其中该ndRGDBP包含HNH或RuvC样核酸酶结构域中的突变，或任选地其中所述突变是：(i)SEQ ID NO:1的Cas9蛋白中的D10A和/或H840A突变；(ii)SEQ ID NO:25的FnCpf1蛋白中的D917A、E1006A、E1028A、D1255A和/或N1257A突变；(iii)SEQ ID NO:37的CasJ蛋白中的D901A、E1128A和/或D1298A突变；或(iv)SEQ ID NO:73的LbCpf1蛋白中的D832A、E925A和/或D1148A突变。
19.如实施例16所述的方法，其中该合成的多核苷酸在以下中任一个的全长上具有至少76％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；或
(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP。
20.如实施例16所述的方法，其中该合成的多核苷酸具有大于48％的GC含量并且在以下中任一个的全长上具有至少70％，75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；或
(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP。
21.如实施例16所述的方法，其中该合成的多核苷酸：
(a)在选自由SEQ ID NO:3-11和12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个序列上具有超过或至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(b)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个序列的全长上具有超过或至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；或
(c)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个序列的全长上具有超过或至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性；并且具有的GC含量大于48％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP。
22.如实施例16所述的方法，其中：
(i)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:1具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的SpCas9 ndRGDBP，并且编码该SpCas9 ndRGDBP或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性；
(ii)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:13具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的SaCas9 ndRGDBP，并且编码该SaCas9 ndRGDBP或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:14具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性；
(iii)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:25具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的FnCpf1 ndRGDBP，并且编码该FnCpf1 ndRGDBP或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:26具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性；或(iv)该ndRGDBP是与SEQID NO:37具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的CasJ ndRGDBP，并且编码该CasJndRGDBP或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:38具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性。
23.如实施例16-22中任一项所述的方法，其中该合成的多核苷酸进一步包含可操作地连接的多核苷酸，该多核苷酸编码修饰该内源大豆基因的表达的效应子结构域。
24.如实施例16-23中任一项所述的方法，其中该合成的多核苷酸可操作地连接至：
(a)在大豆植物细胞中可操作的启动子；
(b)5'非翻译(UT)序列和/或3'非翻译(UT)序列，任选地其中该5’UT和/或3’UT任选地(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；或(i)和(ii)的组合。
(c)多聚腺苷酸化序列；
(d)编码核定位信号(NLS)、叶绿体转运肽(CTP)、表位标签(ST)、转录激活结构域(TAD)、转录阻遏结构域(TRD)的第二多核苷酸；或其组合；任选地，其中一个或多个该第二多核苷酸序列(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该NLS、CTP、ET、TAD或TRD的第二大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合；和/或
(e)编码具有修饰靶DNA的酶活性的异源多肽的第三多核苷酸序列；任选地，其中一个或多个该第三多核苷酸序列(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该异源多肽的第三大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合。
25.如实施例24所述的方法，其中由该第三多核苷酸序列编码的异源多肽表现出一种或多种选自以下的酶活性：核酸酶活性、甲基转移酶活性、去甲基化酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨基活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性和/或糖基化酶活性。
26.如实施例16-25中任一项所述的方法，其中与对照大豆植物细胞中该内源基因的表达相比，该合成的多核苷酸提供在该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中该内源基因的表达方面的至少2倍增加，该对照大豆植物细胞包含对照大豆密码子优化的参考多核苷酸，该对照大豆密码子优化的参考多核苷酸编码该ndRGDBP并且(i)具有的GC含量比该多核苷酸的GC含量低至少约8％、9％或10％，或任选地其中编码该ndRGDBP的对照多核苷酸具有的GC含量至少比该合成的多核苷酸的GC含量低约8％至12％。
27.如实施例16-26中任一项所述的方法，其中该合成的多核苷酸包含编码RGE、RGN或ndRGDBP的RNA分子。
28.一种大豆植物细胞，其包含编码蛋白质的合成的多核苷酸，该蛋白质包含RNA指导的核酸内切酶(RGE)、RNA指导的切口酶(RGN)或核酸酶缺陷型受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)，其中所述多核苷酸：
(a)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；
(b)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；
(c)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码RGE的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(d)(a)、(b)和/或(c)的任何组合。
29.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该RGE包括II型Cas核酸内切酶、Cas9核酸内切酶、V型Cas核酸内切酶、Cas12a核酸内切酶、Cas12c核酸内切酶、CasX核酸内切酶或工程化的核酸内切酶。
30.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该ndRGDBP包括II型Cas ndRGDBP、Cas9ndRGDBP、V型Cas ndRGDBP、Cas12a ndRGDBP、Cas12c ndRGDBP、CasX ndRGDBP或工程化的ndRGDBP。
31.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码RGE并且在以下中任一个的全长上具有至少76％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:75-84的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(viii)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
32.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码RGE并且具有超过48％的GC含量并且在以下中任一个的全长上具有至少70％，75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:75-84的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(viii)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
33.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码该RGE并且：
(a)在选自由SEQ ID NO:3-11和12组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过或至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(b)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过或至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(c)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过或至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性；并且具有的GC含量大于48％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
34.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码该RGE并且：
(i)该RGE是与SEQ ID NO:1具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的SpCas9核酸内切酶或其变体，并且编码该SpCas9核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性；
(ii)该RGE是与SEQ ID NO:13具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的SaCas9核酸内切酶或其变体，并且编码该SaCas9核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:14具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性；
(iii)该RGE是与SEQ ID NO:25具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的FnCpf1核酸内切酶或其变体，并且编码该FnCpf1核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:26具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性；或
(iv)该RGE是与SEQ ID NO:37具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的CasJ核酸内切酶或其变体，并且编码该CasJ核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:38具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性。
35.如实施例28至34或35中任一项所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码该RGE并且与在对照大豆植物细胞中修饰该靶基因的效率相比提供在该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中修饰内源基因或基因座的效率方面的至少5倍增加，该对照大豆植物细胞具有对照大豆密码子优化的参考多核苷酸。
36.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码该RGN或该ndRGDBP并且在以下中任一个的全长上具有至少76％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或ndRGDBP；
(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；或
(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP。
37.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码RGN或RGDBP并且具有超过48％的GC含量并且在以下中任一个的全长上具有至少70％，75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；或
(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP。
38.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码该RGN或该RGDBP并且：
(a)在选自由SEQ ID NO:3-11和12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个序列上具有超过或至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN或该ndRGDBP；
(b)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个序列的全长上具有超过或至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性；并且熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN或该ndRGDBP；或
(c)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个序列的全长上具有超过或至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性；并且具有的GC含量大于48％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN或该ndRGDBP。
39.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中：
(i)该RGN或该ndRGDBP是与SEQ ID NO:1具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的SpCas9 RGN或ndRGDBP，并且编码该SpCas9 RGN或ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性；
(ii)该RGN或该ndRGDBP是与SEQ ID NO:13具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的SaCas9 RGN或ndRGDBP，并且编码该SaCas9 RGN或ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:14具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性；
(iii)该RGN或该ndRGDBP是与SEQ ID NO:25具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的FnCpf1 RGN或ndRGDBP，并且编码该FnCpf1 ndRGDBP或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:26具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性；或
(iv)该RGN或该ndRGDBP是与SEQ ID NO:37具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的CasJ RGN或ndRGDBP，并且编码该CasJ ndRGDBP或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:38具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性。
40.如实施例28、30、36至38或39中任一项所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸：
(i)编码包含该ndRGDBP的蛋白质并且与对照大豆植物细胞中内源基因的表达相比提供在该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中该内源基因的表达方面的至少2倍增加或减少，该对照大豆植物细胞包含对照大豆密码子优化的参考多核苷酸，该对照大豆密码子优化的参考多核苷酸编码该ndRGDBp；或
(ii)编码该RGN并与对照大豆植物细胞中内源靶序列的切口或切口相关修饰相比提供该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中的该内源靶序列的切口或切口相关修饰方面的至少2倍增加，该对照大豆植物细胞包含编码该RGN的对照大豆密码子优化的参考多核苷酸。
41.如实施例28至39或40中任一项所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸包含编码该RNA指导的核酸内切酶蛋白或RNA指导的DNA结合蛋白的RNA分子。
42.如实施例28至40或41中任一项所述的大豆植物细胞，其中该大豆植物细胞进一步包含指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸。
43.如实施例28至41或42中任一项所述的大豆植物细胞，其中，该大豆植物细胞进一步包含与该靶编辑位点具有同源性的供体模板DNA分子。
44.如实施例28至42或43中任一项所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸可操作地连接至：
(a)在大豆植物细胞中可操作的启动子；
(b)5'非翻译(UT)序列和/或3'非翻译(UT)序列，任选地其中该5’UT和/或3’UT任选地(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；或(i)和(ii)的组合。
(c)多聚腺苷酸化序列；和/或
(d)编码核定位信号(NLS)、叶绿体转运肽(CTP)、表位标签(ET)、转录激活结构域(TAD)、转录阻遏结构域(TRD)的第二多核苷酸；或其组合；任选地，其中一个或多个该第二多核苷酸序列(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该NLS、CTP、ET、TAD或TRD的第二大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该NLS、CTP、ET、TAD或TRD的第二大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合；和/或
(e)编码具有修饰靶DNA的酶活性的异源多肽的第三多核苷酸序列；任选地，其中一个或多个该第三多核苷酸序列(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该异源多肽的第三大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合。
45.如实施例44所述的大豆植物细胞，其中由该第三多核苷酸序列编码的异源多肽表现出一种或多种选自以下的酶活性：核酸酶活性、甲基转移酶活性、去甲基化酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨基活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性和/或糖基化酶活性。
46.如实施例28-44或45中任一项所述的大豆植物细胞，其中该ndRGDBP包含HNH和/或RuvC样核酸酶结构域中的突变，或任选地其中所述突变是：(i)SEQ ID NO:1的Cas9蛋白中的D10A和/或H840A突变；(ii)SEQ ID NO:25的FnCpf1蛋白中的D917A、E1006A、E1028A、D1255A和/或N1257A突变；(iii)SEQ ID NO:37的CasJ蛋白中的D901A、E1128A和/或D1298A突变；或(iv)SEQ ID NO:73的LbCpf1蛋白中的D832A、E925A和/或D1148A突变。
47.如实施例28-45或46中任一项所述的大豆植物细胞，其中该RGN包含HNH或RuvC样核酸酶结构域中的突变，或任选地其中所述突变是：(i)SEQ ID NO:1的Cas9蛋白中的D10A突变；(ii)SEQ ID NO:25的FnCpf1蛋白中的R1226A氨基酸突变；(iii)SEQ ID NO:73的LbCpf1蛋白中的R1138A突变。
48.一种大豆植物、植物部分、组织或愈伤组织，其包含如实施例28至47中任一项所述的大豆植物细胞。
49.如实施例48所述的大豆植物部分，其中：
(a)该部分是茎、荚、叶、芽、根或种子；
(b)该组织是愈伤组织、分生组织或胚组织；或
(c)该组织是胚愈伤组织。
50.一种获得如实施例28至47中任一项所述的大豆植物细胞的方法，该方法包括：
(a)将编码包含该RNA指导的核酸内切酶(RGE)、该RNA指导的切口酶(RGN)或该核酸酶缺陷型受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)的蛋白质的合成的多核苷酸引入该大豆植物细胞，其中所述多核苷酸具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码RGE的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；所述GC含量、Tm和较低sCAI的任何组合；并且
(b)选择包含该合成的多核苷酸的植物细胞。
实施例集2
1.一种修饰植物基因组中的内源植物基因的方法，该方法包括：
(a)向包含编码RNA指导的核酸内切酶(RGE)的合成的多核苷酸的植物细胞中引入针对该内源植物基因中的靶编辑位点的指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸和任选地与该靶编辑位点具有同源性的供体模板DNA分子，
其中所述合成的多核苷酸在SEQ ID NO:122-131、134-143或146-185中任一个的全长上具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，并且
(b)选择包含该内源植物基因的修饰的经修饰的植物细胞、植物、植物部分、植物组织或植物愈伤组织。
2.如实施例1所述的方法，其中该植物是大豆，并且该合成的多核苷酸在SEQ IDNO:122-131、134-143或146-185中任一个的全长上具有至少77％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，和
(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于50％；
(ii)具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度；
(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码RGE的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iv)或i、ii和iii的任何组合；并且
3.一种修饰内源大豆基因组的方法，该方法包括：
(a)向大豆植物细胞中引入：
(i)编码RNA指导的核酸内切酶(RGE)的合成的多核苷酸，其中所述合成多核苷酸编码Cas12j核酸酶并且具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于50％，具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度，具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码RGE的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，或所述GC含量、所述Tm和所述较低sCAI的任何组合；
(ii)指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸，该指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸针对该内源大豆基因中的靶编辑位点；以及任选地
(iii)与该靶编辑位点具有同源性的供体模板DNA分子；并且
(b)选择包含该内源大豆基因的修饰的经修饰的大豆植物细胞、大豆植物、大豆植物部分、大豆组织或大豆愈伤组织。
4.如实施例1或3所述的方法，其中该RGE包含在SEQ ID NO:122-131、134-143或146-185中任一个的全长上具有至少77％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性。
5.如实施例2或3所述的方法，其中该合成的多核苷酸：
(i)在选自由SEQ ID NO:122-131组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸中任一个的全长上具有至少76％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)在选自由SEQ ID NO:134-143组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸中任一个的全长上具有至少76％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(iii)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸中任一个的全长上具有至少77％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
6.如实施例2或3所述的方法，其中该合成的多核苷酸具有大于50％的GC含量并且在以下中任一个的全长上具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:122-131组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)选自由SEQ ID NO:134-143组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(iii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
7.如实施例2或3所述的方法，其中该合成的多核苷酸：
(i)在选自由SEQ ID NO:122-131组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)在选自由SEQ ID NO:122-131组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iii)在选自由SEQ ID NO:122-131组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iv)在选自由SEQ ID NO:134-143组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(v)在选自由SEQ ID NO:134-143组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vi)在选自由SEQ ID NO:134-143组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vii)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(viii)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(ix)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
8.如实施例1-3所述的方法，其中：
(i)该RGE是与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的Cas12j-1核酸内切酶或其变体，并且编码该Cas12j-1核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性；
(ii)该RGE是与SEQ ID NO:132具有至少95％序列同一性的Cas12j-2核酸内切酶或其变体，并且编码该Cas12j-2核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:133具有至少95％序列同一性；或
(iii)该RGE是与SEQ ID NO:144具有至少95％序列同一性的Cas12j-3核酸内切酶或其变体，并且编码该Cas12j-3核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:145具有至少95％序列同一性。
9.如实施例2或3所述的方法，其中该大豆密码子优化的参考多核苷酸具有比该合成的多核苷酸的GC含量低至少约8％、9％或10％的GC含量，或任选地其中该大豆密码子优化的参考多核苷酸具有比该合成的多核苷酸的GC含量低至少约8％至约12％的GC含量。
10.如实施例1或3所述的方法，其中该合成的多核苷酸编码RGE并且
(i)该RGE是与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的Cas12j-1核酸内切酶或其变体，并且该合成的多核苷酸在选自由SEQ ID NO:156-164和165组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％或95％序列同一性；
(ii)该RGE是与SEQ ID NO:132具有至少95％序列同一性的Cas12j-2核酸内切酶或其变体，并且该合成的多核苷酸在选自由SEQ ID NO:166-174和175组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％或95％序列同一性；或
(iii)该RGE是与SEQ ID NO:144具有至少95％序列同一性的Cas12j-3核酸内切酶或其变体，并且该合成的多核苷酸在选自由SEQ ID NO:176-184和185组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％或95％序列同一性。
11.一种修饰植物基因组中内源基因的表达的方法，该方法包括：
(a)将针对该内源大豆基因中的靶DNA结合位点的指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸引入包含编码ndRGDBP的合成的多核苷酸的植物细胞中，其中所述合成的多核苷酸在SEQ ID NO:122-131、134-143或146-185中任一个的全长上具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，并且
(b)选择其中该内源植物基因的表达已被修饰的植物细胞、植物、植物部分、组织或植物愈伤组织。
12.如实施例11所述的方法，其中该ndRGDBP包含至少一个对应于以下的突变：
(i)SEQ ID NO:120的残基D371、E579、D673、C640、C643、C646、C661或C664；
(ii)SEQ ID NO:132的残基D394、E606、D697、C667、C670、C673、C685或C688；或
(iii)SEQ ID NO:144的残基D413、E618、D710、C680、C683、C687、C698或C701。
13.如实施方式12所述的方法，其中该ndRGDBP包含至少一个选自以下的突变
(i)SEQ ID NO:120的D371A、E579A、D673A、C640A、C643A、C646A、C661A、C664A、C640S、C643S、C646S、C661S或C664S；
(ii)SEQ ID NO:132的D394A、E606A、D697A、C667A、C670A、C673A、C685A、C688A、C667S、C670S、C673S、C685S或C688S；或
(iii)SEQ ID NO:144的D413A、E618A、D710A、C680A、C683A、C687A、C698A、C701A、C680S、C683S、C687S、C698S和C701S。
14.如实施例11所述的方法，其中该合成的多核苷酸编码ndRGDBP并且
(i)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的Cas12j-1核酸内切酶或其变体，并且该合成的多核苷酸在选自由SEQ ID NO:156-164和165组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％或95％序列同一性；
(ii)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:132具有至少95％序列同一性的Cas12j-2核酸内切酶或其变体，并且该合成的多核苷酸在选自由SEQ ID NO:166-174和175组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％或95％序列同一性；或
(iii)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:144具有至少95％序列同一性的Cas12j-3核酸内切酶或其变体，并且该合成的多核苷酸在选自由SEQ ID NO:176-184和185组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％或95％序列同一性；
15.一种修饰大豆基因组中内源大豆基因的表达的方法，该方法包括：
(a)向大豆植物细胞中引入：
(i)编码包含Cas12j核酸酶缺陷型受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)的蛋白质的合成的多核苷酸，其中所述合成的多核苷酸具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于50％，具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度，具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，或所述GC含量、Tm和sCAI的任何组合；以及
(ii)指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸，该指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸针对该内源大豆基因中的靶结合位点；并且
(b)选择其中该内源大豆基因的表达已经被修饰的经修饰的大豆植物细胞、大豆植物、大豆植物部分、大豆组织或大豆愈伤组织。
16.如实施例15所述的方法，其中该ndRGDBP包含RuvC样核酸酶结构域中的突变。
17.如实施例15所述的方法，其中该ndRGDBP包含以下突变：
(i)选自由SEQ ID NO:120的D371A、E579A、D673A、C640A、C643A、C646A、C661A、C664A、C640S、C643S、C646S、C661S和C664S组成的组；
(ii)选自由SEQ ID NO:132的D394A、E606A、D697A、C667A、C670A、C673A、C685A、C688A、C667S、C670S、C673S、C685S和C688S组成的组；或
(iii)选自由SEQ ID NO:144的D413A、E618A、D710A、C680A、C683A、C687A、C698A、C701A、C680S、C683S、C687S、C698S和C701S组成的组。
18.如实施例15所述的方法，其中该合成的多核苷酸
(i)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸中任一个的全长上具有至少76％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸中任一个的全长上具有至少76％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(iii)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸中任一个的全长上具有至少77％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
19.如实施例15所述的方法，其中该合成的多核苷酸具有大于50％的GC含量并且在以下中任一个的全长上具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(ii)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；或
(iii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP。
20.如实施例15所述的方法，其中该合成的多核苷酸：
(i)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(ii)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；其包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(iii)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(iv)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(v)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(vi)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(vii)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(viii)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；或
(ix)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP。
21.如实施例15所述的方法：
(i)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的Cas12j-1变体，并且该合成的多核苷酸在选自由SEQ ID NO:122-131、156-164和165组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％或95％序列同一性；
(ii)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:132具有至少95％序列同一性的Cas12j-2变体，并且该合成的多核苷酸在选自由SEQ ID NO:134-143、166-174和175组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％或95％序列同一性；或
(iii)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:144具有至少95％序列同一性的Cas12j-3变体，并且该合成的多核苷酸在选自由SEQ ID NO:146-155、176-184和185组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％或95％序列同一性。
22.如实施例11或15所述的方法，其中该合成的多核苷酸进一步包含可操作地连接的多核苷酸，该多核苷酸编码修饰该内源大豆基因的表达的效应子结构域。
23.如实施例11或15所述的方法，其中该合成的多核苷酸可操作地连接至：
(a)在大豆植物细胞中可操作的启动子；
(b)5'非翻译(UT)序列和/或3'非翻译(UT)序列，任选地其中该5’UT和/或3’UT任选地(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于50％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度；或(i)和(ii)的组合；
(c)多聚腺苷酸化序列；
(d)编码核定位信号(NLS)、叶绿体转运肽(CTP)、表位标签(ST)、转录激活结构域(TAD)、转录阻遏结构域(TRD)的第二多核苷酸；或其组合；任选地，其中一个或多个该第二多核苷酸序列(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于50％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该NLS、CTP、ET、TAD或TRD的第二大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合；和/或
(e)编码具有修饰靶DNA的酶活性的异源多肽的第三多核苷酸序列；任选地，其中一个或多个该第三多核苷酸序列(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于50％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该异源多肽的第三大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合。
24.如实施例23所述的方法，其中由该第三多核苷酸序列编码的异源多肽表现出一种或多种选自以下的酶活性：核酸酶活性、甲基转移酶活性、去甲基化酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨基活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性和/或糖基化酶活性。
25.如实施例11或15所述的方法，其中与对照大豆植物细胞中该内源基因的表达相比，该合成的多核苷酸提供在该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中该内源基因的表达方面的至少2倍增加，该对照大豆植物细胞包含对照大豆密码子优化的参考多核苷酸，该对照大豆密码子优化的参考多核苷酸编码该ndRGDBP并且(i)具有的GC含量比该多核苷酸的GC含量低至少约8％、9％或10％，或任选地其中编码该ndRGDBP的对照多核苷酸具有的GC含量至少比该合成的多核苷酸的GC含量低约8％至12％。
26.如实施例11或15所述的方法，其中该合成的多核苷酸包含编码该ndRGDBP的RNA分子。
27.一种植物细胞，其包含编码蛋白质的合成的多核苷酸，该蛋白质包含RNA指导的核酸内切酶(RGE)或核酸酶缺陷型受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)，其中所述多核苷酸在SEQ ID NO:122-131、134-143或146-185中任一个的全长上具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，任选地其中该植物细胞是单子叶植物细胞，并且任选地其中该单子叶植物细胞是玉米植物细胞。
28.一种大豆植物细胞，其包含编码蛋白质的合成的多核苷酸，该蛋白质包含Cas12j RNA指导的核酸内切酶(RGE)或核酸酶缺陷型受Cas12j RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)，其中所述多核苷酸：
(a)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于50％；
(b)具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度；
(c)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码RGE的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(d)(a)、(b)和/或(c)的任何组合。
29.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)，其包含以下中的至少一个突变：
(i)SEQ ID NO:120的残基D371、E579、D673、C640、C643、C646、C661和C664；
(ii)SEQ ID NO:132的残基D394、E606、D697、C667、C670、C673、C685和C688；或
(iii)SEQ ID NO:144的残基D413、E618、D710、C680、C683、C687、C698和C701。
30.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码RGE并且：
(i)在选自由SEQ ID NO:122-131组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸中任一个的全长上具有至少76％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)在选自由SEQ ID NO:134-143组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸中任一个的全长上具有至少76％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iii)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸中任一个的全长上具有至少77％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(iv)在SEQ ID NO:146-185中任一个的全长上具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性。
31.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸具有大于50％的GC含量并且在以下中任一个的全长上具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(iii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
32.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸：
(i)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iii)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iv)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(v)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vi)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vii)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(viii)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(ix)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
33.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码该RGE并且：
(i)该RGE是与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的Cas12j-1核酸内切酶或其变体，并且编码该Cas12j-1核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性；
(ii)该RGE是与SEQ ID NO:132具有至少95％序列同一性的Cas12j-2核酸内切酶或其变体，并且编码该Cas12j-2核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:133具有至少95％序列同一性；或
(iii)该RGE是与SEQ ID NO:144具有至少95％序列同一性的Cas12j-3核酸内切酶或其变体，并且编码该Cas12j-3核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:145具有至少95％序列同一性。
34.如实施例28至33中任一项所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码该RGE并且与在对照大豆植物细胞中修饰该靶基因的效率相比提供在该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中修饰内源基因或基因座的效率方面的至少2倍增加，该对照大豆植物细胞具有对照大豆密码子优化的参考多核苷酸。
35.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码该ndRGDBP并且在以下中任一个的全长上具有至少76％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(ii)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少两个或三个序列；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(iii)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(iv)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(v)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少两个或三个序列；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(vi)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(vii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(viii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少两个或三个序列；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；或
(ix)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP。
36.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码RGDBP，具有大于50％的GC含量并且在以下中任一个的全长上具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(ii)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少两个或三个序列；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(iii)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(iv)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(v)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少两个或三个序列；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(vi)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(vii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(viii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少两个或三个序列；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；或
(ix)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP。
37.如实施例28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码RGDBP并且：
(i)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(ii)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(iii)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(iv)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(v)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(vi)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(vii)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(viii)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；或
(ix)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性并且具有的GC含量大于48％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP。
38.如实施例29所述的大豆植物细胞，其中：
(i)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的Cas12j-1ndRGDBP，并且编码该Cas12j-1ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性；
(ii)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:132具有至少95％序列同一性的Cas12j-2ndRGDBP，并且编码该Cas12j-2ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:133具有至少95％序列同一性；或
(iii)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:144具有至少95％序列同一性的Cas12j-3ndRGDBP，并且编码该Cas12j-3ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:145具有至少95％序列同一性。
39.如实施例28、29、35至37或38中任一项所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码包含该ndRGDBP的蛋白质并且与对照大豆植物细胞中内源基因的表达相比提供在该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中该内源基因的表达方面的至少2倍增加或减少，该对照大豆植物细胞包含对照大豆密码子优化的参考多核苷酸，该对照大豆密码子优化的参考多核苷酸编码该ndRGDBP。
40.如实施例28至33、34至37或38中任一项所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸包含编码该RNA指导的核酸内切酶蛋白或RNA指导的DNA结合蛋白的RNA分子。
41.如实施例28至33、35至37或38中任一项所述的大豆植物细胞，其中该大豆植物细胞进一步包含指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸。
42.如实施例28至33、35至37或38中任一项所述的大豆植物细胞，其中该大豆植物细胞进一步包含与该靶编辑位点具有同源性的供体模板DNA分子。
43.如实施例28至33、35至37或38中任一项所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸可操作地连接至：
(a)在大豆植物细胞中可操作的启动子；
(b)5'非翻译(UT)序列和/或3'非翻译(UT)序列，任选地其中该5’UT和/或3’UT任选地(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于50％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度；或(i)和(ii)的组合。
(c)多聚腺苷酸化序列；和/或
(d)编码核定位信号(NLS)、叶绿体转运肽(CTP)、表位标签(ET)、转录激活结构域(TAD)、转录阻遏结构域(TRD)的第二多核苷酸；或其组合；任选地，其中一个或多个该第二多核苷酸序列(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于50％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该NLS、CTP、ET、TAD或TRD的第二大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该NLS、CTP、ET、TAD或TRD的第二大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合；和/或
(e)编码具有修饰靶DNA的酶活性的异源多肽的第三多核苷酸序列；任选地，其中一个或多个该第三多核苷酸序列(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于50％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该异源多肽的第三大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合。
44.如实施例43所述的大豆植物细胞，其中由该第三多核苷酸序列编码的异源多肽表现出一种或多种选自以下的酶活性：核酸酶活性、甲基转移酶活性、去甲基化酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨基活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性和/或糖基化酶活性。
45.如实施例28、29、35至37或38中任一项所述的大豆植物细胞，其中该ndRGDBP包含至少一个对应于以下的突变：
(i)SEQ ID NO:120的残基D371、E579、D673、C640、C643、C646、C661或C664；
(ii)SEQ ID NO:132的残基D394、E606、D697、C667、C670、C673、C685或C688；或
(iii)SEQ ID NO:144的残基D413、E618、D710、C680、C683、C687、C698或C701。
46.如实施例28、29、35至37或38中任一项所述的大豆植物细胞，其中该ndRGDBP包含：
(i)SEQ ID NO:120，其具有选自由C640A、C643A、C646A、C661A、C664A、C640S、C643S、C646S、C661S和C664S组成的组的突变；
(ii)SEQ ID NO:132，其具有选自由C667A、C670A、C673A、C685A、C688A、C667S、C670S、C673S、C685S和C688S组成的组的突变；或
(iii)SEQ ID NO:144，其具有选自由C680A、C683A、C687A、C698A、C701A、C680S、C683S、C687S、C698S和C701S组成的组的突变。
47.一种大豆植物、植物部分、组织或愈伤组织，其包含如实施例28至33、35至37或38中任一项所述的大豆植物细胞。
48.如实施例47所述的大豆植物部分，其中：
(a)该部分是茎、荚、叶、芽、根或种子；
(b)该组织是愈伤组织、分生组织或胚组织；或
(c)该组织是胚愈伤组织。
49.一种获得如实施例28至33、35至37或38中任一项所述的大豆植物细胞的方法，该方法包括：
(a)将编码包含该Cas12j RNA指导的核酸内切酶(RGE)或Cas12j核酸酶缺陷型受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)的蛋白质的合成的多核苷酸引入该大豆植物细胞，其中所述多核苷酸具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于50％；具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度；具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码RGE的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；所述GC含量、Tm和较低sCAI的任何组合；并且
(b)选择包含该合成的多核苷酸的植物细胞。
50.一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:122-131、134-143或146-185中的任一个。
51.一种编码Cas12j多肽的分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含对应于以下的突变或残基：
(a)SEQ ID NO:120的C640、SEQ ID NO:132的C667或SEQ ID NO:144的C680；
(b)SEQ ID NO:120的C643、SEQ ID NO:132的C670或SEQ ID NO:144的C683；
(c)SEQ ID NO:120的C646、SEQ ID NO:132的C673或SEQ ID NO:144的C687；
(d)SEQ ID NO:120的C661、SEQ ID NO:132的C685或SEQ ID NO:144的C698；或
(e)SEQ ID NO:120的C664、SEQ ID NO:132的C688或SEQ ID NO:144的C701。
52.一种编码多肽的分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含：
(a)SEQ ID NO:120，其具有选自由C640A、C643A、C646A、C661A、C664A、C640S、C643S、C646S、C661S和C664S组成的组的突变；
(b)SEQ ID NO:132，其具有选自由C667A、C670A、C673A、C685A、C688A、C667S、C670S、C673S、C685S和C688S组成的组的突变；或
(c)SEQ ID NO:144，其具有选自由C680A、C683A、C687A、C698A、C701A、C680S、C683S、C687S、C698S和C701S组成的组的突变。
53.一种重组核酸，其包含如实施例50、51或52中任一项所述的分离的核酸。
实例
以下实例并非旨在限制权利要求的范围。
实例1-大豆细胞中的Cas合成序列构建和表达水平
合成了两个编码相同RGN多肽但使用不同密码子的Cas核酸酶表达载体。编码RGN的Cas Soy 1.1.1的大豆密码子优化的参考多核苷酸序列包含使用OPTIMIZER程序(PuigboP.,Guzmen E.Romeu A.和Garcia-Vallve S.2007OPTIMIZER:A web server foroptimizing the codon usage of DNA sequences[OPTIMIZER:用于优化DNA序列密码子使用的网络服务器].Nucleic Acids Research[核酸研究],35:W126-W131)根据常规大豆密码子使用表(图1；来自万维网网站“kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝3847”)指定的密码子并且具有的GC含量为约37.5％。编码RGN的测试Cas Soy1.1.S主题合成多核苷酸序列包含未根据常规大豆密码子使用表指定的密码子并且具有约49.5％的GC含量。将对照参考Cas Soy 1.1.1和测试Cas Soy 1.1.1S编码序列插入到在其他方面相同的植物表达盒中。
在类似条件下将表达载体转染到大豆原生质体中。与Cas Soy 1.1.1大豆密码子优化的参考多核苷酸相比，对表达的Cas多肽的免疫印迹(即“蛋白质印迹”)探测揭示了测试Cas Soy 1.1.1S主题合成多核苷酸序列的更高水平的表达(图2)。
实例2-Cas表达载体在番茄和大豆原生质体中的表现
将Cas表达载体(其包含Cas Soy 1.1.1的大豆密码子优化的参考多核苷酸序列或Cas Soy 1.1.1S的本主题的合成的多核苷酸序列并且各自进一步包含针对番茄基因组位点的RNA指导物的表达盒)转染到番茄原生质体中。还将Cas Soy 1.1.1或Cas Soy 1.1.1S表达载体(每个表达载体进一步包含针对大豆基因组位点的RNA指导物的表达盒)转染到大豆原生质体中。处理后提取经转染的原生质体的DNA，并量化靶位点的编辑效率。Cas Soy1.1.S比Cas Soy 1.1.1提高了约10倍的编辑效率(图3)。
实例3-大豆细胞中的Cas合成序列构建和表达水平
合成了两个编码SEQ ID NO:132的相同RGE多肽但使用不同密码子的Cas核酸酶表达载体。编码RGE的Cas12j-2的大豆密码子优化的参考多核苷酸序列包含使用OPTIMIZER程序(Puigbo P.,Guzmen E.Romeu A.和Garcia-Vallve S.2007 OPTIMIZER:A web serverfor optimizing the codon usage of DNA sequences[OPTIMIZER:用于优化DNA序列密码子使用的网络服务器].Nucleic Acids Research[核酸研究],35:W126-W131)根据常规大豆密码子使用表(图1；来自万维网网站“kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝3847”)指定的密码子并且具有的GC含量为约48.7％(SEQ ID NO:133)。编码RGE的测试Cas12j-2主题合成多核苷酸序列包含未根据常规大豆密码子使用表指定的密码子并且具有约58.4％的GC含量(SEQ ID NO:137)。将对照参考和测试Cas12j-2编码序列插入到在其他方面相同的植物表达盒中。
在类似条件下将表达载体转染到大豆原生质体中。与参考Cas12j-2多核苷酸相比，对表达的Cas多肽的免疫印迹(即“蛋白质印迹”)探测揭示了测试Cas 12j-2主体合成多核苷酸序列的更高水平的表达。
实例4-编辑效率的增加
将Cas表达载体(其包含Cas12j-2的大豆密码子优化的参考多核苷酸序列或CasCas12j-2的本主题的合成的多核苷酸序列并且各自进一步包含针对大豆基因组位点的RNA指导物的表达盒)转染到大豆原生质体中。处理后提取经转染的原生质体的DNA，并量化靶位点的编辑效率。表达的本主题的合成的多核苷酸显示出比参考多核苷酸更高的编辑效率。
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实例的方式对前述披露进行了一些详细的描述，但是显然可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。
序列表
<110> 伊纳瑞农业有限公司（Inari Agriculture, Inc. ）
Bevan, Scott A.
Joyce, Adam
<120>用于在大豆中表达RNA指导的核酸酶和DNA结合蛋白的改进多核苷酸
<130> P13455WO00
<150> 63/075,395
<151> 2020-09-08
<150> 63/072,585
<151> 2020-08-31
<150> 63/001,806
<151> 2020-03-30
<160> 188
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1368
<212> PRT
<213> 酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）
<400> 1
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
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gaagtcctcg acgccactct tatccaccag agtatcaccg gcttgtacga gaccaggatt 4080
gatctctccc agctcggcgg tgac 4104
<210> 12
<211> 4104
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 12
atggacaaga aatacagcat tggcctcgac attggaacca actcagtggg ctgggccgtg 60
atcaccgacg agtacaaggt cccctccaag aaatttaaag ttctcggtaa caccgacagg 120
cactccatta agaagaacct tattggcgcc ttgctcttcg actctggcga aaccgccgag 180
gccacaaggc tcaaaagaac agcaaggagg aggtacacca ggaggaagaa taggatctgc 240
tacctccaag aaatcttcag taacgagatg gctaaggtcg acgattcctt ctttcacaga 300
ctcgaggagt ccttccttgt ggaggaagac aagaagcatg aaaggcaccc catcttcggt 360
aacatagtcg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca caatctacca tctcagaaaa 420
aagttggtcg actccaccga caaggccgat ctcaggctta tctacctcgc cttggctcac 480
atgatcaagt ttaggggcca tttcctcatc gagggcgacc tcaatcccga taacagcgac 540
gtcgacaagc tctttatcca gctcgttcag acatacaatc agttgttcga ggaaaacccc 600
atcaacgcca gcggcgtcga tgccaaggca atcctttccg caaggctctc taagagcaga 660
aggctcgaaa atctcatcgc ccaacttccc ggcgagaaga agaatgggct ctttggtaac 720
ttgatcgccc tctcactcgg gctcacaccc aacttcaaga gcaatttcga tctcgcagaa 780
gacgctaagc tccagctctc caaggatacc tacgatgatg acctcgacaa cctccttgcc 840
cagattgggg accagtacgc cgacctcttt cttgccgcca agaacctcag cgacgccata 900
ctcctctccg acatcctcag ggttaatacc gaaataacca aggcccccct cagtgcctcc 960
atgatcaaga gatacgacga gcaccaccaa gacctcacac tcctcaaagc cctcgtcagg 1020
cagcagctcc ccgagaagta caaagagatc tttttcgatc agtccaagaa tggctatgcc 1080
ggctacatcg atggcggggc ctctcaggag gagttctaca aattcatcaa acccatcctc 1140
gagaagatgg acggaaccga ggagctcctc gtcaagctca acagggagga cctcctcagg 1200
aagcagagga cgttcgacaa cgggagcatc ccccaccaga ttcatctcgg cgagctccac 1260
gctatactca ggaggcagga agatttctac cccttcctca aggacaacag ggagaagatc 1320
gaaaagatcc tcaccttcag gattccttac tacgttgggc ccctcgccag aggcaacagc 1380
aggttcgcat ggatgaccag gaaatctgag gagaccatca ctccctggaa ctttgaggag 1440
gttgtcgaca agggggcctc cgctcagagc ttcatcgaga ggatgaccaa ctttgataag 1500
aatctcccta acgagaaggt cctccctaaa cattccctct tgtacgaata cttcaccgtc 1560
tacaacgagc tcaccaaagt caagtatgtc actgagggga tgagaaagcc agccttcctc 1620
agtggggaac agaaaaaagc catcgtcgac ctcctcttca aaaccaacag aaaggttacc 1680
gtgaaacagc tcaaggagga ctatttcaaa aaaatagaat gtttcgattc cgttgagatc 1740
tcaggcgttg aggacaggtt caacgccagc cttgggacct atcacgacct ccttaagatc 1800
atcaaggata aggattttct cgacaatgag gagaacgagg atatcctcga ggacatcgtc 1860
ctcaccttga ccctcttcga ggacagggag atgatcgagg agaggctcaa gacctacgct 1920
cacctcttcg acgacaaggt tatgaagcag ctcaagagga ggaggtacac cggctggggc 1980
aggctttcaa gaaaacttat caacgggata agggacaagc agtccggcaa gaccatcctc 2040
gatttcctca agtctgacgg cttcgccaac aggaacttca tgcagctcat ccatgacgac 2100
tccctcacct tcaaggaaga catccagaaa gctcaggtct caggacaggg cgacagcctc 2160
cacgagcaca tcgccaacct cgccggatcc cccgccatta agaagggaat attgcaaacc 2220
gttaaagttg tggacgagct cgttaaggtt atggggaggc ataaacccga gaacatcgtg 2280
atcgagatgg ccagggagaa ccagacaacc cagaagggac aaaagaatag cagagaaaga 2340
atgaagagga tcgaggaggg aatcaaggag ttgggttccc agatactcaa ggagcacccc 2400
gtggagaaca cccagttgca gaacgaaaag ctctacctct actatcttca gaacggcagg 2460
gacatgtacg tggatcagga gctcgatatc aacagactct ccgactatga cgtggaccac 2520
atcgttccac agagctttct taaagacgac agcatcgata acaaagttct caccaggagc 2580
gataagaaca ggggcaaatc cgacaatgtt cccagcgaag aagtcgtgaa aaagatgaag 2640
aattactgga gacagcttct caatgccaaa ctcatcaccc agagaaagtt cgacaacctc 2700
accaaggccg agaggggtgg gctcagcgag ctcgacaagg ccggctttat aaagagacag 2760
ctcgtggaga ccaggcagat cactaagcat gtggcccaga tcctcgactc caggatgaat 2820
accaaatacg acgagaatga caagctcatc agggaggtca aagtgatcac cctcaagtcc 2880
aagctcgtgt ccgacttcag gaaagatttt caattttaca aagtgagaga gatcaataac 2940
tatcaccacg cccacgatgc ctacctcaat gccgtggtgg gaacagccct tatcaagaaa 3000
taccctaagc tcgaatccga gttcgtgtac ggagactata aggtctacga cgtgagaaaa 3060
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cctctcatcg agaccaatgg ggagaccggg gagattgttt gggacaaggg gagggacttt 3240
gccactgtga ggaaggtttt gagtatgcct caggtgaaca tcgtcaagaa gacagaggtt 3300
cagacaggcg ggttttccaa ggagagtatt ttgcccaaaa ggaactccga caagctcata 3360
gccaggaaga aagactggga ccccaaaaag tacgggggct ttgacagccc cactgtggcc 3420
tatagcgtcc ttgtcgtggc caaggtcgag aaggggaagt ccaagaagct caagagtgtg 3480
aaggagctcc tcggcatcac catcatggaa aggtccagct tcgagaagaa ccccatagat 3540
ttcctcgagg ccaaggggta caaggaggtg aagaaggacc tcatcatcaa gctccccaag 3600
tacagcctct tcgagctcga aaacggtagg aagaggatgc tcgcctctgc cggagagctc 3660
cagaagggca acgagctcgc cctccccagc aagtacgtga acttcctcta cctcgccagc 3720
cactacgaga agctcaaggg gagccccgaa gacaacgagc agaagcagct ctttgtggag 3780
caacacaaac actacctcga cgaaattatc gagcagatct ccgagtttag caaaagagtc 3840
atcctcgctg acgccaacct tgacaaggtg ctctctgcct ataacaagca cagggacaag 3900
cctatcaggg agcaggccga gaacatcata catcttttca ccttgaccaa cctcggagcc 3960
cctgccgcct tcaagtactt cgacaccaca atcgatagga agaggtacac cagcactaag 4020
gaggttttgg acgccaccct cattcaccaa agcatcaccg gactctacga gaccaggatc 4080
gaccttagcc aactcggagg cgac 4104
<210> 13
<211> 1053
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 13
Met Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly
20 25 30
Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg
35 40 45
Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile
50 55 60
Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His
65 70 75 80
Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu
85 90 95
Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu
100 105 110
Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr
115 120 125
Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala
130 135 140
Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys
145 150 155 160
Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr
165 170 175
Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln
180 185 190
Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg
195 200 205
Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys
210 215 220
Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe
225 230 235 240
Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr
245 250 255
Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn
260 265 270
Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe
275 280 285
Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu
290 295 300
Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys
305 310 315 320
Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr
325 330 335
Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala
340 345 350
Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu
355 360 365
Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser
370 375 380
Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile
385 390 395 400
Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala
405 410 415
Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln
420 425 430
Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro
435 440 445
Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile
450 455 460
Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg
465 470 475 480
Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys
485 490 495
Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr
500 505 510
Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp
515 520 525
Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu
530 535 540
Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro
545 550 555 560
Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys
565 570 575
Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu
580 585 590
Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile
595 600 605
Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu
610 615 620
Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp
625 630 635 640
Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu
645 650 655
Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys
660 665 670
Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp
675 680 685
Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp
690 695 700
Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys
705 710 715 720
Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys
725 730 735
Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu
740 745 750
Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp
755 760 765
Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile
770 775 780
Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu
785 790 795 800
Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu
805 810 815
Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His
820 825 830
Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly
835 840 845
Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr
850 855 860
Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile
865 870 875 880
Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp
885 890 895
Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr
900 905 910
Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val
915 920 925
Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser
930 935 940
Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala
945 950 955 960
Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly
965 970 975
Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile
980 985 990
Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn Met
995 1000 1005
Asn Asp Lys Arg Pro Pro Arg Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser Lys
1010 1015 1020
Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn Leu
1025 1030 1035
Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys Gly
1040 1045 1050
<210> 14
<211> 3159
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 14
atgaagagga actatatact aggcctcgac ataggtatca ccagcgtggg ctacggcatc 60
atagattatg agactaggga cgtgatagat gctggtgtta ggctattcaa ggaggcgaat 120
gtcgagaaca atgaaggacg tagatcaaag cgcggcgcac gccgcctgaa acgcagaagg 180
cgacacagga ttcagagggt gaagaaactg ttgttcgact acaatttgct tactgaccat 240
tcagagcttt ccggtatcaa tccttacgag gctcgtgtga aaggcctcag ccaaaaattg 300
tccgaagaag aattttccgc tgcacttctg cacctggcaa aacgacgtgg tgtccataac 360
gtcaatgaag ttgaagagga taccgggaat gagttgagta caaaagaaca aattagtaga 420
aatagtaaag ctttagagga aaaatatgtc gctgagctcc aattagaaag attaaagaag 480
gatggtgagg ttaggggttc cataaatcgt tttaagacaa gtgattacgt caaagaggca 540
aagcaacttc ttaaagtaca gaaggcatat catcaattgg atcaatcctt tatcgataca 600
tacatcgatc ttcttgagac tcgtagaact tactatgaag gcccaggcga gggttctcca 660
tttggctgga aggatataaa agagtggtat gaaatgctga tgggtcattg tacctacttt 720
ccagaggaac taaggtctgt taagtatgct tataacgccg atctttataa cgccctcaat 780
gacctgaata acctagttat tactagggac gaaaatgaaa agttggaata ttatgaaaag 840
ttccagatta ttgagaacgt tttcaaacaa aagaagaaac cgaccctaaa acagatagct 900
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cctgaattta ccaatctcaa agtttatcat gatattaaag acattaccgc ccggaaagag 1020
ataattgaaa acgctgaact tttagaccag attgcgaaga ttttgactat atatcaatcc 1080
tcagaggata tccaggagga gttaacgaat ctcaactcag agcttaccca agaagagata 1140
gagcagataa gtaacttgaa gggatacact gggactcata atctctcgct gaaggcaata 1200
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ctaaagttgg tgcctaagaa ggttgatttg agccaacaaa aggagatccc aacgacttta 1320
gtcgatgatt tcattctgag cccagtagtg aagcggtcat tcattcaatc aatcaaggtt 1380
ataaatgcca ttattaagaa gtacggctta cctaacgata ttataatcga actcgccaga 1440
gaaaaaaata gcaaggatgc ccagaaaatg atcaacgaaa tgcaaaagag aaatcggcag 1500
actaatgaga gaatcgagga aatcatcagg accacaggta aggagaatgc aaaatacctg 1560
attgaaaaga tcaaattgca tgacatgcaa gagggaaagt gcttgtattc cctcgaagca 1620
atccccctcg aggatcttct taacaaccct ttcaactatg aggttgatca cattattcct 1680
aggtctgtgt cattcgataa tagcttcaat aacaaagtgc ttgtgaagca ggaagagaac 1740
tcaaaaaaag ggaacagaac ccccttccag tacctcagtt cctctgattc caaaatttct 1800
tatgaaactt ttaaaaagca cattttgaac ctagcaaagg gtaagggaag aatttctaag 1860
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ttcataaaca gaaaccttgt tgacaccaga tatgccaccc ggggtcttat gaatttactt 1980
agatcgtact tccgggtgaa caatttggac gttaaggtga agtcaatcaa tgggggcttc 2040
acctcatttc taaggcggaa atggaagttt aaaaaagaac gtaataaggg gtacaagcat 2100
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ctcgataaag caaaaaaagt tatggaaaac caaatgttcg aggaaaaaca agctgaatct 2220
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attgtcaata atctcaatgg tctgtacgat aaagacaatg acaaacttaa gaaactcatt 2460
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cgcaacaagg tggtaaagtt gtccctcaaa ccatacaggt tcgacgttta ccttgataac 2760
ggggtataca agttcgttac cgttaagaac cttgacgtca ttaagaaaga gaactactat 2820
gaggttaata gtaagtgcta tgaagaagct aaaaaactaa aaaaaatatc caaccaggca 2880
gaatttatcg catcatttta caataacgat cttataaaga ttaacggcga actctacagg 2940
gtgattggtg tgaataatga tcttctgaat cgaattgagg tgaacatgat tgatatcact 3000
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<210> 15
<211> 3159
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 15
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gttgaaaaca atgaaggcag gagatctaag agaggagcca ggagacttaa gagaaggagg 180
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gtgaatgagg tcgaggaaga caccgggaac gagctctcta ccaaggagca gatcagcagg 420
aacagtaagg cccttgagga gaagtacgtc gccgaactcc agctcgagag gcttaagaag 480
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cccgaagagt tgaggtccgt caagtatgcc tataatgccg acctctacaa cgcactcaat 780
gacttgaata acctcgtgat cacaagagat gagaacgaga aactcgaata ctacgagaag 840
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atcaacgcca tcataaaaaa atacggactc cccaacgaca tcatcatcga actcgccagg 1440
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accaatgaaa gaattgaaga gattatcaga accaccggca aagagaacgc aaagtacctt 1560
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aagctcatca tggagcagta cggggacgag aaaaatccct tgtacaagta ttacgaggag 2580
accgggaact acctcaccaa gtactccaaa aaggacaacg gtcccgttat caagaagatc 2640
aagtactacg ggaacaagct caatgcacat ctcgacataa ccgacgacta ccccaactcc 2700
aggaacaaag tggtcaagtt gtccttgaag ccctacaggt tcgatgtgta cttggataac 2760
ggcgtgtaca aattcgttac cgtgaagaac ttggacgtga tcaagaagga gaactactac 2820
gaggttaact ccaagtgcta tgaggaggct aaaaagctca agaaaatcag caaccaggcc 2880
gagttcatcg ccagctttta caacaacgac ttgatcaaga tcaacggcga gctctacagg 2940
gttataggcg tgaacaatga cttgctcaac aggatcgagg tcaacatgat cgacatcact 3000
tacagggagt acctcgagaa tatgaacgac aagaggccac ctaggatcat caaaaccatc 3060
gctagcaaga cccagagcat caagaagtac agcaccgaca tcttgggtaa tctttacgag 3120
gttaagagta aaaagcatcc ccagatcatc aaaaaggga 3159
<210> 25
<211> 1300
<212> PRT
<213> 土拉弗朗西斯菌新凶手亚种（Francisella tularensis subsp. novicida）
<400> 25
Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys
20 25 30
Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys
35 40 45
Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu
50 55 60
Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys
85 90 95
Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr
100 105 110
Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile
115 120 125
Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln
130 135 140
Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr
145 150 155 160
Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr
165 170 175
Thr Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser
180 185 190
Asn Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu
195 200 205
Pro Lys Phe Leu Glu Asn Lys Ala Lys Tyr Glu Ser Leu Lys Asp Lys
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu
225 230 235 240
Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg
245 250 255
Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr
260 265 270
Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys
275 280 285
Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile
290 295 300
Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys
305 310 315 320
Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser
325 330 335
Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met
340 345 350
Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys
355 360 365
Ser Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln
370 375 380
Lys Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr
385 390 395 400
Asp Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala
405 410 415
Val Leu Glu Tyr Ile Thr Gln Gln Ile Ala Pro Lys Asn Leu Asp Asn
420 425 430
Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala
435 440 445
Lys Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn
450 455 460
Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala
465 470 475 480
Asn Phe Ala Ala Ile Pro Met Ile Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys
485 490 495
Asp Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys
500 505 510
Asp Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Asp Asp Val Lys Ala Ile Lys Asp
515 520 525
Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His
530 535 540
Ile Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His
545 550 555 560
Phe Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val
565 570 575
Pro Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser
580 585 590
Asp Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly
595 600 605
Trp Asp Lys Asn Lys Glu Pro Asp Asn Thr Ala Ile Leu Phe Ile Lys
610 615 620
Asp Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile
625 630 635 640
Phe Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys
645 650 655
Ile Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val
660 665 670
Phe Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile
675 680 685
Leu Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln
690 695 700
Lys Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe
705 710 715 720
Ile Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp
725 730 735
Phe Gly Phe Arg Phe Ser Asp Thr Gln Arg Tyr Asn Ser Ile Asp Glu
740 745 750
Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Thr Phe Glu Asn
755 760 765
Ile Ser Glu Ser Tyr Ile Asp Ser Val Val Asn Gln Gly Lys Leu Tyr
770 775 780
Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg
785 790 795 800
Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn
805 810 815
Leu Gln Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr
820 825 830
Arg Lys Gln Ser Ile Pro Lys Lys Ile Thr His Pro Ala Lys Glu Ala
835 840 845
Ile Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu
850 855 860
Tyr Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe
865 870 875 880
His Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe
885 890 895
Asn Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His
900 905 910
Ile Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu
915 920 925
Val Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile
930 935 940
Gly Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile
945 950 955 960
Glu Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn
965 970 975
Ile Lys Glu Met Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Glu Ile
980 985 990
Ala Lys Leu Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Val Val Phe Glu Asp Leu
995 1000 1005
Asn Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val
1010 1015 1020
Tyr Gln Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu
1025 1030 1035
Val Phe Lys Asp Asn Glu Phe Asp Lys Thr Gly Gly Val Leu Arg
1040 1045 1050
Ala Tyr Gln Leu Thr Ala Pro Phe Glu Thr Phe Lys Lys Met Gly
1055 1060 1065
Lys Gln Thr Gly Ile Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Gly Phe Thr Ser
1070 1075 1080
Lys Ile Cys Pro Val Thr Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys
1085 1090 1095
Tyr Glu Ser Val Ser Lys Ser Gln Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp
1100 1105 1110
Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe
1115 1120 1125
Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys Ala Ala Lys Gly Lys Trp Thr
1130 1135 1140
Ile Ala Ser Phe Gly Ser Arg Leu Ile Asn Phe Arg Asn Ser Asp
1145 1150 1155
Lys Asn His Asn Trp Asp Thr Arg Glu Val Tyr Pro Thr Lys Glu
1160 1165 1170
Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Tyr Ser Ile Glu Tyr Gly His Gly
1175 1180 1185
Glu Cys Ile Lys Ala Ala Ile Cys Gly Glu Ser Asp Lys Lys Phe
1190 1195 1200
Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln Met Arg
1205 1210 1215
Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val
1220 1225 1230
Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys
1235 1240 1245
Asn Met Pro Gln Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Gly
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu
1265 1270 1275
Gly Lys Lys Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu
1280 1285 1290
Phe Val Gln Asn Arg Asn Asn
1295 1300
<210> 26
<211> 3900
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 26
atgagcatct atcaggaatt tgtgaataag tattctctat caaagaccct gcgtttcgaa 60
ctcattcctc aaggcaaaac cttggaaaac attaaggcca gagggcttat cttggatgac 120
gagaaaaggg ccaaagatta caagaaggca aaacaaataa ttgacaaata tcatcaattc 180
ttcatcgaag aaattttgag tagtgtttgt atcagcgaag atcttcttca gaattattcg 240
gatgtctatt tcaagctcaa aaaaagcgac gacgataatt tgcagaagga tttcaaaagt 300
gcaaaggaca ctattaaaaa gcaaatttct gaatatatca aagattcaga gaagttcaag 360
aaccttttta accagaatct tattgacgct aagaaggggc aagagtccga tcttatacta 420
tggctaaaac aaagcaagga taacggtatt gaactcttca aagcaaattc cgatatcact 480
gatattgacg aagcacttga gattatcaaa tcttttaaag gttggactac atacttcaag 540
gggttccacg aaaatcgaaa gaatgtctat tcaagtaacg atattcccac aagtataatt 600
tataggatcg ttgatgacaa tttacccaag ttccttgaga ataaggcaaa gtacgaatcc 660
ttgaaggata aggctcctga agcaataaat tatgagcaaa taaaaaagga cctcgccgaa 720
gagcttacct ttgacattga ttacaaaacc agcgaagtca atcaaagagt tttttcattg 780
gacgaggttt tcgagattgc caattttaac aattacttga accagtctgg cattacaaag 840
ttcaacacaa ttatcggggg aaagtttgtt aatggtgaga atactaaaag gaagggcata 900
aatgagtata taaaccttta ttcccaacag ataaatgata agactttgaa gaagtataaa 960
atgtcagttc tcttcaaaca gattctgtcc gataccgaat cgaaatcttt tgttattgat 1020
aaattggagg acgacagcga cgtcgtgact acaatgcaga gcttttatga acaaatagct 1080
gcttttaaga ccgtagagga gaagagcatt aaagaaactc tgtcgttgct gttcgacgac 1140
ctaaaagctc aaaaacttga cctttcaaag atctacttca agaatgataa gtctctgacc 1200
gatttgtcac aacaagtttt tgatgactat agtgtaattg ggactgccgt tctagagtac 1260
attacccagc agattgctcc taagaatttg gataatccct ctaaaaagga acaggagtta 1320
atagctaaga aaactgagaa ggccaaatac cttagtttgg agacaattaa attagcctta 1380
gaagagttta acaagcaccg tgatattgac aaacaatgta gattcgaaga aattctggca 1440
aattttgccg ctattcctat gatttttgac gaaattgcac aaaacaagga taatctggca 1500
cagataagca taaagtacca aaaccagggt aagaaggatt tattgcaggc tagtgcagaa 1560
gacgatgtga aggcaataaa agacttattg gatcagacta ataacctgct gcataagcta 1620
aaaatcttcc acatcagcca aagcgaggat aaagctaata ttctagacaa agatgagcat 1680
ttttatttgg tcttcgaaga atgctatttt gaacttgcaa atattgttcc tctttataac 1740
aagatccgta actacataac acaaaaacct tattccgatg aaaagtttaa gttgaacttc 1800
gagaattcta ctttggccaa cggctgggac aaaaacaaag aacccgataa tactgctatt 1860
ttgttcatta aggacgataa gtattacctt ggggttatga ataagaaaaa caataagatc 1920
ttcgatgata aagcaatcaa ggagaacaag ggagagggtt ataagaaaat cgtctataaa 1980
ttgcttcctg gggcaaacaa gatgctacct aaggtgttct tcagcgcaaa gtccattaag 2040
ttttataacc cttccgagga tatattaagg attcgcaatc attctacgca tacgaaaaat 2100
ggtagcccac aaaagggata cgaaaaattt gaatttaata ttgaagactg caggaagttc 2160
atcgactttt acaaacaaag tatctctaaa caccccgagt ggaaggactt tggctttcgc 2220
ttctcagata ctcagagata taactcaata gatgaattct atcgtgaagt agagaaccag 2280
gggtacaaac taactttcga gaatattagc gagagctaca tagattcagt agttaatcaa 2340
ggtaagttgt atctgtttca aatctataat aaagacttct cagcatactc taagggtcga 2400
cccaacttgc ataccttgta ctggaaggcc ttgttcgatg aaaggaacct ccaagatgta 2460
gtttacaagc tgaatggtga ggccgagctg ttctatagaa agcaatctat tccgaaaaag 2520
atcacacatc ccgctaaaga agcaattgct aataaaaaca aggataatcc taaaaaggag 2580
tctgtttttg agtatgattt aattaaggat aaaaggttta ccgaggataa gtttttcttc 2640
cattgtccca taactatcaa ttttaagagt tctggtgcga ataagtttaa cgacgaaatt 2700
aatcttttgc ttaaggagaa ggcaaacgat gtgcacatct tgagtatcga caggggggag 2760
agacatctcg catattacac attagttgat ggcaagggaa acattatcaa acaggatact 2820
tttaatatta taggtaacga tcgtatgaag acaaactatc acgataagtt ggctgcaatc 2880
gaaaaagata gggactctgc ccgcaaggac tggaagaaaa ttaacaatat taaagaaatg 2940
aaggaagggt atctgtctca ggttgttcac gagatcgcga agcttgtaat agaatacaac 3000
gctattgtgg ttttcgaaga tctgaacttc ggtttcaaac gcggaaggtt taaggttgag 3060
aagcaggttt atcaaaagtt ggaaaaaatg ttgattgaaa aattgaacta tcttgtgttt 3120
aaagataacg aatttgataa aaccggtggc gttctccgtg catatcaact cactgcacca 3180
tttgaaacat ttaaaaaaat gggaaagcag acagggatta tctattatgt tccagcaggc 3240
tttacttcta aaatatgtcc cgtcaccggc tttgtgaacc aattgtaccc taaatatgag 3300
tccgtttcaa aaagtcagga gttcttttca aaatttgata aaatttgtta taacttagat 3360
aaaggttact tcgaattttc gttcgattat aaaaactttg gagataaagc cgcgaaggga 3420
aaatggacta tagcctcatt tgggtcaaga ttaataaact tcaggaattc tgataagaac 3480
cataactggg acaccaggga ggtgtaccca acaaaagagc tggaaaagct tcttaaggat 3540
tactcaatag agtatggaca cggcgaatgt ataaaggctg ccatttgcgg cgaatcggat 3600
aagaaatttt tcgctaaatt gacaagcgtg ctaaacacta tccttcaaat gagaaactca 3660
aagacaggta ctgaacttga ctaccttatc agtcctgtgg cggatgttaa tggtaatttt 3720
ttcgactctc gtcaggcacc aaaaaatatg ccccaagatg cagatgcaaa tggtgcctat 3780
cacattggac tcaaaggatt aatgctgttg ggaaggatta agaataacca agagggaaag 3840
aaattgaacc tcgtgataaa gaacgaggaa tatttcgaat tcgtccagaa cagaaataac 3900
<210> 27
<211> 3900
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 27
atgtccatat atcaggagtt cgtgaacaag tacagtctta gcaagacctt gaggtttgag 60
cttatccccc agggaaagac cctcgagaac atcaaggcca ggggcctcat cctcgacgac 120
gagaagaggg ccaaggacta caagaaggcc aagcagatta tcgacaagta ccatcaattt 180
ttcatcgagg agatactctc cagtgtttgc ataagcgagg acctcctcca gaattactcc 240
gacgtttatt tcaagctcaa gaagagcgac gacgacaatc tccagaaaga cttcaagtcc 300
gccaaggaca ccatcaagaa gcaaatcagc gagtatatca aggattccga gaagttcaag 360
aacctcttca atcaaaactt gatcgatgcc aagaagggcc aggaaagcga cctcattctc 420
tggctcaagc agtccaagga taacgggatt gagctcttca aggccaacag cgacatcact 480
gacattgacg aagccctcga gatcattaag tcatttaagg gttggaccac ctacttcaag 540
ggcttccatg agaacaggaa aaacgtgtac tcatccaacg acatccccac ctccatcatc 600
tacaggatcg tggacgacaa tctccccaaa ttcctcgaga ataaagccaa atatgagagc 660
ttgaaggaca aagcccccga ggccattaac tacgagcaga tcaagaagga tttggccgaa 720
gaacttacct ttgacatcga ctacaagacc tccgaagtga accaaagggt cttcagcctc 780
gatgaagtgt ttgaaatcgc caatttcaat aactacctca accaaagtgg gatcacaaag 840
ttcaatacca tcatcggagg caagttcgtt aacggcgaaa ataccaagag gaagggaatc 900
aatgagtaca tcaacctcta ctcacaacag attaacgata agaccctcaa aaagtacaaa 960
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aagttggagg acgactccga cgtggtgaca actatgcagt ccttctacga gcagatcgcc 1080
gcctttaaaa ccgtggagga gaagagcatc aaagagaccc tcagcttgct ctttgacgac 1140
ttgaaggccc agaaactcga cctttctaag atctatttca agaatgacaa gtccctcacc 1200
gacctcagcc agcaagtgtt cgacgactac tcagttatcg ggacagcagt cctcgaatac 1260
attacacagc agatcgcccc aaagaacctc gataacccct ccaagaagga gcaggagctc 1320
atcgccaaga aaaccgagaa ggctaagtat ctcagtttgg agactatcaa gctcgccctc 1380
gaggagttca acaagcacag agacatagac aagcaatgta ggtttgagga gatcttggcc 1440
aacttcgccg ccatccccat gatattcgac gagatcgccc agaacaaaga caacctcgcc 1500
cagatcagca tcaagtatca gaatcagggg aagaaggatc tccttcaggc ctcagccgaa 1560
gatgacgtca aggccatcaa ggatctcctc gaccaaacaa acaacctcct ccacaaactc 1620
aaaattttcc atatcagcca gtccgaagac aaggccaaca tcttggacaa ggacgagcat 1680
ttctacctcg tctttgaaga atgctacttc gagctcgcca atatcgtgcc actctacaat 1740
aaaatcagga actacatcac ccagaaacca tacagtgacg agaagttcaa acttaatttc 1800
gagaactcca ccctcgctaa cgggtgggat aagaacaagg agcccgacaa caccgcaatt 1860
cttttcatca aggacgacaa gtactacctc ggcgtcatga acaaaaagaa caacaaaatc 1920
ttcgatgata aagccatcaa ggagaacaag ggcgaggggt ataagaagat agtgtataag 1980
cttctccccg gcgccaacaa gatgctccca aaagtctttt ttagcgccaa gtccataaag 2040
ttctacaacc ccagtgagga tatcctcagg atcaggaacc actccactca cacaaagaac 2100
gggagccccc aaaaagggta cgagaaattc gaattcaaca tcgaagactg cagaaagttc 2160
atcgatttct acaagcagtc catctccaaa caccccgaat ggaaggattt cgggttcagg 2220
ttctcggaca cccaaaggta caacagcatc gacgaattct acagggaggt tgagaaccag 2280
ggttacaaat tgacattcga aaacatcagt gagagctata tcgattccgt ggtgaaccag 2340
gggaagctct acctctttca aatatataat aaggatttca gtgcctacag caaggggagg 2400
ccaaacttgc atacccttta ctggaaagca ctcttcgacg agaggaacct ccaggacgtg 2460
gtttataagt taaacggcga ggccgagctc ttctacagga aacagagtat ccccaaaaag 2520
atcacacacc ccgccaaaga ggccatagcc aacaagaaca aggacaaccc caagaaagaa 2580
tccgttttcg agtatgacct catcaaggac aagaggttca ccgaggacaa attcttcttt 2640
cactgcccta tcaccattaa ctttaagtcc tccggcgcca acaagttcaa cgacgagatc 2700
aacctcttgc ttaaggagaa ggctaatgac gttcacatac tcagcatcga caggggggag 2760
aggcatctcg cctactacac cctcgtggac ggcaaaggca acatcatcaa gcaagacacc 2820
ttcaacatta tcgggaacga caggatgaag accaactacc acgacaagct cgccgctatc 2880
gagaaagaca gggacagcgc cagaaaagac tggaagaaaa taaacaatat caaggagatg 2940
aaagaagggt acctcagcca agtcgtccat gagatcgcca agctcgtgat cgagtataac 3000
gctatagttg tcttcgagga cctcaacttc ggcttcaaaa gaggcaggtt caaagtggaa 3060
aagcaggtgt accagaaact cgaaaagatg ctcatcgaga agttgaacta tctcgttttc 3120
aaggataatg agttcgacaa aaccgggggc gtcctcaggg cctaccagct caccgcaccc 3180
ttcgagactt tcaaaaaaat gggcaagcag accggtatca tttactatgt ccccgccggt 3240
ttcacttcta agatctgccc cgtgacaggc tttgtgaacc agctttatcc caagtacgaa 3300
tcagtttcca agtcccagga gttcttctct aagtttgata agatatgcta caacctcgac 3360
aaggggtatt tcgaattcag cttcgattat aagaacttcg gagacaaggc cgccaaggga 3420
aagtggacca tcgccagctt tggttccagg ctcataaact tcaggaacag cgacaagaac 3480
cacaactggg ataccaggga ggtttaccct accaaagaac tcgagaagct cctcaaggac 3540
tactccatcg agtacggtca tggggagtgc atcaaggctg ccatctgcgg cgagagcgat 3600
aagaagttct tcgccaaact caccagcgtt ttgaacacca tcctccagat gaggaatagc 3660
aagaccggca ccgagctcga ctacctcatc tcacccgtcg ccgacgtgaa cggcaatttc 3720
ttcgattcta ggcaggcacc taagaacatg ccccaggacg cagacgccaa cggcgcctac 3780
cacatcgggc ttaaggggct catgctcttg ggcagaatca aaaacaacca agaggggaaa 3840
aaactcaact tggtgatcaa gaacgaggaa tacttcgagt tcgtccagaa caggaacaac 3900
<210> 28
<211> 3900
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 28
atgagcatat accaagagtt cgtgaacaag tacagcctct ctaagaccct taggtttgag 60
ctcatccccc aggggaaaac cctcgagaac atcaaggcca ggggcctcat cctcgacgat 120
gagaagaggg ccaaggacta caagaaagcc aagcagatca tcgacaagta tcaccagttc 180
ttcatcgaag agatcctctc ctccgtgtgc atcagtgagg acttgctcca aaattactcc 240
gatgtgtact tcaagctcaa gaagtcagat gatgacaacc ttcagaagga ctttaagagt 300
gccaaagata ccatcaaaaa acagatcagc gagtacatca aggactccga gaagttcaag 360
aacttgttca accagaacct cattgacgcc aagaaggggc aggagtccga tctcatcctc 420
tggctcaagc agagcaaaga caacgggatc gagctcttca aggctaactc agacataacc 480
gacatcgatg aggccctcga gatcatcaaa tcctttaagg ggtggaccac ttattttaag 540
gggtttcacg agaacaggaa gaatgtctat agcagcaacg acatccccac cagcatcatc 600
tataggatcg tggatgataa tcttcccaaa tttttggaaa acaaggccaa gtacgaatct 660
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aagatcagga actacatcac ccaaaagccc tactctgacg agaagttcaa gctcaacttc 1800
gagaacagca ccctcgccaa cgggtgggac aaaaacaaag aacccgacaa cactgccatc 1860
ctcttcatca aagacgacaa atactatctc ggcgtgatga ataaaaaaaa caacaagata 1920
tttgatgaca aagccatcaa ggagaacaag ggcgaaggtt acaagaaaat cgtctacaag 1980
ctcctccccg gcgccaacaa gatgctcccc aaggtcttct ttagtgcaaa gtcaatcaag 2040
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ggcagccctc aaaaagggta cgagaaattc gagttcaaca tcgaggactg cagaaaattc 2160
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gggtacaagc tcaccttcga aaacatctcc gagtcataca tcgactctgt ggttaaccag 2340
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gtttacaaac tcaacgggga ggctgagctc ttttacagga agcagtccat ccccaagaaa 2520
atcacccatc ccgccaagga ggccatcgcc aataagaata aagacaaccc taaaaaggag 2580
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gagaaggata gggactccgc aaggaaggac tggaagaaga tcaacaacat caaagagatg 2940
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gccatcgtcg tctttgagga cctcaatttc ggattcaaga gggggagatt caaggtggag 3060
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cacataggcc tcaagggtct catgctcctc gggaggatca agaacaacca ggagggcaag 3840
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<210> 36
<211> 3900
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 36
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gacgtctact tcaagctcaa aaaaagcgac gacgacaact tgcaaaagga cttcaaatcc 300
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aatctcttta atcaaaatct catcgacgcc aaaaagggcc aagagtctga cttgatcctc 420
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ttcaacacca ttatcggtgg caaattcgtg aacggggaga acaccaagag gaaaggtatc 900
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<223> 细菌
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Val Asn Val Ser Glu Glu Arg Ile Lys Asn Glu Ile Thr Lys Asp Asp
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Gly Leu Ile Arg Gly Ser Gln Lys Thr Ser Ile Asn Asp Tyr Phe Tyr
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tacccctttg gcatcgtttc cttcgtcaac cccaggaaca ccagtatttc ctgcccaaac 3720
tgcaagaacg ccaacaagag caacaggatt aagaaagaga acgacaggat cctctgcaag 3780
cacaatatcg agaagacaaa gggtaactgt ggcttcgaca ccgccaactt tgatgagaac 3840
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gcagcctaca acatagccgt caaactcctc gaggacaaga tcttcgagat caacaagaag 3960
<210> 46
<211> 3960
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 46
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accgaccaaa tacaacttac caaggagtac tacaaggtga tcgccaagaa ggcctgcttc 300
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<210> 47
<211> 3960
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 47
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gagaattcta cattggccgg ccttggcacc tatcattttt ttgagatgca actcctcaag 3540
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accgagaatt acgagaagat cgtcagaaag gataagaacg tcaaggcaaa aatcgtctcc 3660
taccccttcg gaatcgtttc cttcgtcaac cccaggaaca ccagcatttc ctgtcccaac 3720
tgcaagaacg ccaataagtc aaacaggatt aagaaggaaa acgataggat tctctgcaag 3780
cacaacatcg agaagactaa gggaaattgc gggtttgaca ccgccaactt tgatgagaac 3840
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gccgcctaca acattgccgt taaactcctc gaggacaaaa tctttgagat aaacaaaaag 3960
<210> 48
<211> 3960
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 48
atgcagcaat accaggtttc caagaccgtg agatttggcc tcacactcaa aaattctgag 60
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<210> 49
<211> 1307
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 氨基酸球菌属物种（Acidaminococcus sp. ）
<400> 49
Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln
20 25 30
Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys
35 40 45
Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln
50 55 60
Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile
65 70 75 80
Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile
85 90 95
Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly
100 105 110
Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile
115 120 125
Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys
130 135 140
Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg
145 150 155 160
Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg
165 170 175
Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg
180 185 190
Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe
195 200 205
Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn
210 215 220
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225 230 235 240
Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp
245 250 255
Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu
260 265 270
Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn
275 280 285
Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro
290 295 300
Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu
305 310 315 320
Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr
325 330 335
Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu
340 345 350
Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His
355 360 365
Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr
370 375 380
Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys
385 390 395 400
Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu
405 410 415
Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser
420 425 430
Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala
435 440 445
Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys
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tccgtgctcc agatgaggaa ttccaacgcc gccaccggcg aggattacat aaacagcccc 3720
gtcagggacc tcaacggggt ttgcttcgac tccaggttcc aaaaccccga gtggcccatg 3780
gacgctgacg ctaacggcgc ataccacatc gcactcaaag gccagctcct cttgaaccat 3840
ctcaaggagt caaaagacct caagctccag aacgggatca gcaaccagga ttggttggcc 3900
tacatacagg agctcaggaa c 3921
<210> 60
<211> 3921
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 60
atgacacaat tcgagggctt cacaaacctc taccaggtca gcaaaaccct caggttcgag 60
ctcatccctc aggggaagac cctcaaacac atccaggagc aggggttcat agaggaggac 120
aaggctagga atgaccatta caaggagctt aagccaatca tcgacaggat ctataaaacc 180
tatgccgacc aatgcctcca gctcgtgcag cttgactggg aaaacctctc cgccgccatc 240
gacagctata ggaaggagaa aaccgaggaa accagaaacg cccttatcga agaacaagca 300
acctacagga acgccatcca tgactacttc atagggagga cagacaatct caccgacgcc 360
atcaacaaga ggcacgccga gatctacaaa ggccttttca aggcagagtt gtttaacggg 420
aaggtcctca agcagttggg tacagtcacc accaccgaac acgaaaacgc cttgttgagg 480
tccttcgaca agttcaccac ctacttcagc ggcttctatg aaaacaggaa aaacgtcttc 540
tctgccgagg atatctcaac cgccatcccc cataggattg tgcaagacaa cttccccaag 600
tttaaagaga actgtcacat cttcaccaga ctcatcactg ctgtgcccag tctcagggaa 660
cacttcgaga atgtcaaaaa ggccatcggc atcttcgtct ctacaagcat cgaggaggtt 720
ttcagcttcc ctttctacaa ccagttgctc acccaaaccc agattgatct ctacaatcaa 780
ctcctcgggg gcatcagcag ggaggccggg accgagaaga tcaagggcct taacgaggtc 840
ctcaacctcg ccatccagaa gaacgatgag accgcccata tcattgccag cctccctcac 900
aggttcatcc ccctttttaa gcagatcctc agcgatagga ataccctctc attcatcctc 960
gaggaattca agtccgacga ggaagtcatt cagtccttct gtaagtataa gaccctcctc 1020
aggaatgaaa atgttctcga gaccgccgag gctctcttca acgaactcaa ctccatcgat 1080
cttacccaca tattcataag ccacaaaaag ctcgagacca taagcagcgc cctctgcgac 1140
cactgggata ctctcagaaa cgccctctac gagaggagga tctccgagct taccggtaag 1200
atcaccaagt ccgccaagga gaaggttcag aggagcctca agcacgagga tatcaacctc 1260
caggaaataa tctcagccgc cgggaaggag ttgagtgagg ctttcaaaca gaagacaagc 1320
gaaatcctca gccacgccca cgcagccctc gaccaaccac tccccaccac cctcaaaaag 1380
caagaggaaa aggagatact caaaagccag cttgattcat tgctcggcct ctaccacctc 1440
ctcgactggt tcgccgtgga cgaatccaac gaggtcgacc ccgaatttag cgctaggctc 1500
accggaatca aactcgagat ggagcccagc ctcagcttct acaacaaggc caggaactac 1560
gccaccaaga agccttactc cgtggagaag ttcaaactca acttccagat gccaaccctc 1620
gcctccggtt gggacgtgaa caaagagaag aacaatggtg ctatcttgtt cgtgaagaat 1680
gggctttatt accttggaat catgcccaaa cagaaaggaa ggtacaaggc cctctcattc 1740
gaacccaccg aaaagacttc cgaggggttc gacaagatgt attacgacta cttccctgat 1800
gccgcaaaga tgatacccaa gtgctccact caactcaagg ccgtcaccgc ccacttccag 1860
acccacacca cccccatctt gctctccaat aacttcatag aacctctcga aatcaccaag 1920
gagatctacg atcttaataa cccagagaag gagcccaaaa agttccaaac cgcatacgcc 1980
aagaagaccg gggaccagaa ggggtacagg gaagccttgt gcaagtggat agactttacc 2040
agggacttct tgtccaagta taccaagacc accagtatcg atctcagctc tctcaggccc 2100
agcagccagt acaaggattt gggggagtac tacgccgagt tgaaccccct cctctaccac 2160
atctcattcc agaggatcgc cgagaaggaa atcatggatg cagtcgagac tggcaagctc 2220
tacctcttcc agatctataa caaggacttc gccaagggcc accacgggaa gccaaacctc 2280
catacactct attggaccgg gttgttttcc cccgagaacc ttgccaagac ctccatcaag 2340
ttgaacgggc aggccgagct cttctacaga cccaagagca ggatgaagag aatggcacac 2400
aggctcggtg agaagatgct caacaagaag ctcaaggacc agaaaactcc catccccgac 2460
accctctacc aggagttgta tgactacgtt aaccacaggc tctcccatga cctctccgac 2520
gaagctagag ccctccttcc caacgtcatc accaaggagg tctcccacga gatcatcaaa 2580
gacaggaggt ttaccagcga caagttcttc tttcacgtcc ctataaccct taactaccag 2640
gctgctaact ccccctccaa atttaaccag agggtcaacg cttaccttaa ggaacacccc 2700
gagacaccca ttattggaat cgacagaggc gaaaggaacc tcatctatat taccgtcatc 2760
gacagcaccg gcaagatcct cgagcagagg agcctcaaca ccatccagca gttcgactat 2820
cagaagaagt tggacaatag agagaaagag agggtcgccg ccaggcaagc ctggagcgtc 2880
gtgggaacca tcaaggacct caagcaggga tatctctccc aggtcatcca cgagatagtg 2940
gatctcatga tccattacca agccgtggtg gttctcgaga acctcaactt cggcttcaag 3000
agcaagagga ccggcatcgc cgaaaaggcc gtttaccaac agtttgagaa gatgttgatc 3060
gacaaattga actgcctcgt ccttaaagat taccctgccg agaaggtggg tggggtttta 3120
aacccctacc agctcaccga ccagttcacc tcctttgcca agatgggcac ccagagcggc 3180
ttcctcttct acgttccagc cccctacacc tccaagatcg atcccctcac cgggttcgtg 3240
gaccccttcg tctggaagac catcaagaac cacgaaagca gaaagcattt cctcgaaggg 3300
ttcgactttc tccactacga tgtgaagacc ggggatttca tcctccactt caagatgaat 3360
aggaacctta gcttccagag ggggttgcct ggatttatgc ccgcctggga catcgtgttt 3420
gagaagaacg agactcagtt cgacgccaag gggactccct tcatcgccgg caagaggatc 3480
gtgccagtaa tcgagaatca tagattcacc ggcaggtata gggaccttta ccccgccaac 3540
gagctcatcg ccctcctcga ggagaagggc atcgttttta gagacgggtc caacatcctt 3600
cccaaactcc tcgagaacga cgattctcac gcaatcgata ccatggtcgc cctcatcagg 3660
agcgtgctcc agatgagaaa ctccaacgcc gccactggcg aggactatat taactcccct 3720
gttagggacc ttaacggcgt gtgtttcgat agcagattcc agaatccaga gtggcccatg 3780
gacgccgatg ctaatggggc ctatcatatc gctcttaagg gacagctcct cttgaaccac 3840
cttaaggagt ccaaggactt gaaattgcag aatgggatat ccaaccagga ctggctcgcc 3900
tacattcagg agctcaggaa t 3921
<210> 61
<211> 1064
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 史密斯氏菌属物种（Smithella sp. ）
<400> 61
Met Glu Lys Tyr Lys Ile Thr Lys Thr Ile Arg Phe Lys Leu Leu Pro
1 5 10 15
Asp Lys Ile Gln Asp Ile Ser Arg Gln Val Ala Val Leu Gln Asn Ser
20 25 30
Thr Asn Ala Glu Lys Lys Asn Asn Leu Leu Arg Leu Val Gln Arg Gly
35 40 45
Gln Glu Leu Pro Lys Leu Leu Asn Glu Tyr Ile Arg Tyr Ser Asp Asn
50 55 60
His Lys Leu Lys Ser Asn Val Thr Val His Phe Arg Trp Leu Arg Leu
65 70 75 80
Phe Thr Lys Asp Leu Phe Tyr Asn Trp Lys Lys Asp Asn Thr Glu Lys
85 90 95
Lys Ile Lys Ile Ser Asp Val Val Tyr Leu Ser His Val Phe Glu Ala
100 105 110
Phe Leu Lys Glu Trp Glu Ser Thr Ile Glu Arg Val Asn Ala Asp Cys
115 120 125
Asn Lys Pro Glu Glu Ser Lys Thr Arg Asp Ala Glu Ile Ala Leu Ser
130 135 140
Ile Arg Lys Leu Gly Ile Lys His Gln Leu Pro Phe Ile Lys Gly Phe
145 150 155 160
Val Asp Asn Ser Asn Asp Lys Asn Ser Glu Asp Thr Lys Ser Lys Leu
165 170 175
Thr Ala Leu Leu Ser Glu Phe Glu Ala Val Leu Lys Ile Cys Glu Gln
180 185 190
Asn Tyr Leu Pro Ser Gln Ser Ser Gly Ile Ala Ile Ala Lys Ala Ser
195 200 205
Phe Asn Tyr Tyr Thr Ile Asn Lys Lys Gln Lys Asp Phe Glu Ala Glu
210 215 220
Ile Val Ala Leu Lys Lys Gln Leu His Ala Arg Tyr Gly Asn Lys Lys
225 230 235 240
Tyr Asp Gln Leu Leu Arg Glu Leu Asn Leu Ile Pro Leu Lys Glu Leu
245 250 255
Pro Leu Lys Glu Leu Pro Leu Ile Glu Phe Tyr Ser Glu Ile Lys Lys
260 265 270
Arg Lys Ser Thr Lys Lys Ser Glu Phe Leu Glu Ala Val Ser Asn Gly
275 280 285
Leu Val Phe Asp Asp Leu Lys Ser Lys Phe Pro Leu Phe Gln Thr Glu
290 295 300
Ser Asn Lys Tyr Asp Glu Tyr Leu Lys Leu Ser Asn Lys Ile Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Thr Ala Lys Ser Leu Leu Ser Lys Asp Ser Pro Glu Ala Gln
325 330 335
Lys Leu Gln Thr Glu Ile Thr Lys Leu Lys Lys Asn Arg Gly Glu Tyr
340 345 350
Phe Lys Lys Ala Phe Gly Lys Tyr Val Gln Leu Cys Glu Leu Tyr Lys
355 360 365
Glu Ile Ala Gly Lys Arg Gly Lys Leu Lys Gly Gln Ile Lys Gly Ile
370 375 380
Glu Asn Glu Arg Ile Asp Ser Gln Arg Leu Gln Tyr Trp Ala Leu Val
385 390 395 400
Leu Glu Asp Asn Leu Lys His Ser Leu Ile Leu Ile Pro Lys Glu Lys
405 410 415
Thr Asn Glu Leu Tyr Arg Lys Val Trp Gly Ala Lys Asp Asp Gly Ala
420 425 430
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Tyr Phe Glu Ser Met Thr Tyr
435 440 445
Arg Ala Leu Arg Lys Leu Cys Phe Gly Ile Asn Gly Asn Thr Phe Leu
450 455 460
Pro Glu Ile Gln Lys Glu Leu Pro Gln Tyr Asn Gln Lys Glu Phe Gly
465 470 475 480
Glu Phe Cys Phe His Lys Ser Asn Asp Asp Lys Glu Ile Asp Glu Pro
485 490 495
Lys Leu Ile Ser Phe Tyr Gln Ser Val Leu Lys Thr Asp Phe Val Lys
500 505 510
Asn Thr Leu Ala Leu Pro Gln Ser Val Phe Asn Glu Val Ala Ile Gln
515 520 525
Ser Phe Glu Thr Arg Gln Asp Phe Gln Ile Ala Leu Glu Lys Cys Cys
530 535 540
Tyr Ala Lys Lys Gln Ile Ile Ser Glu Ser Leu Lys Lys Glu Ile Leu
545 550 555 560
Glu Asn Tyr Asn Thr Gln Ile Phe Lys Ile Thr Ser Leu Asp Leu Gln
565 570 575
Arg Ser Glu Gln Lys Asn Leu Lys Gly His Thr Arg Ile Trp Asn Arg
580 585 590
Phe Trp Thr Lys Gln Asn Glu Glu Ile Asn Tyr Asn Leu Arg Leu Asn
595 600 605
Pro Glu Ile Ala Ile Val Trp Arg Lys Ala Lys Lys Thr Arg Ile Glu
610 615 620
Lys Tyr Gly Glu Arg Ser Val Leu Tyr Glu Pro Glu Lys Arg Asn Arg
625 630 635 640
Tyr Leu His Glu Gln Tyr Thr Leu Cys Thr Thr Val Thr Asp Asn Ala
645 650 655
Leu Asn Asn Glu Ile Thr Phe Ala Phe Glu Asp Thr Lys Lys Lys Gly
660 665 670
Thr Glu Ile Val Lys Tyr Asn Glu Lys Ile Asn Gln Thr Leu Lys Lys
675 680 685
Glu Phe Asn Lys Asn Gln Leu Trp Phe Tyr Gly Ile Asp Ala Gly Glu
690 695 700
Ile Glu Leu Ala Thr Leu Ala Leu Met Asn Lys Asp Lys Glu Pro Gln
705 710 715 720
Leu Phe Thr Val Tyr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Phe Lys His Gly
725 730 735
Tyr Ile Tyr Asn Lys Glu Arg Glu Leu Val Ile Arg Glu Lys Pro Tyr
740 745 750
Lys Ala Ile Gln Asn Leu Ser Tyr Phe Leu Asn Glu Glu Leu Tyr Glu
755 760 765
Lys Thr Phe Arg Asp Gly Lys Phe Asn Glu Thr Tyr Asn Glu Leu Phe
770 775 780
Lys Glu Lys His Val Ser Ala Ile Asp Leu Thr Thr Ala Lys Val Ile
785 790 795 800
Asn Gly Lys Ile Ile Leu Asn Gly Asp Met Ile Thr Phe Leu Asn Leu
805 810 815
Arg Ile Leu His Ala Gln Arg Lys Ile Tyr Glu Glu Leu Ile Glu Asn
820 825 830
Pro His Ala Glu Leu Lys Glu Lys Asp Tyr Lys Leu Tyr Phe Glu Ile
835 840 845
Glu Gly Lys Asp Lys Asp Ile Tyr Ile Ser Arg Leu Asp Phe Glu Tyr
850 855 860
Ile Lys Pro Tyr Gln Glu Ile Ser Asn Tyr Leu Phe Ala Tyr Phe Ala
865 870 875 880
Ser Gln Gln Ile Asn Glu Ala Arg Glu Glu Glu Gln Ile Asn Gln Thr
885 890 895
Lys Arg Ala Leu Ala Gly Asn Met Ile Gly Val Ile Tyr Tyr Leu Tyr
900 905 910
Gln Lys Tyr Arg Gly Ile Ile Ser Ile Glu Asp Leu Lys Gln Thr Lys
915 920 925
Val Glu Ser Asp Arg Asn Lys Phe Glu Gly Asn Ile Glu Arg Pro Leu
930 935 940
Glu Trp Ala Leu Tyr Arg Lys Phe Gln Gln Glu Gly Tyr Val Pro Pro
945 950 955 960
Ile Ser Glu Leu Ile Lys Leu Arg Glu Leu Glu Lys Phe Pro Leu Lys
965 970 975
Asp Val Lys Gln Pro Lys Tyr Glu Asn Ile Gln Gln Phe Gly Ile Ile
980 985 990
Lys Phe Val Ser Pro Glu Glu Thr Ser Thr Thr Cys Pro Lys Cys Leu
995 1000 1005
Arg Arg Phe Lys Asp Tyr Asp Lys Asn Lys Gln Glu Gly Phe Cys
1010 1015 1020
Lys Cys Gln Cys Gly Phe Asp Thr Arg Asn Asp Leu Lys Gly Phe
1025 1030 1035
Glu Gly Leu Asn Asp Pro Asp Lys Val Ala Ala Phe Asn Ile Ala
1040 1045 1050
Lys Arg Gly Phe Glu Asp Leu Gln Lys Tyr Lys
1055 1060
<210> 62
<211> 3192
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 62
atggaaaagt ataagatcac aaaaacaatc cgattcaagc tacttcctga caaaatacag 60
gatatttctc ggcaggtggc cgtgttgcaa aattcaacga acgcagaaaa aaagaacaat 120
ttgttgaggc tcgttcaaag ggggcaagag ctcccaaagc tcttgaatga atacattagg 180
tattccgata atcacaaact caaaagtaac gttacggtgc atttcaggtg gcttagatta 240
ttcactaagg acttatttta taattggaaa aaagacaaca ccgaaaagaa gataaagatt 300
tccgatgttg tttatctgag ccacgttttt gaagctttcc tgaaggagtg ggagtccaca 360
attgagaggg tgaacgcaga ttgcaacaaa ccggaagaat ccaaaacacg cgatgcagaa 420
atcgcactct caatcagaaa actcggcatc aaacatcaat tgccttttat taagggattc 480
gtggacaact ctaacgataa gaattcagag gatactaaat ctaagctaac cgcacttctg 540
tccgagtttg aagctgtgct taaaatttgt gagcagaact acttaccctc tcagtcatcg 600
ggtattgcaa tcgctaaagc cagtttcaac tactatacaa ttaacaagaa gcaaaaggat 660
tttgaggctg agatagttgc tttaaagaag cagttgcacg ccaggtatgg aaataaaaag 720
tatgaccagc tactgagaga gctaaacctc attccactta aagaattgcc tcttaaagaa 780
cttccgctta ttgaatttta cagcgaaatc aagaagagaa agtccaccaa aaagtccgag 840
ttccttgaag ctgtctcaaa tgggttggtc tttgatgatc ttaagagtaa gttcccattg 900
tttcaaacag agagcaacaa atacgacgag taccttaaac tatcaaacaa aatcacccaa 960
aaatccactg caaagagcct tctctcaaaa gacagcccag aggcacagaa attacaaact 1020
gagattacaa agctgaaaaa aaatagggga gagtatttca agaaggcatt cggcaagtat 1080
gtgcaattgt gtgagctgta taaagagatc gcaggaaagc ggggcaagct taaggggcaa 1140
attaagggaa tagaaaacga gcgcatagat tcacagaggc tccaatactg ggctttggtc 1200
ctggaggata acttgaagca tagtttaatt ttgattccta aggaaaagac taacgagttg 1260
tatcgaaagg tttggggtgc aaaggatgac ggtgccagtt cctccagcag tagtacccta 1320
tattacttcg aatccatgac gtacagggca ctacgtaaac tctgttttgg gattaacgga 1380
aatacatttc tccctgaaat ccagaaagaa ctacctcagt acaaccaaaa ggagttcggc 1440
gaattctgct ttcataagtc caatgacgac aaagagatcg atgagccaaa gttgatctcg 1500
ttctaccagt cagttctcaa gacagatttc gttaagaaca cactagctct ccctcaatca 1560
gttttcaatg aggtagctat ccaatcattt gagacgaggc aggattttca aattgctctt 1620
gagaaatgtt gttatgcaaa gaagcaaatt atttctgaga gcctgaaaaa agagattctt 1680
gaaaattata acacgcagat ttttaaaatt acgtctcttg accttcagag gagcgagcag 1740
aagaatctga aggggcacac aaggatctgg aatagatttt ggacaaaaca gaacgaagag 1800
ataaattaca atcttcgttt aaatcctgag attgctatcg tgtggagaaa ggctaagaag 1860
actaggattg aaaagtacgg agaaagatct gtgctttatg agccagagaa gaggaataga 1920
tatttacacg aacaatatac actgtgtacc accgtgactg ataatgcttt gaacaatgag 1980
ataacttttg ctttcgagga tactaagaaa aagggtaccg agattgttaa gtataatgaa 2040
aagatcaatc agactttgaa gaaagaattt aataagaatc aattgtggtt ttacggaatt 2100
gacgccggtg aaattgagct tgctacactg gcccttatga acaaagacaa ggaacctcaa 2160
ttgtttacgg tgtacgaact gaagaagctt gacttcttca aacacggtta catttataac 2220
aaagagcgtg agttggttat tcgcgaaaag ccttacaagg ctatccaaaa tctttcttat 2280
ttcctgaacg aggaacttta cgagaagact ttcagggacg gaaagtttaa cgaaacctat 2340
aacgagttat ttaaggagaa gcatgtgagt gccatagact tgaccacagc caaggtaatt 2400
aacggtaaaa ttatattgaa cggagatatg attacgttct tgaatttgag gattcttcac 2460
gcgcagagaa agatttatga agagcttatt gaaaatcctc atgccgaact taaggagaag 2520
gactataagc tttattttga gattgaaggt aaggataaag atatatatat ctccaggttg 2580
gatttcgaat acattaagcc gtaccaggag atcagtaatt atttgtttgc ctactttgca 2640
tctcaacaga ttaacgaggc cagagaagaa gagcagatta atcaaactaa gagagctcta 2700
gccggaaaca tgataggagt gatttattat ttataccaga agtacagagg aattattagc 2760
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attagtgagc ttataaagct aagagagctt gagaagtttc cactgaagga tgtgaaacaa 2940
ccaaaatacg aaaatatcca gcaattcggt attatcaaat ttgtttctcc agaagagaca 3000
tcaaccacct gcccgaaatg tttgcgccga tttaaggact acgataaaaa taaacaggaa 3060
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ctgaatgacc cagacaaagt ggctgccttt aatattgcta aaaggggatt tgaggacttg 3180
caaaagtaca aa 3192
<210> 63
<211> 3192
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 63
atggagaagt acaagattac caagacaatt aggttcaaac tcctccccga taagattcag 60
gatatctcca gacaagtcgc cgtcctccaa aacagcacaa atgccgagaa gaagaacaac 120
ctccttagac tcgtgcagag ggggcaggag ctccccaaac ttctcaatga gtatatcagg 180
tattctgaca atcataagct caagagcaac gtgaccgtcc acttcaggtg gctcaggctt 240
ttcaccaagg acctcttcta caactggaag aaggataaca ccgagaagaa gattaagatc 300
tccgacgttg tgtacctctc ccacgtcttc gaggcctttc tcaaagagtg ggagagtacc 360
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gtggacaact ccaacgacaa aaactccgag gacaccaaat ccaagctcac agccttgctt 540
agcgagttcg aggccgtgct caagatctgt gagcagaact acctcccctc ccagagctcc 600
gggatcgcca tcgccaaagc ctccttcaac tactacacca ttaacaagaa gcaaaaggac 660
ttcgaagccg agatcgttgc cctcaagaaa caactccacg ctaggtacgg caataaaaag 720
tacgaccaac ttctcaggga actcaacctc atcccactga aggagctccc ccttaaggag 780
cttccactca tcgagttcta ttccgagatc aagaagagga aatctaccaa gaaatccgag 840
tttctcgagg ctgtctccaa cggcctcgtc ttcgacgacc ttaaatccaa atttcccttg 900
ttccagaccg agagcaacaa atacgatgag tacttgaaat tgtccaacaa gataacccag 960
aagagcaccg ccaagtccct tctctccaag gacagccctg aggcccagaa gctccaaacc 1020
gagatcacaa aactcaaaaa gaataggggg gagtacttca agaaagcctt tggcaagtac 1080
gtgcagctct gcgaactcta caaggagatc gccggcaaga ggggcaaact caaaggccag 1140
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ctcgaggaca atctcaagca tagcttgatc ctcattccca aggagaagac caatgaattg 1260
tataggaagg tctggggtgc aaaggatgat ggcgcatcca gctctagtag ctccaccctc 1320
tactatttcg agtcaatgac ctatagggcc cttaggaagc tctgcttcgg gatcaatggc 1380
aatacctttc ttcccgaaat ccagaaggag ctcccacagt acaaccaaaa ggagtttggt 1440
gagttctgct tccacaagag caacgacgat aaggagatcg acgagcctaa gctcatttcc 1500
ttctaccaat cagtcctcaa gactgacttc gttaagaaca cccttgcctt gccccagtcc 1560
gtcttcaacg aagtggccat ccagagcttc gagaccagac aggatttcca gatcgccttg 1620
gagaagtgct gctatgccaa gaaacagatc atctccgagt ccctcaagaa ggagatcctc 1680
gaaaactaca acacccaaat ctttaagatc actagcctcg acctccagag gtccgaacag 1740
aagaacctca aggggcacac caggatctgg aacaggttct ggaccaagca gaacgaggag 1800
atcaactaca acctcagact caatcccgag atcgcaatcg tctggagaaa ggccaagaaa 1860
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tatctccacg agcagtacac cctctgcacc accgttactg acaatgcact caacaacgaa 1980
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aagatcaacc agactctcaa gaaggagttc aataagaacc aactctggtt ctatgggatc 2100
gacgccggcg agattgagct cgcaacactc gccctcatga ataaggacaa ggagccccag 2160
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aaagagagag agctcgtgat tagggagaag ccatataaag ccatccagaa tctttcctat 2280
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aatgagctct ttaaagaaaa gcacgtttcc gccatagact tgactaccgc caaggttatc 2400
aacgggaaga tcatcttgaa cggggacatg atcacctttc tcaacctcag aatcctccac 2460
gcacagagga agatctacga ggagttgatc gaaaaccccc acgccgaact caaggagaag 2520
gactataagc tctatttcga aatcgagggg aaggacaaag acatctacat cagcaggctc 2580
gactttgaat acatcaaacc ataccaggag atcagcaatt acctcttcgc ctacttcgcc 2640
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accaggatcg aaaagtacgg ggagaggagc gtgctctatg agcccgagaa gaggaacagg 1920
tacttgcacg agcagtatac tctctgcacc accgtcaccg acaacgccct caacaatgaa 1980
atcaccttcg ccttcgagga tacaaagaag aaggggaccg agattgtgaa atataacgag 2040
aagatcaacc agaccctcaa gaaggagttt aacaaaaacc agctctggtt ttacggcata 2100
gacgccggag aaatcgagct cgccaccctc gccctcatga ataaggacaa ggagccccaa 2160
ctcttcaccg tgtatgagct taagaagctc gacttcttca agcacggcta catctacaac 2220
aaggaaaggg agcttgtgat cagggagaaa ccctacaagg caatccagaa cctcagctat 2280
ttccttaacg aggaactcta cgagaagacc tttagggacg ggaagttcaa cgagacctac 2340
aacgagctct tcaaagaaaa gcacgtgagc gccatcgacc ttaccaccgc aaaagtgatc 2400
aacggtaaga tcattttgaa cggggacatg attaccttcc tcaatctcag aatactccac 2460
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gattacaagc tctacttcga aatcgagggg aaggataagg acatctacat cagtaggctc 2580
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cccaagtatg agaatataca gcagtttggg atcatcaaat tcgtgagtcc cgaggagacc 3000
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gggttctgca aatgccagtg cggattcgat accaggaacg accttaaggg gttcgagggc 3120
ctcaacgatc ccgataaggt tgccgccttt aacatcgcca agaggggctt tgaggacctc 3180
cagaaataca ag 3192
<210> 73
<211> 1228
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 毛螺科菌细菌（Lachnospiraceae bacterium）
<400> 73
Met Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp
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Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys
35 40 45
Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp
50 55 60
Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser Leu
65 70 75 80
Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
85 90 95
Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly Asn
100 105 110
Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile Leu
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Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser Phe
130 135 140
Asn Gly Phe Thr Thr Ala Phe Thr Gly Phe Phe Asp Asn Arg Glu Asn
145 150 155 160
Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys Ile
165 170 175
Asn Glu Asn Leu Thr Arg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe Glu Lys
180 185 190
Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Lys
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Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly Glu Phe
210 215 220
Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala Ile
225 230 235 240
Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn
245 250 255
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Arg Asn Thr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile Lys Lys
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Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile
325 330 335
Phe Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile Phe
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Gly Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr Asp Asp
355 360 365
Ile His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu Asp Asp
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Arg Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu Gln Leu
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Ile Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser Ser
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Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val Lys
450 455 460
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465 470 475 480
Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp Ile
485 490 495
Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val Thr
500 505 510
Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn Pro
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530 535 540
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Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val Asn Gly
565 570 575
Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met
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Leu Pro Lys Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr Asn Pro
595 600 605
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610 615 620
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Glu Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln Ile
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Phe Asn Lys Tyr Gly Ile Asn Tyr Gln Gln Gly Asp Ile Arg Ala
1100 1105 1110
Leu Leu Cys Glu Gln Ser Asp Lys Ala Phe Tyr Ser Ser Phe Met
1115 1120 1125
Ala Leu Met Ser Leu Met Leu Gln Met Arg Asn Ser Ile Thr Gly
1130 1135 1140
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1145 1150 1155
Gly Ile Phe Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr Glu Ala Gln Glu Asn Ala
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<210> 74
<211> 3684
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 74
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ttccgaaaga aaactagaac agaaaaggag aataaagaat tggagaatct ggagattaat 300
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attggaggat tcgttaccga gagcggagaa aagataaaag gtcttaacga atatatcaat 780
ctatacaacc agaagacaaa gcagaaactc ccaaaattta aaccacttta caagcaagtc 840
ctctctgatc gtgaaagtct ttctttttat ggcgaaggtt ataccagtga cgaagaggtg 900
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gactcagtga agtctttcga gaactacatt aaggcttttt ttggagaagg aaaggagacg 1440
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gattatcgcg caacaatttt gagatatggt tccaagtact atctggctat catggataag 1680
aaatatgcta agtgcctgca gaaaatcgac aaagatgatg ttaatgggaa ttatgaaaag 1740
attaactata aattattgcc cggacctaac aaaatgttgc ctaaggtttt tttttcaaag 1800
aaatggatgg cctactataa tccttccgag gacatccaaa aaatttataa gaacggtaca 1860
tttaaaaaag gagatatgtt caacttaaat gattgtcaca agctaattga tttttttaag 1920
gactccatct ctagataccc aaaatggagt aacgcctatg attttaactt cagcgaaact 1980
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gccaattctc ctatagctaa caaaaatccc gataatccta agaagaccac gacacttagc 2340
tatgatgttt ataaggacaa gagattttct gaggatcaat atgagttgca tatccccatt 2400
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gctgggtata tcagtcaggt cgttcataag atatgtgaat tagttgaaaa gtacgatgcc 2760
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<210> 75
<211> 3684
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 75
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aagtccaacc cctgcgccac cggtggggcc ctcaagggtt atcagatcac taacaagttc 2940
gagtccttca agtccatgag tacccagaac gggtttatct tctacattcc cgcttggctc 3000
acatcgaaga tagacccctc cacaggtttc gttaacttgc ttaaaactaa atacacctcc 3060
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<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 76
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tttattaacg acgttctcca ctccatcaag cttaaaaacc tcaataacta catcagcctc 240
tttagaaaga aaaccaggac agagaaggag aataaggagc tcgagaacct cgagataaat 300
ctcagaaagg agatcgccaa ggctttcaag ggcaacgagg gctataagag tttgttcaag 360
aaggatatca tcgaaactat cctccccgaa ttcctcgacg ataaagatga gatcgctctt 420
gtcaactctt tcaacggttt tactactgct tttaccggtt tcttcgataa cagggagaac 480
atgttcagcg aagaggctaa atccacctcc atcgctttca ggtgcataaa cgaaaatctc 540
accagataca tcagtaacat ggatatcttt gagaaggtgg acgccatctt cgacaagcat 600
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gagagcttca agagcatgag cacccagaat ggcttcatct tttatattcc cgcctggctc 3000
accagtaaaa tcgacccctc tacaggtttc gtcaacctct tgaagactaa atataccagc 3060
atcgcagaca gcaaaaagtt tatcagcagc tttgatagga tcatgtacgt gcccgaggaa 3120
gacttgttcg aatttgccct cgattacaag aatttcagca ggaccgatgc agactacatc 3180
aagaagtgga aactctatag ttacggcaat aggatcagaa tcttcagaaa cccaaagaaa 3240
aacaacgtct tcgactggga ggaggtctgc ctcacatctg cctataagga gctcttcaat 3300
aagtacggaa tcaattatca gcagggcgac ataagggccc tcctctgcga gcagagcgac 3360
aaagccttct attctagctt catggccctc atgtccctta tgctccagat gaggaatagc 3420
atcactggga ggaccgacgt ggactttctc atctcccctg tcaagaattc agacgggatt 3480
ttctacgatt ccaggaatta cgaggctcag gaaaatgcca tccttcctaa aaacgcagat 3540
gccaacggcg cctacaacat cgccagaaag gtgctttggg ctatcggtca attcaagaaa 3600
gccgaggacg agaagctcga caaggtcaag atcgctatca gcaacaagga gtggctcgag 3660
tatgcccaaa ccagtgtcaa gcac 3684
<210> 84
<211> 3684
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 84
atgagcaagc ttgagaagtt taccaattgc tactctctca gcaaaaccct caggttcaag 60
gccatccccg tcgggaagac ccaggagaac attgacaaca agagactctt ggttgaagat 120
gaaaaaaggg ccgaggacta taagggggtg aagaaactcc tcgacaggta ctaccttagc 180
tttatcaacg acgtgctcca cagcataaaa ttgaaaaatc tcaacaatta catcagcctc 240
ttcaggaaga agaccaggac cgaaaaagag aacaaagagc tcgagaacct cgagatcaac 300
ctcaggaagg aaatagcaaa agccttcaaa ggcaatgagg gctataagag cctcttcaag 360
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gtgaacagct tcaacggttt caccaccgcc ttcaccggct tctttgacaa cagggagaat 480
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atcaattaca agctcctccc cggtccaaac aagatgctcc ccaaggtgtt tttctcaaag 1800
aagtggatgg cctactacaa cccctccgag gatatccaaa agatctacaa aaacggcact 1860
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aaagagaggt ttgaagctag acaaaactgg acttccatag agaacatcaa agagctcaag 2700
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<211> 1263
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 细菌
<400> 85
Met Asn Asn Gly Thr Asn Asn Phe Gln Asn Phe Ile Gly Ile Ser Ser
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Leu Gln Lys Thr Leu Arg Asn Ala Leu Ile Pro Thr Glu Thr Thr Gln
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Gln Phe Ile Val Lys Asn Gly Ile Ile Lys Glu Asp Glu Leu Arg Gly
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Glu Asn Arg Gln Ile Leu Lys Asp Ile Met Asp Asp Tyr Tyr Arg Gly
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Phe Ile Ser Glu Thr Leu Ser Ser Ile Asp Asp Ile Asp Trp Thr Ser
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Leu Phe Glu Lys Met Glu Ile Gln Leu Lys Asn Gly Asp Asn Lys Asp
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Thr Leu Ile Lys Glu Gln Thr Glu Tyr Arg Lys Ala Ile His Lys Lys
100 105 110
Phe Ala Asn Asp Asp Arg Phe Lys Asn Met Phe Ser Ala Lys Leu Ile
115 120 125
Ser Asp Ile Leu Pro Glu Phe Val Ile His Asn Asn Asn Tyr Ser Ala
130 135 140
Ser Glu Lys Glu Glu Lys Thr Gln Val Ile Lys Leu Phe Ser Arg Phe
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Ala Thr Ser Phe Lys Asp Tyr Phe Lys Asn Arg Ala Asn Cys Phe Ser
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Ala Asp Asp Ile Ser Ser Ser Ser Cys His Arg Ile Val Asn Asp Asn
180 185 190
Ala Glu Ile Phe Phe Ser Asn Ala Leu Val Tyr Arg Arg Ile Val Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Asn Asp Asp Ile Asn Lys Ile Ser Gly Asp Met Lys Asp
210 215 220
Ser Leu Lys Glu Met Ser Leu Glu Glu Ile Tyr Ser Tyr Glu Lys Tyr
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Gly Glu Phe Ile Thr Gln Glu Gly Ile Ser Phe Tyr Asn Asp Ile Cys
245 250 255
Gly Lys Val Asn Ser Phe Met Asn Leu Tyr Cys Gln Lys Asn Lys Glu
260 265 270
Asn Lys Asn Leu Tyr Lys Leu Gln Lys Leu His Lys Gln Ile Leu Cys
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His Ile Val Glu Arg Leu Arg Lys Ile Gly Asp Asn Tyr Asn Gly Tyr
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Asn Leu Asp Lys Ile Tyr Ile Val Ser Lys Phe Tyr Glu Ser Val Ser
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Gln Lys Thr Tyr Arg Asp Trp Glu Thr Ile Asn Thr Ala Leu Glu Ile
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435 440 445
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Asn Asn Phe Tyr Ala Glu Leu Glu Glu Ile Tyr Asp Glu Ile Tyr Pro
485 490 495
Val Ile Ser Leu Tyr Asn Leu Val Arg Asn Tyr Val Thr Gln Lys Pro
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Met Arg Asp Asn Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Phe Asn Ala Lys Asn Lys
545 550 555 560
Pro Asp Lys Lys Ile Ile Glu Gly Asn Thr Ser Glu Asn Lys Gly Asp
565 570 575
Tyr Lys Lys Met Ile Tyr Asn Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met Ile
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Pro Lys Val Phe Leu Ser Ser Lys Thr Gly Val Glu Thr Tyr Lys Pro
595 600 605
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610 615 620
Ser Lys Asp Phe Asp Ile Thr Phe Cys His Asp Leu Ile Asp Tyr Phe
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Lys Asn Cys Ile Ala Ile His Pro Glu Trp Lys Asn Phe Gly Phe Asp
645 650 655
Phe Ser Asp Thr Ser Thr Tyr Glu Asp Ile Ser Gly Phe Tyr Arg Glu
660 665 670
Val Glu Leu Gln Gly Tyr Lys Ile Asp Trp Thr Tyr Ile Ser Glu Lys
675 680 685
Asp Ile Asp Leu Leu Gln Glu Lys Gly Gln Leu Tyr Leu Phe Gln Ile
690 695 700
Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Lys Lys Ser Thr Gly Asn Asp Asn Leu His
705 710 715 720
Thr Met Tyr Leu Lys Asn Leu Phe Ser Glu Glu Asn Leu Lys Asp Ile
725 730 735
Val Leu Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Ile Phe Phe Arg Lys Ser Ser
740 745 750
Ile Lys Asn Pro Ile Ile His Lys Lys Gly Ser Ile Leu Val Asn Arg
755 760 765
Thr Tyr Glu Ala Glu Glu Lys Asp Gln Phe Gly Asn Ile Gln Ile Val
770 775 780
Arg Lys Asn Ile Pro Glu Asn Ile Tyr Gln Glu Leu Tyr Lys Tyr Phe
785 790 795 800
Asn Asp Lys Ser Asp Lys Glu Leu Ser Asp Glu Ala Ala Lys Leu Lys
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Asn Val Val Gly His His Glu Ala Ala Thr Asn Ile Val Lys Asp Tyr
820 825 830
Arg Tyr Thr Tyr Asp Lys Tyr Phe Leu His Met Pro Ile Thr Ile Asn
835 840 845
Phe Lys Ala Asn Lys Thr Gly Phe Ile Asn Asp Arg Ile Leu Gln Tyr
850 855 860
Ile Ala Lys Glu Lys Asp Leu His Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu
865 870 875 880
Arg Asn Leu Ile Tyr Val Ser Val Ile Asp Thr Cys Gly Asn Ile Val
885 890 895
Glu Gln Lys Ser Phe Asn Ile Val Asn Gly Tyr Asp Tyr Gln Ile Lys
900 905 910
Leu Lys Gln Gln Glu Gly Ala Arg Gln Ile Ala Arg Lys Glu Trp Lys
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Glu Ile Gly Lys Ile Lys Glu Ile Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Leu Val
930 935 940
Ile His Glu Ile Ser Lys Met Val Ile Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Ala
945 950 955 960
Met Glu Asp Leu Ser Tyr Gly Phe Lys Lys Gly Arg Phe Lys Val Glu
965 970 975
Arg Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu Thr Met Leu Ile Asn Lys Leu Asn
980 985 990
Tyr Leu Val Phe Lys Asp Ile Ser Ile Thr Glu Asn Gly Gly Leu Leu
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Gly His Gln Cys Gly Cys Ile Phe Tyr Val Pro Ala Ala Tyr Thr
1025 1030 1035
Ser Lys Ile Asp Pro Thr Thr Gly Phe Val Asn Ile Phe Lys Phe
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Phe Asp Tyr Asn Asn Phe Ile Thr Gln Asn Thr Val Met Ser Lys
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Ser Ser Trp Ser Val Tyr Thr Tyr Gly Val Arg Ile Lys Arg Arg
1100 1105 1110
Phe Val Asn Gly Arg Phe Ser Asn Glu Ser Asp Thr Ile Asp Ile
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Thr Lys Asp Met Glu Lys Thr Leu Glu Met Thr Asp Ile Asn Trp
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Arg Asp Gly His Asp Leu Arg Gln Asp Ile Ile Asp Tyr Glu Ile
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Val Gln His Ile Phe Glu Ile Phe Arg Leu Thr Val Gln Met Arg
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Ser Pro Val Leu Asn Glu Asn Asn Ile Phe Tyr Asp Ser Ala Lys
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Ala Gly Asp Ala Leu Pro Lys Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr
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1220 1225 1230
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Ser Asn Lys Asp Trp Phe Asp Phe Ile Gln Asn Lys Arg Tyr Leu
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<211> 3789
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 86
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tactatagag gatttatttc cgagacactg tcaagcattg atgatatcga ttggacttca 240
ctttttgaga agatggaaat tcagctgaag aatggcgata acaaagatac tcttattaag 300
gaacaaacag agtatcgcaa agcaatacac aaaaagtttg ctaatgacga tagattcaag 360
aatatgttct cagcgaagct gatttccgat attctccccg agtttgtgat tcacaacaat 420
aattactcgg cttctgagaa agaggaaaaa actcaggtta taaagttatt ctcacgcttt 480
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tcctcatcat cctgtcaccg gattgttaac gataatgcgg aaatcttttt cagcaacgct 600
ctagtttaca gacgcattgt caaatcgctg tcgaacgatg atattaacaa gatcagcggc 660
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cacattgttg aaaggcttcg gaaaattgga gacaattaca atgggtacaa cttagacaag 1020
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<210> 87
<211> 3789
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 87
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ctcaggaacg ccctcattcc aacagagacc acacaacagt tcatcgtcaa gaacgggatc 120
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<210> 95
<211> 3789
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 95
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<220>
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<223> δ变形细菌（deltaproteobacterium）
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485 490 495
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675 680 685
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agtgatggtc acagtattca gtataggaat ttactagcat ggaaatacct tgagaacggc 1620
aagagagagt tctacttact aatgaattac ggcaagaaag gcaggattcg ctttaccgat 1680
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tccgggaaac agccattcgt tggtgcctgg caggccttct acaaaagaag actcaaagaa 2940
gtctggaagc ccaacgcc 2958
<210> 108
<211> 2958
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 108
atggaaaaga ggatcaacaa gattaggaag aaactctctg ccgacaacgc caccaagccc 60
gtgtcccgtt ctgggcccat gaaaaccctc ctcgtcaggg ttatgaccga cgacctcaag 120
aaaaggcttg agaaaagaag gaagaagcct gaggtgatgc cccaggttat ctccaacaac 180
gccgcaaata atttgaggat gctcttggac gactatacca agatgaaaga ggctatactc 240
caagtctatt ggcaggagtt caaagatgac cacgtggggc tcatgtgcaa gttcgcccag 300
cccgccagca agaaaatcga ccagaacaag ctcaagcccg agatggacga gaagggcaac 360
ctcaccaccg ccggtttcgc ctgctcccag tgtgggcagc ccctcttcgt ttacaaactc 420
gagcaggtga gcgagaaggg caaagcctac accaactact tcggcagatg caacgtcgct 480
gagcacgaga agctcatcct cctcgcccaa ctcaagccag agaaggactc cgatgaggcc 540
gtgacctaca gcctcgggaa gtttggacag agagcccttg atttctacag catccacgtg 600
accaaagagt ccacccaccc agtgaagccc ctcgcccaaa tcgccggaaa caggtacgcc 660
tctgggcctg tcgggaaggc tctctccgac gcctgcatgg gcacaatcgc cagcttcttg 720
agcaagtacc aggacatcat catcgaacac cagaaagtgg tgaaggggaa ccagaaaagg 780
ctcgagtccc tcagagaatt ggccggtaag gagaacctcg agtaccccag cgtgaccctc 840
cccccccaac cccataccaa agagggtgtc gatgcatata acgaggtcat cgccagggtc 900
agaatgtggg tcaacctcaa tctctggcag aagttgaaac tcagtaggga tgacgctaaa 960
cccctcttga ggctcaaggg gtttcccagc ttccccgttg tggagaggag ggagaatgag 1020
gtcgactggt ggaacaccat caacgaggtg aagaagttga tcgacgccaa gagggacatg 1080
gggagggtgt tctggtccgg cgtgaccgcc gagaaaagga acaccatctt ggagggttac 1140
aactacctcc ccaacgagaa tgaccacaaa aagagggagg ggtccctcga aaaccccaaa 1200
aaacccgcca agaggcagtt cggggacctc cttctctatt tggaaaagaa gtacgccgga 1260
gactggggga aagtctttga tgaggcctgg gagaggattg acaagaagat cgcagggttg 1320
accagccaca tcgagaggga agaggccagg aacgccgaag acgcccagtc caaggccgtt 1380
ctcactgact ggttgagggc caaggcctct ttcgtgctcg agaggctcaa ggagatggac 1440
gaaaaggaat tttatgcctg cgagatccaa ctccagaaat ggtacggcga tctcaggggc 1500
aacccatttg ccgtcgaggc cgaaaatagg gtggttgaca tatccgggtt ctctatcggc 1560
tccgacgggc actccatcca gtacaggaac ctcctcgcct ggaagtacct cgaaaacgga 1620
aagagggagt tttacttgct catgaattat ggcaagaagg gcaggattag gtttaccgac 1680
ggaaccgaca taaaaaagag cggcaagtgg caaggcctcc tctacggggg gggcaaagcc 1740
aaggtcatcg acctcacctt cgaccccgac gacgagcagc tcatcatact tcccctcgcc 1800
ttcggcacca gacaggggag ggaattcatt tggaacgacc tcttgtccct cgagaccggc 1860
ctcatcaaac tcgctaatgg cagagtgatc gaaaagacta tctacaacaa gaagatcggg 1920
agggacgagc ctgccctctt cgtggctctt acattcgaga gaagggaggt tgtggatccc 1980
tccaatatca agcccgtcaa cctcataggc gtcgacaggg gggagaatat ccccgccgtc 2040
atagccctca ccgaccccga ggggtgtccc ctccccgagt tcaaagactc ctccggcggc 2100
cccaccgaca tactcaggat aggggagggg tacaaggaga aacagagagc catacaggca 2160
gccaaggagg tcgagcagag gagggcaggc ggttacagca ggaagttcgc ctccaaatcc 2220
agaaacctcg ccgacgatat ggtcagaaac tccgcaaggg atctctttta ccacgctgtg 2280
acccatgacg ccgtgctcgt gttcgaaaac ctctccaggg gattcggcag gcaaggtaaa 2340
aggaccttca tgaccgagag gcagtacacc aaaatggagg actggctcac tgccaaattg 2400
gcctacgagg gtctcaccag taaaacatac ttgtccaaaa ctctcgccca gtatacctcc 2460
aagacatgct ccaattgcgg gtttaccata accactgccg actatgatgg catgttggtc 2520
aggcttaaga agacctccga cgggtgggcc actaccctca ataataagga gttgaaggcc 2580
gaaggccaga tcacctacta caataggtac aagaggcaaa ctgttgagaa ggaactctca 2640
gccgaactcg acagactctc cgaggagtcc ggcaacaacg acatctccaa gtggaccaaa 2700
gggagaaggg acgaagccct tttccttctt aagaaaagat tttcacacag gcccgtccag 2760
gagcagttcg tctgcttgga ctgtggccat gaagtgcacg ccgacgagca ggctgccctc 2820
aatatcgcca ggagctggct cttcctcaat agcaacagca ccgagtttaa gagttacaag 2880
agcggcaagc aacccttcgt cggggcctgg caggctttct ataagaggag acttaaggag 2940
gtttggaagc caaatgcc 2958
<210> 109
<211> 531
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 109
Glu Ala Ser Gly Ser Gly Arg Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
1 5 10 15
Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
20 25 30
Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp
35 40 45
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Ile Asn Ser Arg Ser Ser
50 55 60
Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ser Gln Tyr Leu Pro Asp
65 70 75 80
Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu Glu Lys Arg Lys Arg Thr Tyr Glu
85 90 95
Thr Phe Lys Ser Ile Met Lys Lys Ser Pro Phe Ser Gly Pro Thr Asp
100 105 110
Pro Arg Pro Pro Pro Arg Arg Ile Ala Val Pro Ser Arg Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Val Pro Lys Pro Ala Pro Gln Pro Tyr Pro Phe Thr Ser Ser Leu
130 135 140
Ser Thr Ile Asn Tyr Asp Glu Phe Pro Thr Met Val Phe Pro Ser Gly
145 150 155 160
Gln Ile Ser Gln Ala Ser Ala Leu Ala Pro Ala Pro Pro Gln Val Leu
165 170 175
Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Met Val Ser Ala Leu
180 185 190
Ala Gln Ala Pro Ala Pro Val Pro Val Leu Ala Pro Gly Pro Pro Gln
195 200 205
Ala Val Ala Pro Pro Ala Pro Lys Pro Thr Gln Ala Gly Glu Gly Thr
210 215 220
Leu Ser Glu Ala Leu Leu Gln Leu Gln Phe Asp Asp Glu Asp Leu Gly
225 230 235 240
Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp Pro Ala Val Phe Thr Asp Leu Ala
245 250 255
Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu Asn Gln Gly Ile Pro
260 265 270
Val Ala Pro His Thr Thr Glu Pro Met Leu Met Glu Tyr Pro Glu Ala
275 280 285
Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ala Gln Arg Pro Pro Asp Pro Ala Pro
290 295 300
Ala Pro Leu Gly Ala Pro Gly Leu Pro Asn Gly Leu Leu Ser Gly Asp
305 310 315 320
Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp Met Asp Phe Ser Ala Leu Leu Gly
325 330 335
Ser Gly Ser Gly Ser Arg Asp Ser Arg Glu Gly Met Phe Leu Pro Lys
340 345 350
Pro Glu Ala Gly Ser Ala Ile Ser Asp Val Phe Glu Gly Arg Glu Val
355 360 365
Cys Gln Pro Lys Arg Ile Arg Pro Phe His Pro Pro Gly Ser Pro Trp
370 375 380
Ala Asn Arg Pro Leu Pro Ala Ser Leu Ala Pro Thr Pro Thr Gly Pro
385 390 395 400
Val His Glu Pro Val Gly Ser Leu Thr Pro Ala Pro Val Pro Gln Pro
405 410 415
Leu Asp Pro Ala Pro Ala Val Thr Pro Glu Ala Ser His Leu Leu Glu
420 425 430
Asp Pro Asp Glu Glu Thr Ser Gln Ala Val Lys Ala Leu Arg Glu Met
435 440 445
Ala Asp Thr Val Ile Pro Gln Lys Glu Glu Ala Ala Ile Cys Gly Gln
450 455 460
Met Asp Leu Ser His Pro Pro Pro Arg Gly His Leu Asp Glu Leu Thr
465 470 475 480
Thr Thr Leu Glu Ser Met Thr Glu Asp Leu Asn Leu Asp Ser Pro Leu
485 490 495
Thr Pro Glu Leu Asn Glu Ile Leu Asp Thr Phe Leu Asn Asp Glu Cys
500 505 510
Leu Leu His Ala Met His Ile Ser Thr Gly Leu Ser Ile Phe Asp Thr
515 520 525
Ser Leu Phe
530
<210> 110
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是赖氨酸、组氨酸或精氨酸
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、组氨酸或精氨酸
<220>
<221> 变体
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是赖氨酸、组氨酸或精氨酸
<220>
<221> 变体
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是赖氨酸、组氨酸或精氨酸
<220>
<221> 变体
<222> (19)..(19)
<223> Xaa是赖氨酸、组氨酸或精氨酸
<400> 110
Gly Leu Phe Xaa Ala Leu Leu Xaa Leu Leu Xaa Ser Leu Trp Xaa Leu
1 5 10 15
Leu Leu Xaa Ala
20
<210> 111
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 111
Gly Leu Phe His Ala Leu Leu His Leu Leu His Ser Leu Trp His Leu
1 5 10 15
Leu Leu His Ala
20
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> 猿猴病毒 40
<400> 112
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 113
<211> 23
<212> PRT
<213> 玉蜀黍（Zea mays）
<400> 113
Arg Lys Arg Lys Glu Ser Asn Arg Glu Ser Ala Arg Arg Ser Arg Arg
1 5 10 15
Ser Arg Tyr Arg Lys Lys Val
20
<210> 114
<211> 14
<212> PRT
<213> 猿猴病毒 40
<400> 114
Ala Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒1型
<400> 115
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 116
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 116
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 117
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 117
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 118
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 118
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 119
<211> 18
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 细菌
<400> 119
atttctacta ttgtagat 18
<210> 120
<211> 707
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 噬菌体
<400> 120
Met Ala Asp Thr Pro Thr Leu Phe Thr Gln Phe Leu Arg His His Leu
1 5 10 15
Pro Gly Gln Arg Phe Arg Lys Asp Ile Leu Lys Gln Ala Gly Arg Ile
20 25 30
Leu Ala Asn Lys Gly Glu Asp Ala Thr Ile Ala Phe Leu Arg Gly Lys
35 40 45
Ser Glu Glu Ser Pro Pro Asp Phe Gln Pro Pro Val Lys Cys Pro Ile
50 55 60
Ile Ala Cys Ser Arg Pro Leu Thr Glu Trp Pro Ile Tyr Gln Ala Ser
65 70 75 80
Val Ala Ile Gln Gly Tyr Val Tyr Gly Gln Ser Leu Ala Glu Phe Glu
85 90 95
Ala Ser Asp Pro Gly Cys Ser Lys Asp Gly Leu Leu Gly Trp Phe Asp
100 105 110
Lys Thr Gly Val Cys Thr Asp Tyr Phe Ser Val Gln Gly Leu Asn Leu
115 120 125
Ile Phe Gln Asn Ala Arg Lys Arg Tyr Ile Gly Val Gln Thr Lys Val
130 135 140
Thr Asn Arg Asn Glu Lys Arg His Lys Lys Leu Lys Arg Ile Asn Ala
145 150 155 160
Lys Arg Ile Ala Glu Gly Leu Pro Glu Leu Thr Ser Asp Glu Pro Glu
165 170 175
Ser Ala Leu Asp Glu Thr Gly His Leu Ile Asp Pro Pro Gly Leu Asn
180 185 190
Thr Asn Ile Tyr Cys Tyr Gln Gln Val Ser Pro Lys Pro Leu Ala Leu
195 200 205
Ser Glu Val Asn Gln Leu Pro Thr Ala Tyr Ala Gly Tyr Ser Thr Ser
210 215 220
Gly Asp Asp Pro Ile Gln Pro Met Val Thr Lys Asp Arg Leu Ser Ile
225 230 235 240
Ser Lys Gly Gln Pro Gly Tyr Ile Pro Glu His Gln Arg Ala Leu Leu
245 250 255
Ser Gln Lys Lys His Arg Arg Met Arg Gly Tyr Gly Leu Lys Ala Arg
260 265 270
Ala Leu Leu Val Ile Val Arg Ile Gln Asp Asp Trp Ala Val Ile Asp
275 280 285
Leu Arg Ser Leu Leu Arg Asn Ala Tyr Trp Arg Arg Ile Val Gln Thr
290 295 300
Lys Glu Pro Ser Thr Ile Thr Lys Leu Leu Lys Leu Val Thr Gly Asp
305 310 315 320
Pro Val Leu Asp Ala Thr Arg Met Val Ala Thr Phe Thr Tyr Lys Pro
325 330 335
Gly Ile Val Gln Val Arg Ser Ala Lys Cys Leu Lys Asn Lys Gln Gly
340 345 350
Ser Lys Leu Phe Ser Glu Arg Tyr Leu Asn Glu Thr Val Ser Val Thr
355 360 365
Ser Ile Asp Leu Gly Ser Asn Asn Leu Val Ala Val Ala Thr Tyr Arg
370 375 380
Leu Val Asn Gly Asn Thr Pro Glu Leu Leu Gln Arg Phe Thr Leu Pro
385 390 395 400
Ser His Leu Val Lys Asp Phe Glu Arg Tyr Lys Gln Ala His Asp Thr
405 410 415
Leu Glu Asp Ser Ile Gln Lys Thr Ala Val Ala Ser Leu Pro Gln Gly
420 425 430
Gln Gln Thr Glu Ile Arg Met Trp Ser Met Tyr Gly Phe Arg Glu Ala
435 440 445
Gln Glu Arg Val Cys Gln Glu Leu Gly Leu Ala Asp Gly Ser Ile Pro
450 455 460
Trp Asn Val Met Thr Ala Thr Ser Thr Ile Leu Thr Asp Leu Phe Leu
465 470 475 480
Ala Arg Gly Gly Asp Pro Lys Lys Cys Met Phe Thr Ser Glu Pro Lys
485 490 495
Lys Lys Lys Asn Ser Lys Gln Val Leu Tyr Lys Ile Arg Asp Arg Ala
500 505 510
Trp Ala Lys Met Tyr Arg Thr Leu Leu Ser Lys Glu Thr Arg Glu Ala
515 520 525
Trp Asn Lys Ala Leu Trp Gly Leu Lys Arg Gly Ser Pro Asp Tyr Ala
530 535 540
Arg Leu Ser Lys Arg Lys Glu Glu Leu Ala Arg Arg Cys Val Asn Tyr
545 550 555 560
Thr Ile Ser Thr Ala Glu Lys Arg Ala Gln Cys Gly Arg Thr Ile Val
565 570 575
Ala Leu Glu Asp Leu Asn Ile Gly Phe Phe His Gly Arg Gly Lys Gln
580 585 590
Glu Pro Gly Trp Val Gly Leu Phe Thr Arg Lys Lys Glu Asn Arg Trp
595 600 605
Leu Met Gln Ala Leu His Lys Ala Phe Leu Glu Leu Ala His His Arg
610 615 620
Gly Tyr His Val Ile Glu Val Asn Pro Ala Tyr Thr Ser Gln Thr Cys
625 630 635 640
Pro Val Cys Arg His Cys Asp Pro Asp Asn Arg Asp Gln His Asn Arg
645 650 655
Glu Ala Phe His Cys Ile Gly Cys Gly Phe Arg Gly Asn Ala Asp Leu
660 665 670
Asp Val Ala Thr His Asn Ile Ala Met Val Ala Ile Thr Gly Glu Ser
675 680 685
Leu Lys Arg Ala Arg Gly Ser Val Ala Ser Lys Thr Pro Gln Pro Leu
690 695 700
Ala Ala Glu
705
<210> 121
<211> 2121
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 121
atggcagata cgcccactct ttttacacag tttctcaggc atcacttacc tggtcaacgg 60
ttccgtaagg acatcttgaa gcaagctgga cgtattcttg ccaacaaggg agaggatgct 120
accatcgcat ttcttagggg taagtctgaa gaaagtcccc cagattttca acctccagtt 180
aaatgcccta tcattgcttg cagcagacca ttgactgaat ggcctatata ccaggcaagt 240
gtggcaatcc aaggatacgt ctacggccaa agtcttgctg agtttgaagc aagtgatccc 300
ggatgttcaa aggatgggct attgggctgg ttcgataaga ccggagtttg tactgactac 360
ttttcagttc aaggtttgaa cttaatattc cagaatgctc gtaaaagata cattggagtc 420
cagaccaagg ttacgaatag aaatgaaaaa cgccacaaga aattaaagag aatcaacgcc 480
aagagaatag cagagggctt gccagagcta acttcagatg agccagaatc cgctctagac 540
gaaacgggac atttgatcga cccacctggg ttgaacacca atatctattg ttaccagcag 600
gtcagcccca agccattggc tctgtcagaa gtgaaccaat tgccgactgc atacgcgggt 660
tactctacgt ccggtgatga tcccattcaa cccatggtta cgaaggaccg cttaagtatc 720
tctaagggac aaccaggata tatccccgaa caccaaagag cactcctctc tcaaaaaaag 780
cacagacgca tgagagggta cgggttaaag gcccgcgctt tacttgtgat cgtgcgaatt 840
caagatgatt gggcagttat tgaccttaga tccttgttga gaaacgcata ctggagaaga 900
attgttcaga ctaaagaacc ttcgacgatt acaaaacttt taaagttagt tacaggggac 960
cccgttctcg atgcaacacg gatggttgct acattcactt acaagcctgg aatagtgcag 1020
gttagaagtg caaagtgtct caagaataag caaggaagta aattgttctc tgagaggtat 1080
ctcaacgaga cagtttcggt tacttcaatt gacctcggat cgaataattt agttgctgtt 1140
gcaacatata gattggttaa tggtaacaca ccagaacttc ttcaaaggtt taccttacca 1200
tcacacttgg ttaaggattt cgagagatat aagcaagcgc acgacacttt ggaggatagc 1260
atccagaaaa ctgctgtagc gtccttaccg cagggacagc aaacagaaat aagaatgtgg 1320
tcgatgtacg gattcagaga ggcacaagaa agggtgtgcc aagagttggg gctagccgac 1380
ggatcaatcc catggaatgt gatgacggca acttcgacca ttttgactga tctgttcctc 1440
gcgagaggcg gggaccctaa aaagtgtatg ttcacatccg aacctaaaaa aaaaaagaat 1500
agcaaacaag tcttgtataa gatccgcgat cgggcttggg caaaaatgta tcgtacatta 1560
ctctccaagg agacccgcga agcatggaat aaagccttgt gggggcttaa gagaggtagt 1620
cctgattacg cccgcttatc aaaacgtaaa gaagagctcg ctaggcgttg tgtgaactac 1680
acgatttcta ctgctgaaaa gagggcccag tgcggacgta caattgttgc actcgaggac 1740
ttgaacatcg ggttcttcca cggtagaggg aagcaagagc ctggatgggt tggtttgttc 1800
acaaggaaaa aggagaatcg ctggttgatg caggctcttc acaaagcttt tttggagctc 1860
gcgcatcata ggggctacca tgtcattgag gttaaccccg cttacacgag tcagacttgc 1920
cccgtttgtc gtcactgtga tccagataac cgggatcaac ataataggga agcatttcat 1980
tgtattggtt gcggattcag aggcaacgca gatttggacg ttgctaccca caacattgcg 2040
atggtggcta taactggaga gtcattgaaa agggccagag ggtctgttgc atcaaagacc 2100
cctcagccat tagcggctga g 2121
<210> 122
<211> 2121
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 122
atggccgaca cccctaccct cttcactcag ttcctcaggc accacttgcc agggcagagg 60
tttaggaagg acatcctcaa acaggccggg aggattctcg ccaacaaggg tgaggacgcc 120
accatcgcct tcctcagggg caagtccgag gagtcccccc cagactttca gcccccagtg 180
aagtgcccaa tcatcgcctg cagcaggccc ttgactgagt ggcccatcta ccaggccagc 240
gtcgccatcc agggatacgt gtacgggcag agcctcgccg agttcgaggc cagcgaccct 300
ggatgctcta aggacggcct cctcggttgg ttcgacaaaa ccggcgtgtg caccgactac 360
ttttccgtgc aagggctcaa ccttatcttc caaaacgcca gaaagaggta cattggagtc 420
cagactaaag tgaccaacag gaacgagaaa aggcacaaaa agctcaaaag gatcaatgcc 480
aagaggatcg ccgagggcct ccccgagctc acctccgatg agcctgagtc cgccctcgac 540
gagactgggc acctcatcga ccctcctggt ctcaacacca acatctattg ctaccagcaa 600
gtgtctccca agccactcgc cttgagcgaa gtgaaccaac tccccacagc ttacgcaggc 660
tacagcacat ccggtgacga tcccatccag cccatggtca ccaaggacag gctcagtatc 720
agcaagggtc agcccgggta catccccgag caccagaggg ccctcctcag ccagaaaaaa 780
cacaggagaa tgagaggcta cggactcaaa gctagggccc ttctcgtgat cgtgagaata 840
caggacgact gggccgtcat cgacctcagg agcctcctca ggaacgccta ctggagaagg 900
atcgttcaga caaaggagcc ctccaccatc accaaacttc tcaaattggt caccggggac 960
cccgtcctcg acgccaccag gatggtggcc acattcacct ataagcctgg gattgtccag 1020
gtgaggagtg ccaagtgcct caagaacaag caggggagca aactcttcag cgagagatac 1080
ttgaacgaaa ccgtttccgt gacctccatc gatttgggga gcaacaacct cgtggccgtt 1140
gccacataca gactcgttaa tggaaacacc cccgagttgc tccagagatt caccttgcct 1200
tcacatttgg ttaaggattt tgagaggtac aagcaagccc atgacaccct cgaggatagc 1260
atccagaaga ccgccgttgc ctccctcccc caggggcagc agactgagat cagaatgtgg 1320
agcatgtacg gctttagaga agcccaggag agggtttgcc aggagctcgg cctcgccgac 1380
ggcagcatcc cctggaacgt tatgactgcc accagcacca tactcaccga cctcttcctc 1440
gccagaggcg gcgatcccaa gaagtgcatg tttacatccg agcccaagaa gaagaagaac 1500
agcaagcagg tcctctacaa gatcagggac agggcttggg ccaagatgta cagaaccctc 1560
ctcagcaagg agaccaggga ggcctggaat aaagctctct ggggcctcaa gagggggagc 1620
cccgattacg ccaggctcag taagaggaag gaggagttgg caaggaggtg cgtgaattac 1680
actattagca ctgccgagaa gagagcccag tgtggtagga ctatcgtcgc cttggaagac 1740
ctcaacatcg gcttctttca tggcagaggc aaacaagagc ctggttgggt cgggctcttt 1800
accaggaaga aagagaacag gtggctcatg caggctctcc acaaggcctt cctcgaactc 1860
gctcatcaca ggggctacca cgtcatcgaa gtgaatcccg cttacaccag ccaaacctgc 1920
ccagtttgca ggcactgtga tcccgacaat agggaccagc acaacaggga ggcttttcat 1980
tgtatcggct gcgggttcag aggaaacgcc gatctcgacg tcgcaacaca caatatcgcc 2040
atggttgcca tcacaggaga atccctcaaa agggcaaggg ggagcgtggc ctctaagact 2100
ccccagcccc ttgctgccga a 2121
<210> 123
<211> 2121
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 123
atggccgaca ccccaactct cttcactcag ttcctcagac accacttgcc cggacagagg 60
ttcaggaaag acatcctcaa gcaggccggc aggattctcg ccaacaaggg ggaggatgcc 120
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atccagaaga ccgccgtggc ctccctcccc caggggcagc agacagagat cagaatgtgg 1320
tccatgtacg gcttcagaga ggcccaagag agggtgtgcc aagagctcgg gctcgccgac 1380
ggctctatcc cctggaacgt gatgaccgcc acttcaacca tcttgaccga cctcttcctc 1440
gcacggggag gggatcccaa gaaatgtatg ttcacctccg agcccaaaaa gaaaaagaat 1500
tccaagcagg tgctttacaa gatcagggac agggcctggg caaagatgta taggaccctc 1560
ctctcaaagg aaaccaggga ggcttggaat aaggccctct ggggcctcaa gaggggatcc 1620
cccgactacg ccaggctcag caaaaggaaa gaggagctcg ccaggaggtg cgtgaactac 1680
acaatttcca ccgctgagaa gagggcccaa tgcggcagaa ccatcgttgc ccttgaagac 1740
ctcaacatcg ggttcttcca cggcagggga aagcaggagc caggttgggt cgggctcttc 1800
acaaggaaaa aagaaaacag atggctcatg caagcccttc acaaggcctt cctcgagctc 1860
gcacaccaca ggggatatca cgtgatcgaa gtgaaccccg cttacacctc ccagacctgc 1920
cctgtctgca gacactgtga ccccgacaac agagaccagc ataataggga agccttccac 1980
tgcatcggct gtgggtttag gggtaacgct gacctcgacg tcgctactca caacatcgcc 2040
atggtggcca tcacagggga gtctttgaag agggccagag gcagcgtggc cagtaagact 2100
ccccagccac ttgccgcaga g 2121
<210> 130
<211> 2121
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 130
atggcagaca cacccacact ttttacccag tttctcaggc accacttgcc cggacagaga 60
tttaggaagg acatcctcaa gcaagccggc aggatcttgg ccaacaaggg ggaggacgcc 120
actatcgcat tcctcagggg gaaatccgag gaatcacccc ctgacttcca gcccccagtc 180
aaatgtccaa tcattgcctg tagcaggcct ttgactgaat ggcccatata ccaggcatct 240
gtggccatcc aaggctacgt gtatggccag agcctcgctg agttcgaagc tagtgaccct 300
ggatgctcta aggacgggct cctcggctgg ttcgacaaga ctggtgtgtg cacagattac 360
ttcagcgttc agggactcaa tctcatcttc cagaacgcca ggaagaggta catcggggtg 420
cagaccaagg tgaccaacag gaacgagaag aggcacaaga agctcaagag gatcaatgcc 480
aagaggatcg ctgagggtct ccctgagctc acctccgacg agccagagtc cgccctcgat 540
gagaccggac acttgattga cccccccggg ctcaatacca acatctattg ctaccaacaa 600
gtgagcccca agcccctcgc cctctccgaa gtgaaccagc tccccaccgc ctacgcaggc 660
tactccacca gcggggacga ccccattcag cctatggtga ccaaggatag gttgagcatt 720
tctaaggggc agccaggcta catccctgag caccagaggg cccttctctc ccagaagaaa 780
cacaggagga tgagggggta cgggttgaag gcaagagcac tcctcgtgat tgttagaatt 840
caggacgact gggccgtcat cgacctcaga agcctcctca gaaacgccta ttggaggaga 900
atcgtccaaa ccaaggagcc cagcaccatc actaaacttc tcaagctcgt taccggtgac 960
cccgtgctcg atgcaaccag gatggtggcc accttcacct acaagcccgg gatcgtccag 1020
gtgaggagcg caaaatgtct caaaaacaag caggggtcca agctcttttc tgagagatac 1080
ctcaacgaga ccgtgtccgt gacctcaatc gatctcggga gcaataacct cgtcgccgtt 1140
gcaacctaca gactcgtgaa cgggaacacc cccgagctct tgcagaggtt cacccttccc 1200
agtcacttgg tcaaagattt tgagaggtac aaacaggccc atgacaccct cgaggattca 1260
atccagaaga ccgcagtcgc ctccctcccc cagggacagc aaaccgagat caggatgtgg 1320
agcatgtacg ggttcaggga agcccaggag agggtgtgtc aagagcttgg gctcgccgac 1380
ggctccatcc catggaatgt gatgaccgcc acctcaacca tcctcaccga cctctttctc 1440
gccagggggg gtgaccccaa gaagtgcatg tttacttccg agccaaagaa gaagaaaaac 1500
tccaagcagg tgttgtataa aataagggac agggcctggg ccaagatgta caggaccctc 1560
ctctccaagg agaccaggga ggcctggaac aaggccctct ggggcctcaa aaggggcagc 1620
cccgactacg ccagactctc caagaggaag gaagagctcg cccggaggtg cgtcaactat 1680
accattagca ctgccgagaa gagggcccag tgcggcagga ccatcgtggc cttggaggat 1740
ctcaacatcg gcttcttcca cgggaggggc aaacaggagc ccgggtgggt gggcttgttt 1800
accaggaaga aagaaaatag gtggcttatg caggccctcc acaaggcctt cctcgagctc 1860
gcacaccaca ggggctatca cgttatcgag gtcaaccccg cctataccag ccagacctgc 1920
ccagtctgca ggcactgcga ccccgacaac agggaccagc acaataggga ggctttccat 1980
tgcatcgggt gcggatttag gggcaacgcc gacctcgatg tggctacaca caatatcgcc 2040
atggttgcta tcaccggcga gagtctcaaa agggccaggg gatcagtcgc ctctaagacc 2100
ccccagcccc tcgccgccga g 2121
<210> 131
<211> 2121
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 131
atggccgaca cccccaccct tttcacacag tttttgaggc accacctccc cggacagagg 60
ttcaggaagg acattctcaa gcaagccggg aggatcctcg ccaacaaagg ggaggacgcc 120
accatcgcct tcttgagagg taagagcgag gagtcccccc ccgatttcca accccccgtg 180
aagtgtccca tcatcgcctg ctccaggccc ctcaccgagt ggcccatcta ccaggcctct 240
gtcgctatcc agggatatgt ttacgggcag agtcttgcag agttcgaggc cagcgacccc 300
ggatgtagta aggacggcct cctcggttgg ttcgacaaga ctggcgtctg caccgactat 360
tttagcgttc aggggctcaa tctcatcttc cagaacgcca gaaagaggta catcggcgtc 420
caaactaagg tgactaatag gaacgagaag aggcacaaga agctcaaaag aatcaacgcc 480
aagagaatcg ctgagggcct ccccgagctc accagcgacg agcccgagtc cgcactcgac 540
gagaccggcc atctcatcga cccccccggg ctcaacacaa acatctactg ctatcaacaa 600
gtctccccca aacccctcgc cttgtccgag gtgaaccaac ttcccacagc atacgctggc 660
tacagcacct ccggcgacga ccccatccag ccaatggtga ccaaagacag actctcaatc 720
agcaagggcc agcccggata catccctgag caccagaggg ccctcctctc ccagaagaag 780
cacaggagga tgaggggtta tggactcaag gctagggccc tcctcgtgat tgtgaggatc 840
caggacgact gggcagttat tgatctcagg agcctcctta ggaatgccta ctggagaagg 900
attgttcaaa ccaaggagcc tagcaccatc accaagctcc tcaagctcgt gaccggggat 960
cccgtcctcg acgccaccag aatggtggcc accttcacct acaaacctgg cattgtgcag 1020
gtcaggtctg ccaaatgctt gaagaacaag caggggtcca aactcttcag cgagaggtac 1080
ctcaacgaga ccgtttccgt cacctcaatc gatttggggt ccaacaacct cgtcgccgtc 1140
gccacctata ggctcgtgaa tggcaacacc ccagaattgc ttcagaggtt cacactccct 1200
tcccaccttg ttaaagactt tgaaagatac aagcaagccc acgacacact cgaggacagc 1260
atccaaaaga ccgccgtcgc ctctctcccc caaggacaac agaccgagat aaggatgtgg 1320
agcatgtatg ggttcaggga ggcccaggaa agggtttgcc aggagctcgg tttggcagac 1380
ggctccattc cctggaacgt gatgaccgcc acctccacca tcctcacaga cttgtttctc 1440
gccaggggag gagaccctaa gaagtgtatg ttcacctcag agcctaagaa aaagaaaaac 1500
tccaagcagg tcctctacaa gatcagggac agggcctggg ccaagatgta taggactctc 1560
ctctccaagg agaccaggga ggcatggaac aaggccctct ggggccttaa gaggggatcc 1620
cccgattatg ccaggctcag caagaggaag gaggagctcg ccaggagatg cgttaattat 1680
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ctcaatatcg ggttctttca cggcaggggt aagcaggaac ccgggtgggt gggccttttc 1800
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cccgtgtgca gacactgcga tcccgacaac agggatcagc acaacaggga agcctttcac 1980
tgcatcgggt gtgggttcag gggtaacgcc gacctcgatg tcgcaaccca caatatcgcc 2040
atggtggcta tcaccgggga gagcctcaag agggccagag gaagcgttgc ctcaaaaaca 2100
ccccagcccc tcgccgccga a 2121
<210> 132
<211> 757
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 噬菌体
<400> 132
Met Pro Lys Pro Ala Val Glu Ser Glu Phe Ser Lys Val Leu Lys Lys
1 5 10 15
His Phe Pro Gly Glu Arg Phe Arg Ser Ser Tyr Met Lys Arg Gly Gly
20 25 30
Lys Ile Leu Ala Ala Gln Gly Glu Glu Ala Val Val Ala Tyr Leu Gln
35 40 45
Gly Lys Ser Glu Glu Glu Pro Pro Asn Phe Gln Pro Pro Ala Lys Cys
50 55 60
His Val Val Thr Lys Ser Arg Asp Phe Ala Glu Trp Pro Ile Met Lys
65 70 75 80
Ala Ser Glu Ala Ile Gln Arg Tyr Ile Tyr Ala Leu Ser Thr Thr Glu
85 90 95
Arg Ala Ala Cys Lys Pro Gly Lys Ser Ser Glu Ser His Ala Ala Trp
100 105 110
Phe Ala Ala Thr Gly Val Ser Asn His Gly Tyr Ser His Val Gln Gly
115 120 125
Leu Asn Leu Ile Phe Asp His Thr Leu Gly Arg Tyr Asp Gly Val Leu
130 135 140
Lys Lys Val Gln Leu Arg Asn Glu Lys Ala Arg Ala Arg Leu Glu Ser
145 150 155 160
Ile Asn Ala Ser Arg Ala Asp Glu Gly Leu Pro Glu Ile Lys Ala Glu
165 170 175
Glu Glu Glu Val Ala Thr Asn Glu Thr Gly His Leu Leu Gln Pro Pro
180 185 190
Gly Ile Asn Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Gln Thr Ile Ser Pro Gln Ala
195 200 205
Tyr Arg Pro Arg Asp Glu Ile Val Leu Pro Pro Glu Tyr Ala Gly Tyr
210 215 220
Val Arg Asp Pro Asn Ala Pro Ile Pro Leu Gly Val Val Arg Asn Arg
225 230 235 240
Cys Asp Ile Gln Lys Gly Cys Pro Gly Tyr Ile Pro Glu Trp Gln Arg
245 250 255
Glu Ala Gly Thr Ala Ile Ser Pro Lys Thr Gly Lys Ala Val Thr Val
260 265 270
Pro Gly Leu Ser Pro Lys Lys Asn Lys Arg Met Arg Arg Tyr Trp Arg
275 280 285
Ser Glu Lys Glu Lys Ala Gln Asp Ala Leu Leu Val Thr Val Arg Ile
290 295 300
Gly Thr Asp Trp Val Val Ile Asp Val Arg Gly Leu Leu Arg Asn Ala
305 310 315 320
Arg Trp Arg Thr Ile Ala Pro Lys Asp Ile Ser Leu Asn Ala Leu Leu
325 330 335
Asp Leu Phe Thr Gly Asp Pro Val Ile Asp Val Arg Arg Asn Ile Val
340 345 350
Thr Phe Thr Tyr Thr Leu Asp Ala Cys Gly Thr Tyr Ala Arg Lys Trp
355 360 365
Thr Leu Lys Gly Lys Gln Thr Lys Ala Thr Leu Asp Lys Leu Thr Ala
370 375 380
Thr Gln Thr Val Ala Leu Val Ala Ile Asp Leu Gly Gln Thr Asn Pro
385 390 395 400
Ile Ser Ala Gly Ile Ser Arg Val Thr Gln Glu Asn Gly Ala Leu Gln
405 410 415
Cys Glu Pro Leu Asp Arg Phe Thr Leu Pro Asp Asp Leu Leu Lys Asp
420 425 430
Ile Ser Ala Tyr Arg Ile Ala Trp Asp Arg Asn Glu Glu Glu Leu Arg
435 440 445
Ala Arg Ser Val Glu Ala Leu Pro Glu Ala Gln Gln Ala Glu Val Arg
450 455 460
Ala Leu Asp Gly Val Ser Lys Glu Thr Ala Arg Thr Gln Leu Cys Ala
465 470 475 480
Asp Phe Gly Leu Asp Pro Lys Arg Leu Pro Trp Asp Lys Met Ser Ser
485 490 495
Asn Thr Thr Phe Ile Ser Glu Ala Leu Leu Ser Asn Ser Val Ser Arg
500 505 510
Asp Gln Val Phe Phe Thr Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ala Lys Lys Lys
515 520 525
Ala Pro Val Glu Val Met Arg Lys Asp Arg Thr Trp Ala Arg Ala Tyr
530 535 540
Lys Pro Arg Leu Ser Val Glu Ala Gln Lys Leu Lys Asn Glu Ala Leu
545 550 555 560
Trp Ala Leu Lys Arg Thr Ser Pro Glu Tyr Leu Lys Leu Ser Arg Arg
565 570 575
Lys Glu Glu Leu Cys Arg Arg Ser Ile Asn Tyr Val Ile Glu Lys Thr
580 585 590
Arg Arg Arg Thr Gln Cys Gln Ile Val Ile Pro Val Ile Glu Asp Leu
595 600 605
Asn Val Arg Phe Phe His Gly Ser Gly Lys Arg Leu Pro Gly Trp Asp
610 615 620
Asn Phe Phe Thr Ala Lys Lys Glu Asn Arg Trp Phe Ile Gln Gly Leu
625 630 635 640
His Lys Ala Phe Ser Asp Leu Arg Thr His Arg Ser Phe Tyr Val Phe
645 650 655
Glu Val Arg Pro Glu Arg Thr Ser Ile Thr Cys Pro Lys Cys Gly His
660 665 670
Cys Glu Val Gly Asn Arg Asp Gly Glu Ala Phe Gln Cys Leu Ser Cys
675 680 685
Gly Lys Thr Cys Asn Ala Asp Leu Asp Val Ala Thr His Asn Leu Thr
690 695 700
Gln Val Ala Leu Thr Gly Lys Thr Met Pro Lys Arg Glu Glu Pro Arg
705 710 715 720
Asp Ala Gln Gly Thr Ala Pro Ala Arg Lys Thr Lys Lys Ala Ser Lys
725 730 735
Ser Lys Ala Pro Pro Ala Glu Arg Glu Asp Gln Thr Pro Ala Gln Glu
740 745 750
Pro Ser Gln Thr Ser
755
<210> 133
<211> 2271
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 133
atgcctaagc ccgctgtgga gtctgaattc agcaaggttc tgaaaaaaca ctttcctggt 60
gaacgtttta gatccagtta catgaagcgc ggtggaaaaa tcttggcagc ccagggggag 120
gaagcagtag tcgcatacct acaaggtaag tccgaggagg agccgcctaa tttccaacca 180
ccagccaagt gtcatgtggt gacaaaaagt agagacttcg ctgaatggcc tattatgaaa 240
gcaagcgagg caatccagag gtatatttat gcgttgagca ccaccgaacg cgctgcatgc 300
aaacctggca agtcctcgga gtcccacgcc gcctggtttg ctgctacggg ggtttctaat 360
cacgggtatt cacatgtaca aggactgaat ttgattttcg atcacacttt gggaagatac 420
gatggtgtcc ttaaaaaggt ccaactgaga aatgagaagg ccagggcacg ccttgagtct 480
ataaacgctt cacgcgcgga tgaaggactg cctgagataa aggctgaaga agaggaagtt 540
gctaccaacg agacgggaca cttgttgcaa cctccgggga tcaatccttc attctatgtt 600
taccaaacga tatctcctca agcttacaga ccacgtgacg aaatagtgtt accccctgaa 660
tatgccggtt atgttagaga tccaaacgca ccaatccctc taggagttgt tagaaacagg 720
tgtgatattc aaaagggatg tccaggttat ataccagagt ggcagagaga ggctggcact 780
gcgattagtc ctaaaactgg caaagcggtg acggttcctg ggttgagtcc aaaaaagaac 840
aagcgcatgc gccgctattg gagaagtgaa aaggagaaag cccaggatgc attgcttgtg 900
actgtcagga ttggcactga ttgggtcgta attgatgtga gaggtctgtt gcgtaacgcg 960
cgatggagaa caattgctcc taaggatatc tcgctcaatg ccctgctcga cttgttcact 1020
ggagatcccg tcatagacgt caggaggaat atagttacat tcacatacac actggacgcc 1080
tgcggtactt acgcacgtaa gtggactctt aaagggaagc aaaccaaagc tactttggac 1140
aaattgacgg caacacagac agtcgcattg gtggccatcg atttgggcca aacaaatcct 1200
atttctgctg gaatctcgag ggtgacacaa gagaacggtg ccctccagtg tgaaccctta 1260
gaccggttca ctcttccaga cgatcttctg aaggacatta gtgcttacag aattgcttgg 1320
gataggaacg aagaagagtt gagggctaga agtgtggagg ctctgcccga agcacagcag 1380
gccgaagtca gagctctcga tggagtgtca aaggaaaccg cgagaacaca gctctgcgca 1440
gattttggcc ttgaccccaa gaggttgccc tgggacaaga tgtcctccaa cacaactttc 1500
attagcgagg cactgttgtc aaacagcgtt tcccgcgatc aggtattttt tactcctgcc 1560
ccaaagaaag gagcaaagaa gaaggctcct gttgaggtta tgcgcaagga caggacctgg 1620
gcgagggctt acaagccaag gctaagcgtg gaagcacaga agcttaagaa tgaagcgctt 1680
tgggctctga agaggacttc accagagtac cttaagctct caagacgaaa agaagaattg 1740
tgtcggagga gcataaatta tgttatcgaa aagactcgga gaagaactca gtgtcagatc 1800
gttattcccg tgatagagga tttgaatgtt cgatttttcc atggctcagg caagagattg 1860
cctggttggg ataatttttt cactgctaag aaggaaaacc gttggttcat acaaggtttg 1920
cataaggcct tctcagactt gcgtacccac cgctcgttct acgtttttga ggtgagacca 1980
gaacgtactt caattacttg tcctaaatgc ggccattgcg aggttggaaa cagagatggt 2040
gaagcattcc aatgtctgtc gtgcgggaaa acctgtaatg cagaccttga cgttgcaacg 2100
cacaatctta cacaggtagc tcttactggg aagaccatgc ctaagaggga agaaccacgc 2160
gatgctcaag gaactgctcc tgcaagaaag acaaaaaaag cttctaagtc aaaggctcca 2220
cctgcagaaa gggaagacca gacccctgcc caggagccat ctcagacatc a 2271
<210> 134
<211> 2271
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 134
atgcctaagc ccgccgttga gtctgaattt tccaaggttc tcaagaagca ttttcccgga 60
gagaggttta gaagcagcta catgaagaga ggggggaaaa tcctcgcagc ccagggggag 120
gaagctgtgg tcgcttacct ccaaggcaag agcgaagaag agccccccaa cttccagccc 180
ccagccaaat gtcatgtggt tacaaagtct agggactttg ccgaatggcc aataatgaag 240
gccagcgagg ccatccagag gtacatctat gccctcagca ccaccgagag agccgcctgc 300
aagcccggaa agtcaagcga gtcacacgct gcctggttcg ccgccaccgg cgtttcaaac 360
cacgggtatt ctcatgtcca gggccttaac cttatcttcg accacaccct cggcaggtat 420
gacggagtcc tcaagaaagt tcaactcagg aacgagaagg ctagggccag gctcgagagc 480
atcaatgcct ctagggcaga tgaaggcctc cccgagatca aggccgagga ggaggaggtg 540
gccaccaacg agaccggtca cctcctccaa cctcccggca tcaatccaag cttctatgtg 600
taccagacca tcagccccca ggcctatagg cccagggacg agatcgtcct cccccccgag 660
tacgccggat acgtcaggga ccctaatgcc ccaatccctc tcggtgtggt gaggaatagg 720
tgcgacatcc aaaaggggtg ccccggctac atcccagaat ggcagaggga ggccggaacc 780
gccatctccc ccaagaccgg taaggccgtc accgtccccg ggctcagtcc caagaagaac 840
aagaggatga ggagatactg gaggagcgag aaggaaaagg cccaggatgc actcctcgtt 900
accgtcagga tcggcaccga ctgggtggtc atcgacgtga gaggcctcct caggaacgcc 960
agatggagga ccatcgcccc caaggatatc agcctcaacg ccctcctcga tctcttcact 1020
ggagaccccg tcatagacgt taggagaaac atcgtcacct tcacctacac cctcgacgcc 1080
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aaactcactg ccacccagac tgttgccctc gtggccatcg acctcggcca gaccaacccc 1200
atctcagccg gcatctcaag ggtgacacag gagaatggcg ccctccagtg cgagcctctc 1260
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gacaggaacg aagaagaact tagggcaaga tccgtcgagg ccctccctga agcacagcaa 1380
gccgaggtga gggccctcga cggggtgagc aaggagaccg ccaggaccca gctctgtgcc 1440
gatttcgggc tcgatcccaa gagacttcct tgggacaaga tgagcagtaa caccaccttc 1500
atttccgaag ccctcctcag caacagcgtt agcagagacc aggtcttctt cactcccgcc 1560
cccaagaaag gcgccaagaa aaaagccccc gtggaggtca tgaggaagga caggacctgg 1620
gcaagagcct acaagcccag gctctcagtt gaagcccaga aattgaaaaa cgaagccctc 1680
tgggctctca agaggacctc ccccgaatac cttaaattga gcaggaggaa ggaggagctc 1740
tgcaggaggt ccataaacta cgtgatcgaa aaaactagaa ggaggacaca atgtcagatc 1800
gttatccccg ttatcgaaga tctcaacgtg aggttcttcc acggctcagg gaagaggctc 1860
ccaggatggg ataacttctt caccgccaag aaggagaata ggtggttcat tcagggattg 1920
cacaaggcat tcagtgatct caggactcac agaagctttt atgtgttcga ggtgaggccc 1980
gagaggacct ccatcacctg ccccaagtgc gggcattgcg aggtcggcaa cagggacggg 2040
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cataacctca cccaagtcgc tctcacaggg aagaccatgc ccaagaggga ggaacccaga 2160
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cccgccgaga gggaggatca gacccccgct caggagccct cacagacctc c 2271
<210> 135
<211> 2271
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 135
atgcccaagc ccgcagtcga gagcgagttt tcaaaggttc tcaaaaagca ctttcccggc 60
gagaggttca gatccagcta tatgaaaaga ggggggaaaa tcctcgccgc ccagggcgaa 120
gaggccgttg tggcctactt gcagggcaag agcgaagaag aaccccccaa cttccagcct 180
cccgccaagt gccacgtcgt gacaaagagc agagacttcg ccgagtggcc catcatgaag 240
gcttccgagg ccatccagag gtacatctac gccctctcca ccacagagag ggccgcctgc 300
aagcccggca agagcagcga gtcccacgcc gcctggtttg ctgccaccgg cgttagcaat 360
catgggtact cccacgtcca ggggcttaat ctcattttcg accacaccct cgggaggtac 420
gacggtgtgc tcaaaaaggt tcagctcagg aacgagaagg caagggctag gctcgaatca 480
atcaacgcca gtagagctga tgagggtcta cccgagatta aagccgaaga ggaggaggtc 540
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taccaaacca tctccccaca ggcttacagg cccagagatg agatcgtcct cccacccgag 660
tacgccgggt acgttagaga ccccaacgcc cccatccccc tcggtgtggt gaggaacagg 720
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aagagaatga ggaggtactg gaggagcgaa aaggagaagg cccaggacgc cttgctcgtc 900
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ggcgatccag ttatcgatgt caggaggaac atcgtgacct tcacatatac cctcgacgcc 1080
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aagctcaccg ccacccagac cgtggccttg gtcgcaatcg acctcggaca gaccaacccc 1200
atcagcgccg ggatctctag ggtgacccaa gagaacgggg ccttgcagtg tgagcccctc 1260
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gacttcggcc tcgacccaaa gagactcccc tgggacaaga tgagctccaa taccaccttc 1500
atctctgagg ccctcttgtc taactccgtg agcagagacc aggtcttctt caccccagca 1560
cccaagaagg gagccaagaa gaaggcaccc gtcgaagtca tgaggaagga caggacctgg 1620
gccagggcat acaagcccag actcagcgtt gaggcccaaa agcttaagaa cgaagccctc 1680
tgggccctca agagaacctc cccagaatac ctcaagctca gcagaaggaa ggaggagctc 1740
tgcagaagat caatcaacta tgttatcgag aagaccagaa ggaggaccca atgccaaatc 1800
gtcattcctg tgattgagga cctcaacgtg aggtttttcc atggctccgg caagagactc 1860
ccggggtggg ataacttctt taccgccaag aaggaaaaca ggtggttcat acagggtctc 1920
cataaagcct tctctgattt gaggacccac agaagctttt acgtgttcga ggtgagaccc 1980
gagaggacca gcatcacctg ccccaagtgc gggcactgcg aggtcgggaa cagggatggc 2040
gaggccttcc agtgcctcag ttgcggcaag acctgcaacg ccgacctcga tgttgctacc 2100
cacaatctca cccaggtcgc ccttaccggg aagaccatgc ccaagaggga ggaacccagg 2160
gacgcccaag gtaccgcccc cgccaggaag accaaaaagg cctccaagag caaagccccc 2220
cctgccgaaa gagaggacca aacccccgcc caggagccca gccagaccag t 2271
<210> 142
<211> 2271
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 142
atgcccaaac ccgccgtcga aagcgagttc tcaaaggtcc tcaaaaagca cttccccgga 60
gagaggttta ggagcagcta catgaaaagg ggcggcaaaa tcctcgccgc ccagggagag 120
gaggctgtcg tggcatacct ccaggggaag agtgaggagg agccccctaa cttccagccc 180
cccgcaaaat gtcacgtcgt gaccaaatcc agggacttcg ccgaatggcc tatcatgaag 240
gccagcgaag ccatccagag gtatatctac gccctttcaa ccaccgagag ggcagcttgc 300
aaaccaggta agtcctccga gtcccacgcc gcctggttcg ccgccaccgg tgtctccaac 360
catgggtact cacacgtgca ggggctcaac cttatcttcg accataccct cgggaggtac 420
gacggcgtct tgaagaaagt ccagctcagg aacgagaagg ccagagccag gctcgagtcc 480
ataaacgcat ccagagctga cgaggggctc cccgagatca aggccgaaga ggaggaggtt 540
gccaccaacg agactgggca cctcctccag ccacccggga taaacccctc tttctacgtg 600
taccaaacta tctcccccca ggcctatagg cccagagacg agatcgtgct cccacccgaa 660
tacgccgggt acgtgaggga tcccaatgcc cccatccccc tcggagttgt gagaaacaga 720
tgcgacatcc agaaggggtg ccccgggtac attcccgaat ggcaaaggga agccggcacc 780
gccatatccc ccaagaccgg caaggctgtc accgtgcctg ggctctcccc caagaaaaac 840
aagagaatga gaaggtattg gagatccgag aaggaaaaag cacaggacgc cctccttgtg 900
accgtcagga tcggcaccga ctgggttgtt atcgatgtca ggggcctcct cagaaacgcc 960
aggtggagga ccattgcccc caaggacatc agcctcaacg ccctcctcga tctctttacc 1020
ggggaccccg ttatcgacgt caggaggaac attgtgacat tcacctatac cctcgacgcc 1080
tgtgggactt acgccagaaa atggaccctc aaggggaagc aaaccaaggc caccctcgac 1140
aagttgaccg caacacaaac agtcgccctc gtggccatcg acctcggtca gacaaacccc 1200
atctccgccg gcatctccag ggtgacccag gagaacgggg ccctccagtg cgagcctctc 1260
gataggttta ccctcccaga cgacctcctc aaggacatca gcgcctacag gatcgcctgg 1320
gataggaatg aggaagagct cagggccagg tccgtggagg ccctccccga ggcccaacag 1380
gcagaggtga gggccctcga cggggtgtcc aaggagaccg ccaggactca gctctgtgcc 1440
gacttcggct tggatccaaa gaggctcccc tgggacaaga tgagcagcaa caccaccttt 1500
atctccgagg ccctcctctc caactccgtc tcaagggacc aggtgttttt cacccccgcc 1560
cccaagaagg gtgctaagaa aaaggccccc gtggaggtta tgaggaaaga cagaacttgg 1620
gccagggcct acaagcccag gttgtccgtt gaggcccaaa agctcaagaa cgaggccttg 1680
tgggccctca agagaacttc acccgaatac cttaagctta gtaggaggaa ggaggagttg 1740
tgtaggaggt ccatcaacta cgtgattgag aaaaccagga ggaggactca gtgtcagatc 1800
gtgatccccg tgatcgagga cttgaacgtt agattctttc acgggagcgg taagaggttg 1860
cccgggtggg acaatttctt caccgcaaag aaagagaata ggtggttcat ccaaggcctc 1920
cacaaggctt tcagcgacct tagaacacat agaagcttct acgtctttga agttaggcct 1980
gagaggacca gtatcacctg ccccaagtgc ggccactgcg aggtggggaa cagagacggg 2040
gaagcattcc aatgcctttc ctgcggcaag acctgcaacg ccgacctcga cgtcgctact 2100
cacaacctca cccaggtggc cctcaccggc aagactatgc ccaaaaggga ggagcccagg 2160
gatgctcagg gtaccgcccc cgccaggaag accaagaagg catccaagag caaggctccc 2220
ccagccgaga gggaagacca gacccctgcc caggagccct cccagacctc c 2271
<210> 143
<211> 2271
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 143
atgccaaaac ccgccgtcga atccgagttc agcaaggtcc tcaagaagca tttccccggg 60
gagaggttca ggtcctccta tatgaagagg ggaggcaaga tcctcgctgc tcagggcgag 120
gaagccgttg tggcctactt gcaggggaag agcgaggaag agccccccaa cttccagccc 180
cctgccaagt gccacgttgt gacaaagtcc agggacttcg ccgagtggcc catcatgaaa 240
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cacggttaca gccatgtgca gggcctcaac cttatctttg atcacaccct cgggaggtac 420
gatggcgttc ttaagaaggt gcagctcaga aatgagaagg caagggccag gcttgagagc 480
attaacgcct ccagggccga cgaggggctt cccgagatca aggctgagga ggaggaggtt 540
gcaaccaacg agaccggcca cctcctccaa ccacccggga tcaatccctc cttctacgtt 600
taccagacaa tatcccctca ggcctacaga cccagggacg aaattgtcct ccccccagaa 660
tacgcagggt acgtgaggga ccctaacgcc cccatccccc ttggcgtcgt taggaacagg 720
tgtgacatcc aaaaggggtg ccccggctac atccccgagt ggcaaagaga ggccggtacc 780
gccatctctc caaagaccgg caaggccgtc accgtccccg gcctctcccc caaaaagaac 840
aagaggatga ggagatactg gaggtcagaa aaggagaagg cccaagacgc cctcctcgtg 900
actgtgagaa tcggcaccga ctgggtcgtt attgatgtga gggggcttct caggaacgcc 960
aggtggagga ccatcgcccc aaaagacatc agcctcaatg ctctcctcga cttgttcacc 1020
ggcgaccccg tcatcgatgt caggaggaat attgtgacct tcacatacac cctcgacgcc 1080
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aaactcaccg ccacccagac tgtggccctc gtggccatcg accttgggca gaccaatccc 1200
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cccaagaagg gtgccaagaa gaaggcccct gtcgaggtca tgaggaagga caggacctgg 1620
gccagagcct acaagcccag gttgtccgtg gaggctcaga agttgaaaaa cgaggccctc 1680
tgggcactca agaggacaag cccagagtac ctcaagctct ccaggaggaa ggaagagctc 1740
tgcaggaggt ccatcaacta cgttatcgag aaaacaagga ggaggaccca gtgccagatc 1800
gtgattcccg tcatcgagga cctcaacgtc aggttcttcc acgggagcgg caagaggctt 1860
cccgggtggg acaacttctt caccgctaag aaggagaaca ggtggttcat ccagggcctt 1920
cacaaggcct tctccgatct caggacccac aggtccttct atgtgttcga ggtcaggccc 1980
gaaaggacct ccataacctg ccccaagtgc gggcactgcg aggtgggtaa cagggacggt 2040
gaggcctttc agtgcttgag ttgcggcaaa acctgcaacg ccgacctcga cgtcgctacc 2100
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gacgcccagg gcaccgcccc cgccagaaag accaagaagg cctctaagag caaggccccc 2220
cccgccgaga gggaggacca gacccccgcc caggaaccca gccagacatc a 2271
<210> 144
<211> 766
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 噬菌体
<400> 144
Met Glu Lys Glu Ile Thr Glu Leu Thr Lys Ile Arg Arg Glu Phe Pro
1 5 10 15
Asn Lys Lys Phe Ser Ser Thr Asp Met Lys Lys Ala Gly Lys Leu Leu
20 25 30
Lys Ala Glu Gly Pro Asp Ala Val Arg Asp Phe Leu Asn Ser Cys Gln
35 40 45
Glu Ile Ile Gly Asp Phe Lys Pro Pro Val Lys Thr Asn Ile Val Ser
50 55 60
Ile Ser Arg Pro Phe Glu Glu Trp Pro Val Ser Met Val Gly Arg Ala
65 70 75 80
Ile Gln Glu Tyr Tyr Phe Ser Leu Thr Lys Glu Glu Leu Glu Ser Val
85 90 95
His Pro Gly Thr Ser Ser Glu Asp His Lys Ser Phe Phe Asn Ile Thr
100 105 110
Gly Leu Ser Asn Tyr Asn Tyr Thr Ser Val Gln Gly Leu Asn Leu Ile
115 120 125
Phe Lys Asn Ala Lys Ala Ile Tyr Asp Gly Thr Leu Val Lys Ala Asn
130 135 140
Asn Lys Asn Lys Lys Leu Glu Lys Lys Phe Asn Glu Ile Asn His Lys
145 150 155 160
Arg Ser Leu Glu Gly Leu Pro Ile Ile Thr Pro Asp Phe Glu Glu Pro
165 170 175
Phe Asp Glu Asn Gly His Leu Asn Asn Pro Pro Gly Ile Asn Arg Asn
180 185 190
Ile Tyr Gly Tyr Gln Gly Cys Ala Ala Lys Val Phe Val Pro Ser Lys
195 200 205
His Lys Met Val Ser Leu Pro Lys Glu Tyr Glu Gly Tyr Asn Arg Asp
210 215 220
Pro Asn Leu Ser Leu Ala Gly Phe Arg Asn Arg Leu Glu Ile Pro Glu
225 230 235 240
Gly Glu Pro Gly His Val Pro Trp Phe Gln Arg Met Asp Ile Pro Glu
245 250 255
Gly Gln Ile Gly His Val Asn Lys Ile Gln Arg Phe Asn Phe Val His
260 265 270
Gly Lys Asn Ser Gly Lys Val Lys Phe Ser Asp Lys Thr Gly Arg Val
275 280 285
Lys Arg Tyr His His Ser Lys Tyr Lys Asp Ala Thr Lys Pro Tyr Lys
290 295 300
Phe Leu Glu Glu Ser Lys Lys Val Ser Ala Leu Asp Ser Ile Leu Ala
305 310 315 320
Ile Ile Thr Ile Gly Asp Asp Trp Val Val Phe Asp Ile Arg Gly Leu
325 330 335
Tyr Arg Asn Val Phe Tyr Arg Glu Leu Ala Gln Lys Gly Leu Thr Ala
340 345 350
Val Gln Leu Leu Asp Leu Phe Thr Gly Asp Pro Val Ile Asp Pro Lys
355 360 365
Lys Gly Val Val Thr Phe Ser Tyr Lys Glu Gly Val Val Pro Val Phe
370 375 380
Ser Gln Lys Ile Val Pro Arg Phe Lys Ser Arg Asp Thr Leu Glu Lys
385 390 395 400
Leu Thr Ser Gln Gly Pro Val Ala Leu Leu Ser Val Asp Leu Gly Gln
405 410 415
Asn Glu Pro Val Ala Ala Arg Val Cys Ser Leu Lys Asn Ile Asn Asp
420 425 430
Lys Ile Thr Leu Asp Asn Ser Cys Arg Ile Ser Phe Leu Asp Asp Tyr
435 440 445
Lys Lys Gln Ile Lys Asp Tyr Arg Asp Ser Leu Asp Glu Leu Glu Ile
450 455 460
Lys Ile Arg Leu Glu Ala Ile Asn Ser Leu Glu Thr Asn Gln Gln Val
465 470 475 480
Glu Ile Arg Asp Leu Asp Val Phe Ser Ala Asp Arg Ala Lys Ala Asn
485 490 495
Thr Val Asp Met Phe Asp Ile Asp Pro Asn Leu Ile Ser Trp Asp Ser
500 505 510
Met Ser Asp Ala Arg Val Ser Thr Gln Ile Ser Asp Leu Tyr Leu Lys
515 520 525
Asn Gly Gly Asp Glu Ser Arg Val Tyr Phe Glu Ile Asn Asn Lys Arg
530 535 540
Ile Lys Arg Ser Asp Tyr Asn Ile Ser Gln Leu Val Arg Pro Lys Leu
545 550 555 560
Ser Asp Ser Thr Arg Lys Asn Leu Asn Asp Ser Ile Trp Lys Leu Lys
565 570 575
Arg Thr Ser Glu Glu Tyr Leu Lys Leu Ser Lys Arg Lys Leu Glu Leu
580 585 590
Ser Arg Ala Val Val Asn Tyr Thr Ile Arg Gln Ser Lys Leu Leu Ser
595 600 605
Gly Ile Asn Asp Ile Val Ile Ile Leu Glu Asp Leu Asp Val Lys Lys
610 615 620
Lys Phe Asn Gly Arg Gly Ile Arg Asp Ile Gly Trp Asp Asn Phe Phe
625 630 635 640
Ser Ser Arg Lys Glu Asn Arg Trp Phe Ile Pro Ala Phe His Lys Ala
645 650 655
Phe Ser Glu Leu Ser Ser Asn Arg Gly Leu Cys Val Ile Glu Val Asn
660 665 670
Pro Ala Trp Thr Ser Ala Thr Cys Pro Asp Cys Gly Phe Cys Ser Lys
675 680 685
Glu Asn Arg Asp Gly Ile Asn Phe Thr Cys Arg Lys Cys Gly Val Ser
690 695 700
Tyr His Ala Asp Ile Asp Val Ala Thr Leu Asn Ile Ala Arg Val Ala
705 710 715 720
Val Leu Gly Lys Pro Met Ser Gly Pro Ala Asp Arg Glu Arg Leu Gly
725 730 735
Asp Thr Lys Lys Pro Arg Val Ala Arg Ser Arg Lys Thr Met Lys Arg
740 745 750
Lys Asp Ile Ser Asn Ser Thr Val Glu Ala Met Val Thr Ala
755 760 765
<210> 145
<211> 2298
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 145
atggaaaagg agatcactga gttaaccaag attagacgag aattccctaa taagaaattc 60
agctcaaccg atatgaagaa ggccggaaaa ttgttaaagg cagagggtcc agatgctgtc 120
agagattttt taaattcgtg tcaggagatt attggagact tcaagcctcc cgtgaagact 180
aacatcgttt ccatctcgcg gcccttcgag gagtggccag tgtcgatggt agggagggct 240
attcaagagt attacttctc tttgactaag gaagaacttg aatcagtgca tccgggcacg 300
tcatctgagg atcataaatc attctttaat ataactggac tctccaatta taactacacc 360
tccgttcagg gacttaatct catctttaaa aatgcaaaag ctatttatga tggaactttg 420
gttaaggcca acaacaagaa taagaaatta gaaaagaaat ttaatgagat caatcataag 480
cgctcactcg aaggactacc aataatcaca cctgacttcg aggagccctt cgacgaaaac 540
gggcacctca ataatcctcc aggaattaac agaaatattt atggatatca gggctgcgcc 600
gctaaagttt ttgtgccatc aaaacacaag atggtatcgc tgccaaagga gtacgaaggt 660
tataacagag acccaaatct gagtctcgca ggtttcagga atcgtcttga aatcccggag 720
ggagaaccag gtcatgtccc atggttccaa cgaatggaca tacctgaggg gcaaattgga 780
cacgtaaaca agattcagcg atttaatttt gttcacggca agaattcagg taaggtgaaa 840
ttcagcgaca agacagggcg cgtgaagaga tatcaccata gcaagtataa ggacgcaact 900
aaaccttata aattcttgga ggaatctaag aaggtgtcgg ctctcgatag catattagcg 960
atcattacaa tcggcgatga ttgggttgtg tttgatatac gaggactcta tagaaacgtc 1020
ttttatagag agcttgctca aaaaggtttg actgccgtcc aattgctgga tcttttcacc 1080
ggtgatcccg ttattgaccc aaagaaggga gtcgtaactt tctcctataa agagggggtt 1140
gtgcctgtct tttcccagaa aatcgttcct cgttttaaat cacgagacac cttagagaag 1200
ctcacgtcac aggggcctgt tgcgcttttg agcgttgatc ttggacagaa tgagcccgtc 1260
gcagccaggg tgtgttctct taagaatatt aacgacaaga ttaccctaga taacagttgc 1320
cgtatatctt ttcttgatga ttacaaaaag caaataaaag actaccgtga ttccctcgat 1380
gaattggaaa ttaaaatccg ccttgaagcg attaatagtt tggagactaa ccagcaggtt 1440
gagattaggg atctggacgt attttctgct gatcgggcca aagcaaacac agtggatatg 1500
ttcgatatcg acccaaatct aatctcctgg gacagcatga gtgatgccag agtttcaacc 1560
caaataagtg acctgtatct taagaatgga ggggatgaat caagggtgta cttcgagatt 1620
aataataaaa ggattaagag atcagactat aacattagcc agttggtgcg cccaaagctt 1680
tcagatagta caaggaagaa cctaaatgat tctatctgga aactcaagcg tacttctgag 1740
gaatatctta aactatcaaa gcgtaaactt gagctcagca gagctgtggt taactacacc 1800
attagacaaa gtaagttact ttctggtatc aatgatatcg ttatcatcct ggaagatttg 1860
gacgttaaga agaagtttaa cggacgtggt attcgcgaca tcgggtggga caatttcttc 1920
tctagccgaa aggaaaaccg ctggtttatc cctgctttcc ataaggcttt ttccgaactt 1980
tcatccaaca gagggctttg tgtgatagaa gtaaaccctg catggaccag tgcaacctgc 2040
ccagactgcg gcttctgcag taaagaaaac agagacggta ttaattttac atgcagaaag 2100
tgcggtgtca gttatcatgc tgacattgac gtggcaaccc taaatattgc aagggtagca 2160
gtcttgggaa agcctatgtc aggtcccgct gatcgcgagc gtctgggaga tactaagaaa 2220
ccaagagttg ctcggtctag gaaaacaatg aagcggaagg atataagcaa ttcaactgtg 2280
gaggccatgg tcacagcg 2298
<210> 146
<211> 2298
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 146
atggagaagg aaataaccga actcacaaaa atcaggaggg aattccccaa caaaaagttc 60
tcctccaccg acatgaagaa ggccggcaag ttgctcaagg ccgagggccc tgacgccgtg 120
agggatttcc tcaattcctg ccaagagatc atcggagact ttaaaccccc cgtcaagact 180
aacatcgtca gcataagcag gccattcgag gagtggccag tctccatggt gggcagagcc 240
atccaggagt actacttcag cctcaccaag gaggagctcg agtccgtgca ccccgggact 300
agcagtgaag accataagag cttcttcaac attaccgggc tctccaacta caattacacc 360
tccgttcagg gtttgaacct catcttcaag aacgccaaag ccatctatga cggcactctc 420
gttaaagcca acaacaagaa caagaagctc gaaaagaagt tcaatgagat taaccacaag 480
aggtccctcg agggcctccc catcatcacc cccgacttcg aggagccctt cgatgaaaat 540
gggcacttga acaacccccc cggtattaac aggaacatct atgggtatca gggctgcgcc 600
gccaaagtct tcgtgccatc caagcataag atggttagcc tcccaaagga gtacgagggg 660
tataacaggg accccaactt gtccctcgcc gggttcagga acagactcga gatcccagag 720
ggagagcctg gccacgtgcc ttggttccag aggatggata tacccgaggg acagattggc 780
cacgtgaaca agatccagag gttcaatttc gtccacggga agaattccgg aaaagtgaaa 840
ttcagcgata aaaccgggag ggtcaagagg taccaccaca gtaagtacaa ggatgcaacc 900
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ttttacaggg agctcgccca gaaggggctc accgccgtgc agctcctcga cctcttcacc 1080
ggggaccccg tgatcgaccc caaaaaagga gtcgttacct tctcctataa ggagggagtg 1140
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cttaccagcc agggccccgt cgcccttttg tctgtcgacc ttggacaaaa cgagcccgtg 1260
gccgcaagag tctgttccct caagaacatc aacgataaga tcacccttga taattcatgt 1320
agaatcagct tcctcgatga ctacaaaaag cagatcaagg actatagaga ctccctcgac 1380
gagctcgaga tcaagattag gctcgaagcc atcaacagcc ttgagaccaa ccaacaagtc 1440
gaaatcagag atttggacgt tttctcagca gatagagcca aggccaacac cgtcgacatg 1500
ttcgacatcg acccaaacct catctcctgg gactccatgt ctgacgccag ggtctccaca 1560
cagatctccg atctttactt gaaaaatggc ggtgacgaat ccagagttta ctttgagatc 1620
aataacaaga ggatcaaaag gagcgactac aacatatccc agctcgtcag gccaaagctc 1680
tccgacagca ccaggaagaa cctcaacgat tccatctgga aactcaagag aaccagcgag 1740
gagtacctca agctctcaaa gagaaagctc gaactcagca gggccgtcgt caactacacc 1800
atcaggcagt ccaagctctt gtccgggata aacgacatcg tcatcatatt ggaggatctc 1860
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tctagtagga aggaaaacag gtggttcatc cccgccttcc acaaagcctt tagcgagctc 1980
agctccaata ggggcctttg cgttatcgaa gtcaaccccg cctggacatc tgccacttgc 2040
ccagactgtg gcttctgtag caaggaaaac agagacggga tcaactttac ctgtaggaag 2100
tgcggggtct cctaccatgc cgacatcgac gttgccactc ttaacatcgc cagggtcgcc 2160
gtcctcggca agcccatgtc cggccccgcc gatagggaga ggttgggcga caccaagaaa 2220
cccagggtgg ccagaagcag gaagaccatg aagaggaaag acatcagcaa ctctaccgtg 2280
gaggccatgg ttaccgcc 2298
<210> 147
<211> 2298
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 147
atggagaagg agatcaccga gctcacaaaa atcaggaggg agttccccaa caagaagttc 60
tcaagcactg acatgaagaa ggccggcaag ctcctcaagg ccgagggccc cgacgccgtc 120
agggacttcc tcaactcctg tcaggaaatc ataggagact tcaagccccc cgtgaaaacc 180
aacatcgttt ccatcagcag gcccttcgaa gagtggcccg tcagtatggt cgggagagcc 240
atccaagaat actatttcag cctcaccaag gaagaactcg agtccgtcca tcccggaacc 300
tcctctgagg accacaaaag cttctttaat atcaccggcc tcagcaatta caactacacc 360
agcgtgcagg gcttgaatct catcttcaaa aacgccaaag ccatctacga cggtactctc 420
gttaaggcca acaacaaaaa caagaagttg gagaagaagt tcaacgaaat caaccacaag 480
aggtccctcg agggcctccc tataatcacc cccgacttcg aggaaccttt cgacgagaac 540
gggcacctca acaacccccc cggcattaat aggaacatct acggctacca gggctgcgct 600
gccaaagttt tcgtgcccag caagcacaag atggtgagcc tccccaagga atacgaaggt 660
tacaacaggg accctaactt gtcccttgcc ggcttcagga acaggctcga gatccccgag 720
ggggaacccg gacacgtgcc ctggtttcag aggatggaca tcccagaggg ccagatcggc 780
cacgtcaata aaatacagag gttcaatttt gtccacggca agaacagcgg gaaggtcaag 840
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<211> 2271
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
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<211> 2271
<212> DNA
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<223> 合成的
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ggagagcctg gtcacgtccc gtggtttcag cgcatggaca tcccggaggg gcaaattggt 780
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gagtatctga agttgtctaa gaggaagctt gagctgagcc gggcagtagt gaattatact 1800
atccgccaga gcaagcttct tagcggcatt aacgacatcg tcatcatcct cgaagatttg 1860
gacgtcaaaa agaagttcaa tggacgcggt atcagagata ttggctggga caactttttc 1920
agcagcagga aggaaaatag gtggttcatt ccggcgtttc acaaggcttt ctcagagctg 1980
tcgtcaaaca ggggattatg tgttatcgag gtgaaccctg catggaccag cgcgacttgc 2040
ccggattgcg gtttctgctc caaggaaaat cgggacggca ttaactttac ttgccgcaag 2100
tgtggcgtct cataccacgc ggacattgat gtcgctactc tcaatattgc ccgggtggca 2160
gtattgggca aacctatgtc cggccccgca gaccgggagc ggttagggga cacgaagaaa 2220
ccgcgcgtcg ctagatcacg taaaactatg aagagaaagg acatatctaa ctccaccgtt 2280
gaggccatgg tgacagca 2298
<210> 184
<211> 2298
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 184
atggagaagg agatcaccga gttaaccaag atccggagag agtttccaaa taaaaaattt 60
tctagcaccg atatgaagaa ggcaggtaag cttctgaagg cggagggacc cgacgcagtg 120
cgtgatttcc tgaactcgtg ccaagagatc attggggatt tcaaacctcc ggtgaagact 180
aatatagttt ctatcagtag accttttgag gagtggccag tctctatggt gggccgggca 240
atccaggagt attacttctc ccttacaaag gaagagctgg aaagcgtgca tccagggacc 300
agcagtgagg accataagag cttctttaac atcacgggtc ttagcaacta taattacaca 360
agcgttcagg ggctcaatct aatcttcaag aacgcaaaag ctatttatga cggtaccctg 420
gtcaaggcaa acaataagaa taaaaagctg gagaagaaat ttaatgagat caatcacaaa 480
cggtcactgg agggactgcc gatcataacc cccgattttg aagagccctt cgatgagaac 540
ggtcatctta ataacccacc agggatcaac cgcaatatat atgggtacca ggggtgtgcg 600
gctaaggtct ttgtgccctc gaaacataag atggtctccc tcccaaagga atatgagggg 660
tacaaccgtg acccgaacct tagcctggca gggttccgca atcgcttaga gatccccgag 720
ggagagcccg gtcacgtgcc gtggtttcag aggatggaca ttcccgaggg tcagatcggg 780
catgtcaaca agatccaaag attcaacttc gtgcacggca agaactccgg gaaggtcaag 840
ttttccgaca agaccgggcg tgtcaagcgg taccatcact ccaagtacaa ggatgccacc 900
aaaccgtata agttcctaga ggagtccaaa aaggtttccg ctctggactc tatccttgcg 960
attatcacga ttggggacga ctgggtggtg ttcgacataa gaggcctgta ccgtaacgta 1020
ttttataggg agcttgcaca aaagggcctc accgcagttc aactgctgga cctttttacc 1080
ggcgatcctg ttatcgaccc gaaaaagggc gtggtgacct tctcttacaa agagggtgtc 1140
gtgcccgttt tctcacagaa gatagtccct cgcttcaaat cacgggacac gctcgagaag 1200
ctgacatctc aaggtcccgt ggccctcctg agcgtcgatc tgggtcagaa cgagccggtc 1260
gcggctaggg tttgctcact gaagaacatc aacgacaaga taacactcga taacagctgc 1320
cggatctcct tcctagatga ctacaagaag cagattaagg actatcgtga ttctctcgat 1380
gagttggaga ttaaaatcag actcgaagcc attaactccc tcgagacgaa ccaacaggtt 1440
gagatccgcg acctcgacgt attcagtgcg gaccgggcta aggcaaatac cgtcgacatg 1500
ttcgacattg accccaacct gatttcttgg gatagcatgt cggacgcccg cgtgtctacg 1560
cagatttccg atctgtacct taaaaatggg ggagatgaga gtcgtgttta cttcgagatc 1620
aataacaagc gcattaagcg gtcagactac aatatctcgc agctggtcag acctaagctg 1680
tctgatagca cgaggaagaa tctcaacgac agcatttgga agttgaagcg aacaagtgaa 1740
gaatacttaa agctaagcaa acgcaagctg gaactgtctc gcgcggtggt taactacacg 1800
atccgacaat cgaagcttct gtccgggatc aacgatatcg tcataattct tgaagacttg 1860
gacgtgaaaa aaaagttcaa tggtaggggc attcgcgaca ttgggtggga taacttcttt 1920
tcctcccgca aggagaatcg ctggtttatc cctgccttcc ataaggcctt ttccgagctg 1980
agtagtaatc gggggttgtg tgttatagaa gtcaatcccg catggactag cgccacttgt 2040
cctgattgcg gattctgctc caaggaaaac cgggacggca tcaactttac gtgccggaag 2100
tgcggggttt cttaccatgc tgacatcgat gtggcgacct tgaacatagc tagagtagct 2160
gtcttgggta agccgatgtc cgggcctgcg gacagggaga gactgggcga cacgaagaag 2220
cctcgagtcg caagaagtag aaagaccatg aagaggaagg acatatccaa ttctactgtc 2280
gaggcaatgg tgaccgct 2298
<210> 185
<211> 2298
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 185
atggagaaag aaataaccga gctcaccaag atcaggcgag agtttcccaa taagaagttc 60
tccagcaccg acatgaaaaa ggctggtaag cttctcaaag ccgagggtcc ggatgcagtc 120
agagattttt tgaactcctg ccaggagata ataggtgact ttaagccacc agtcaagaca 180
aacattgttt ctatcagccg cccctttgag gagtggccgg tgagcatggt gggcagggcg 240
atccaggagt attatttcag cctcactaag gaagagctgg aaagcgttca tcctggcacc 300
agctccgaag accacaaaag tttcttcaac atcacgggtc tctccaatta taattacacc 360
agcgtgcaag gattgaatct gatttttaag aacgctaagg cgatttacga cggaaccctc 420
gttaaagcca ataacaagaa caagaagttg gaaaagaagt ttaacgaaat caatcataag 480
aggagcctgg agggcctgcc gatcatcacc cctgacttcg aggagccctt tgacgaaaat 540
ggacatttga acaacccacc aggtataaac aggaacatct acggttacca ggggtgcgct 600
gccaaagtgt tcgtaccatc caagcataag atggtgtcgc ttcccaaaga gtatgaagga 660
tataatcgag acccaaacct ttcccttgct ggtttccgca accggctgga gatcccagag 720
ggtgagccag gacatgtgcc gtggtttcaa agaatggata taccggaggg ccaaattgga 780
catgtcaata agattcagcg cttcaatttc gtccatggga aaaatagcgg gaaggtgaag 840
ttttcagata agaccgggcg agtgaaacgg taccaccaca gtaagtataa ggatgcgaca 900
aagccatata aattcttgga agagagcaaa aaggtttcgg ccctcgattc aatactggca 960
atcatcacta tcggtgatga ctgggtcgtg tttgacattc gcgggctata taggaatgtt 1020
ttctaccgcg agcttgcgca gaaggggctc accgccgtgc agctgctgga cctctttacg 1080
ggtgatcccg tcatcgatcc taagaaaggc gtggttacgt ttagttataa agaaggggtg 1140
gtgcccgtct tcagtcaaaa aattgtgcca aggttcaagt cacgtgatac attggaaaag 1200
cttacgtctc aaggcccggt agccttgctc tccgtggacc taggccagaa cgagccagtc 1260
gctgcacgcg tgtgttcact taagaacatt aacgacaaaa tcactctcga caacagctgc 1320
cgcatttcat ttctggacga ctacaagaaa caaatcaagg actacaggga ctcgctggat 1380
gagctcgaaa ttaaaatccg gctggaagcc atcaactcac tggagaccaa ccaacaggtt 1440
gagattagag atctagacgt cttctcggcg gaccgagcca aagccaacac agtggatatg 1500
tttgacattg acccaaacct gatcagttgg gactctatgt ccgatgcgcg cgtatcaaca 1560
cagatctctg acctctacct caaaaatgga ggtgacgagt cccgcgttta ctttgagatc 1620
aataataagc gcatcaagcg ttcggactac aatattagcc agctggtaag gcccaagctt 1680
tccgacagca cacgtaaaaa cctgaatgat tcgatttgga aactcaagcg cacctcggag 1740
gaatacctaa aactctcgaa gcgaaaactc gagctttccc gggcggtcgt aaactacacg 1800
attaggcaaa gtaaactcct ctccggtatt aacgatattg taattatcct tgaggacctt 1860
gatgtaaaga agaaattcaa cggacgaggc atccgggata tcggctggga taacttcttt 1920
tcttcgcgca aagaaaaccg gtggtttatc ccggccttcc ataaggcttt cagcgagctt 1980
tcttccaacc gagggttgtg cgtgatagaa gttaacccgg cctggacgag cgcaacctgc 2040
ccggattgtg ggttctgtag caaggagaac agggatggga tcaacttcac gtgtaggaag 2100
tgcggggtgt cctaccacgc cgatatcgac gttgccacgc tcaatatcgc ccgcgtggcc 2160
gtgctgggca agcccatgtc gggccctgcc gatagagaga ggctggggga cactaagaaa 2220
ccgcgtgtcg cacgaagccg caagacgatg aagaggaagg atatctccaa ttccaccgtc 2280
gaggcaatgg ttaccgcg 2298
<210> 186
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 186
ggagagatct caaacgattg ctcgattagt cgagac 36
<210> 187
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 187
gtcggaacgc tcaacgattg cccctcacga ggggac 36
<210> 188
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 188
accaaaacga ctattgattg cccagtacgc tgggac 36

Claims (54)

1.一种修饰大豆基因组中的内源大豆基因的方法，该方法包括：
(a)向包含编码RNA指导的核酸内切酶(RGE)或RNA指导的切口酶(RGN)的合成的多核苷酸的大豆植物细胞中引入针对该内源大豆基因中的靶编辑位点的指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸和任选地与该靶编辑位点具有同源性的供体模板DNA分子，其中所述合成的多核苷酸：
(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；
(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；
(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该RGE或该RGN的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，
(iv)或i、ii和iii的任何组合；并且
(b)选择包含该内源大豆基因的修饰的经修饰的大豆植物细胞、大豆植物、大豆植物部分、大豆组织或大豆愈伤组织。
2.一种修饰大豆基因组中的内源大豆基因的方法，该方法包括：
(a)向大豆植物细胞中引入：
(i)编码RNA指导的核酸内切酶(RGE)或RNA指导的切口酶(RGN)的合成的多核苷酸，其中所述合成的多核苷酸具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％、48％或50％，具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度，具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该RGE或该RGN的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，或所述GC含量、所述Tm和所述较低sCAI的任何组合；
(ii)指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸，该指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸针对该内源大豆基因中的靶编辑位点；以及任选地
(iii)与该靶编辑位点具有同源性的供体模板DNA分子；并且
(b)选择包含该内源大豆基因的修饰的经修饰的大豆植物细胞、大豆植物、大豆植物部分、大豆组织或大豆愈伤组织。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该RGE包括II型Cas核酸内切酶、Cas9核酸内切酶、V型Cas核酸内切酶、Cas12a核酸内切酶、Cas12c核酸内切酶、CasX核酸内切酶、Cas12j核酸内切酶或工程化的核酸内切酶。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中该RGN包含II型Cas切口酶、Cas9切口酶、V型Cas切口酶、Cas12a切口酶、Cas12c切口酶、CasX切口酶或工程化的切口酶。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中该RGN包含HNH或RuvC样核酸酶结构域中的突变，或任选地其中所述突变是：(i)SEQ ID NO:1的Cas9蛋白中的D10A突变；(ii)SEQ ID NO:25的FnCpf1蛋白中的R1226A氨基酸突变；或(iii)SEQ ID NO:73的LbCpf1蛋白中的R1138A突变。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中该合成的多核苷酸在以下中任一个的全长上具有至少76％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(x)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(xi)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(xii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(xiii)在SEQ ID NO:122-131、134-143或146-154中任一个的全长上至少77％序列同一性。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中该合成的多核苷酸具有大于48％或50％的GC含量并且在以下中任一个的全长上具有至少70％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(x)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(xi)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(xii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中该合成的多核苷酸：
(a)在选自由SEQ ID NO:3-11和12组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(b)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(c)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于48％并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(d)在选自由SEQ ID NO:122-131组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(e)在选自由SEQ ID NO:122-131组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(f)在选自由SEQ ID NO:122-131组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(g)在选自由SEQ ID NO:134-143组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(h)在选自由SEQ ID NO:134-143组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(i)在选自由SEQ ID NO:134-143组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(j)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(k)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(l)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
9.如权利要求1或2所述的方法，其中该合成的多核苷酸编码RGE并且：
(i)该RGE是与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的SpCas9核酸内切酶或其变体，并且编码该SpCas9核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性；
(ii)该RGE是与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的SaCas9核酸内切酶或其变体，并且编码该SaCas9核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ IDNO:14具有至少95％序列同一性；
(iii)该RGE是与SEQ ID NO:25具有至少95％序列同一性的FnCpf1核酸内切酶或其变体，并且编码该FnCpf1核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ IDNO:26具有至少95％序列同一性；
(iv)该RGE是与SEQ ID NO:37具有至少95％序列同一性的CasJ核酸内切酶或其变体，并且编码该CasJ核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:38具有至少95％序列同一性；
(v)该RGE是与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的Cas12j-1核酸内切酶或其变体，并且编码该Cas12j-1核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ IDNO:121具有至少95％序列同一性；
(vi)该RGE是与SEQ ID NO:132具有至少95％序列同一性的Cas12j-2核酸内切酶或其变体，并且编码该Cas12j-2核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQID NO:133具有至少95％序列同一性；或
(vii)该RGE是与SEQ ID NO:144具有至少95％序列同一性的Cas12j-3核酸内切酶或其变体，并且编码该Cas12j-3核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQID NO:145具有至少95％序列同一性。
10.如权利要求1或2所述的方法，其中该合成的多核苷酸编码该RGN，具有大于48％的GC含量，并且在以下中任一个的全长上具有至少70％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN；
(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN；
(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN；或
(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中该合成的多核苷酸编码该RGN并且：
(a)在选自由SEQ ID NO:3-11和12组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN；
(b)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN；或
(c)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于48％并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN。
12.如权利要求1或2所述的方法，其中：
(i)该合成的多核苷酸是与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的SpCas9 RGN，并且编码该SpCas9 RGN的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性；
(ii)该RGN是与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的SaCas9 RGN，并且编码该SaCas9 ndRGDBP或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性；
(iii)该RGN是与SEQ ID NO:25具有至少95％序列同一性的FnCpf1 RGN，并且编码该FnCpf1 RGN或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:26具有至少95％序列同一性；或
(iv)该RGN是与SEQ ID NO:37具有至少95％序列同一性的CasJ RGN，并且编码该CasJRGN或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:38具有至少95％序列同一性。
13.如权利要求1或2所述的方法，其中该合成的多核苷酸：
(i)编码该RGE并且与在对照大豆植物细胞中修饰该内源基因的频率相比提供在该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中修饰该内源基因的频率方面的至少5倍增加，该对照大豆植物细胞具有包含编码该RGE的大豆密码子优化的参考多核苷酸的对照多核苷酸；或，
(ii)编码该RGN并与对照大豆植物细胞中内源靶序列的切口或切口相关修饰相比提供该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中的该内源靶序列的切口或切口相关修饰方面的至少2倍增加，该对照大豆植物细胞包含编码该RGN的对照大豆密码子优化的参考多核苷酸。
14.如权利要求1或2所述的方法，其中该大豆密码子优化的参考多核苷酸具有比该合成的多核苷酸的GC含量低至少约8％、9％或10％的GC含量，或任选地其中该大豆密码子优化的参考多核苷酸具有比该合成的多核苷酸的GC含量低至少约8％至约12％的GC含量。
15.一种修饰大豆基因组中内源大豆基因的表达的方法，该方法包括：
(a)将针对该内源大豆基因中的靶DNA结合位点的指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸引入包含编码该ndRGDBP的合成的多核苷酸的大豆植物细胞中，其中所述合成的多核苷酸：
(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％、48％或50％；
(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；
(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iv)或i、ii和iii的任何组合；并且
(b)选择其中该内源大豆基因的表达已经被修饰的大豆植物细胞、大豆植物、大豆植物部分、大豆组织或大豆愈伤组织。
16.一种修饰大豆基因组中内源大豆基因的表达的方法，该方法包括：
(a)向大豆植物细胞中引入：
(i)编码包含核酸酶缺陷型受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)的蛋白质的合成的多核苷酸，其中所述合成的多核苷酸具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％、48％或50％，具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度，具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，或所述GC含量、Tm和sCAI的任何组合；并且
(ii)指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸，该指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸针对该内源大豆基因中的靶结合位点；并且
(b)选择其中该内源大豆基因的表达已经被修饰的经修饰的大豆植物细胞、大豆植物、大豆植物部分、大豆组织或大豆愈伤组织。
17.如权利要求16所述的方法，其中该ndRGDBP包括II型Cas ndRGDBP、Cas9ndRGDBP、V型Cas ndRGDBP、Cas12a ndRGDBP、Cas12c ndRGDBP、CasX ndRGDBP、Cas12j ndRGDBP或工程化的ndRGDBP。
18.如权利要求16所述的方法，其中该ndRGDBP包含HNH或RuvC样核酸酶结构域中的突变，或任选地其中所述突变是：(i)SEQ ID NO:1的Cas9蛋白中的D10A和/或H840A突变；(ii)SEQ ID NO:25的FnCpf1蛋白中的D917A、E1006A、E1028A、D1255A和/或N1257A突变；(iii)SEQ ID NO:37的CasJ蛋白中的D901A、E1128A和/或D1298A突变；(iv)SEQ ID NO:73的LbCpf1蛋白中的D832A、E925A和/或D1148A突变；(v)选自由SEQ ID NO:120的D371A、E579A、D673A、C640A、C643A、C646A、C661A、C664A、C640S、C643S、C646S、C661S和C664S组成的组；(vi)选自由SEQ ID NO:132的D394A、E606A、D697A、C667A、C670A、C673A、C685A、C688A、C667S、C670S、C673S、C685S和C688S组成的组；或(vii)选自由SEQ ID NO:144的D413A、E618A、D710A、C680A、C683A、C687A、C698A、C701A、C680S、C683S、C687S、C698S和C701S组成的组。
19.如权利要求16所述的方法，其中该合成的多核苷酸在以下中任一个的全长上具有至少76％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(x)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(xi)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(xii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
20.如权利要求16所述的方法，其中该合成的多核苷酸具有大于48％或50％的GC含量并且在以下中任一个的全长上具有至少70％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(x)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(xi)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；或
(xii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP。
21.如权利要求16所述的方法，其中该合成的多核苷酸：
(a)在选自由SEQ ID NO:3-11和12组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(b)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(c)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于48％并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(d)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(e)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；其包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该ndRGDBP；
(f)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(g)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(h)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(i)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(j)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(k)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；或
(l)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP。
22.如权利要求16所述的方法，其中：
(i)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的SpCas9ndRGDBP，并且编码该SpCas9 ndRGDBP或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性；
(ii)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的SaCas9ndRGDBP，并且编码该SaCas9 ndRGDBP或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性；
(iii)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:25具有至少95％序列同一性的FnCpf1ndRGDBP，并且编码该FnCpf1 ndRGDBP或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:26具有至少95％序列同一性；
(iv)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:37具有至少95％序列同一性的CasJ ndRGDBP，并且编码该CasJ ndRGDBP或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:38具有至少95％序列同一性；
(v)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的Cas12j-1变体，并且该合成的多核苷酸在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；
(vi)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:132具有至少95％序列同一性的Cas12j-2变体并且该合成的多核苷酸在选自由SEQ ID NO:134-143组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；或
(vii)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:144具有至少95％序列同一性的Cas12j-3变体，并且该合成的多核苷酸在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性。
23.如权利要求16所述的方法，其中该合成的多核苷酸进一步包含可操作地连接的多核苷酸，该多核苷酸编码修饰该内源大豆基因的表达的效应子结构域。
24.如权利要求16所述的方法，其中该合成的多核苷酸可操作地连接至：
(a)在大豆植物细胞中可操作的启动子；
(b)5'非翻译(UT)序列和/或3'非翻译(UT)序列，任选地其中该5’UT和/或3’UT任选地(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；或(i)和(ii)的组合；
(c)多聚腺苷酸化序列；
(d)编码核定位信号(NLS)、叶绿体转运肽(CTP)、表位标签(ST)、转录激活结构域(TAD)、转录阻遏结构域(TRD)的第二多核苷酸；或其组合；任选地，其中一个或多个该第二多核苷酸序列(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该NLS、CTP、ET、TAD或TRD的第二大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合；和/或
(e)编码具有修饰靶DNA的酶活性的异源多肽的第三多核苷酸序列；任选地，其中一个或多个该第三多核苷酸序列(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该异源多肽的第三大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合。
25.如权利要求24所述的方法，其中由该第三多核苷酸序列编码的异源多肽表现出一种或多种选自以下的酶活性：核酸酶活性、甲基转移酶活性、去甲基化酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨基活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性和/或糖基化酶活性。
26.如权利要求16所述的方法，其中与对照大豆植物细胞中该内源基因的表达相比，该合成的多核苷酸提供在该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中该内源基因的表达方面的至少2倍增加，该对照大豆植物细胞包含对照大豆密码子优化的参考多核苷酸，该对照大豆密码子优化的参考多核苷酸编码该ndRGDBP并且(i)具有的GC含量比该多核苷酸的GC含量低至少约8％、9％或10％，或任选地其中编码该ndRGDBP的对照多核苷酸具有的GC含量至少比该合成的多核苷酸的GC含量低约8％至12％。
27.如权利要求16所述的方法，其中该合成的多核苷酸包含编码RGE、RGN或ndRGDBP的RNA分子。
28.一种大豆植物细胞，其包含编码蛋白质的合成的多核苷酸，该蛋白质包含RNA指导的核酸内切酶(RGE)、RNA指导的切口酶(RGN)或核酸酶缺陷型受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)，其中所述多核苷酸：
(a)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；
(b)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；
(c)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码RGE的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(d)(a)、(b)和/或(c)的任何组合。
29.如权利要求28所述的大豆植物细胞，其中该RGE包括II型Cas核酸内切酶、Cas9核酸内切酶、V型Cas核酸内切酶、Cas12a核酸内切酶、Cas12c核酸内切酶、CasX核酸内切酶、Cas12j核酸内切酶或工程化的核酸内切酶。
30.如权利要求28所述的大豆植物细胞，其中该ndRGDBP包括II型Cas ndRGDBP、Cas9ndRGDBP、V型Cas ndRGDBP、Cas12a ndRGDBP、Cas12c ndRGDBP、CasX ndRGDBP、Cas12jndRGDBP或工程化的ndRGDBP。
31.如权利要求28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码RGE并且在以下中任一个的全长上具有至少76％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:75-84的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(viii)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ix)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(x)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(xi)在SEQ ID NO:122-131、134-143或146-154中任一个的全长上至少77％序列同一性。
32.如权利要求28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码RGE并且具有大于48％或50％的GC含量并且在以下中任一个的全长上具有至少70％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:75-84的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(vii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(viii)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(ix)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(x)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(xi)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
33.如权利要求28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码该RGE并且：
(a)在选自由SEQ ID NO:3-11和12组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(b)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(c)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于48％并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(d)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(e)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(f)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(g)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(h)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(i)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(j)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；
(k)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或
(l)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI。
34.如权利要求28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码该RGE并且：
(i)该RGE是与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的SpCas9核酸内切酶或其变体，并且编码该SpCas9核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性；
(ii)该RGE是与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的SaCas9核酸内切酶或其变体，并且编码该SaCas9核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ IDNO:14具有至少95％序列同一性；
(iii)该RGE是与SEQ ID NO:25具有至少95％序列同一性的FnCpf1核酸内切酶或其变体，并且编码该FnCpf1核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ IDNO:26具有至少95％序列同一性；
(iv)该RGE是与SEQ ID NO:37具有至少95％序列同一性的CasJ核酸内切酶或其变体，并且编码该CasJ核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:38具有至少95％序列同一性；
(v)该RGE是与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的Cas12j-1核酸内切酶或其变体，并且编码该Cas12j-1核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ IDNO:121具有至少95％序列同一性；
(vi)该RGE是与SEQ ID NO:132具有至少95％序列同一性的Cas12j-2核酸内切酶或其变体，并且编码该Cas12j-2核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQID NO:133具有至少95％序列同一性；或
(vii)该RGE是与SEQ ID NO:144具有至少95％序列同一性的Cas12j-3核酸内切酶或其变体，并且编码该Cas12j-3核酸内切酶或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQID NO:145具有至少95％序列同一性。
35.如权利要求28至34或35中任一项所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码该RGE并且与在对照大豆植物细胞中修饰该靶基因的效率相比提供在该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中修饰内源基因或基因座的效率方面的至少5倍增加，该对照大豆植物细胞具有对照大豆密码子优化的参考多核苷酸。
36.如权利要求28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码该RGN或该ndRGDBP并且在以下中任一个的全长上具有至少76％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或ndRGDBP；
(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(x)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN或该ndRGDBP；
(xi)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少两个或三个序列；并且熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN或该ndRGDBP；
(xii)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN或该ndRGDBP；
(xiii)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN或该ndRGDBP；
(xiv)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少两个或三个序列；并且熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN或该ndRGDBP；
(xv)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN或该ndRGDBP；
(xvi)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(xvii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少两个或三个序列；并且熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN或该ndRGDBP；或
(xviii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP。
37.如权利要求28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码RGN或RGDBP，具有大于48％或50％的GC含量，并且在以下中任一个的全长上具有至少70％序列同一性：
(i)选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(ii)选自由SEQ ID NO:15-24组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:14的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(iii)选自由SEQ ID NO:27-36组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:26的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(iv)选自由SEQ ID NO:39-48组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:38的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(v)选自由SEQ ID NO:51-60组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:50的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(vi)选自由SEQ ID NO:63-72组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:62的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(vii)选自由SEQ ID NO:75-84组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:74的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(viii)选自由SEQ ID NO:87-96组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:86的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(ix)选自由SEQ ID NO:99-108组成的组的至少一个、两个或三个多核苷酸，并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:98的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并编码该RGN或该ndRGDBP；
(x)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(xi)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少两个或三个序列；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(xii)选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(xiii)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(xiv)选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少两个或三个序列；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(xv)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(xvi)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(xvii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少两个或三个序列；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；或
(xviii)选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP。
38.如权利要求28所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸编码该RGN或该RGDBP并且：
(a)在选自由SEQ ID NO:3-11和12组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN或该ndRGDBP；
(b)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN或该ndRGDBP；
(c)在选自由SEQ ID NO:3-12组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于48％并且任选地具有的sCAI低于SEQ IDNO:2的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该RGN或该ndRGDBP
(d)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(e)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(f)在选自由SEQ ID NO:122-130和131组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:121的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(g)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(h)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(i)在选自由SEQ ID NO:134-142和143组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性；并且具有的GC含量大于50％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:133的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(j)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、两个或三个序列上具有超过80％序列同一性并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；
(k)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性并且具有的熔化温度(Tm)大于90摄氏度并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP；或
(l)在选自由SEQ ID NO:146-154和155组成的组的至少一个、至少两个或三个序列的全长上具有超过80％序列同一性并且具有的GC含量大于48％并且任选地具有的sCAI低于SEQ ID NO:145的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI，该大豆密码子优化的参考多核苷酸包含一个或多个核苷酸插入、缺失和/或取代并且编码该ndRGDBP。
39.如权利要求28所述的大豆植物细胞，其中：
(i)该RGN或该ndRGDBP是与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的SpCas9 RGN或ndRGDBP，并且编码该SpCas9 RGN或ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ IDNO:2具有至少95％序列同一性；
(ii)该RGN或该ndRGDBP是与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的SaCas9 RGN或ndRGDBP，并且编码该SaCas9 RGN或ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ IDNO:14具有至少95％序列同一性；
(iii)该RGN或该ndRGDBP是与SEQ ID NO:25具有至少95％序列同一性的FnCpf1 RGN或ndRGDBP，并且编码该FnCpf1 ndRGDBP或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQID NO:26具有至少95％序列同一性；
(iv)该RGN或该ndRGDBP是与SEQ ID NO:37具有至少95％序列同一性的CasJ RGN或ndRGDBP，并且编码该CasJ ndRGDBP或其变体的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ IDNO:38具有至少95％序列同一性；
(v)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的Cas12j-1ndRGDBP，并且编码该Cas12j-1ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性；
(vi)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:132具有至少95％序列同一性的Cas12j-2ndRGDBP，并且编码该Cas12j-2ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:133具有至少95％序列同一性；或
(vii)该ndRGDBP是与SEQ ID NO:144具有至少95％序列同一性的Cas12j-3ndRGDBP，并且编码该Cas12j-3ndRGDBP的大豆密码子优化的参考多核苷酸与SEQ ID NO:145具有至少95％序列同一性。
40.如权利要求28、30、36至38或39中任一项所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸：
(iii)编码包含该ndRGDBP的蛋白质并且与对照大豆植物细胞中内源基因的表达相比提供在该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中该内源基因的表达方面的至少2倍增加或减少，该对照大豆植物细胞包含对照大豆密码子优化的参考多核苷酸，该对照大豆密码子优化的参考多核苷酸编码该ndRGDBp；或
(iv)编码该RGN并与对照大豆植物细胞中内源靶序列的切口或切口相关修饰相比提供该大豆植物细胞的核、质体或线粒体基因组中的该内源靶序列的切口或切口相关修饰方面的至少2倍增加，该对照大豆植物细胞包含编码该RGN的对照大豆密码子优化的参考多核苷酸。
41.如权利要求28至34、36至38或39中任一项所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸包含编码该RNA指导的核酸内切酶蛋白或RNA指导的DNA结合蛋白的RNA分子。
42.如权利要求28至34、36至38或39中任一项所述的大豆植物细胞，其中该大豆植物细胞进一步包含指导RNA或编码指导RNA的多核苷酸。
43.如权利要求28至34、36至38或39中任一项所述的大豆植物细胞，其中该大豆植物细胞进一步包含与该靶编辑位点具有同源性的供体模板DNA分子。
44.如权利要求28至34、36至38或39中任一项所述的大豆植物细胞，其中该合成的多核苷酸可操作地连接至：
(a)在大豆植物细胞中可操作的启动子；
(b)5'非翻译(UT)序列和/或3'非翻译(UT)序列，任选地其中该5’UT和/或3’UT任选地(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；或(i)和(ii)的组合；
(c)多聚腺苷酸化序列；和/或
(d)编码核定位信号(NLS)、叶绿体转运肽(CTP)、表位标签(ET)、转录激活结构域(TAD)、转录阻遏结构域(TRD)的第二多核苷酸；或其组合；任选地，其中一个或多个该第二多核苷酸序列(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该NLS、CTP、ET、TAD或TRD的第二大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该NLS、CTP、ET、TAD或TRD的第二大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合；和/或
(e)编码具有修饰靶DNA的酶活性的异源多肽的第三多核苷酸序列；任选地，其中一个或多个该第三多核苷酸序列(i)具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；(ii)具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；(iii)具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码该异源多肽的第三大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合。
45.如权利要求44所述的大豆植物细胞，其中由该第三多核苷酸序列编码的异源多肽表现出一种或多种选自以下的酶活性：核酸酶活性、甲基转移酶活性、去甲基化酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨基活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性和/或糖基化酶活性。
46.如权利要求28、30、36至38或39中任一项所述的大豆植物细胞，其中该ndRGDBP包含HNH和/或RuvC样核酸酶结构域中的突变，或任选地其中所述突变是：(i)SEQ ID NO:1的Cas9蛋白中的D10A和/或H840A突变；(ii)SEQ ID NO:25的FnCpf1蛋白中的D917A、E1006A、E1028A、D1255A和/或N1257A突变；(iii)SEQ ID NO:37的CasJ蛋白中的D901A、E1128A和/或D1298A突变；或(iv)SEQ ID NO:73的LbCpf1蛋白中的D832A、E925A和/或D1148A突变。
47.如权利要求28、30、36至38或39中任一项所述的大豆植物细胞，其中该RGN包含HNH或RuvC样核酸酶结构域中的突变，或任选地其中所述突变是：(i)SEQ ID NO:1的Cas9蛋白中的D10A突变；(ii)SEQ ID NO:25的FnCpf1蛋白中的R1226A氨基酸突变；(iii)SEQ ID NO:73的LbCpf1蛋白中的R1138A突变；(iv)SEQ ID NO:120的残基D371、E579、D673、C640、C643、C646、C661或C664；(v)SEQ ID NO:132的残基D394、E606、D697、C667、C670、C673、C685或C688；或(vi)SEQ ID NO:144的残基D413、E618、D710、C680、C683、C687、C698或C701。
48.一种大豆植物、植物部分、组织或愈伤组织，其包含如权利要求28至34、36至38或39中任一项所述的大豆植物细胞。
49.如权利要求48所述的大豆植物部分，其中：
(a)该部分是茎、荚、叶、芽、根或种子；
(b)该组织是愈伤组织、分生组织或胚组织；或
(c)该组织是胚愈伤组织。
50.一种获得如权利要求28至34、36至38或39中任一项所述的大豆植物细胞的方法，该方法包括：
(a)将编码包含该RNA指导的核酸内切酶(RGE)、该RNA指导的切口酶(RGN)或该核酸酶缺陷型受RNA指导的DNA结合蛋白(ndRGDBP)的蛋白质的合成的多核苷酸引入该大豆植物细胞，其中所述多核苷酸具有的GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量大于47％或48％；具有的熔化温度(Tm)大于89或90摄氏度；具有的大豆密码子适应指数(sCAI)低于编码RGE的大豆密码子优化的参考多核苷酸的sCAI；所述GC含量、Tm和/或较低sCAI的任何组合；并且
(b)选择包含该合成的多核苷酸的植物细胞。
51.一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:122-131、134-143或146-185中的任一个。
52.一种编码Cas12j多肽的分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含对应于以下的突变或残基：
(a)SEQ ID NO:120的C640、SEQ ID NO:132的C667或SEQ ID NO:144的C680；
(b)SEQ ID NO:120的C643、SEQ ID NO:132的C670或SEQ ID NO:144的C683；
(c)SEQ ID NO:120的C646、SEQ ID NO:132的C673或SEQ ID NO:144的C687；
(d)SEQ ID NO:120的C661、SEQ ID NO:132的C685或SEQ ID NO:144的C698；或
(e)SEQ ID NO:120的C664、SEQ ID NO:132的C688或SEQ ID NO:144的C701。
53.一种编码多肽的分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含：
(a)SEQ ID NO:120，其具有选自由C640A、C643A、C646A、C661A、C664A、C640S、C643S、C646S、C661S和C664S组成的组的突变；
(b)SEQ ID NO:132，其具有选自由C667A、C670A、C673A、C685A、C688A、C667S、C670S、C673S、C685S和C688S组成的组的突变；或
(c)SEQ ID NO:144，其具有选自由C680A、C683A、C687A、C698A、C701A、C680S、C683S、C687S、C698S和C701S组成的组的突变。
54.一种重组核酸，其包含如权利要求51、52或53中任一项所述的分离的核酸。
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