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Promotores sinteticos.
ES2292234T3
Spain
- Other languages
English - Inventor
Benjamin A. Bowen Wesley B. Bruce Guihua Lu Lynne E. Sims Laura A. Tagliani - Current Assignee
- Pioneer Hi Bred International Inc
Description
translated from
Promotores sintéticos.
Esta invención se relaciona generalmente con el
campo de la biología molecular vegetal y en particular para mejorar
la expresión de los genes estructurales deseados en ambas plantas
monocotiledóneas y dicotiledóneas.
La expresión génica abarca un número de etapas
que originan de la plantilla del ADN finalmente a la proteína o el
producto de la proteína final. El control y la regulación de la
expresión génica pueden ocurrir a través de numerosos mecanismos.
La iniciación de la transcripción de un gen se piensa generalmente
como el control predominante de la expresión génica. Los controles
transcripcionales (o promotores) se relegan generalmente a las
secuencias relativamente cortas incrustadas en la región
flanqueante-5' o del extremo 5' del gen transcrito.
Existen secuencias de ADN que afectan la expresión génica en
respuesta al estímulo ambiental, disponibilidad de nutrientes, o
condiciones adversas que incluyen choque térmico, anaerobiosis o la
presencia de metales pesados. También hay secuencias de ADN que
controlan la expresión génica durante el desarrollo o en un tejido,
o una forma específica del órgano.
Los promotores contienen las señales para que la
polimerasa del ARN comience la transcripción de modo que la
síntesis de la proteína pueda proceder. El ADN que une, las
proteínas nucleares interactúa específicamente con estas secuencias
cognadas de ADN del promotor para promover la formación del complejo
transcripcional y eventualmente iniciar el proceso de la expresión
génica.
Uno de los motivos más comunes de las secuencias
presentes en los promotores de genes transcritos por un sistema II
(polll) de la polimerasa de ARN eucariota es el elemento "TATA"
que reside en el extremo 5' del inicio de la transcripción. Los
promotores eucariotas son complejos y abarcan los componentes que
incluyen una secuencia consenso de la caja TATA a aproximadamente
35 pares de bases 5' relativo al sitio inicial de transcripción o
sitio remate que se define como +1. El motivo TATA es el sitio donde
la proteína que une TATA (TBP) como parte de un complejo de varios
polipéptidos (complejo TFIID) se une e interactúa productivamente
(directa o indirectamente) con los factores unidos a otros
elementos de las secuencias del promotor. Este complejo TFIID a su
vez recluta el complejo de la polimerasa de ARN II que se colocará
para iniciar la transcripción generalmente 25 a 30 pares de bases
del extremo 3' del elemento TATA y promueve la elongación que
produce las moléculas del ARN. Las secuencias más o menos al inicio
de la transcripción (denominadas INR) de algunos genes polII
parecen proporcionar un sitio de enlace alterno para los factores
que también reclutan los miembros del complejo TFIID y así
"activan" la transcripción. Estas secuencias INR son
particularmente relevantes en los promotores que carecen de
elementos funcionales TATA proporcionando los sitios de enlace
promotor central para la transcripción eventual. Se ha propuesto
que los promotores que contienen ambos un TATA funcional y un
motivo INR son los más eficientes en la actividad transcripcional.
(Zenzie-Gregory et al. (1992) J. Biol.Chem.
267:2823-2830).
En la mayoría de los casos, los elementos de las
secuencias con excepción del motivo TATA se requieren para la
transcripción exacta. Tales elementos se localizan con frecuencia en
el extremo 5' del motivo TATA y un subconjunto puede tener
homología con la secuencia consenso CCAAT.
Se ha encontrado que otras secuencias de ADN
elevan el nivel total de expresión de los genes cercanos. Uno de
los elementos más comunes que ha sido descrito reside lejos del
extremo 5' del sitio de iniciación y parece mostrar características
de posición y orientación independientes. Estos elementos lejanos
del extremo 5' se han denominado potenciadores.
Uno de los elementos menos comunes en virtud de
sus especificidades son las secuencias que interactúan con factores
que unen el ADN específico. Estos motivos de secuencias se conocen
colectivamente como elementos del extremo 5' que son dependientes
generalmente de la posición y la orientación.
Muchos elementos del extremo 5' se han
identificado de un número de promotores de la planta basados
inicialmente en la función y en segundo término en las homologías
de las secuencias. Estos elementos del extremo 5' del promotor
oscilan ampliamente en el tipo de control: de respuestas ambientales
como temperatura, humedad, lesiones, etc., señales de desarrollo,
(germinación, maduración de la semilla, floración, etc.) para la
información espacial (especificidad del tejido). Estos elementos
también parecen mostrar modularidad en eso pueden ser
intercambiados con otros elementos mientras que mantienen su control
característico sobre la expresión génica.
Los promotores usualmente se sitúan 5' o en el
extremo 5' relativo al inicio de la región codificante al gen
correspondiente, y la región total que contiene todos los elementos
auxiliares que afectan la regulación o los niveles absolutos de
transcripción se pueden contener de menos de 100 pares de bases o
tanto como 1 par de kilobases.
Un número de promotores que son activos en las
células vegetales se han descrito en la literatura. Estos incluyen
los promotores nopalina sintasa (NOS) y octopina sintasa (OCS) (que
se llevan en el tumor que induce los plásmidos del Agrobacterium
tumefaciens). También se incluyen, el virus mosaico de la coliflor
(CaMV) 19S y los promotores 35S, el promotor
leve-inducible a partir de la pequeña subunidad de
carboxilasa bifosfato ribulosa (ssRUBICSO, un polipéptido vegetal
muy abundante), y el promotor sacarosa sintasa. Todos estos
promotores se han utilizado para crear varios tipos de
construcciones de ADN que se han expresado en las plantas. (Ver por
ejemplo la publicación PCT WO84/0291 Rogers, et al).
Dos promotores que se han utilizado ampliamente
en las transformaciones de las células vegetales son aquellos de
los genes que codifican el alcohol dehidrogenasa, AdhI y AdhII.
Ambos genes se inducen después del principio de la anaerobiosis. El
maíz AdhI ha sido clonado y secuenciado como ha sido el AdhII. La
formación de un gen quimérico AdhI, El Adh-Cat que
abarca el promotor AdhI conectado a la cloramfenicol
acetiltransferasa (CAT) que codifica las secuencias y la señal
nopalina sintasa (NOS) 3' causó la expresión CAT a niveles
aproximadamente 4-veces más altos, en
concentraciones de oxígeno bajas, que bajo las condiciones control.
Los elementos de la secuencia necesarios para la inducción
anaeróbica del ADH-CAT quimérico también han sido
identificados. Las existencias de elementos reguladores anaeróbicos
(ARE) entre las posiciones -140 y -99 del promotor AdhI de maíz
compuestos de al menos dos elementos de secuencias en las posiciones
-133 a -124 y las posiciones -113 a 99 ambos de los cuales se han
encontrado necesarios y son suficientes para la baja expresión de
oxígeno de la actividad del gen ADH-CAT. El
promotor Adh sin embargo responde a la anaerobiosis y no es un
promotor constitutivo limitando drásticamente su efectividad.
Otro promotor utilizado comúnmente es el
promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor. El promotor 35S
(CaMV) es un promotor de virus dicotiledóneo sin embargo dirige la
expresión de los genes introducidos en los protoplastos de
dicotiledóneas y monocotiledónea. El promotor 35S es un promotor muy
fuerte y esto explica su extenso uso para la expresión a alto nivel
de rasgos en plantas transgénicas. El promotor CaMV 35S sin embargo
también ha demostrado actividad relativamente baja en varias plantas
gramíneas de importancia agrícola tales como el trigo. Mientras que
todos estos promotores dan una expresión alta en las dicotiledóneas,
pocos dan niveles altos de expresión en monocotiledóneas. Existe
una necesidad para los promotores sintéticos y otros elementos que
inducen la expresión en células transformadas del protoplasto de las
monocotiledóneas.
Se proporcionan los métodos y composiciones para
la expresión de secuencias heterólogas en las células huésped. Las
composiciones encuentran particular uso en controlar la expresión de
secuencias en las plantas. Las composiciones de la invención
comprenden las secuencias promotor. En particular, se proporcionan,
una molécula sintética novedosa del promotor central y los
elementos reguladores útiles para controlar la expresión en las
células diana. El promotor central comprende una caja TATA y un
inicio de la transcripción. Además, la región "TATA para
iniciar" es 64% o más rica en GC. Los elementos reguladores
incluyen un elemento novedoso del extremo 5' y las regiones que
activan el extremo 5'. La región de activación del extremo 5' es
diferente del elemento del extremo 5' sintético. Los elementos se
pueden utilizar juntos o con otros elementos del promotor para
controlar la expresión de las secuencias de interés.
Es un objeto de primer orden de la invención,
proporcionar los elementos reguladores sintéticos que mejoren la
expresión de los genes introducidos en las células vegetales y los
tejidos vegetales.
Es un objeto de la invención proporcionar una
molécula del promotor recombinante que prevea los niveles altos
confiables de la expresión de genes introducidos en las células
diana. Es aún otro objeto de la invención proporcionar los
elementos potenciadores del extremo 5' heterólogos que pueden
mejorar la actividad de cualquier promotor.
Es otro objeto de la invención proporcionar
plantas, células vegetales y tejidos vegetales que contienen
cualquiera o ambos el promotor recombinante o el elemento del
extremo 5' de la invención.
Es otro objeto de la invención proporcionar los
vehículos para la transformación de las células vegetales que
incluyen vectores virales o plásmidos y casetes de expresión que
incorporan el promotor sintético y los elementos del extremo 5' de
la invención.
Es otro objeto de la invención proporcionar
células bacterianas que comprenden tales vectores para el
mantenimiento, y la transformación de la planta.
Otros objetos de la invención, serán evidentes a
partir de la descripción de la invención que sigue. De acuerdo con
la presente invención, así se proporciona una secuencia de ADN del
promotor vegetal sintético, dicha secuencia que comprende:
un motivo TATA;
un sitio inicial de transcripción;
una región entre dicho motivo TATA y dicho sitio
inicial que es al menos 64% rica en GC;
un elemento del extremo 5'; y
una región de activación del extremo 5',
en donde dicha secuencia del promotor comprende
una secuencia seleccionada del grupo que consiste de:
- a)
- una secuencia de nucleótidos publicada en la SEQ ID NO: 12, y
- b)
- una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad de la secuencia con a).
La invención también proporciona un casete de
expresión que comprende:
una secuencia de ADN del promotor sintético de
la invención;
un gen estructural ligado de manera operable a
dicho promotor; y
una señal de poliadenilación del sitio de
terminación de la transcripción.
La invención también proporciona un vector de
ácidos nucleicos que comprende un promotor de la invención ligado
de manera operable a un gen estructural.
La invención también proporciona una célula
huésped procariota o eucariota transformada con un vector de ácidos
nucleicos de la invención.
La invención también proporciona un método de
control del nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos
transgénica en una célula vegetal, dicho método que comprende la
transformación de dicha célula vegetal con un casete de expresión
de la invención.
La invención también proporciona una planta
transgénica que comprende una célula vegetal o progenitor de esta
que ha sido transformada con un vector de ácidos nucleicos de la
invención.
La invención también proporciona una planta
transformada que contiene en su genoma un casete de expresión de la
invención.
La invención también proporciona una planta
transgénica que expresa un gen oxalato oxidasa exógeno a un nivel
alto en donde dicho gen oxalato oxidasa esta bajo el control
transcripcional de un promotor recombinante de la invención.
La invención también proporciona una semilla de
un vegetal de la invención, una semilla que contiene en su genoma
un promotor recombinante de la invención.
Figura 1 es una descripción de una configuración
base del nucleótido típica de un promotor central que contiene las
secuencias consenso de los motivos TATA e INR presentes en los
promotores de la planta. A denomina +1 de la región transcrita.
Figura 2 es una descripción de la Secuencia del
Promotor Core Syn II completa con un ejemplo de un promotor de la
planta y ambos se alinean en el inicio principal de la transcripción
(letra en negrilla). El motivo TATA se subraya. El promotor 35S
CaMV se muestra con el porcentaje de las secuencias del contenido de
GC en paréntesis.
Figura 3 es la secuencia de ADN del elemento
Rsyn 7 del extremo 5'. Los motivos TGACG se indican en negrilla.
Figura 4 es un mapa del plásmido del promotor
Central Syn II y los elementos Rsyn7 conducen un GUS que contiene
la construcción.
Figura 5 describe varios esquemáticos de los
promotores sintéticos probados en los transformables transitorios y
estable.
Figura 6 es una descripción de datos de ensayo
transitorio utilizando los plásmidos que incorporan las secuencias
del promotor central descritos aquí.
Figura 7(A). Actividad de Rsyn7::GUS
(PHP6086) para las plantas del maíz T0.
Figura 7(B) es un esquemático de la etapa
VT de las plantas de maíz con los sitios de muestras del tejido
indicado.
Figura 8 describe la actividad GUS en segmentos
de raíz de una población segregada de los semilleros transgénicos
T1 del maíz que contienen el Rsyn7::GUS (PHP6086) o la construcción
UBI:GUS (PHP3953).
Figura 9 describe la expresión GUS de tres
promotores sintéticos en plantas transgénicas del maíz T0 que
incluyen las secuencias del promotor central descritos aquí como
comparación.
Figura 10 muestra la comparación de las
actividades del promotor Rsyn7, el promotor 35S CaMV, y el promotor
35SU 7Rsyn7 en la expresión transitoria en cotiledones del
girasol.
Figura 11 muestra el efecto de la región de
activación del extremo 5' de Ubi-l en la
potencia del promotor Rsyn-7 en la expresión
transitoria en los cotiledones del girasol.
Figura 12 muestra que en los callos de girasol
transformados estables, la expresión GUS detrás del control del
35SURsyn7 es 20% más alta que cuando detrás del control del promotor
35S CaMV.
Figura 13 muestra el efecto de la región de
activación del extremo 5' de Ubi-l en la
actividad del promotor Rsyn7 en el ensayo de callos del girasol
transgénicos.
En la descripción que sigue un número de
términos se utilizan extensamente. Las siguientes definiciones se
proporcionan con el fin de eliminar ambigüedades en el intento o
alcance de sus usos en la especificación y las reivindicaciones, y
para facilitar la comprensión de la invención.
Un gen estructural es una secuencia de ADN que
se transcribe en el ARN mensajero (mARN) el cual luego se traduce
en una secuencia de aminoácidos característicos de un polipéptido
específico.
Un promotor es una secuencia de ADN que dirige
la transcripción de un gen estructural. Usualmente un promotor se
localiza en la región 5' de un gen, próximo al sitio inicial
transcripcional de un gen estructural. El promotor de la invención
comprende un promotor central según lo definido abajo.
Adicionalmente, el promotor incluye los elementos del extremo 5'.
Tales elementos incluyen UARs y opcionalmente, otras secuencias de
ADN que afectan la transcripción de un gen estructural tal como un
elemento del extremo 5' sintético.
Un promotor central o promotor mínimo contiene
las secuencias de nucleótidos esenciales para la expresión de la
secuencia codificante ligada de manera operable, que incluyen la
caja TATA y el inicio de la transcripción. Por esta definición, un
promotor central puede o no tener actividad detectable en la
ausencia de secuencias específicas que pueden potenciar la
actividad o conferir actividad específica del tejido. Por ejemplo,
el promotor central del gen SGB6 del maíz consiste de
aproximadamente 37 nucleótidos 5' del sitio inicial transcripcional
del gen SGB6, mientras que el promotor central del Virus del Mosaico
de la Coliflor (CaMV) 35S consiste de aproximadamente 33
nucleótidos 5' del sitio inicial transcripcional del genoma 35S.
ADH se refiere generalmente a un gen alcohol
dehidrogenasa vegetal expresable y específicamente al gen alcohol
dehidrogenasa del maíz.
ADH 1 UAR se refiere al fragmento de ADN que
abarca la región entre las posiciones del nucleótido aproximadamente
-1094 a aproximadamente -106 del gen alcohol dehidrogenasa 1 del
maíz, o el fragmento homólogo que es equivalente funcionalmente. La
secuencia se enumera con el inicio del sitio de transcripción,
denominada como +1 de acuerdo con la corrección publicada por Ellis
et al. (1987) supra.
"TATA para iniciar" significaría la
secuencia entre el motivo TATA de primer orden y el inicio de la
transcripción.
Un ADN sintético es una secuencia de ADN creada
artificialmente que no se produce de modo natural, y se debe
introducir a un organismo o a un progenitor de ese organismo para
controlar o para ser expresado.
El elemento OCS se refiere al motivo TGACG
identificado del gen octopina sintasa, los genes histona, genes de
enzimas para la biosíntesis de la agropina, el gen mannopina
sintasa, el gen CaMV 35S, gen H3 histona y gen nopalina sintasa.
Según se utiliza aquí el término incluye cualquier secuencia capaz
de unir el factor ASF-1 según lo identificado en
Patente U.S. No. 4,990,607 por Katagiri.
UAR es usualmente un elemento dependiente de la
posición u orientación que en primer lugar dirige el tejido, tipo
de célula, o expresión regulada.
Un potenciador es un elemento regulador de ADN
que puede incrementar la eficiencia de la transcripción a pesar de
la distancia u orientación del potenciador relativo al sitio inicial
de la transcripción.
El término expresión se refiere a la biosíntesis
de un producto génico. En el caso de un gen estructural, la
expresión involucra la transcripción del gen estructural en mARN y
luego la traducción del mARN en uno o más polipépti-
dos.
dos.
Un vector de clonación es una molécula de ADN
tal como un plásmido, cósmido o fago bacteriano que tiene la
capacidad de replicación autónomamente en una célula huésped. Los
vectores de clonación usualmente contienen uno o un número pequeño
de sitios de reconocimiento de la restricción de la endonucleasa en
los cuales las secuencias de ADN foráneo se pueden insertar de una
manera determinable sin pérdida de función biológica individual del
vector, así como un gen marcador que es apropiado para utilizar en
la identificación y selección de las células transformadas con el
vector de clonación. Los genes marcadores usualmente incluyen los
genes que proporcionan la resistencia a la tetraciclina,
resistencia a la higromicina o resistencia a la ampicilina.
Un vector de expresión es una molécula de ADN
que comprende un gen que se expresa en una célula huésped.
Usualmente la expresión génica se coloca bajo el control de ciertos
elementos reguladores que incluyen promotores, elementos
reguladores de tejido específico, y potenciadores. Tal gen se indica
para ser "ligado de manera operable a" los elementos
reguladores.
Un huésped recombinante puede ser cualquier
célula procariota o eucariota que contiene ya sea un vector de
clonación o un vector de expresión. Este término también incluye
aquellas células procariotas o eucariotas que se han modificado
genéticamente para contener los genes clonados en el cromosoma o en
el genoma de la célula huésped.
Una planta transgénica es una planta que tiene
una o más células vegetales que contienen un vector de
expresión.
Será entendido que puede haber variaciones
menores de la secuencia dentro de la secuencia o los fragmentos
utilizados o revelados en esta aplicación. Por "variaciones
menores" se pretende que las secuencias tengan al menos 80%,
preferiblemente 90% de identidad de la secuencia. Estas variaciones
se pueden determinar por técnicas estándar para permitir a aquellos
de ordinaria habilidad en el oficio manipular y poner en utilidad
las unidades funcionales de los elementos del promotor necesarios
para dirigir la iniciación de la transcripción en el gen
estructural seguido por una señal de terminación de transcripción (y
quizás poliadenilación) expresable de la planta.
El tejido vegetal incluye tejidos o plantas
diferenciadas y sin diferencias, que incluyen pero no limitan a
raíces, tallos, brotes, hojas, polen, semillas, tejido tumoral y
varias formas de células y cultivo tales como células simples,
protoplasto, embriones, y tejido de callos. El tejido vegetal puede
estar en plantas o en cultivo de órganos, tejidos o células.
Un elemento revelado aquí, el promotor central,
se muestra en la SEQ ID NO: 1. El promotor central es capaz de
conducir la expresión de una secuencia codificante en una célula
diana, particularmente las células vegetales. El promotor central
encuentra uso en conducir la expresión de las secuencias que
solamente son necesarias a niveles mínimos en las células diana.
También se revela un elemento novedoso del extremo 5', SEQ ID NO:2,
que ayuda a potenciar la transcripción. El promotor central
sintético se puede utilizar con combinaciones del potenciador,
elementos del extremo 5', y/o secuencias que activan a partir de las
regiones flanqueantes de 5' de los genes estructurales expresables
de la planta. Del mismo modo el elemento del extremo 5' se puede
utilizar en combinación con varias secuencias del promotor central
de la planta. El promotor central y elemento del extremo 5' se
pueden utilizar juntos para obtener una expresión
diez-veces más alta de un gen marcador introducido
en plantas transgénicas monocotiledóneas que se obtienen con el
promotor ubiquitin I del maíz.
El promotor central comprende un motivo TATA y
una región "TATA para iniciar la transcripción" rica en GC
(64% o más del contenido de GC) que es generalmente característico
de los promotores de animales. La secuencia se coloca en 5' de un
gen estructural y estimulará la expresión constitutiva que es tejido
no-específica en células de plantas
transgénicas.
También se describe aquí un casete de expresión
que comprende el elemento del extremo 5', el promotor central
sintético, un gen estructural, la expresión que se desea en las
células vegetales, y una señal de poliadenilación o de parada. El
casete de expresión se puede incluir en vectores virales o plásmidos
para la transformación de las células del protoplasto de la
planta.
La invención también abarca las células
bacterianas transformadas para el mantenimiento y replicación del
vector, así como las células monocotiledóneas o dicotiledóneas
transformadas y finalmente las plantas transgénicas.
También se revela aquí un elemento del extremo
5' que se pueden utilizar en combinación con el promotor sintético
o con otros promotores conocidos en el oficio. El elemento del
extremo 5' comprende al menos 3 motivos (TGACG) unidos a OCS con
una secuencia que interviene novedosa. Una modalidad se revela en la
SEQ ID NO: 2 y se coloca 5' a una secuencia del promotor central
para potenciar los niveles de transcripción del producto génico
resultante. De esta manera describimos un casete de expresión que
comprende el elemento del extremo 5' sintético de la invención, 5'
en un promotor inducible de la planta que está en 5' en un gen
estructural. Este casete de expresión se puede incorporar en los
vectores y plásmidos según lo descrito previamente.
El elemento del extremo 5' sintético se puede
utilizar en combinación con la secuencia del promotor central
sintético para lograr la expresión constitutiva de tejido
no-específico del producto génico que es un
incremento de diez-veces del promotor
Ubi-l del maíz.
La presente invención abarca una construcción
del promotor que comprende el promotor central sintético descrito
arriba y una región de activación del extremo 5'. La región de
activación del extremo 5' es diferente del elemento del extremo 5'
sintético. Preferiblemente la región de activación del extremo 5' es
una región de activación del extremo 5' (UAR) que tiene
considerable similaridad de secuencia con la UAR de CaMV 35S. Las
construcciones del promotor de la invención comprenden el promotor
central sintético en combinación con una UAR y un elemento del
extremo 5' sintético.
La construcción del promotor se puede incluir
por conveniencia en un casete de expresión. Este casete de expresión
se puede incluir en vectores de transformación.
La secuencia de la región de activación del
extremo 5' (UAR) del gen Ubi-l del maíz también se
revela. Esta UAR se puede utilizar en combinación con cualquier
promotor central para potenciar la actividad del promotor.
El promotor central como se ve en la SEQ ID NO:
1 y/o SEQ ID NO: 10 (promotor central modificado), se pueden
utilizar para obtener niveles altos de la expresión de genes
estructurales. Del mismo modo el elemento del extremo 5' de la SEQ
ID NO: 2 se puede utilizar en combinación con otros promotores o el
promotor de la invención para potenciar los niveles de la
transcripción en las plantas modificadas genéticamente. La
producción de un tejido vegetal modificado genéticamente que
expresa un gen estructural bajo el control de los elementos
reguladores de la invención combina las instrucciones de la presente
divulgación con una variedad de técnicas y expedientes conocidos en
el oficio. En la mayoría de los casos existen expedientes alternos
para cada etapa del proceso completo. La elección de los
expedientes depende de las variables tales como el sistema del
vector plásmido seleccionado para la clonación e introducción de la
molécula de ADN recombinante, las especies vegetales a ser
modificadas, el gen estructural particular, los elementos del
promotor y los elementos del extremo 5' utilizados. Las personas de
habilidad en el oficio son capaces de seleccionar y utilizar
alternativas apropiadas para lograr la funcionabilidad. Las
condiciones de cultivo para expresar los genes estructurales
deseados y las células cultivadas son conocidas en el oficio.
También según se conoce en el oficio, se pueden obtener, un número
de ambas especies vegetales monocotiledóneas y dicotiledóneas son
transformables y regenerables tal que las plantas completas que
contienen y que expresan los genes deseados bajo el control
regulador de las moléculas promotor de la invención. Como se conoce
por aquellos de habilidad en el oficio, la expresión en plantas
transformadas puede ser específica al tejido y/o específica a
ciertas etapas para el desarrollo o influencias ambientales. La
selección del promotor truncada y la selección del gen estructural
son otros parámetros que pueden ser optimizados para lograr la
expresión vegetal deseada como se conoce por aquellos de habilidad
en el oficio y se enseña aquí.
Las secuencias de nucleótidos de la invención se
pueden introducir en cualquier vegetal. Los genes que se
introducirán se pueden utilizar convenientemente en los casetes de
expresión por la introducción y expresión en cualquier planta de
interés.
Tales casetes de expresión comprenderán un
promotor de la invención unido a una secuencia de nucleótidos de
interés. Tal casete de expresión se proporciona con una pluralidad
de los sitios de restricción por inserción del gen de interés para
estar bajo la regulación transcripcional de las regiones
reguladoras. El casete de expresión puede adicionalmente contener
genes marcadores seleccionables.
El casete transcripcional incluirá en la
dirección 5'-3' de la transcripción, una región de
iniciación transcripcional y de traducción, una secuencia de ADN de
interés, y una región de terminación transcripcional y de traducción
funcional en plantas. La región de terminación puede ser nativa con
la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la
secuencia de ADN de interés, o puede ser derivada de otra fuente.
Las regiones de terminación convenientes están disponibles del
Tiplasmid de A. tumefaciens, tales como las regiones de
terminación octopina sintasa y nopalina sintasa. Ver también,
Guerineau et al., (1991) Mol. Gen. Genet.
262:141-144; Proudfoot (1991) Cell
64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev.
5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell
2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene
91:151-158; Ballas et al. 1989) Nucleic Acids
Res. 17:7891-7903; Joshi et al. (1987)
Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
Los genes descritos aquí se proporcionan en
casetes de expresión para la expresión en la planta de interés. El
casete incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' ligadas de manera
operable al gen de interés. El casete puede adicionalmente contener
al menos un gen adicional para ser cotransformado en el organismo.
Alternativamente, el o los genes adicionales pueden ser
proporcionados en otro casete de expresión. Donde es apropiado, el
gen(s) puede ser optimizado para incrementar la expresión en
la planta transformada. Es decir que, los genes se pueden
sintetizar utilizando codones preferidos de plantas para mejorar la
expresión. Los métodos están disponibles en el oficio para
sintetizar los genes preferidos de las plantas. Ver, por ejemplo,
Patente U.S. Nos. 5,380,831, 5,436, 391, y Murray et al.
(1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.
Se conocen modificaciones de la secuencia
adicionales para potenciar la expresión génica en un huésped
celular. Estas incluyen eliminación de las secuencias que codifican
las señales de poliadenilación falsas, señales del sitio de
división y empalme exón-intrón, repeticiones
semejantes a transposón, y otras secuencias bien caracterizadas que
pueden ser nocivas a la expresión génica. El contenido
G-C de la secuencia se puede ajustar a niveles
promedios para un huésped celular dado, como se calcula por
referencia a aquellos genes conocidos expresados en la célula
huésped. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar
las predichas estructuras de horquilla del mARN secundario.
La selección de un vector de expresión apropiado
dependerá del método para introducir el vector de expresión en las
células huésped. Usualmente un vector de expresión contiene (1)
elemento de ADN procariota que codifica para un origen de una
replicación bacteriana y un gen de resistencia a un antibiótico para
proporcionar la amplificación y selección del vector de expresión
en un huésped bacteriano; (2) elementos de ADN que controlan la
iniciación de la transcripción tal como un promotor; (3) elementos
de ADN que controlan el proceso de las transcripciones tales como
los intrones, terminación de la transcripción/secuencia de
poliadenilación; y (4) un gen indicador que se liga de manera
operable a los elementos de ADN para controlar la iniciación de la
transcripción. Los genes indicadores útiles incluyen
\beta-glucoronidasa,
\beta-galactosidasa, cloramfenicol acetil
transferasa, luciferasa, proteína fluorescente verde (GFP) y
similares. Preferiblemente el gen indicador es ya sea
\beta-glucoronidasa (GUS), GFP o luciferasa. Las
descripciones generales de vectores de expresión de las plantas y
genes indicadores se pueden encontrar en Gruber, et al.,
"Vectors for Plant Transformation, in Methods in Plant Molecular
Biology & Biotechnology" en Glich et al., (Eds. pp.
89-119, CRC Press, 1993). Adicionalmente los
vectores de expresión GUS y casetes del gen GUS están disponibles de
Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, California mientras los
vectores de expresión luciferasa y casetes del gen luciferasa están
disponibles de Promega Corp. (Madison, Wisconsin).
Los vectores de expresión que contienen
fragmentos genómicos o sintéticos se pueden introducir en los
protoplastos o en los tejidos intactos o células aisladas.
Preferiblemente los vectores de expresión se introducen en tejido
intacto. Los métodos generales de cultivos de tejidos vegetales se
proporcionan por ejemplo por Maki et al. "Procedures for
Introducing Foreign ADN into Plants" en Methods in Plant
Molecular Biology & Biotechnology, Glich et al. (Eds.
pp. 67-88 CRC Press, 1993); y por Phillips et
al. "Cell- Tissue Culture and In-Vitro
Manipulation" en Corn & Corn Improvement, 3rd Edition
Sprague et al. (Eds. pp. 345-387) American
Society of Agronomy Inc. et al. 1988.
Los métodos para introducir los vectores de
expresión en el tejido vegetal incluyen la infección directa o
co-cultivo de la célula vegetal con Agrobacterium
tumefaciens, Horsch et al., Science, 227:1229 (1985).
Las descripciones de los sistemas del vector Agrobacterium y los
métodos para la transferencia del gen mediada por el Agrobacterium
por Gruber, et al. supra.
Preferiblemente, los vectores de expresión se
introducen en maíz u otros tejidos vegetales utilizando un método
directo de transferencia del gen tales como entrega mediada por
microproyectiles, inyección de ADN, electroporación y similares.
Más preferiblemente los vectores de expresión se introducen en los
tejidos vegetales utilizando la entrega del medio de
microproyectiles con el dispositivo biolístico. Ver, por ejemplo,
Tomes et al. "Direct DNA transfer into intact plant cells
via microproyectiles bombardment" In: Gamborg and Phillips (Eds.)
Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods,
Springer-Verlag, Berlin (1995).
Los vectores de la invención no pueden solamente
ser utilizados para la expresión de genes estructurales sino
también pueden ser utilizados en la clonación
exón-trampa, o procedimientos de promotor trampa
para detectar la expresión génica diferencial en variedades de
tejidos, K. Lindsey et al., 1993 "Tagging Genomic Sequences
That Direct Transgene Expression by Activation of a Promoter Trap
in Plants", Transgenic Research 2:33-47. D. Auch
& Reth, et al., "Exon Trap Cloning: Using PCR to
Rapidly Detect and Clone Exons from Genomic ADN fragmentos",
Nucleic Acids Research, Vol. 18, No. 22, p. 6743.
La identificación del promotor central se basa
en parte en el descubrimiento que una región "TATA para
iniciar" rica en GC en un promotor de la planta actúa como un
promotor central muy fuerte de tejido no-específico
que induce la expresión constitutiva en las células vegetales. El
elemento TATA de los promotores de la planta de los genes polII
generalmente tienen la secuencia
TATA(A/T)A(A/T)A, SEQ ID NO:3, mientras
el consenso del inicio de la transcripción consiste de la secuencia
5'...TYYTCAT(A/C)AA..3'. SEQ ID NO.:3, donde la A
designa la base inicial para la transcripción. La secuencia del
promotor vegetal típica se describe en la Figura 1.
Se ha mostrado que las secuencias que
intervienen el elemento TATA y el inicio de la transcripción juegan
un papel significante en la eficiencia de la activación
transcripcional. La proteína que une TATA se ha demostrado que
interactúa con el surco menor de la doble hélice unida al motivo
TATA doblada hacia en lado del surco principal (Kim, et al.
1993, Nature, 365: 512-520). Siguen de esta manera
las secuencias del extremo 3' del motivo TATA que impacta este
descubrimiento afectarán la eficiencia de la formación
transcripcional del complejo estable y finalmente la expresión. El
reconocimiento de las regiones "TATA para iniciar" de los
promotores de la planta muestran un nivel significativamente más
alto de las secuencias ricas en AT conducen al potencial de la
compresión menor del surco (Yaurawj et al Biological
Abstracts Vol. 47, Issue 8, Ref. 144712, "Consensus Sequences for
Plant Minimal Promoters" Annual Meeting of the American Society
of Plant Physiologists, July 29-August 2, 1995,
Plant Physiology 108 [2 Supp.] 1995, 114). Generalmente los
promotores de animales muestran una secuencia rica en GC "TATA
para iniciar" que conduce a una compresión del surco principal
que sugiere que el promedio de los complejos del promotor central
transcripcional de plantas y animales reconocen e interactúan con
un TATA algo diferente para iniciar la estructura con la diferencia
de la secuencia correspondiente. Muy sorprendentemente el aplicante
ha encontrado que un promotor sintético tipo animal rico en GC
trabaja muy bien en las plantas.
Mientras la invención no se limita por ninguna
teoría, es posible que el motivo TATA rico en AT presente en una
secuencia rica en GC pueda "por sí mismo presentar" más
destacadamente al complejo enlace-TATA por una
demarcación afilada del motivo TATA que podrían interactuar más
estrechamente con el complejo enlace-TATA. Esto
podría mejorar el inicio de la eficiencia de la transcripción,
alternando el equilibrio del enlace a una forma más estabilizada,
mientras que la versión "TATA no-unida", i.e.
que tiene un nivel más alto de las secuencias ricas en AT que
flanquean el motivo TATA, el complejo enlace-TATA
podría potencialmente deslizarse o vacilar 5' o 3' al sitio inicial
y reducir efectivamente la eficiencia de unir finalmente la
transcripción reducida. Pocos datos respecto a esta región de
promotores de la planta es disponible excepto de las deleciones
crudas y algunas mutaciones punto. El diseño obvio de un promotor
central sintético para la expresión de la planta podría incluir la
secuencia "TATA para iniciar" rico en AT basado en la
inspección de promotores de la planta conocidos. Sin embargo,
basado en el mecanismo "ligado", se postula por el mecanismo de
la invención que un promotor central más eficiente es un resultado
de un motivo TATA incrustado en una secuencia rica en GC.
La Figura 2 describe la secuencia del promotor
Central Syn II, SEQ ID NO: 1, con ejemplos de promotores centrales
de la planta alineados al inicio principal de la transcripción. Otro
ejemplo de un promotor de la planta 35S de CaMV (SEQ ID NO:4) se
muestra con el porcentaje de las secuencias ricas en GC se mostraron
a la derecha en el paréntesis. La secuencia Central Syn II no
muestra ninguna homología de la secuencia significante a las
secuencias en las bases de datos públicos de la secuencia.
La secuencia del promotor sintético Coren Syn II
muestra una secuencia "TATA para iniciar" 64% rica en GC
diferente de la secuencia completa 40% rica en GC presente en los
promotores tradicionales de la planta (CaMV35S por ejemplo). El
promotor central UBI que ocurre de modo natural y aislado que
potencia niveles muy altos de la actividad en las monocotiledóneas
usualmente muestra una secuencia "TATA para iniciar" 64% rica
en GC más similar a los promotores de animales. Tales ejemplos
proveen el ímpetu para diseñar un elevada secuencia "TATA para
iniciar" rica en GC para la transcripción eficiente en oposición
al dogma corriente de los promotores centrales de la planta.
De esta manera el promotor de la invención
comprende una secuencia del promotor central sintético de la planta
que comprende un motivo TATA y una región "TATA para iniciar"
que es 64% rica en GC o más. En una modalidad preferida, el
promotor puede incluir la restricción de los sitios diana de la
endonucleasa para facilitar la clonación. En la modalidad más
preferida, la secuencia es aquella de la SEQ ID NO: 1. Como será
apreciado por aquellos de habilidad en el oficio, varias
transversiones base dentro de la SEQ ID NO: 1 puede ocurrir que
mantendrán el porcentaje del contenido de GC y se pretenden dentro
del alcance de esta invención. Por ejemplo las guaninas podrían ser
reemplazadas con citocinas y vice-versa sin
que afectan la eficacia completa del promotor, con la condición que
el porcentaje del contenido de GC se mantenga.
También se describe un elemento del extremo 5'
sintético situado en 5' en cualquier promotor que ocurre de modo
natural o sintético para utilizar en plantas, particularmente la
expresión génica del maíz.
De la actividad de numerosos promotores, los
elementos básicos (sitios de enlace) se han definido. Estos incluyen
por ejemplo regiones ricas en AT a partir de los promotores de
choque térmico, y elementos (AS-1) del sitio de
enlace ASF-1 presentes en octopina sintasa (OCS) y
promotores del Virus del Mosaico de la Coliflor.
AS-1 es uno de los mejores elementos conocidos del
extremo 5' y su secuencia enlace (elemento OCS) está presente en
muchos promotores constitutivos de la planta tales como los
promotores histona del trigo CaMV35S, A. tumefaciens, NOS y
OCS. El elemento OCS primero se aisló como un elemento potenciador
en el promotor del gen OCS donde fue identificado como una
secuencia palindrómica de 16-pares de bases (Ellis
et al. (1987) EMBO J. 6:11-16), pero ha sido
reducido a sus características esenciales como un motivo TGACG. Ver
Patente U.S. No. 4,990,607. El elemento del extremo 5' presente en
los promotores de la invención tiene una identidad del 71% al
elemento potenciador del promotor se revela en la Patente U.S.
5,023,179 to Lam et al. Las dos secuencias son muy
diferentes en sus secuencias flanqueadoras circundantes al motivo
TGACG, las regiones que se han mostrado por impactar el
mejoramiento del nivel de la transcripción. La actividad mejorada
transcripcional del elemento OCS se correlaciona con el enlace
in-vitro de un factor transcripcional. Los
elementos similares también se identificaron en las regiones del
promotor de seis otros genes de cADN involucrados en la síntesis de
opina y tres promotores virales vegetales que incluyen el promotor
35S CaMV (Bouchez et al. 1989) supra. Estos elementos
se mostraron que unen el factor de transcripción OCS
in-vitro y potencian la transcripción en las
células vegetales.
En tabaco un factor que une el ADN, TGA1, se
muestra que interactúa específicamente con el elemento
AS-1 ya sea solo o en conjunción con otros
elementos promotor. (Katagiri et al. 1989, Nature
340:727-730). Este factor también se demostró que
se expresa de una manera preferida en la raíz en las plantas de
tabaco. Los promotores centrales con una o dos copias del elemento
OCS del extremo 5' tienden a potenciar la expresión génica mientras
4 o más repeticiones de este elemento producen más o menos actividad
constitutiva a pesar de bajas relativas a los promotores 35S
intactos.
De esta manera también describimos un elemento
del extremo 5' sintético que se puede utilizar con el promotor
central descrito aquí u otros promotores centrales para potenciar la
expresión génica. El elemento incorpora tres motivos como OCS y las
secuencias novedosas que intervienen las cuales potencian la
expresión génica.
La Figura 3, SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia
completa del elemento del extremo 5' sintético RSyn7 que incorpora
al menos tres motivos como OSC de TGACG SEQ ID NO:5 que se indican
en negrilla.
Las secuencias que flanquean muchos elementos
tales como el motivo TGACG SEQ ID NO: 5 se han mostrado que tienen
impactos profundos en las afinidades del enlace de los factores que
unen el ADN y así juegan un papel importante como los motivos
centrales de ellos mismos. (Burrows et al. 1992, Plant
Molecular Biology 19:665-675, Shinder et al.
1992, Plant Cell 4:1309-1319, Foster et al.
1994, FASEBJ 8:192-200). Las secuencias novedosas
que flanquean el motivo TGACGs en el promotor Rsyn7 se han
determinado y establecen un claro mejoramiento de la actividad
transcripcional con varios promotores, particularmente cuando se
utilizan con el promotor Core Syn II.
El elemento Rsyn7 del extremo 5' ha sido clonado
en el extremo 5' del promotor Core Syn II conduciendo una
construcción GUS y tiene los niveles producidos de la actividad GUS
en las plantas transgénicas del maíz aproximadamente
diez-veces más alto que el promotor ubiquitin, el
promotor del maíz más fuerte a la fecha.
En el promotor de la presente invención, una
región de activación del extremo 5' (UAR), que es diferente del
elemento del extremo 5' sintético, se liga de manera operable al
promotor central sintético. También describimos que la UAR puede
ser utilizada sola o en combinación con el elemento del extremo 5'
sintético descrito aquí. Preferiblemente se utiliza, la región de
activación del extremo 5' del promotor 35S del virus del mosaico de
la coliflor (CaMV). Adicionalmente, las secuencias que tienen
similaridad de secuencia a esta UAR pueden ser utilizadas con tal
que tales secuencias retengan la habilidad para potenciar la
actividad del promotor. El mejoramiento se puede medir mediante un
análisis de los niveles de transcripciones o alternativamente la
producción de la proteína.
CaMV 35S UARs se han estudiado bien en el
oficio. La secuencia completa de nucleótidos del ADN de doble cadena
circular CaMV ha sido establecida en el oficio. Ver Guilley et
al. (1980) Cell 21:285-294. El promotor 35S
transcribe la transcripción del ARN 35S principal del genoma viral
circular por el núcleo de la polimerasa de ARN II. Ver Guilley
et al. (1982) Cell 30:763-773. Además, las
35S UARs pueden funcionar con un promotor heterólogo e incrementar
la expresión de un gen de interés en células y plantas transgénicas.
Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Se
han identificado elementos reguladores cis múltiples para la
actividad del promotor 35S CaMV. Ver Odell et al. (1985)
Nature 313:810-812; Fang et al. (1989) Plant
Cell 1:141-150.
En la presente invención, un fragmento grande de
las regiones que activan el extremo 5' (UARs) del promotor 35S CaMV
se pueden utilizar para potenciar la actividad del promotor
sintético central. El tamaño de la UAR puede, por ejemplo, oscilar
aproximadamente de 15 pares de bases a aproximadamente 850 pares de
bases, preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 500,
más preferiblemente de aproximadamente 20-25 a
aproximadamente 50-200 pares de bases. Una región
preferida del 35S CaMV del extremo región 5' incluye las secuencias
aproximadamente de -421 a aproximadamente -90. Se reconoce que las
modificaciones, en longitud y secuencia de nucleótidos se pueden
hacer a la región y aún resultar en la actividad mejorada del
promotor sintético central. Tales modificaciones se pueden analizar
por el efecto en la actividad utilizando sistemas de expresión como
se publica en la Sección Experimental de la presente aplicación.
Los números en el diagrama de la secuencia UAR indican la posición
del extremo 5' del sitio inicial de transcripción, o +1 posición del
gen estructural 35S. Por ejemplo, -25 significa una posición de 25
pares de bases del extremo 5' a partir del sitio inicial de
transcripción del gen estructural 35S.
La región de activación del extremo 5' del gen
ubiquitin del maíz Ubi-l también se describe.
La secuencia de la región reguladora de la transcripción del gen
Ubi-l se revela en la Patente US No.
5,510,474. Ver también Christensen et al. (1992) Plant Mol.
Biol. 18:675-689; Cornejo et al. (1993) Plant
Mol. Biol. 23:567-581; Takimoto et al.
(1994) Plant Mol. Biol. 26: 1007-1012; y Christensen
et al. (1996) Transgenic Res. 5:213-218. El
UAR del promotor del gen Ubi-1 comprende
preferiblemente de aproximadamente -867 a aproximadamente -54.
Según lo indicado arriba para el 35S UAR, también se describen las
modificaciones del Ubi-l UAR que funcionaran
para potenciar la actividad del promotor central.
Mientras que la secuencia completa del promotor
ubiquitin se ha publicado, esta es la primera divulgación de la Ubi
UAR. De esta manera, revelamos la UAR del promotor ubiquitin así
como la Ubi UAR en combinación con cualquier promotor.
Adicionalmente, se describen los métodos para utilizar la Ubi UAR
para potenciar la actividad de los promotores.
Las regiones que activan el extremo 5' según lo
descrito aquí se pueden unir con el promotor central sintético y/o
otros elementos del extremo 5' por cualquier método convencional que
se conoce usualmente en el oficio con tal que un elemento operativo
o promotor se construya. Las regiones que activan el extremo 5'
generalmente se ligan de manera operable en el extremo 5' del
promotor central. Cuando el elemento del extremo 5' sintético
también está presente, la regiones que activan el extremo 5' se
pueden unir a ya sea el extremo 5' del elemento del extremo 5'
sintético, el extremo 3' del promotor sintético central o insertar
entre el elemento del extremo 5' sintético y el promotor central
sintético. En una modalidad preferida las regiones que activan el
extremo 5' se ligan en la proximidad cercana al elemento del
extremo 5' sintético y el promotor central sintético. Por
proximidad cercana se pretende dentro de aproximadamente 1 a
aproximadamente 50 nucleótidos. Sin embargo, se reconoce que más de
50 nucleótidos pueden separar los elementos. Las regiones que
activan el extremo 5' pueden estar en la dirección 5' a 3' o la
dirección 3' a 5', pero preferi-
blemente en la dirección 5' a 3' en el extremo 5' del promotor central sintético o el elemento del extremo 5' sintético.
blemente en la dirección 5' a 3' en el extremo 5' del promotor central sintético o el elemento del extremo 5' sintético.
También describimos que se pueden utilizar, una
o multiples copias de las regiones que activan el extremo 5'.
Cuando se utilizan multiples copias, pueden ser repeticiones en
tándem de una UAR o combinaciones de varias UARs. De esta manera,
el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos de interés se
puede controlar por el número de UARs presentes en la construcción
del promotor desde que los resultados indican que se obtuvieron
niveles de expresión incrementados, aumentando los números de los
UARs. De esta manera, la invención proporciona los métodos para
regular los niveles de expresión de un gen o una secuencia de
nucleótidos de interés.
Según lo indicado, describimos que multiples
copias de una UAR se pueden utilizar para potenciar la actividad
del promotor ligado de manera operable. Como se registra, las
multiples copias de las UARs iguales o diferentes pueden ser
utilizados.
Los promotores de esta invención que tienen una
UAR según lo descrito arriba se pueden proporcionar en casetes de
expresión y tales casetes contenidos en vectores virales o
plásmidos. Tales vectores se pueden utilizar para la transformación
de células bacterianas y vegetales. Las plantas transgénicas se
pueden regenerar finalmente de tales células vegetales
transformadas.
Las UARs incorporadas en los promotores de la
planta pueden sustancialmente potenciar la actividad de
transcripción en plantas transgénicas.
Las construcciones del promotor de la invención
se pueden ligar de manera operable a cualquier secuencia de
nucleótidos o gen de interés. La construcción del promotor, por
ejemplo, se puede utilizar para potenciar la expresión del gen
oxalato oxidasa en plantas transgénicas. La oxalato oxidasa es una
enzima vegetal implicada en los mecanismos de defensa de las
plantas contra el ataque patógeno. La enzima degrada el compuesto
químico ácido oxálico secretado por patógenos vegetales. Ver por
ejemplo, PCT Publication No. WO 92/14824. Incrementando el
nivel de oxalato oxidasa en plantas tales como el girasol conducirán
al incremento de la resistencia vegetal a patógenos vegetales.
Los siguientes ejemplos son solamente para
propósitos de ilustración y no pretenden de ninguna manera limitar
el alcance o aplicación de la presente invención. Aquellos de
habilidad en el oficio apreciarán que muchas permutaciones se
pueden lograr y de hecho tienen la intención de estar dentro del
alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los plásmidos se designaron utilizando el sitio
de clonación múltiple de pBlueScriptIIKS+ de Stratagene. (Para
facilitar la clonación de la diferente combinación de los
elementos). Los oligonucleótidos que contienen las secuencias de
los elementos se sintetizaron con la restricción de los sitios de la
endonucleasa en los extremos. De esta manera los elementos podrían
ser adicionados o retirados y reemplazados según sea necesario. GUS
y Luciferasa se utilizaron para genes indicadores.
Para los ensayos transitorios, el ADN del
plásmido se introdujo en semilleros de maíz de
3-días-de edad intactos, mediante
el bombardeo de partículas. Continuando con 16 horas de incubación a
25EC en la oscuridad, la expresión se analizó midiendo la actividad
de la enzima GUS en extractos de raíces y brotes para cada semillero
para determinar si cualquier expresión de tejido preferido se
demostró. La actividad GUS se midió utilizando un kit de ensayo
GUS-Light de Tropix (47 Wiggins Avenue, Bedford, MA
01730).
Las construcciones que dieron niveles altos de
la expresión se introdujeron en una línea celular para producir
transformables estables. Estos transformables estables (TO) se
analizaron por PCR para determinar la presencia del gen GUS por
ensayo de MUG (4- metilumelliferil-glucuronida) para
cuantificar el nivel de actividad de la proteína GUS que se
produce. Cuando las plantas se alistaron para ser transferidas al
invernadero se analizaron histoquímicamente con
X-gluc para determinar donde el producto GUS fue
sintetizado. Las plantas que demostraron los niveles de expresión
preferidos se cultivaron en el invernadero para la etapa V6.
\vskip1.000000\baselineskip
Las técnicas de biología molecular estándar se
realizaron de acuerdo con Maniantis et al. (1982) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y. Todos los plásmidos utilizados en la invención
se pueden preparar de acuerdo con las direcciones de la
especificación por alguien de ordinaria habilidad en el oficio sin
la indebida experimentación empleando materiales disponibles
fácilmente en el oficio.
Oligos N306 SEQ ID NO:6
5'-TCGACACTGC AGCTCTAGGG ATGGTAGCGC AGGGTGCGTA
GGTACG
TATT TATAGCCGCT CGAGTG-3' y N307 SEQ ID NO: 7 5'-GATCCACTCG AGCGGCTATA AATACGTACC TACGCACCCT GCGCTACCAT CCTAGAGCT GCAGTG-3' se sintetizaron de acuerdo con las direcciones en un sintetizador de ADN automatizado (tal como Applied Biosystems Inc. ADN Synthesizer (Model 380B). Estos sintetizadores automatizados son disponibles comercialmente. Los oligos luego se ligaron al fragmento BamHI del plásmido pBlueScriptIIKS+ que comprende del gen\beta\beta-glucoronidasa interrumpido por la región 1 del intrón ADH1 del maíz. Un mapa de un plásmido que incorpora ambos el promotor Core Syn II y el elemento del extremo 5' se revelan según la Figura 4. Varios otros plásmidos se describen en la Figura 5. Los números del plásmido se muestran a la derecha de cada diagrama del promotor con la leyenda correspondiente colocada debajo de los diagramas. El diagrama arriba muestra la unidad del transplante transcripcional completa con los diagramas subsiguientes enfocándose en las diferencias salientes entre 35S y el promotor Central Syn. La leyenda muestra el número y naturaleza de los varios subelementos del promotor, la secuencia si es relativamente corta, la fuente del elemento y posición relativa al inicio de la transcripción.
TATT TATAGCCGCT CGAGTG-3' y N307 SEQ ID NO: 7 5'-GATCCACTCG AGCGGCTATA AATACGTACC TACGCACCCT GCGCTACCAT CCTAGAGCT GCAGTG-3' se sintetizaron de acuerdo con las direcciones en un sintetizador de ADN automatizado (tal como Applied Biosystems Inc. ADN Synthesizer (Model 380B). Estos sintetizadores automatizados son disponibles comercialmente. Los oligos luego se ligaron al fragmento BamHI del plásmido pBlueScriptIIKS+ que comprende del gen\beta\beta-glucoronidasa interrumpido por la región 1 del intrón ADH1 del maíz. Un mapa de un plásmido que incorpora ambos el promotor Core Syn II y el elemento del extremo 5' se revelan según la Figura 4. Varios otros plásmidos se describen en la Figura 5. Los números del plásmido se muestran a la derecha de cada diagrama del promotor con la leyenda correspondiente colocada debajo de los diagramas. El diagrama arriba muestra la unidad del transplante transcripcional completa con los diagramas subsiguientes enfocándose en las diferencias salientes entre 35S y el promotor Central Syn. La leyenda muestra el número y naturaleza de los varios subelementos del promotor, la secuencia si es relativamente corta, la fuente del elemento y posición relativa al inicio de la transcripción.
La secuencia del promotor central consiste de 35
pares de bases con los sitios de enzima del extremo 5' de una caja
TATA y un inicio de la transcripción con 10 a 15 pares de bases del
extremo 3'. Los elementos del extremo 5' (4-sitios
de enlace Gal, Rsyn, AT-GBL etc.) se fundieron a la
secuencia central con los genes marcadores diferentes y
ADHI-intrón (LUC o GUS) y ambas se mostraron
funcionales en los ensayos transitorios (Figura 6) y las plantas
transformadas estables Rsyn (Figura 7).
Los oligos para la construcción del subelemento
N del promotor Rsyn7 1965: (SEQ ID NO:8) GATCCTATGA CG
TATGGTAT GACGTGTGTT CAAGATGATG ACTTCAAACC TACCTATGAC GTATGGTATG ACGTGTGTCG ACTGATGACT TA- 3' y N1966: (SEQ ID NO:9) GATCTAAGTC ATCAGTCGAC AGACGTCATA CCATACGT
CA TAGGTAGGTT TGAAGTCATC ATCTTGAACA CACGTCATAC CATACGTCA TAG-3' se sintetizaron según lo descrito previamente. Los oligos se hibridaron y clonaron en un plásmido PHP3398 del extremo 5' de la secuencia Core Syn II y resultan en varias versiones de la secuencia Rsyn7 original debido a las deleciones espontáneas. La versión Rsyn7-2 involucró una deleción de base única que resulta en un motivo reiterativo 3X TGACG del extremo 5' del promotor Core Syn II (Rsyn7::LUC, P5903). La secuencia LUC codificante se reemplazó por la secuencia codificante GUS para producir la construcción Rsyn7::GUS P6086. P6086 luego se introdujo en el maíz transgénico que resulta en niveles altos de actividad constitutiva en cuatro de los seis eventos activos examinados (Figura 7).
TATGGTAT GACGTGTGTT CAAGATGATG ACTTCAAACC TACCTATGAC GTATGGTATG ACGTGTGTCG ACTGATGACT TA- 3' y N1966: (SEQ ID NO:9) GATCTAAGTC ATCAGTCGAC AGACGTCATA CCATACGT
CA TAGGTAGGTT TGAAGTCATC ATCTTGAACA CACGTCATAC CATACGTCA TAG-3' se sintetizaron según lo descrito previamente. Los oligos se hibridaron y clonaron en un plásmido PHP3398 del extremo 5' de la secuencia Core Syn II y resultan en varias versiones de la secuencia Rsyn7 original debido a las deleciones espontáneas. La versión Rsyn7-2 involucró una deleción de base única que resulta en un motivo reiterativo 3X TGACG del extremo 5' del promotor Core Syn II (Rsyn7::LUC, P5903). La secuencia LUC codificante se reemplazó por la secuencia codificante GUS para producir la construcción Rsyn7::GUS P6086. P6086 luego se introdujo en el maíz transgénico que resulta en niveles altos de actividad constitutiva en cuatro de los seis eventos activos examinados (Figura 7).
La progenie de las plantas T0 de varios eventos
de transformación se examinaron y la actividad de GUS fluctúo de 1
a 400 PPM (microgramos de enzima GUS/GFW en tejido de raíz de un
semillero de 7-días de edad) Figura 8. Estas
plantas T0 y T1 generalmente produjeron una actividad GUS
4X-10X mayor que las plantas hospedadas en el gen
indicador ubiquitin::GUS.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando ensayos de bombardeo transitorios la
secuencia Central Syn II del promotor se comparó contra la
secuencia central 35S ya sea solo o en conjunción con numerosos
elementos de activación. La Figura 6 es una descripción de los
datos de ensayo transitorios utilizando los plásmidos que incorporan
las secuencias del promotor central descritas aquí y muestra la
actividad transitoria de GUS o LUC en raíces de maíz de
tres-días de edad o callos BMS bombardeados con el
promotor quimérico::GUS o construcciones LUC. El -33 CaMV35S en las
versiones del promotor Core Syn II de las construcciones del
promotor sintético::GUS (o LUC) se bombardearon en raíces de
tres-días de edad (o callos BMS cultivados según lo
descrito más adelante) y ensayados para la actividad de la enzima
20 horas después de los bombardeos. Los datos mostrados son las
unidades de enzimas crudas de una recopilación de al menos tres
experimentos y no han sido normalizados de cualquier manera debido
a la variabilidad inherente de los ensayos transitorios. Los
plásmidos control 1654 y 3537 son las construcciones LUC probadas
en los callos BMS del maíz. Hay aproximadamente 4 a 20 veces de
diferencia en actividad transitoria entre las versiones Core 35S y
Syn II. El eje Y es en escala logarítmica. Ambos promotores
centrales fueron conducidos en un GUS que contenía una construcción
(Figuras 4 y 5) y generaron un nivel basal de actividad (Figura 6).
Sin embargo cuando los elementos activadores se colocaron en el
extremo 5' del motivo TATA, el Core Syn II proporcionaron
generalmente los niveles más altos de actividad (2-4
veces mejores) en las células del maíz que cuando los elementos
activadores se colocaron en el extremo 5' del centro 35S (Figura
6).
La secuencia Core Syn II se ha mostrado para
potenciar la actividad en plantas estables transformadas. Además
con ciertas secuencias activador del extremo 5' de los niveles de
actividad del elemento TATA en las plantas estables transformadas
de maíz alcanzan niveles diez veces más grandes que las
construcciones ubiquitin del maíz que producen niveles sumamente
altos de actividad.
Las Figuras 7 y 8 muestran los niveles de
actividad GUS de tejidos aislados de la etapa VT de las plantas T0
y tejido de raíz de los semilleros T1, respectivamente. Estos datos
demostraron que esta secuencia central puede participar en
potenciar los niveles muy altos de actividad como un socio funcional
para los promotores quiméricos activos. La Figura 7 muestra la
actividad Rsyn7::GUS (6086) en las plantas del maíz T0. Las plantas
de la etapa VT con espigas pos polinización de 3 a 8 días se
disecaron y analizaron para la actividad GUS. 7A describe la
expresión GUS en tejidos designados. 7B describe un esquemático de
una planta de maíz indicando los sitios de medición. Se analizaron
las plantas de los eventos T0 que demostraron una fluctuación de las
actividades con el promotor Rsyn7. Nuevamente se registra la escala
logarítmica. La actividad oscila para las plantas UBI::GUS se
indica a la derecha de la gráfica para comparaciones. Estos datos
demostraron que el promotor Rsyn7 puede incrementar la actividad a
niveles diez-veces arriba del promotor ubiquitin aún
muestra poca preferencia del tejido haciendo el Rsyn7 apropiado
como un promotor constitutivo fuerte.
La Figura 8 describe la actividad GUS en
segmentos de raíz de una población segregada de los semilleros
transgénicos T1 del maíz que contiene la construcción Rsyn7::GUS
(6086) o la UBI::GUS (3953). Los segmentos de 1 cm de raíz de
semilleros transgénicos de maíz de seis a siete-días
de edad se disecaron, pesaron y analizaron para GUS utilizando el
kit GUS-light. La actividad se representa como
partes por millón en peso fresco. La actividad de la raíz de varias
plantas T1 que hospedan el promotor Rsyn7::GUS muestra una actividad
más alta que muchos de los niveles de actividad producida por el
promotor UBI. Esto es consistente con los datos de la planta
transgénica T0. Los niveles de actividad en hojas jóvenes que
contienen Rsyn7::GUS también son mucho más altos que los niveles de
actividad de las hojas jóvenes que contienen UBI::GUS- (datos no
mostrados). La secuencia Central Syn II se muestra que funciona
bien con una variedad de elementos del extremo 5' que incluyen
sitios de enlace GAL 4, elementos Rsyn7, elementos GBL, etc.
La Figura 9 muestra la expresión GUS de tres
promotores sintéticos en plantas T0 transgénicas del maíz. Los
tejidos disecados (Ver Figura 7B) de las plantas T0 transgénicas de
la etapa VT que hospedan Rsyn7 (Rsyn), Atsyn o las construcciones
Syn II Core solo promotor (syn-core)::GUS se
analizaron cuantitativamente para la actividad GUS. Cada círculo
representa un promedio de la actividad del tejido de las plantas
transgénicas del maíz de un evento de transformación único. El
motivo TGACG corresponde a la secuencia Rsyn7 y el motivo
"AT-com" se refiere al elemento combinado como
AT consenso, Atcom, de W. Gurley, et al. 1993. In: Control
of Plant Gene Expression. ed. by Desh Pal Verma. CRC press, Boca
Raton, FL. pp. 103-123. Syn-core se
refiere a la secuencia Central Syn II del promotor que contiene el
elemento TATA y el inicio de la transcripción.
Para construir un vector de expresión que tiene
35SU (regiones que activan el extremo 5' del 35S
gen)-promotor Rsyn7, PHP413 se digirió con BgIII y
EcoRV. Los extremos alternados/cohesivos del vector linealizado se
rellenaron mediante Klenow en presencia de dNTP. El fragmento CaMV
2x fue extremo romo ligador en BamH1 digerido PHP6086 después de
rellenar los terminales BamH1. El fragmento CaMV
35S-Rsyn7 luego se recorto a partir de la nueva
construcción por digestión con XbaI y Pst 1, y se ligó en el vector
XbaI-Pst1 de 4 kb a partir de PHP9925 para formar
el vector de expresión de 35SU-Rsyn7::GUS
(PHP9778).
Para construir un vector de expresión que tiene
UbiU (elementos que activan el extremo 5' del gen del maíz
Ubi-1)-promotor Rsyn7, el fragmento
XbaI-SpeI de PHP8277 se ligó en el sitio XbaI de
PHP6086 para formar PHP10539, en el sitio XbaI de PHP10970 para
formar PHP10971, y en el sitio XbaI de PHP10971 para formar el
vector de expresión de
Ubi-1-Rsyn7::GUS (PHP10972).
Aquellas secuencias no referenciadas de otra
manera incluyen:
SEQ ID NO: 11 expone el 35S UAR.
SEQ ID NO: 12 expone la secuencia del promotor
SCP1, (35S UAR ligado de manera operable al promotor central de la
SEQ ID NO: 1).
SEQ ID NO: 13 expone el Ubi1 UAR.
SEQ ID NO: 14 expone SCP1 ligado de manera
operable a la secuencia codificante oxalato oxidasa ligada de manera
operable con el PinII terminador.
SEQ ID NO: 16 expone la secuencia del promotor
UCP2 (2 copias de Ubi1 UAR operable con el promotor central).
SEQ ID NO: 18 expone la secuencia del promotor
UCP4 (4 copias de Ubi1 UAR operable con el promotor central).
Los diversos fragmentos promotores::GUS se
clonaron en un vector binario Bin9 que contiene ALS3::NPTII como un
marcador de selección para generar callos de girasol transgénicos o
Arabidopsis.
Para la expresión transitoria, semillas del
girasol SMF3 se plantaron en el invernadero. Las semillas de
15-días-de edad después de la
polinización se colectaron de las plantas y se utilizaron en el
sistema de expresión transitoria. Después de remover el pericarpio,
los cotiledones con la semilla cubierta se esterilizaron por la
incubación en lejía al 20% a RT por 15 minutos, y se lavó cuatro
veces con agua destilada esterilizada dos veces. Luego los
cotiledones se incubaron en un filtro de 3MM empapado con medio MS
durante la noche antes se bombardearon de acuerdo con el método
revelado por Klein et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA
86:6681-6685. La actividad GUS se analizó 20 horas
después del bombardeo utilizando el kit GUS-Light de
ensayo de Tropix de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Para la transformación del disco de la hoja, la
hoja joven del girasol SMF3 expandida del girasol de
30-días-de edad se cosechó y
esterilizó en lejía al 20% con un par de gotas de Tween 20 por 20
minutos. Los discos de la hoja se prepararon a partir de hojas
estériles después de lavarlas con agua destilada esterilizada dos
veces 4 veces. Los discos de la hoja luego se incubaron por 10
minutos en medio de inoculación (MES 12.5 mM, NH_{4}Cl 1 g/l, y C
0.3 g/l de MgSO_{4}) que contiene Agrobacterium (EHA105)
transformado con las construcciones del vector que se probara a
A600=0.75. Los discos de la hoja luego se cultivaron por 3 días en
medio sin-selección y luego se transfirieron al
medio de selección.
Para transformar la Arabidopsis,
Arabidopsis se cultivó en el invernadero hasta la etapa
cuando los brotes comienzan a emerger en 15 plantas/maceta. Los
brotes emergentes se sujetaron completamente para impulsar el
crecimiento de los brotes secundarios múltiples. Después de 7 días,
las plantas se alistaron para la infiltración. El Agrobacterium
(EHA105) que lleva la construcción que se probará se cultivó a 28ºC
hasta cuando A600 fue entre 0.65 y 0.8. Las células se cosecharon
en medio de inoculación (4.3g/l de sal MS, 0.5 mg/l de ácido
nicotínico, 0.5 mg/l de piridoxina-HCl, 1 mg/l de
Tiamina-HCl, 0.1 g de mio-inositol,
I g/l de casaminoácidos, 0.01 mg de BAP, 68.5 g/l de sacarosa, y 36
g/l de glucosa) a A600 de 7.5.
Las plantas sujetadas con grapas para ser
transformadas se invirtieron en un 250 ml vaso de precipitados que
contiene la solución anterior del Agrobacterium. El vaso de
precipitados se colocó en una vasija de campana y se sometió a
vacío hasta que se forman burbujas en la superficie de las hojas y
del tallo. Después de 15 minutos de infiltración, el vacío se
liberó y las plantas se retiraron del vaso de precipitados,
acostadas en su lado en un plástico plano, y se cubrió con un manto
plástico. Las plantas se colocaron de pie y crecieron en el
invernadero por cuatro semanas antes de que las semillas se
cosecharan. Las semillas transgénicas se seleccionaron sembrando
las semillas en una placa de medio que contiene 65 \mug/ml de
Kanamicina.
En ensayos de expresión transitoria, el promotor
Rsyn7 en PHP10464 tiene el 15% de la actividad del promotor 35S
(PHP9925), mientras que el promotor-35SU Rsyn7
(PHP9778) (más adelante promotor SCPl) tiene aproximadamente 107%
de la actividad del promotor 35S (Figura 10). De esta manera, la
región de activación del extremo 5' del gen CaMV 35S incrementó la
actividad de Rsyn7 por aproximadamente 6 veces.
El elemento del extremo 5' (UbiU) del maíz
Ubi-l tiene efectos similares en el promotor
Rsyn7 en ensayos transitorios. Cuando la región de activación del
extremo 5' (UAR) del maíz Ubi-l se fusionó a
Rsyn7, la actividad de la enzima GUS incrementó con el número de
copias del UAR. En la presencia de tres copias del UbiU, la
actividad GUS incrementó aproximadamente 4-veces.
Este efecto aditivo de UbiU no se observó cuando se coloca en el
contexto del promotor ubiquitin del maíz (PHP 11974). Esto sugiere
que el reemplazo del promotor central del maíz Ubi1 con Rsyn7
puede convertir el promotor Ubi1 monocotiledóneo en un promotor
altamente activo en las plantas dicotiledóneas (Figura 11).
En los callos estables del girasol
transformados, la expresión GUS es 20% más alta detrás del control
del promotor 35SURsyn7 (SCP1 promotor) que cuando detrás del
control del promotor 35S CaMV (Figura 12).
Los resultados del ensayo de los callos
transgénicos se dan en la Figura 13. El promotor Rsyn7 que contiene
una sola copia de UbiU (PHP10991) (de ahora en adelante promotor UCP
1) (SEQ ID NO: 15) mostró una actividad del promotor de
aproximadamente 3 veces que la del promotor
35SU-Rsyn7 (SCP1) (PHP 10940). Tres copias de UbiU
(PHP 10993) incrementaron la actividad del promotor Rsyn7 a
aproximadamente 7 veces que la del 35SU-promotor
Rsyn7. El 3xUbiU-Rsyn7 (UCP3 promotor) (SEQ ID NO:
17) es con mucho el promotor más fuerte en tejidos del girasol.
Para determinar la actividad y especificidad del
tejido de los promotores Rsyn7 mejorados, el girasol transformado
estable y Arabidopsis se generaron para la transformación
mediada por el Agrobacterium. La tinción histoquímica de la
expresión GUS en Arabidopsis T1 transgénicaindica que
35SU-Rsyn7 (SCP1 promotor) (PHP10940) tiene
idéntica especificidad del tejido y actividad similar que el
promotor 35S CaMV (PHP 10989). Ambos promotores expresan GUS en la
hoja, tallo, pecíolo, y partes florales. UbiU-Rsyn7
(USCP1 promotor) (PHP10991) muestra actividad más alta que el
promotor Ubi-l del maíz (PHP11031) en tejidos
de tallo y hoja de Arabidopsis.
Todas las publicaciones y aplicaciones de las
patentes mencionadas en la especificación son indicativas del nivel
de aquellos de habilidad en el oficio para los cuales esta invención
concierne.
Aunque la invención precedente se ha descrito en
un cierto detalle por medio de ilustración y ejemplo para
propósitos de claridad de comprensión, será obvio que ciertos
cambios y modificaciones se pueden practicar dentro del alcance de
las reivindicaciones anexas.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet WO 840291 A, Rogers [0010]
\bullet US 4990607 A, Katagiri [0037]
[0074]
\bullet US 5380831 A [0060]
\bullet US 5436391 A [0060]
\bullet US 5023179 A [0074]
\bullet US 5510474 A [0083]
\bullet WO 9214824 A [0090]
\bullet US 9903863 W [0121]
\bulletZENZIE-GREGORY et al. J. Biol. Chem., 1992, vol. 267,
2823-2830 [0004]
\bulletGUERINEAU et al. Mol.
Gen. Genet., 1991, vol. 262, 141-144
[0059]
\bulletPROUDFOOT . Cell,
1991, vol. 64, 671-674 [0059]
\bulletSANFACON et al. Genes
Dev., 1991, vol. 5, 141-149 [0059]
\bulletMOGEN et al. Plant
Cell, 1990, vol. 2, 1261-1272 [0059]
\bulletMUNROE et al.
Gene, 1990, vol. 91, 151-158
[0059]
\bulletBALLAS et al. Nucleic
Acids Res., 1989, vol. 17, 7891-7903
[0059]
\bulletJOSHI et al. Nucleic
Acid Res., 1987, vol. 15, 9627-9639
[0059]
\bulletMURRAY et al. Nucleic
Acids Res., 1989, vol. 17, 477-498
[0060]
\bulletGRUBER et al. Vectors
for Plant Transformation, in Methods in Plant Molecular Biology
& Biotechnology. CRC Press, 1993,
89-119 [0062]
\bullet Procedures for Introducing Foreign DNA
into Plants. MAKI et al. Methods in Plant Molecular Biology
& Biotechnology. CRC Press, 1993,
67-88 [0063]
\bullet Cell-Tissue Culture
and In-Vitro Manipulation. PHILLIPS et
al. Corn & Corn Improvement. American Society of Agronomy
Inc, 1988, 345-387 [0063]
\bullet Direct DNA transfer into intact plant
cells via microprojectile bombardment. TOMES et al. Plant
Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods.
Springer-Verlag, 1995 [0065]
\bullet K. LINDSEY et al.
Tagging Genomic Sequences That Direct Transgene Expression by
Activation of a Promoter Trap in Plants. Transgenic Research,
1993, vol. 2, 33-47 [0066]
\bullet D. AUCH; RETH et
al. Exon Trap Cloning: Using PCR to Rapidly Detect and Clone
Exons from Genomic DNA fragments. Nucleic Acids Research,
vol. 18 (22), 6743 [0066]
\bulletKIM et al.
Nature, 1993, vol. 365, 512-520
[0068]
\bulletYAURAWJ et al.
Biological Abstracts, vol. 47 [0068]
\bullet Consensus Sequences for Plant Minimal
Promoters. Annual Meeting of the American Society of Plant
Physiologists, 29 July 1995 [0068]
\bulletPlant Physiology, 1995,
vol. 108, 114 [0068]
\bulletELLIS et al. EMBO
J., 1987, vol. 6, 11-16 [0074]
\bulletKATAGIRI et al.
Nature, 1989, vol. 340, 727-730
[0075]
\bulletBURROWS et al. Plant
Molecular Biology, 1992, vol. 19, 665-675
[0078]
\bulletSHINDER et al. Plant
Cell, 1992, vol. 4, 1309-1319 [0078]
\bulletFOSTER et al.
FASEBJ, 1994, vol. 8, 192-200
[0078]
\bulletGUILLEY et al.
Cell, 1980, vol. 21, 285-294
[0081]
\bulletGUILLEY et al.
Cell, 1982, vol. 30, 763-773
[0081]
\bulletSHAH et al.
Science, 1986, vol. 233, 478-481
[0081]
\bulletODELL et al.
Nature, 1985, vol. 313, 810-812
[0081]
\bulletFANG et al. Plant
Cell, 1989, vol. 1, 141-150 [0081]
\bulletCHRISTENSEN et al.
Plant Mol. Biol., 1992, vol. 18,
675-689 [0083]
\bulletCORNEJO et al. Plant
Mol. Biol., 1993, vol. 23, 567-581
[0083]
\bulletTAKIMOTO et al. Plant
Mol. Biol., 1994, vol. 26, 1007-1012
[0083]
\bulletCHRISTENSEN et al.
Transgenic Res., 1996, vol. 5, 213-218
[0083]
\bulletMANIANTIS et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory, 1982 [0095]
\bullet W. GURLEY et al.
Control of Plant Gene Expression, 1993,
103-123 [0104]
\bulletKLEIN et al. Proc.
Natl. Acad Sci. USA, 1989, vol. 86,
6681-6685 [0109]
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- APLICANTE: Bruce, Wesley Bowen, Benjamin A. Sims, Lynne Tagliani, Laura A. Lu, Guihua
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROMOTORES SINTÉTICOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: W. Murray Spruill (Alston & Bird, LLP)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 3605 Glenwood Ave. Suite 310
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Raleigh
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NC
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 27622
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE DEL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patente en Edición #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE APLICACIÓN ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE APLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE ARCHIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMAIÓN DE AGENTE/ABOGADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Spruill, W. Murray
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32,943
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: 5718-20
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 919 420 2202
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 919 881 3175
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genomic)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Ácido nucleico sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATAWAWATY YTCATMAA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCTATATA AGCAAGTTCA TTTCATTTGG AGAGGAAACG
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAGC
\hfill5
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 92 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 92 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Promotor central de ácido nucleico sintético con transversiones G/C"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 332 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 499 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 813 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Zea mays
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1600 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 994 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1807 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2620 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3433 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Wesley, Bruce
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Promotores sintéticos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 035718/176191
5718-20A-1-pc
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US99/03863
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-02-23
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 08/661,601
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1996-06-11
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente En Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia del promotor central sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: un elemento del extremo 5' sintético que ayuda a
potenciar la transcripción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Una configuración base del nucleótido típica de un
promotor central que contiene las secuencias consenso de los motivos
TATA y INR presentes en los promotores de la planta.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El nucleótido en esta posición puede
ser un a o t.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El nucleótido en esta posición puede
ser una a o t.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los nucleótidos en estas posiciones
pueden ser una t o c.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El nucleótido en esta posición puede
ser a o c.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatawawaty ytcatmaa
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del mosaico de la coliflor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctctatata agcaagttca tttcatttgg agaggaaacg
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: OCS elemento
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgacg
\hfill5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: promotor central del ácido nucleico sintético con
transversiones G/C
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los nucleótidos en las posiciones
26, 27, 30, 31, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 48, y 49,
pueden ser g o c.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 332
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del mosaico de la coliflor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 499
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: 35S UAR del virus del mosaico de la coliflor ligado de
manera operable a la secuencia del promotor central
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 813
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: 35S UAR del virus del mosaico de la coliflor ligado de
manera operable al promotor central ligado de manera operable a la
secuencia oxalato oxidasa codificante ligado de manera operable al
terminador PinII.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 994
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: promotor Rsyn7 que contiene 1 copia del elemento del
extremo 5' ubi-1 de zea mays (UbiU)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia del promotor UCP2 que contiene 2 copias del
ubil UAR de zea mays ligado de manera operable con el
promotor central
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 2620
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: promotor Rsyn7 que contiene 3 copias del elemento del
extremo 5' UbiU de zea mays
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 3433
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia del promotor UCP4que contiene 4 copias del
ubil UAR ligado de manera operable con el promotor central.
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<400> 18
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Claims (25)
Hide Dependent
translated from
Claims (25)
Hide Dependent
translated from
1. Una secuencia de ADN del promotor vegetal
sintético, la citada secuencia comprende:
un motivo TATA;
un sitio inicial de transcripción;
una región entre dicho motivo TATA y dicho sitio
inicial que es al menos 64% rico en GC; un elemento del extremo 5';
y una región de activación del extremo 5', en donde dicha secuencia
del promotor comprende una secuencia seleccionada del grupo que
consiste de:
- a)
- una secuencia de nucleótidos publicada en la SEQ ID NO: 12, y
- b)
- una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia a).
2. Una secuencia de ADN del promotor vegetal
sintético de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende una
secuencia de nucleótidos publicada en la SEQ ID NO: 12.
3. Una secuencia de ADN del promotor vegetal
sintético de acuerdo con la reivindicación 1, dicha secuencia que
contiene en el enlace operable:
una secuencia del promotor sintético central que
comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID
NO: 10;
un elemento del extremo 5' sintético ligado de
manera operable a dicho promotor sintético central, dicho elemento
del extremo 5' sintético que comprende la secuencia presentada en la
SEQ ID NO: 2; y una región de activación del extremo 5'.
4. Una secuencia de ADN del promotor vegetal
sintético de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha región
de activación del extremo 5' comprende una región de activación del
extremo 5' de CaMV 35S.
5. Una secuencia de ADN del promotor vegetal
sintético de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicha región
de activación del extremo 5' de CaMV 35S comprende del nucleótido
-430 al nucleótido -90 del gen CaMV 35S.
6. Una secuencia de ADN del promotor vegetal
sintético de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicha región
de activación del extremo 5' de CaMV 35S comprende la secuencia de
nucleótidos presentada en la SEQ ID NO: 11.
7. Un casete de expresión que comprende:
una secuencia de ADN del promotor sintético de
acuerdo con cualquiera de las precedentes reivindicaciones;
un gen estructural ligado de manera operable a
dicho promotor; y
una señal de poliadenilación del sitio de
terminación de la transcripción.
8. Un casete de expresión de acuerdo con la
reivindicación 7, en donde dicho gen estructural es un gen oxalato
oxidasa.
9. Un vector de ácidos nucleicos que comprende
el promotor de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 ligado de
manera operable a un gen estructural.
10. El vector de la reivindicación 9, en donde
dicho vector es un vector de clonación.
11. El vector de la reivindicación 9 o 10, en
donde dicho vector es un vector de expresión.
12. El vector de cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, que además comprende un gen marcador para
la selección de las células transformadas.
13. El vector de la reivindicación 12, en donde
dicho gen marcador es un gen de resistencia a un antibiótico.
14. El vector de cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 13, que adicionalmente comprende una señal de
poliadenilación.
15. Un célula huésped procariota o eucariota
transformada con el vector de ácidos nucleicos de cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 14.
16. Un método de control del nivel de expresión
de una secuencia de nucleótidos transgénica en una célula vegetal,
dicho método que comprende la transformación de dicha célula vegetal
con un casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 7 u
8.
17. Una planta transgénica que comprende una
célula vegetal o un progenitor de esta, que ha sido transformado
con el vector de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.
18. Una planta transformada que contiene en su
genoma el casete de expresión de la reivindicación 7 o 8.
19. La planta de la reivindicación 17 o 18, en
donde dicha planta es una monocotiledónea.
20. La planta de la reivindicación 17 o 18, en
donde dicha planta es una dicotiledónea.
21. La planta de la reivindicación 20, en donde
dicha planta es un girasol.
22. Una planta transgénica que expresa un gen
oxalato oxidasa exógeno en un nivel alto en donde dicho gen oxalato
oxidasa está bajo el control transcripcional del promotor
recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
23. La planta transgénica de la reivindicación
22, en donde dicha planta es una dicotiledónea.
24. La planta transgénica de la reivindicación
23, en donde dicha dicotiledónea es un girasol.
25. Semillas de la planta de cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 24, semillas que contienen en su genoma el
promotor recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a
6.