CN113100058B

CN113100058B - 一种虎舌红成熟胚愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法

Info

Publication number: CN113100058B
Application number: CN202110411981.9A
Authority: CN
Inventors: 邓伦秀; 吴高殷; 刘晓慧; 陈锐; 龙海燕; 徐超然
Original assignee: GUIZHOU ACADEMY OF FORESTRY
Current assignee: GUIZHOU ACADEMY OF FORESTRY
Priority date: 2021-04-16
Filing date: 2021-04-16
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2041-04-16
Also published as: CN113100058A

Abstract

本发明申请属于虎舌红植物组织培养技术领域，具体公开了一种虎舌红成熟胚愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法，该方法包括成熟果实的获取、种子的预处理、种子消毒、胚的获取、愈伤组织诱导、分化和不定芽增殖培养。在超净工作台上，成熟种子经消毒处理，取出胚接种到培养基上，胚污染率为0；培养60～80天，愈伤组织诱导率为90％，愈伤组织分化率为48％；将分化的不定芽接种到增殖培养基中继续培养45～55天，不定芽增殖率可达1600％以上。本试验为虎舌红培育提供了一种高效的繁殖方法，以成熟胚为外植体，污染率低、诱导率高，培育周期短，不定芽数量多，为虎舌红繁殖、新品种开发和优良品种的保护奠定了基础。

Description

一种虎舌红成熟胚愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法

技术领域

本发明属于虎舌红植物组织培养技术领域，具体公开了一种虎舌红成熟胚愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法。

背景技术

虎舌红(Ardisia mamillata Hance)为紫金牛科，紫金牛属矮小灌木，原产中国，花期6～8月，叶片红色或绿色，全株覆有白色或红色茸毛，果实成熟后呈鲜红色，周年挂果，果叶相映呈现出喜庆祥和的观赏效果，是室内观叶植物的首选佳品。此外，虎舌红全草入药，有清热利湿、活血止血、去腐去肌等功效，具有极高药用价值。

目前虎舌红的繁殖方式主要有播种繁殖、扦插繁殖、嫁接繁殖和组培繁殖。播种繁殖是虎舌红的主要繁殖方式，虎舌红虽结实量大，但生产周期长、实生苗性状不稳定，多数实生苗出现叶片发绿、茸毛发白现象，无法保持母本的优良种质特性，经济价值大大降低。此外，虎舌红生长缓慢，侧枝少，无法保证扦插、嫁接穗条的供应。由于植物组织培养技术具有实验所需材料少，繁殖系数大，培养条件可控性强和培养周期短等优点，因此，组织培养技术是植物繁殖高效的方法。然而，虎舌红的茎段和叶片被绒毛，使得消毒困难，团队成员候娜等(2015)研究得出虎舌红茎段污染率高，且茎段增殖率较低，不能满足产业化生产。本发明为解决上述问题，以虎舌红成熟胚作为外植体，通过诱导愈伤组织、愈伤组织分化和不定芽增殖途径对虎舌红进行扩繁，以期为虎舌红繁殖、新品种开发和优良品种的保护提供技术依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种虎舌红成熟胚愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法，以解决虎舌红组织培养中消毒困难、增殖系数低等问题。

为了达到上述目的，本发明的技术方案为：一种虎舌红成熟胚的愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法，包括以下步骤：

(1)种子处理：取无病虫害和生长健壮植株上的成熟果实，首先用肥皂水清洗去掉外种皮，其次用清水漂洗将沉水的种子捞出，最后将捞出的种子用流动的清水冲洗30min转至超净工作台；

(2)无菌种子：在超净工作台中，将步骤(1)中的种子用70％～75％酒精浸泡30～60s，1％～2％NaClO浸泡5～8min，期间间隔10～30s摇晃一次，再用无菌水漂洗3～5次后获得无菌种子；

(3)外植体的获取：将步骤(2)中的无菌种子用灭菌滤纸吸干水分后，用灭菌镊子和刀片将种子剖开取出成熟胚作为外植体；

(4)愈伤组织诱导与分化诱导：将步骤(3)的外植体接种至MS培养基中，MS培养基中添加6-BA(0.5～1.0mg·L^-1)、KT(0.5～1.0mg·L^-1)和NAA(0.2～0.5mg·L^-1)、蔗糖30g·L^-1和结冷胶2.5g·L^-1，培养30～40天；转接至相同组分浓度的愈伤组织诱导与分化诱导培养基中继续培养30～40天；

(5)不定芽增殖：将步骤(4)分化的不定芽转接至MS培养基，MS培养基中添加6-BA(2.0～8mg·L^-1)、GA3(1～2.0mg·L^-1)、IAA(0.1～0.5mg·L^-1)、蔗糖30g·L^-1和结冷胶2.5g·L^-1。

本技术方案的有益效果在于：

(1)肥皂水清洗后去掉虎舌红外种皮，漂洗后捞出沉水的种子用流动的清水冲洗30min转至超净工作台，在超净工作台上经过消毒清洗后得到无菌种子，将无菌种子用灭菌滤纸吸干水分后，用灭菌镊子和刀片将虎舌红种子剖开取出成熟胚作为外植体，此方法可以得到100％无菌外植体；

(2)本发明方法以虎舌红成熟胚为外植体，在材料选取上较易获得，不易损害母株；

(3)与其它外植体相比，以虎舌红成熟胚作为外植体，操作方便快捷，易处理，易消毒，且污染率为零；

(4)本发明60～80天获得了较高的虎舌红愈伤组织诱导率，其愈伤组织诱导率为90％，愈伤组织分化率为48％，45～55天不定芽增殖率可达1600％以上，本发明方法为虎舌红组培快繁和品种改良奠定基础，为虎舌红的遗传转化及工厂化育苗提供技术支持。

附图说明

图1是虎舌红成熟果实；

图2是虎舌红除去外种皮的种子；

图3是切开的虎舌红成熟种胚；

图4是成熟胚接种到培养基上(3月5日)；

图5是接种7天产生愈伤组织情况(3月12日)；

图6是接种46天愈伤组织转分化培养基(4月20日)；

图7是接种75天愈伤组织分化出不定芽的情况(5月19日)；

图8是不定芽转接35天的增殖情况(6月24日)；

图9是不定芽转接67天继续增殖情况(7月26日)；

图10是不定芽转接87天继续增殖情况(8月17日)；

图11是不定芽继续增殖与生长状态一；

图12是不定芽继续增殖与生长状态二。

具体实施方式

本发明提供的一种虎舌红成熟胚的愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法，包括但不限于以下实施例。

实施例1

一种虎舌红成熟胚的愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法，包括以下步骤：

(1).种子处理：取无病虫害和生长健壮植株上的成熟果实，首先用肥皂水清洗去掉外种皮，其次用清水漂洗将沉水的种子捞出，最后将捞出的种子用流动的清水冲洗30min转至超净工作台；

(2).无菌种子：在超净工作台中，将步骤(1)中的种子用70％～75％酒精浸泡30～60s，1％～2％NaClO浸泡5～8min，期间间隔10～30s摇晃一次，再用无菌水漂洗3～5次后获得无菌种子；

(3).外植体的获取：将步骤(2)中的无菌种子用灭菌滤纸吸干水分后，用灭菌镊子和刀片将种子剖开取出成熟胚作为外植体；

(4).愈伤组织诱导与分化诱导：将步骤(3)的外植体接种至MS培养基中，MS培养基中添加6-BA(0.5～1.0mg·L^-1)、KT(0.5～1.0mg·L^-1)和NAA(0.2～0.5mg·L^-1)、蔗糖30g·L^-1和结冷胶2.5g·L^-1，培养30～40天，转接至相同组分浓度的愈伤组织诱导与分化诱导培养基中继续培养30～40天；

(5).不定芽增殖：将步骤(4)分化的不定芽转接至MS培养基，MS培养基中添加6-BA(2.0～8mg·L^-1)、GA3(1～2.0mg·L^-1)、IAA(0.1～0.5mg·L^-1)、蔗糖30g·L^-1和结冷胶2.5g·L^-1，培养45～55天。

一、培养基的配置：基本培养基为MS培养基，从青岛海博生物公司购买获得，称取MS干粉培养基4.74g、结冷胶2.5g和蔗糖30g，加入所需植物生长调节剂，定容至1L。pH计(雷磁PHSJ-3F)测定溶液pH值，使用1mol·L^-1NaoH和1mol·L^-1HCl调至5.95±0.1，倒入250ml的组培瓶中(每瓶约35mL)。

二、外植体获得：选取叶片、茎段茸毛均为红色的虎舌红，于2019年10月采集成熟果实如图1所示，肥皂水清洗后去掉外种皮，漂洗沉水的种子用流动的清水冲洗30min转至超净工作台，用75％酒精浸泡1min，2％NaClO 5min，期间间隔摇晃，再用无菌水漂洗3～5次后获得无菌种子如图2所示。灭菌滤纸吸干水分，灭菌镊子和刀片将种子切开如图3所示，取出虎舌红成熟胚。

三、愈伤组织诱导与分化诱导：将取出的虎舌红成熟胚作为外植体，接种至MS培养基如图4所示，培养基中添加不同激素6-BA(0.5、1.0mg·L^-1)、KT(0.5、1.0mg·L^-1)和NAA(0.2、0.5mg·L^-1)进行组合试验、见表1。培养条件为暗培养：温度25±3℃，培养30～40天如图5，再转接至相同组分浓度的愈伤组织诱导与分化诱导培养基中继续培养30～40天如图6。60～80天后统计愈伤组织诱导率和愈伤组织分化率如图7。愈伤组织诱导率＝产生愈伤组织的外植体数/接种数×100％，分化率＝愈伤组织分化数/接种数×100％。

四、不定芽增殖：将分化的不定芽转至MS培养基，培养基中添加不同激素6-BA(2.0、4.0、8.0mg·L^-1)、GA3(2.0mg·L^-1)、IAA(0.1、0.2、0.5mg·L^-1)进行组合试验、见表2。培养条件为光培养：光照强度2000～2500Lux，光照时间16h·d^-1，温度25±3℃，培养周期45～55天后统计增殖率如图8。增殖率＝外植体上不定芽数/接种数×100％。

五、愈伤组织诱导与萌发培养基的选择：

胚接种在L1～L5培养基中均能诱导出愈伤组织和愈伤组织的分化(表1)，L2～L4愈伤组织诱导率均高于90％，L1最低，而愈伤组织分化率却在L1中最高，其次为L2，综合考虑以L2效果最好。

表1不同激素组合对于虎舌红种胚愈伤组织诱导和分化诱导的影响

六、不定芽增殖培养基的选择：

在Z1～Z5培养基中，分化的愈伤组织不定芽增殖率较高，Z3～Z5不定芽增殖率均高于10，Z1最低，其中，以Z4增殖效果最好，平均增殖倍数达16倍(表2)，如图8。如果不转接，愈伤组织继续分化与增殖，而分化出的不定芽不断生长，如图9、图10。

表2不同激素组合对虎舌红不定芽增殖诱导的影响

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims

1.一种虎舌红成熟胚愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)无菌种子：在超净工作台中，将步骤(1)中的种子用75％酒精浸泡1min，2％NaClO浸泡5min，期间间隔10～30s摇晃一次，再用无菌水漂洗3～5次后获得无菌种子；

(4)愈伤组织诱导与分化诱导：将步骤(3)的外植体接种至愈伤组织诱导与分化诱导培养基中，愈伤组织诱导与分化诱导培养基为MS培养基+0.5mg·L^-16-BA+0.5mg·L^-1NAA，培养30～40天，转接至相同组分浓度的愈伤组织诱导与分化诱导培养基中继续培养30～40天；

(5)不定芽增殖：将步骤(4)分化的不定芽转接至MS培养基+4.0mg·L^-16-BA+2.0mg·L^- ¹GA₃+0.2mg·L^-1IAA，培养45～55天。

2.根据权利要求1所述的一种虎舌红成熟胚愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法，其特征在于，步骤(1)中所述的虎舌红成熟果实，一年四季均可采收。

3.根据权利要求1所述的一种虎舌红成熟胚愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法，其特征在于，步骤(4)、步骤(5)的MS培养基中还有蔗糖30g·L^-1和结冷胶2.5g·L^-1。

4.根据权利要求1所述的一种虎舌红成熟胚愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法，其特征在于，步骤(4)、步骤(5)的培养基中pH值调节为5.95±0.01。

5.据权利要求1所述的一种虎舌红成熟胚愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法，其特征在于，步骤(4)、步骤(5)的培养基均在121℃下、高压灭菌20min。

6.根据权利要求1所述的一种虎舌红成熟胚愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法，其特征在于，步骤(4)为暗培养，培养温度为25±3℃。

7.根据权利要求1所述的一种虎舌红成熟胚愈伤诱导和分化及不定芽增殖方法，其特征在于，步骤(5)为光培养：光照强度2000～2500Lux、光照时间16h·d^-1、培养温度为25±3℃。