CN109258477B - 粉葛组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种粉葛组织培养方法。该粉葛组织培养方法包括以下步骤：外植体处理：取带有腋芽的粉葛嫩枝，消毒、灭菌待用；愈伤组织诱导：将处理后的所述粉葛嫩枝接种至第一培养基上进行培养，得愈伤组织；丛生芽诱导：将所述愈伤组织切块后接种至第二培养基进行培养，得丛生芽；生根培养：将所述从生芽分开得单个茎芽，将所述茎芽移植至第三培养基上进行培养，得粉葛幼苗。本发明的粉葛组织培养方法通过选取分生能力强且多酚含量低的带有腋芽的粉葛嫩枝为外植体，再在不同的培养阶段配合以不同的培养基，达到防止粉葛在组织培养过程中发生褐化的目的，有效提高粉葛组织培养的存活率。

Description

粉葛组织培养方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种粉葛组织培养方法。
背景技术
葛根具有解表、醒脾等功效，是一种常用的药材。豆科植物的甘葛藤(Puerariathomsonii Benth)因其块根淀粉含量高，被称为粉葛，粉葛有很高的药用和食用价值，可作为天然的保健食品，市场需求量大。粉葛的人工扩繁主要采用扦插繁殖，这类繁育方法需要消耗大量的粉葛茎段，繁殖系数低，品种改良也困难，且由于连年扦插，病毒积累严重，导致粉葛产量下降、种性退化、以及品质变差等问题。进而，越来越多的人选择采用组织培养的方式繁殖粉葛。通过组织培养还能够使染色体加倍，选育优质新品种。
由于粉葛属于多年生的木质藤本，与草本植物相比，粉葛在组织培养过程中容易褐化，且粉葛植株中含有较多的黄酮、异黄酮类化合物，在组织培养过程中更容易因褐化导致死亡。
发明内容
基于此，有必要针对粉葛在组织培养过程中容易发生褐化导致死亡的问题，提供一种能够防止粉葛发生褐化的粉葛组织培养方法。
具体的技术方案如下：
一种粉葛组织培养方法，包括以下步骤：
外植体处理：取带有腋芽的粉葛嫩枝，消毒、灭菌待用；
愈伤组织诱导：将处理后的所述粉葛嫩枝接种至第一培养基上进行培养，得愈伤组织；所述第一培养基为MS培养基+0.5mg/L～1.2mg/L 2.4-D+1.0mg/L～1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L～0.15mg/L NAA+25g/L～35g/L蜂蜜+30g/L～60g/L香柚汁+6g/L～8g/L琼脂；
丛生芽诱导：将所述愈伤组织切块后接种至第二培养基进行培养，得丛生芽；所述第二培养基为MS培养基+0.8mg/L～1.2mg/L 6-BA+0.05mg/L～0.15mg/L NAA+25g/L～35g/L蜂蜜+40g/L～60g/L香柚汁+6g/L～8g/L琼脂；
生根培养：将所述从生芽分开得单个茎芽，将所述茎芽移植至第三培养基上进行培养，得粉葛幼苗；所述第三培养基为1/2MS培养基+0.4mg/L～0.6mg/L IBA+10g/L～30g/L蜂蜜+6g/L～8g/L琼脂。
在其中一个实施例中，所述第一培养基为MS培养基+1.0mg/L 2.4-D+1.2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蜂蜜+50g/L香柚汁+7g/L琼脂。
在其中一个实施例中，所述第二培养基为MS培养基+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蜂蜜+50g/L香柚汁+7g/L琼脂。
在其中一个实施例中，所述第三培养基为1/2MS培养基+0.5mg/L IBA+20g/L蜂蜜+7g/L琼脂。
在其中一个实施例中，所述消毒、灭菌包括以下步骤：用添加有吐温的水浸泡所述粉葛嫩枝；用水冲洗浸泡后的所述粉葛嫩枝；用酒精对冲洗后的所述粉葛嫩枝进行消毒；将经酒精消毒后的所述粉葛嫩枝放入质量分数为0.05％～0.15％的HgCl2溶液中浸泡灭菌，所述浸泡灭菌时间为6min～6.5min；将浸泡灭菌后的所述粉葛嫩枝用无菌水漂洗。
在其中一个实施例中，所述浸泡灭菌时间为6.5min。
在其中一个实施例中，调节所述第一培养基的酸碱度至pH为5～6；调节所述第二培养基的酸碱度至pH为5～6。
在其中一个实施例中，所述愈伤组织诱导步骤，诱导环境温度为23℃～27℃，诱导环境空气相对湿度为40％～50％，交替进行光照处理与黑暗处理，所述光照处理的光照强度为1300lux～1700lux，培养时间为5天～9天。
在其中一个实施例中，所述从生芽诱导步骤，诱导环境温度为23℃～27℃，诱导环境空气相对湿度为40％～50％，交替进行光照处理与黑暗处理，所述光照处理的光照强度为2300lux～2700lux，培养时间为25天～35天。
在其中一个实施例中，所述生根培养步骤，培养环境温度为23℃～27℃，培养环境空气相对湿度为40％～50％，交替进行光照处理与黑暗处理，所述光照处理的光照强度为2300lux～2700lux，培养时间为25天～35天。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
上述的粉葛组织培养方法能够有效的达到防止粉葛发生褐化的目的。首先，在外植体的选择上，粉葛茎尖虽具有良好的分生能力，但因粉葛茎尖中多酚类物质含量高，作为外植体培养很容易褐化，故本发明的粉葛组织培养方法选用带有腋芽的粉葛嫩枝做为外植体，腋芽具有较强的潜在分生能力，多酚含量低于茎尖，且耐消毒剂灭菌。其次，本发明的粉葛组织培养方法在不同的培养阶段配制不同的培养基以防止粉葛在各生长阶段褐化。在愈伤组织诱导阶段，第一培养基为在MS培养基中加入特定量的2.4-D、6-BA、NAA、蜂蜜、香柚汁以及琼脂。在丛生芽诱导阶段，第二培养基为在MS培养基中加入特定量的6-BA、NAA、蜂蜜、香柚汁以及琼脂。在生根培养阶段，第三培养基为在1/2MS培养基中加入特定量的IBA、蜂蜜以及琼脂。其中，香柚汁中具有较高含量的抗坏血酸以及柠檬酸，能够为培养基提供丰富的抗氧化物质，有效防止粉葛在组织培养过程中的发生褐化。蜂蜜作为培养基内的碳源和能源物质，其含有的酚酸类化合物也具有抗氧化特性，能够抑制酚类物质氧化。上述的各个培养基均通过特定量的特定物质互配，在粉葛组织培养的各个阶段中防止其发生褐化。故本发明的粉葛组织培养方法通过选取分生能力强且多酚含量低的带有腋芽的粉葛嫩枝为外植体，再在不同的培养阶段配合以不同的培养基，达到防止粉葛在组织培养过程中发生褐化的目的，有效提高粉葛组织培养的存活率。
上述的粉葛组织培养方法中，对带有腋芽的粉葛嫩枝进行消毒、灭菌时，包括以下步骤：用添加有吐温的水浸泡粉葛嫩枝；用水冲洗浸泡后的粉葛嫩枝；用酒精对冲洗后的粉葛嫩枝进行消毒；将经酒精消毒后的粉葛嫩枝放入质量分数为0.05％～0.15％的HgCl2溶液中浸泡，浸泡时间为6min～6.5min；将浸泡后的粉葛嫩枝用无菌水漂洗。上述的消毒、灭菌步骤能够有效的对粉葛嫩枝进行消毒、灭菌，防止粉葛嫩枝在愈伤组织诱导阶段发生被污染，提高粉葛嫩枝的存活率。尤其是在以HgCl2溶液为表面消毒剂对粉葛嫩枝进行浸泡消毒的过程中，严格限定浸泡时间，能够避免浸泡时间过短导致的粉葛嫩枝消毒不完全以及浸泡时间过长导致的粉葛嫩枝死亡。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例提供了一种粉葛组织培养方法，其包括以下步骤：
外植体处理：取带有腋芽的粉葛嫩枝，消毒、灭菌待用；
所述消毒、灭菌包括以下步骤：用添加有吐温的水浸泡所述粉葛嫩枝；用水冲洗浸泡后的所述粉葛嫩枝；用酒精对冲洗后的所述粉葛嫩枝进行消毒；将经酒精消毒后的所述粉葛嫩枝放入质量分数为0.05％～0.15％的HgCl2溶液中浸泡灭菌，所述浸泡灭菌时间为6min～6.5min；将浸泡灭菌后的所述粉葛嫩枝用无菌水漂洗。
愈伤组织诱导：将处理后的所述粉葛嫩枝接种至第一培养基上进行培养，得愈伤组织；所述第一培养基为MS培养基+0.5mg/L～1.2mg/L 2.4-D+1.0mg/L～1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L～0.15mg/L NAA+25g/L～35g/L蜂蜜+30g/L～60g/L香柚汁+6g/L～8g/L琼脂；调节所述第一培养基的酸碱度至pH为5～6。
所述愈伤组织诱导步骤，诱导环境温度为23℃～27℃，诱导环境空气相对湿度为40％～50％，交替进行光照处理与黑暗处理，所述光照处理的光照强度为1300lux～1700lux，培养时间为5天～9天。
丛生芽诱导：将所述愈伤组织切块后接种至第二培养基进行培养，得丛生芽；所述第二培养基为MS培养基+0.8mg/L～1.2mg/L 6-BA+0.05mg/L～0.15mg/L NAA+25g/L～35g/L蜂蜜+40g/L～60g/L香柚汁+6g/L～8g/L琼脂；调节所述第二培养基的酸碱度至pH为5～6。
所述从生芽诱导步骤，诱导环境温度为23℃～27℃，诱导环境空气相对湿度为40％～50％，交替进行光照处理与黑暗处理，所述光照处理的光照强度为2300lux～2700lux，培养时间为25天～35天。
生根培养：将所述从生芽分开得单个茎芽，将所述茎芽移植至第三培养基上进行培养，得粉葛幼苗；所述第三培养基为1/2MS培养基+0.4mg/L～0.6mg/L IBA+10g/L～30g/L蜂蜜+6g/L～8g/L琼脂。
所述生根培养步骤，培养环境温度为23℃～27℃，培养环境空气相对湿度为40％～50％，交替进行光照处理与黑暗处理，所述光照处理的光照强度为2300lux～2700lux，培养时间为25天～35天。
其中，香柚汁是将香柚去皮取果肉，然后用榨汁机将果肉搅碎，再过筛收集得到的香柚果汁。
1/2MS培养基是指将MS培养基中的微量元素减少至标准的1/2得到的培养基。
实施例1
本实施例提供了一种粉葛组织培养方法，其包括以下步骤：
外植体处理：取带有腋芽的粉葛嫩枝，切成1cm左右的小段，每段均带腋芽。将分切后的粉葛嫩枝用添加吐温的水浸泡30min，后用流水冲洗1h。洗净后，用浓度为75％的酒精消毒20s，后放入质量分数为0.1％的HgCl2溶液中浸泡灭菌6.5min，再用无菌水漂洗5次，最后用无菌滤纸吸干水分，待用。
愈伤组织诱导：将处理后的粉葛嫩枝接种至第一培养基上进行培养，诱导环境温度为23℃～27℃，诱导环境空气相对湿度为40％～50％，交替进行12h光照处理与12h黑暗处理，光照处理的光照强度为1500lux，培养时间为7天，得愈伤组织。
其中，第一培养基为MS培养基+1.0mg/L 2.4-D+1.2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蜂蜜+50g/L香柚汁+7g/L琼脂，并调节第一培养基的酸碱度至pH为5.5。
丛生芽诱导：将愈伤组织切块后接种至第二培养基进行培养，诱导环境温度为23℃～27℃，诱导环境空气相对湿度为40％～50％，交替进行12h光照处理与12h黑暗处理，光照处理的光照强度为2500lux，培养时间为30天，得丛生芽。
其中，第二培养基为MS培养基+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蜂蜜+50g/L香柚汁+7g/L琼脂，并调节第二培养基的酸碱度至pH为5.5。
生根培养：将从生芽分开得单个茎芽，将茎芽移植至第三培养基上进行培养，培养环境温度为23℃～27℃，培养环境空气相对湿度为40％～50％，交替进行12h光照处理与12h黑暗处理，光照处理的光照强度为2500lux，培养时间为30天，得粉葛幼苗。
其中，第三培养基为1/2MS培养基+0.5mg/L IBA+20g/L蜂蜜+7g/L琼脂。
实施例2
本实施例提供了一种粉葛组织培养方法，其包括以下步骤：
外植体处理：取带有腋芽的粉葛嫩枝，切成1cm左右的小段，每段均带腋芽。将分切后的粉葛嫩枝用添加吐温的水浸泡30min，后用流水冲洗1h。洗净后，用浓度为75％的酒精消毒20s，后放入质量分数为0.1％的HgCl2溶液中浸泡6.5min，再用无菌水漂洗5次，最后用无菌滤纸吸干水分，待用。
愈伤组织诱导：将消毒后的粉葛嫩枝接种至第一培养基上进行培养，培养室温度为23℃～27℃，空气相对湿度为40％～50％，交替进行12h光照处理与12h黑暗处理，光照处理的光照强度为1500lux，培养时间为7天，得愈伤组织。
其中，第一培养基为MS培养基+0.5mg/L 2.4-D+1.2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蜂蜜+30g/L香柚汁+7g/L琼脂，并调节第一培养基的酸碱度至pH为5.5。
丛生芽诱导：将愈伤组织切块后接种至第二培养基进行培养，培养室温度为23℃～27℃，空气相对湿度为40％～50％，交替进行12h光照处理与12h黑暗处理，光照处理的光照强度为2300lux，培养时间为30天，得丛生芽。
其中，第二培养基为MS培养基+0.8mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+25g/L蜂蜜+40g/L香柚汁+7g/L琼脂，并调节第二培养基的酸碱度至pH为5。
生根培养：将从生芽分开得单个茎芽，将茎芽移植至第三培养基上进行培养，培养室温度为23℃～27℃，空气相对湿度为40％～50％，交替进行12h光照处理与12h黑暗处理，光照处理的光照强度为2300lux，培养时间为30天，得粉葛幼苗。
其中，第三培养基为1/2MS培养基+0.4mg/L IBA+10g/L蜂蜜+7g/L琼脂。
实施例3
本实施例提供了一种粉葛组织培养方法，其包括以下步骤：
外植体处理：取带有腋芽的粉葛嫩枝，切成1cm左右的小段，每段均带腋芽。将分切后的粉葛嫩枝用添加吐温的水浸泡30min，后用流水冲洗1h。洗净后，用浓度为75％的酒精消毒20s，后放入质量分数为0.1％的HgCl2溶液中浸泡6min，再用无菌水漂洗5次，最后用无菌滤纸吸干水分，待用。
愈伤组织诱导：将消毒后的粉葛嫩枝接种至第一培养基上进行培养，培养室温度为23℃～27℃，空气相对湿度为40％～50％，交替进行12h光照处理与12h黑暗处理，光照处理的光照强度为1700lux，培养时间为7天，得愈伤组织。
其中，第一培养基为MS培养基+1.2mg/L 2.4-D+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+35g/L蜂蜜+60g/L香柚汁+7g/L琼脂，并调节第一培养基的酸碱度至pH为6。
丛生芽诱导：将愈伤组织切块后接种至第二培养基进行培养，培养室温度为23℃～27℃，空气相对湿度为40％～50％，交替进行12h光照处理与12h黑暗处理，光照处理的光照强度为2700lux，培养时间为30天，得丛生芽。
其中，第二培养基为MS培养基+1.2mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+35g/L蜂蜜+60g/L香柚汁+7g/L琼脂，并调节第二培养基的酸碱度至pH为6。
生根培养：将从生芽分开得单个茎芽，将茎芽移植至第三培养基上进行培养，培养室温度为23℃～27℃，空气相对湿度为40％～50％，交替进行12h光照处理与12h黑暗处理，光照处理的光照强度为2700lux，培养时间为30天，得粉葛幼苗。
其中，第三培养基为1/2MS培养基+0.6mg/L IBA+30g/L蜂蜜+7g/L琼脂。
对比例1
本对比例提供了一种粉葛组织培养方法。
本对比例中的粉葛组织培养方法在愈伤组织诱导步骤，第一培养基为MS培养基+0.5mg/L 2.4-D+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+25g/L蜂蜜+7g/L琼脂。其他步骤与实施例1的粉葛组织培养方法相同。
对比例2
本对比例提供了一种粉葛组织培养方法。
本对比例中的粉葛组织培养方法在丛生芽诱导步骤，第二培养基为MS培养基+0.2mg/L 2.4-D+1.0mg/L 6-BA+25g/L蜂蜜+7g/L琼脂。其他步骤与实施例1的粉葛组织培养方法相同。
对比例3
本对比例提供了一种粉葛组织培养方法。
本对比例中的粉葛组织培养方法在丛生芽诱导步骤，第二培养基为MS培养基+0.2mg/L 2.4-D+0.3mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+30g/L蜂蜜+30g/L香柚汁+7g/L琼脂。其他步骤与实施例1的粉葛组织培养方法相同。
实验例1
针对实施例1、实施例2以及对比例1的粉葛组织培养方法对外植体生长的影响进行试验。
实验方法：取50段经外植体处理后的有腋芽的粉葛嫩枝，50段经外植体处理后的无腋芽的粉葛嫩枝以及50段经外植体处理后的粉葛茎尖为一组，共取三组。各组分别按照实施例1、实施例2以及对比例1的粉葛组织培养方法中对于愈伤组织诱导的步骤进行愈伤组织诱导。各组均培养7天后，对各组中不同外植体愈伤组织诱导率以及褐化情况进行统计。
实验结果见下表1：
表1不同激素及营养物质添加量对愈伤组织诱导的的影响
Figure BDA0001893006350000101
Figure BDA0001893006350000111
结果分析：
由表1可知，针对各组中不同外植体愈伤组织诱导率来看，实施例1、实施例2以及对比例1中均为有腋芽的粉葛嫩枝诱导率最高。可见，腋芽具有较强的潜在分生能力，多酚含量低于茎尖，且耐消毒剂灭菌。
进一步地，在实施例1的粉葛组织培养方法下，经愈伤组织诱导步骤后，不同的外植体均能够经诱导形成淡黄色愈伤组织，且增长快速。在实施例2的粉葛组织培养方法下，由于第一培养基与实施例1相比较，2,4-D浓度以及香柚汁的浓度均较低，导致经愈伤组织诱导步骤后，诱导后期少数愈伤组织出现褐化，但整体诱导情况较好。而在对比例1的粉葛组织培养方法下，由于第一培养基与实施例1相比较，不含香柚汁，且其他组分含量均较低，经愈伤组织诱导步骤后，诱导后期大部分愈伤组织出现褐化。
由此可见，本发明的粉葛组织培养方法中，第一培养基通过特定量的2,4-D、6-BA、NAA、蜂蜜、香柚汁以及琼脂互配能够在愈伤组织诱导阶段防止粉葛嫩枝发生褐化，有效提高粉葛组织培养的存活率。
实验例2
针对实施例1、对比例3以及对比例4的粉葛组织培养方法对愈伤组织分化的影响进行试验。
实验方法：取150个经愈伤组织诱导后得到的愈伤组织，平均分为三组，各组分别按照实施例1、对比例3以及对比例4的粉葛组织培养方法中对于丛生芽诱导的步骤进行丛生芽诱导。各组均培养30天后，对各组中愈伤组织分化率、死亡率以及生长发育状况进行统计。
实验结果见下表2：
表2不同激素及营养物质添加量对愈伤组织分化的影响
Figure BDA0001893006350000121
结果分析：
由表2可知，在实施例1的粉葛组织培养方法下，经丛生芽诱导步骤后，愈伤组织能够快速分化，分化率达83％，且愈伤组织分化较快，表面仅有少许变褐色。
而对比例3的粉葛组织培养方法下，由于在丛生芽诱导步骤中，其第二培养基与实施例1相比较，添加有2,4-D，但不含NAA以及香柚汁，即该第二培养基抗氧化物质，导致该组愈伤组织后期易褐化死亡。
对比例4的粉葛组织培养方法下，其第二培养基与实施例1相比较，添加有2,4-D，且NAA以及香柚汁的含量均较低，抗氧化物质含量低，该组愈伤组织增长分化缓慢，部分褐化及玻璃化。
由此可见，本发明的粉葛组织培养方法中，第二培养基通过特定量的6-BA、NAA、蜂蜜、香柚汁以及琼脂互配能够在丛生芽诱导阶段防止愈伤组织发生褐化，有效提高粉葛组织培养的存活率。
实验例3
针对实施例1的粉葛组织培养方法，调整外植体处理过程中，粉葛嫩枝在质量分数为0.1％的HgCl2溶液中浸泡的时间，统计粉葛嫩枝的成活率。
实验方法：取600段分切后的带有腋芽的粉葛嫩枝，平均分为六组，在外植体处理步骤中，各组的粉葛嫩枝在质量分数为0.1％的HgCl2溶液中浸泡灭菌的时间分别为：第1组浸泡灭菌时间为5min、第2组浸泡灭菌时间为6min、第3组浸泡灭菌时间为6.5min、第4组浸泡灭菌时间为7min、第5组浸泡灭菌时间为7.5min、第6组浸泡灭菌时间为8min。其他消毒、灭菌步骤均与实施例1相同。各组的带有腋芽的粉葛嫩枝在经外植体处理后，对其死亡率、污染率以及成活率进行统计。
实验结果见下表3：
表3外植体消毒实验结果比较
Figure BDA0001893006350000131
结果分析：
粉葛嫩枝在质量分数为0.1％的HgCl2溶液中浸泡灭菌的时间能够影响粉葛嫩枝消毒后的成活率。由上表3可知，当浸泡灭菌时间为5min时，污染率达到85.7％。随着浸泡灭菌时间的增加，消毒更加全面，污染率逐渐降低，成活率逐渐升高，当浸泡灭菌时间为6.5min处成活率达到最高为80.6％。再继续增加浸泡灭菌时间，由于浸泡时间过长导致的嫩枝死亡，故死亡率逐渐升高，成活率逐渐降低。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种粉葛组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
外植体处理：取带有腋芽的粉葛嫩枝，消毒、灭菌待用；
愈伤组织诱导：将处理后的所述粉葛嫩枝接种至第一培养基上进行培养，得愈伤组织；所述第一培养基为MS培养基+1mg/L 2.4-D+1.2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蜂蜜+50g/L香柚汁+7g/L琼脂；
丛生芽诱导：将所述愈伤组织切块后接种至第二培养基进行培养，得丛生芽；所述第二培养基为MS培养基+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蜂蜜+50g/L香柚汁+7g/L琼脂；
生根培养：将所述从生芽分开得单个茎芽，将所述茎芽移植至第三培养基上进行培养，得粉葛幼苗；所述第三培养基为1/2MS培养基+0.4mg/L～0.6mg/L IBA+10g/L～30g/L蜂蜜+6g/L～8g/L琼脂；
所述消毒、灭菌包括以下步骤：用添加有吐温的水浸泡所述粉葛嫩枝；用水冲洗浸泡后的所述粉葛嫩枝；用酒精对冲洗后的所述粉葛嫩枝进行消毒；将经酒精消毒后的所述粉葛嫩枝放入质量分数为0.05％～0.15％的HgCl2溶液中浸泡灭菌，将浸泡灭菌后的所述粉葛嫩枝用无菌水漂洗。
2.根据权利要求1所述的粉葛组织培养方法，其特征在于，所述第三培养基为1/2MS培养基+0.5mg/L IBA+20g/L蜂蜜+7g/L琼脂。
3.根据权利要求1～2任意一项所述的粉葛组织培养方法，其特征在于，所述浸泡灭菌的时间为6min～6.5min。
4.根据权利要求3所述的粉葛组织培养方法，其特征在于，所述浸泡灭菌时间为6.5min。
5.根据权利要求1～2任意一项所述的粉葛组织培养方法，其特征在于，调节所述第一培养基的酸碱度至pH为5～6；调节所述第二培养基的酸碱度至pH 为5～6。
6.根据权利要求1～2任意一项所述的粉葛组织培养方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导步骤，诱导环境温度为23℃～27℃，诱导环境空气相对湿度为40％～50％，交替进行光照处理与黑暗处理，所述光照处理的光照强度为1300lux～1700lux，培养时间为5天～9天。
7.根据权利要求1～2任意一项所述的粉葛组织培养方法，其特征在于，所述从生芽诱导步骤，诱导环境温度为23℃～27℃，诱导环境空气相对湿度为40％～50％，交替进行光照处理与黑暗处理，所述光照处理的光照强度为2300lux～2700lux，培养时间为25天～35天。
8.根据权利要求1～2任意一项所述的粉葛组织培养方法，其特征在于，所述生根培养步骤，培养环境温度为23℃～27℃，培养环境空气相对湿度为40％～50％，交替进行光照处理与黑暗处理，所述光照处理的光照强度为2300lux～2700lux，培养时间为25天～35天。
9.根据权利要求1所述的粉葛组织培养方法，其特征在于，调节第一培养基的酸碱度至pH为5.5。
10.根据权利要求1所述的粉葛组织培养方法，其特征在于，调节第二培养基的酸碱度至pH为5.5。
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