CN102349443A - 一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法。一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，选取小菘菜单核靠边期的花蕾，消毒后分离纯化出小孢子，将纯化后的小孢子悬浮于高糖培养基中，调整小孢子的密度达到1×105～1×106个/ml，置于33℃-35℃下黑暗处理12h-24h，离心弃上清后，加入低糖培养基，获得小孢子悬浮液。小孢子悬浮液于黑暗处理10d-14d后即可出现肉眼可见的胚状体，将其置于振荡培养箱中培养，出现子叶型胚后立即放于光照下转绿，然后接到分化培养基上继代进而形成再生植株。通过本发明改良后的小孢子培养方法，使对常规培养没有反应的小菘菜品种产生了胚状体，诱导基因型成功率达到60％。

Description

一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，专用于小菘菜游离小孢子培养。
技术背景
小菘菜(Brassica campestris var.peruviridis)系十字花科二年生草本植物，为不结球白菜的一个变种。原产亚洲，经日本系统改良形成具有独特风味的品种。以幼嫩的植株供食用，品质柔嫩，味道鲜美，经烹调后色泽翠绿，营养价格高，超过绿叶菜之首的菠菜，并且具有防癌的保健功能。在日本市场周年供应，成为销售量最大的蔬菜品种之一。我国宁波市2002年开始大面积种植，目前已成为宁波市出口日本的主要创汇蔬菜品种之一。小菘菜为异花授粉植物，在育种上获得一个纯系需要5～6年的时间，而游离小孢子培养可以在1～2年获得双单倍体植株，大大节省纯化时间和工作量。除此之外，小孢子还是一种优良的转化受体，它具备了单细胞和单倍体两个特性，不会获得杂合体或嵌合体，因此也是突变体筛选和基因工程研究的理想材料。
我国游离小孢子培养的起步较晚，但最近几年，对不结球白菜的游离小孢子培养已取得了较大的进展，李岩等(1993)、卢钢等(2001)、蒋武生等(2005)和耿建峰等(2007)均获得了不结球白菜小孢子再生植株，并对影响培养的各种因素进行了分析，但小菘菜的游离小孢子培养未见过报道，冯辉(2007)曾利用花药培养获得了小菘菜的再生植株，但是花药离体培养容易受到花药壁、药隔等二倍体细胞的干扰，后期检测程序复杂，而小孢子已是单倍体细胞，具有花药培养所不具备的单细胞单倍性、不受体细胞干扰、便于遗传操作等优点，但是游离小孢子培养受基因型的影响很大，而且小菘菜的游离小孢子培养出胚率很低，所以本发明旨在建立稳定高频的小菘菜游离小孢子胚胎发生体系。
发明内容
本发明目的在于针对上述现有技术中小菘菜游离小孢子存在的培养效率低的问题，提供一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，选取小菘菜单核靠边期的花蕾，消毒后分离纯化出小孢子，将纯化后的小孢子悬浮于高糖培养基中，调整小孢子的密度达到1×105～1×106个/ml，置于33℃-35℃下黑暗处理12h-24h，离心弃上清后，加入低糖培养基，获得小孢子悬浮液；其中，所述的高糖培养基是在1/2NLN培养基中加入15％-17％蔗糖及0.8mg/L-1.0mg/L秋水仙碱，再经0.22μm的微孔滤膜抽滤灭菌所得，pH为6.0；所述的低糖培养基是在1/2NLN培养基加入10～13％蔗糖及0.5～0.8g/L活性炭，再经0.22μm的微孔滤膜抽滤灭菌所得，pH为6.0。
所述的小孢子悬浮于高糖培养基后优选于33℃黑暗处理24h。
所述的小菘菜单核靠边期的花蕾长度为2.0mm-3.0mm，外观特征为花瓣、花药长度比为1/2～4/5。
消毒前将选取的适宜花蕾保湿并置于4℃冰箱中处理24h。
所述的消毒是将花蕾用75％的酒精消毒30s，然后用质量比为0.1％的HgCl2消毒6min，最后用无菌水冲洗3次待用。
所述的分离纯化小孢子是将消毒后的花蕾置于研钵中，加入小孢子提取液，采用挤压法使小孢子游离出来，然后用400目滤网过滤，将滤液收集于离心管，800rpm离心5min，弃上清液，重复3次；所述的小孢子提取液为小孢子提取液为加入10～13％蔗糖的B5基本培养基，pH为5.8。
所述的离心条件是800rpm-1000rpm离心5min-7min。
所述的小孢子悬浮液于黑暗处理10d-14d后即可出现肉眼可见的胚状体，将其置于振荡培养箱中培养，当出现子叶型胚后立即放于光照下转绿，然后接到分化培养基上继代进而形成再生植株。
所述的分化培养基是在B5基本培养基中加入10～13％蔗糖、0.1～0.3mg/L 6-BA、0.01～0.03mg/LNAA、0.6～0.9％琼脂以及0.4～0.7g/L活性炭所得，pH为5.8。
本发明方法中培养基的灭菌条件均为：121℃，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。
有益效果：
本发明提供了一种促进小菘菜游离小孢子培养胚胎发生的方法，培养的小孢子获得了再生植株。
通过本发明改良后的小孢子培养(IMC)方法，使对常规培养没有反应的小菘菜品种产生了胚状体，诱导基因型成功率达到60％；除此之外，还使可出胚的小菘菜品种的成胚率有了很大的提高，从0.4个/花蕾提高到1.3个/花蕾，提高了3.25倍。
具体实施方式
实施例1
提高小菘菜游离小孢子培养胚胎诱导率的方法，包括：
1基因型：NHCC秋-631；NHCC秋-632；NHCC秋-634；NHCC秋-635；NHCC秋-636。
2培养基的配置及灭菌
基本培养基为大量元素减半的NLN培养基，即1/2NLN培养基；
①高糖培养基(1/2NLN-17)：1/2NLN+17％蔗糖+0.8mg/L秋水仙碱pH为6.0；
②低糖培养基(1/2NLN-13)：1/2NLN+13％蔗糖+0.8g/L活性炭pH为6.0；
以上培养基用0.22μm的微孔滤膜抽滤灭菌。
③小孢子提取液(B5-13培养基)：B5基本培养基+13％蔗糖，pH为5.8；
④分化培养基：B5基本培养基+13％蔗糖+0.2mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+0.8％琼脂+0.5g/L活性炭，pH为5.8；
以上小孢子提取液和分化培养基于121℃，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。
3取材：2011年1月选取长度为2～3mm的花蕾，将花蕾保湿置于4℃冰箱中保存24h。
4消毒：选取的花蕾用75％的酒精消毒30s，然后用质量比为0.1％的HgCl2消毒6min，最后用无菌水冲洗3次待用；
5小孢子分离与纯化：将消毒后的花蕾置于研钵中，加小孢子提取液(B5-13)，采用挤压法使小孢子游离出来，然后用400目滤网过滤，将滤液收集于离心管，800rpm离心5min，弃上清液，重复3次；
6将纯化后的小孢子悬浮于两种不同的预处理培养基中：①低糖培养基(含13％蔗糖的1/2NLN培养基)；②高糖培养基(含17％蔗糖及0.8mg/L秋水仙碱的1/2NLN培养基)分别进行低糖处理和高糖、秋水仙碱处理，利用血球计数板调整小孢子的密度达到1×105-6个/ml；
7高温诱导：将上述小孢子悬浮液置于33℃高温下黑暗处理24h；
8换培养基：将上述小孢子悬浮液800rpm离心5min弃上清后，加入低糖培养基(1/2NLN-13液体培养基)，获得小孢子悬浮液；
9胚状体形成及植株再生：25℃黑暗处理2周后即可出现肉眼可见的胚状体，将其置于振荡培养箱中培养，当出现子叶型胚后立即放于光照下转绿，然后接到分化培养基上继代进而形成再生植株。
实施结果如下：
表1结果表明，五种基因型的小菘菜对常规培养即低糖处理没有反应，出胚率为0，而经过高糖及秋水仙碱处理后，有三种基因型可诱导出胚，诱导基因型成功率达到60％，其中NHCC秋-631平均出胚3.7个/蕾，NHCC秋-635平均出胚1.3个/蕾，NHCC秋-636平均出胚4.3个/蕾。
表1五种基因型两种培养方式的出胚对比情况
Figure BDA0000076827340000041
实施例2
提高小菘菜游离小孢子培养胚胎诱导率的方法，包括：
1基因型：NHCC秋-633；NHCC秋-607；极乐天。
2取材：2011年1月选取长度为2～3mm的花蕾，将花蕾保湿置于4℃冰箱中保存24h。
3消毒：选取的花蕾用75％的酒精消毒30s，然后用质量比为0.1％的HgCl2消毒6min，最后用无菌水冲洗3次待用；
4小孢子分离与纯化：将消毒后的花蕾置于研钵中，加入小孢子提取液(B5-13培养基)，采用挤压法使小孢子游离出来，然后用400目滤网过滤，将滤液收集于离心管，800rpm离心5min，弃上清液，重复3次；
5将纯化后的小孢子悬浮于四种不同的预处理培养基中：①低糖培养基(含13％蔗糖的1/2NLN培养基)；②低糖+秋水仙碱培养基(含13％蔗糖及0.8mg/L秋水仙碱的1/2NLN培养基)；③高糖培养基(含17％蔗糖的1/2NLN培养基)；④高糖+秋水仙碱培养基(含17％蔗糖及0.8mg/L秋水仙碱的1/2NLN培养基)分别进行处理，利用血球计数板调整小孢子的密度达到1×105-6个/ml；
6高温诱导：将上述小孢子悬浮液置于33℃高温下黑暗处理24h；
7换培养基：将上述小孢子悬浮液800rpm离心5min弃上清后，加入低糖培养基(1/2NLN-13液体培养基)，获得小孢子悬浮液；
8胚状体形成及植株再生：25℃黑暗处理2周后即可出现肉眼可见的胚状体，将其置于振荡培养箱中培养，当出现子叶型胚后立即放于光照下转绿，然后接到分化培养基上继代进而形成再生植株。
实施结果如下：
1.表2结果表明，NHCC秋-633经过秋水仙碱及高糖单独处理后均可以提高胚状体的发生率，分别为平均2.1个/蕾及3.6个/蕾，而且当高糖及秋水仙碱共同处理时，胚胎诱导率达到平均6.4个/蕾，比常规培养提高了3.6倍。
表2NHCC秋-633四种不同预处理诱导出胚率的对比情况
  预处理培养基   24h后换培养基   胚产量(个/蕾)
  1/2NLN-13   1/2NLN-13   1.8
  1/2NLN-13+0.8mg/L秋水仙碱   1/2NLN-13   2.1
  1/2NLN-17   1/2NLN-13   3.6
  1/2NLN-17+0.8mg/L秋水仙碱   1/2NLN-13   6.4
2.表3结果表明，NHCC秋-607经过秋水仙碱及高糖单独处理后均可以提高胚状体的发生率，分别为平均1.9个/蕾及2.8个/蕾，而且当高糖及秋水仙碱共同处理时，胚胎诱导率达到平均5.3个/蕾，比常规培养提高了4.4倍。
表3NHCC秋-607四种不同预处理诱导出胚率的对比情况
  预处理培养基   24h后换培养基   胚产量(个/蕾)
  1/2NLN-13   1/2NLN-13   1.2
  1/2NLN-13+0.8mg/L秋水仙碱   1/2NLN-13   1.9
  1/2NLN-17   1/2NLN-13   2.8
  1/2NLN-17+0.8mg/L秋水仙碱   1/2NLN-13   5.3
3.表4结果表明，极乐天经过秋水仙碱及高糖单独处理后均可以提高胚状体的发生率，分别为平均0.5个/蕾及0.7个/蕾，而且当高糖及秋水仙碱共同处理时，胚胎诱导率达到平均1.3个/蕾，比常规培养提高了3.25倍。
表4极乐天四种不同预处理诱导出胚率的对比情况
  预处理培养基   24h后换培养基   胚产量(个/蕾)
  1/2NLN-13   1/2NLN-13   0.4
  1/2NLN-13+0.8mg/L秋水仙碱   1/2NLN-13   0.5
  1/2NLN-17   1/2NLN-13   0.7
  1/2NLN-17+0.8mg/L秋水仙碱   1/2NLN-13   1.3
实施例3
提高小菘菜游离小孢子培养胚胎诱导率的方法，包括：
1基因型：NHCC秋-633。
2取材：2011年1月选取长度为2～3mm的花蕾，将花蕾保湿置于4℃冰箱中保存24h。
3消毒：选取的花蕾用75％的酒精消毒30s，然后用质量比为0.1％的HgCl2消毒6min，最后用无菌水冲洗3次待用；
4小孢子分离与纯化：将消毒后的花蕾置于研钵中，加入小孢子提取液(B5-13培养基)，采用挤压法使小孢子游离出来，然后用400目滤网过滤，将滤液收集于离心管，800rpm离心5min，弃上清液，重复3次；
5.高糖及秋水仙碱处理：将纯化后的小孢子悬浮于含17％蔗糖及0.8mg/L秋水仙碱的1/2NLN培养基中，利用血球计数板调整小孢子的密度达到1×105-6个/ml；
6高温诱导：将上述小孢子悬浮液分别置于31℃、33℃、35℃、37℃的温度下黑暗处理12h、24h、48h、96h；
7换培养基：将上述小孢子悬浮液800rpm离心5min弃上清后，加入低糖培养基(1/2NLN-13液体培养基)，获得小孢子悬浮液；
8胚状体形成及植株再生：25℃黑暗处理2周后即可出现肉眼可见的胚状体，将其置于振荡培养箱中培养，当出现子叶型胚后立即放于光照下转绿，然后接到分化培养基上继代进而形成再生植株。
实验结果见表5：
表5结果表明，①在25℃常温下，高糖培养基不能诱导NHCC秋-633出胚，而在经过一定高温后才能诱导小孢子胚产生。②对NHCC秋-633而言，33℃的处理效果最好，最高出胚率达到6.5个/蕾，当温度高于或低于33℃时，高糖诱导率呈下降趋势。③高糖处理时间对小孢子的胚诱导率也有影响，对NHCC秋-633而言，处理时间在12h-24h时小孢子胚诱导率较高，并且在此范围内差异不大，随着处理时间的延长，小孢子胚诱导率呈明显下降趋势。
表5高糖培养基不同诱导温度和时间对NHCC秋-633出胚率的影响
Figure BDA0000076827340000061
Figure BDA0000076827340000071

Claims (9)

1.一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于选取小菘菜单核靠边期的花蕾，消毒后分离纯化出小孢子，将纯化后的小孢子悬浮于高糖培养基中，调整小孢子的密度达到1×105～1×106个/ml，置于33℃～35℃下黑暗处理12h～24h，离心弃上清后，加入低糖培养基，获得小孢子悬浮液；其中，所述的高糖培养基是在1/2NLN培养基中加入15％～17％蔗糖及0.8mg/L～1.0mg/L秋水仙碱，再经0.22μm的微孔滤膜抽滤灭菌所得，pH为6.0；所述的低糖培养基是在1/2NLN培养基加入10～13％蔗糖及0.5～0.8g/L活性炭，再经0.22μm的微孔滤膜抽滤灭菌所得，pH为6.0。
2.根据权利要求1所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于小孢子悬浮于高糖培养基后于33℃黑暗处理24h。
3.根据权利要求1所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于所述的小菘菜单核靠边期的花蕾长度为2.0mm～3.0mm。
4.根据权利要求1所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于消毒前将选取的适宜花蕾保湿并置于4℃冰箱中处理24h。
5.根据权利要求1所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于所述的消毒是将花蕾用75％的酒精消毒30s，然后用质量比为0.1％的HgCl2消毒6min，最后用无菌水冲洗3次待用。
6.根据权利要求1所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于所述的分离纯化小孢子是将消毒后的花蕾置于研钵中，加入小孢子提取液，采用挤压法使小孢子游离出来，然后用400目滤网过滤，将滤液收集于离心管，800rpm离心5min，弃上清液，重复3次；所述的小孢子提取液为加入10～13％蔗糖的B5基本培养基，pH为5.8。
7.根据权利要求1所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于所述的离心条件是800rpm～1000rpm离心5min～7min。
8.根据权利要求1所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于所述的小孢子悬浮液于黑暗处理10d～14d后即可出现肉眼可见的胚状体，将其置于振荡培养箱中培养，当出现子叶型胚后立即放于光照下转绿，然后接到分化培养基上继代进而形成再生植株。
9.根据权利要求8所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于所述的分化培养基是在B5基本培养基中加入10～13％蔗糖、0.1～0.3mg/L 6～BA、0.01～0.03mg/LNAA、0.6～0.9％琼脂以及0.4～0.7g/L活性炭，灭菌所得，pH为5.8。
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