CN104304001A - 一种黄瓜游离小孢子的灭菌方法 - Google Patents

一种黄瓜游离小孢子的灭菌方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物组织培养的灭菌方法领域，提供一种黄瓜游离小孢子的灭菌方法；该方法将黄瓜花蕾进行消毒处理步骤、小孢子释放处理步骤、小孢子离心处理步骤，得到无菌的纯化小孢子；所述小孢子离心处理步骤使用的灭菌提取液中含有抗菌剂。本发明是在提取纯化小孢子的过程中的灭菌提取液中加入抗菌剂进行灭菌的，抗菌剂和小孢子接触充分，灭菌彻底；在提取纯化过程中加入抗菌剂，处理后离心弃上清，不会对小孢子的后期培养造成不良影响；通过严格控制抗菌剂的浓度、处理时间和摇床的转速，既能够达到灭菌目的又不影响后期小孢子的正常膨大、细胞分裂和胚胎发育；灭菌效果好，抗菌剂用量大大减少，对环境友好。

Description

一种黄瓜游离小孢子的灭菌方法
技术领域
本发明属于植物组织培养的灭菌方法领域，特别涉及一种黄瓜游离小孢子的灭菌方法，该方法的小孢子离心处理步骤使用的灭菌提取液中，含有植物组培抗菌剂，能够对黄瓜小孢子进行彻底灭菌。
背景技术
黄瓜游离小孢子培养，是通过诱导小孢子出胚可以快速产生纯合的育种新材料(纯系)，缩短了育种年限，提高育种效率，还可用作遗传转化的优良受体材料。此技术在国际上尚未建立起完善且稳定的培养技术体系，很重要的原因之一就是很容易在操作过程中发生污染，尤其是夏秋季节，污染率可达到80-90％，甚至全军覆没，严重影响试验的结果和工作效率，很多实验室在此易污染季节都停止试验工作。污染的原因主要是黄瓜的花蕾外面长有大量的绒毛，而且花瓣包裹不紧实，在外植体清洗和灭菌过程中很难做到彻底灭菌，且部分外植体发生内源性污染，所以很难控制污染的发生。
中国专利申请“黄瓜游离小孢子的培养方法”(申请号200810022098.5，公布号CN101317548A，公布日：2008年12月10日)中记载的黄瓜游离小孢子的培养方法的花蕾消毒步骤中，是先将花蕾在75％酒精溶液中浸泡消毒，再用0.1％的生汞消毒，再用无菌水冲洗；在小孢子离心步骤中，采用未加入任何灭菌剂的液体培养基离心。该培养方法由于消毒不够彻底，所以会对小孢子的后续组织培养产生不利影响。
因此，在植物小孢子培养的科研和实践中，均需要一种既能够对小孢子进行彻底消毒，又不影响小孢子生长分化的灭菌方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种黄瓜游离小孢子的灭菌方法，该方法包括花蕾消毒步骤、小孢子释放处理步骤、小孢子离心处理步骤，得到无菌的纯化小孢子；所述小孢子离心处理步骤使用的灭菌提取液中，含有植物组培抗菌剂，可以对黄瓜小孢子进行彻底灭菌。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种黄瓜游离小孢子的灭菌方法，将黄瓜花蕾进行消毒处理步骤、小孢子释放处理步骤、小孢子离心处理步骤，得到无菌的纯化小孢子；所述小孢子离心处理步骤使用的灭菌提取液中含有抗菌剂。
进一步地，所述抗菌剂为植物组培抗菌剂。
进一步地，所述灭菌提取液中，抗菌剂的质量体积比为0.2-0.3％。
进一步地，所述灭菌提取液为：以基本提取液为基础，添加质量体积比为0.2-0.3％的抗菌剂。
进一步地，所述基本提取液是以B5基本培养基为基础，添加质量体积比为10-14％的蔗糖。
进一步地，所述花蕾消毒处理步骤为：将黄瓜花蕾依次用酒精溶液和次氯酸钠溶液消毒，再用无菌水冲洗，得到消毒后的花蕾；所述小孢子释放处理步骤为：将所述消毒后的花蕾加入基本提取液，再进行挤压处理、过筛处理，得到小孢子滤液；所述小孢子离心处理步骤为：将所述小孢子滤液进行第一轮离心处理，保留沉淀，再加入所述灭菌提取液；再进行振荡处理、第二轮离心处理，保留沉淀，得到所述无菌的纯化小孢子。
进一步地，所述小孢子离心处理步骤中，所述振荡处理的时间为20-40min，转速为30-50rpm。
进一步地，所述小孢子离心处理步骤中，所述第一轮离心处理的转速为500-1000rpm，时间为2-5min。
进一步地，所述小孢子离心处理步骤中，所述第二轮离心处理的转速为500-1000rpm，时间为2-5min。
进一步地，所述灭菌方法适用的黄瓜品种为“中农26”、“津优35”、“北京403”、“粤秀1号”。
本发明相比现有技术具有以下有益效果：
1、常规的灭菌方法是在提取纯化小孢子之前进行的，而本发明是在提取纯化小孢子的过程中的灭菌提取液中加入抗菌剂进行灭菌的，抗菌剂和小孢子接触充分，灭菌彻底。
2、常规抗菌剂多是加入到小孢子提纯后的小孢子悬浮培养液中，小孢子和抗菌剂长期接触很容易对小孢子的后期发育造成不良影响，而本发明在提取纯化过程中加入抗菌剂，处理后离心弃上清，抗菌剂发挥作用后就将其去除掉了，不会对小孢子的后期培养造成不良影响。
3、本发明通过严格控制抗菌剂的浓度、处理时间和摇床的转速，既能够达到灭菌目的又不影响后期小孢子的正常膨大、细胞分裂和胚胎发育。
4、本发明在提取纯化小孢子的过程中加入抗菌剂，灭菌效果好，抗菌剂用量大大减少，对环境友好。
附图说明
图1：对比例1的无菌的纯化小孢子在后续培养中后续培养2-4天后，在AGM(EVOS f1型号)倒置显微镜下的照片。
图2：实施例1的无菌的纯化小孢子在后续培养中后续培养2-4天后，在AGM(EVOS f1型号)倒置显微镜下的照片。
具体实施方式
一种黄瓜游离小孢子的灭菌方法，是将黄瓜花蕾进行消毒处理步骤、小孢子释放处理步骤、小孢子离心处理步骤，得到无菌的纯化小孢子；该灭菌方法适用于“中农26”、“津优35”、“北京403”、“粤秀1号”等代表的国内主栽黄瓜品种。
该灭菌方法包括以下步骤：
步骤一、花蕾消毒处理：先将花蕾在体积比为75％的酒精溶液中浸泡振荡20-60s(比如20s、30s、40s、50s、60s等中任意两者之间，优选为30s)，再在质量比为4％的次氯酸钠溶液中浸泡振荡10-20min(比如10min、15min、20min等中任意两者之间，优选为15min)，最后用无菌水冲洗3-5次，每次30-90s(比如30s、40s、50s、60s、70s、80s、90s等中任意两者之间，优选为60s)，得到消毒后的花蕾；
步骤二、小孢子释放处理：将消毒后的花蕾平铺于无菌的滤纸上，轻压花蕾，尽量吸干花蕾附着的多余水份后，将其置于10ml离心管中；向离心管中加入2-3ml基本提取液，再挤压花蕾使小孢子释放出来，再用200目细胞筛过滤，得到小孢子滤液；
基本提取液以B5基本培养基为基础，添加质量体积比为10-14％(比如10％、11％、12％、13％、14％等中任意两者之间)，优选为13％的蔗糖；
上述B5基本培养基(不含琼脂和糖类)的成分为：
大量元素，包括：
硝酸钾(KNO3)：2500mg/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)：250mg/L，
氯化钙(CaCl2·2H2O)：750mg/L，硫酸铵((NH4)2SO4)：134mg/L，
磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)：150mg/L；
微量元素，包括：
碘化钾(KI)：0.75mg/L，硼酸(H3BO3)：3mg/L，
硫酸锰(MnSO4·H2O)：5mg/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)：2mg/L，
钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)：0.25mg/L，氯化钴(CoCl2·6H2O)：0.025mg/L，
硫酸铜(CuSO4·5H2O)：0.025mg/L；
铁盐，包括：
二水合乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)：37.3mg/L，
硫酸亚铁(FeSO4·4H2O)：27.8mg/L；
有机物，包括：
肌醇：100mg/L，烟酸：1mg/L，盐酸吡哆醇：1mg/L，烟酸硫铵：10mg/L；
上述B5基本培养基(不含琼脂和糖类)的pH值为5.8。
步骤三、小孢子离心处理：先将小孢子滤液于室温下进行第一轮离心处理，该第一轮离心处理需要重复离心2次，每次的转速均为500-1000rpm(比如500rpm、600rpm、700rpm、800rpm、900rpm、1000rpm等中任意两者之间，优选为800rpm)时间均为2-5min(比如2min、3min、4min、5min等中任意两者之间，优选为3min)，每次均弃上清液保留沉淀；
第一轮离心处理完成后，再向得到的沉淀中加入灭菌提取液；再将离心管放置在摇床中振荡摇动20-40min(比如20min、25min、30min、35min、40min等中任意两者之间，优选为30min)，转速为30-50rpm(比如30rpm、35rpm、40rpm、45rpm、50rpm等中任意两者之间，优选为40rpm)；
再将离心管中的液体于转速500-1000rpm(比如500rpm、600rpm、700rpm、800rpm、900rpm、1000rpm、等中任意两者之间，优选为800rpm)于室温下进行第二轮离心处理2-5min(比如2min、3min、4min、5min等中任意两者之间，优选为3min)第二轮离心处理需要离心1次，弃上清液保留沉淀，即为无菌的纯化小孢子；
灭菌提取液为：以基本提取液为基础，添加质量体积比为0.2-0.3％的植物组培抗菌剂(PPM Plant Preservative Mixture)；该植物组培抗菌剂购买于北京金诺利华科技有限公司。
上述质量体积比(w/v)为：配制溶液时，加入的溶质的质量与得到的溶液的体积之间的比例。
采用此方法得到的无菌的纯化小孢子在后续培养中，污染率可以控制在10％以下。污染率的测定方法如下：用液体培养基(上述B5基本培养基的基础上，添加0.5mg/L的2，4-D、0.2mg/L的6-BA、13％的蔗糖)悬浮无菌纯化的小孢子，并用血球计数板计数，调整小孢子密度为1.0×105个·ml-1，得到小孢子悬浮液；将该小孢子悬浮液加入到直径60mm的培养皿中，每皿加入2ml，再用Parafilm封口膜封口后，进行后续培养，即25℃下进行静置暗培养；每次30个皿，3次重复，后续培养4天后统计污染培养皿的数量。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：
一种黄瓜(品种为“中农26”)游离小孢子的灭菌方法，该方法包括以下步骤：
(1)、花蕾消毒：先将黄瓜花蕾在体积比为75％的酒精溶液中浸泡振荡30s，再在质量比为4％的次氯酸钠溶液中浸泡振荡15min，最后用无菌水冲洗3-5次，每次60s，得到消毒后的花蕾；
(2)、小孢子释放：将消毒后的花蕾平铺于无菌的滤纸上，并用镊子轻压，尽量吸干多余水份，再把花蕾放入10ml离心管中；在离心管中加入2-3ml的、在B5基本培养基的基础上添加质量体积比为13％的蔗糖的基本提取液，再用玻璃棒挤压花蕾，使小孢子释放出来，再用200目细胞筛过滤，得到小孢子滤液，放入离心管中；
(3)、小孢子离心：先将小孢子滤液在室温下于转速800rpm离心3min，弃上清液保留沉淀；重复离心2次后，向得到的沉淀中加入在基本提取液的基础上添加质量体积比为0.3％的植物组培抗菌剂的灭菌提取液；再将离心管放置在摇床中40rpm振荡摇动30min；再将离心管中的液体于转速800rpm离心3min，弃上清液保留沉淀，即为无菌的纯化小孢子。
本实施例的无菌的纯化小孢子在后续培养中的污染率仅为3％。如图2所示，后续培养2-4天后，小孢子可以正常膨大和分裂。
实施例2：
一种黄瓜(品种为“中农26”)游离小孢子的灭菌方法，该方法包括以下步骤：
(1)、花蕾消毒：先将黄瓜花蕾在体积比为75％的酒精溶液中浸泡振荡30s，再在质量比为4％的次氯酸钠溶液中浸泡振荡15min，最后用无菌水冲洗3-5次，每次60s，得到消毒后的花蕾；
(2)、小孢子释放：将消毒后的花蕾平铺于无菌的滤纸上，并用镊子轻压，尽量吸干多余水份，再把花蕾放入10ml离心管中；在离心管中加入2-3ml的、在B5基本培养基的基础上添加质量体积比为10％的蔗糖的基本提取液，再用玻璃棒挤压花蕾，使小孢子释放出来，再用200目细胞筛过滤，得到小孢子滤液，放入离心管中；
(3)、小孢子离心：先将小孢子滤液在室温下于转速800rpm离心3min，弃上清液保留沉淀；重复离心2次后，向得到的沉淀中加入在基本提取液的基础上添加质量体积比为0.2％的植物组培抗菌剂的灭菌提取液；再将离心管放置在摇床中40rpm振荡摇动20min；再将离心管中的液体于转速800rpm离心3min，弃上清液保留沉淀，即为无菌的纯化小孢子。
本实施例的无菌的纯化小孢子在后续培养中的污染率仅为10％。后续培养2-4天后，小孢子可以正常膨大和分裂。
实施例3：
一种黄瓜(品种为“津优35”)游离小孢子的灭菌方法，该方法包括以下步骤：
(1)、花蕾消毒：先将黄瓜花蕾在体积比为75％的酒精溶液中浸泡振荡30s，再在质量比为4％的次氯酸钠溶液中浸泡振荡15min，最后用无菌水冲洗3-5次，每次60s，得到消毒后的花蕾；
(2)、小孢子释放：将消毒后的花蕾平铺于无菌的滤纸上，并用镊子轻压，尽量吸干多余水份，再把花蕾放入10ml离心管中；在离心管中加入2-3ml的、在B5基本培养基的基础上添加质量体积比为12％的蔗糖的基本提取液，再用玻璃棒挤压花蕾，使小孢子释放出来，再用200目细胞筛过滤，得到小孢子滤液，放入离心管中；
(3)、小孢子离心：先将小孢子滤液在室温下于转速600rpm离心5min，弃上清液保留沉淀；重复离心2次后，向得到的沉淀中加入在基本提取液的基础上添加质量体积比为0.2％的植物组培抗菌剂的灭菌提取液；再将离心管放置在摇床中30rpm振荡摇动30min；再将离心管中的液体于转速600rpm离心5min，弃上清液保留沉淀，即为无菌的纯化小孢子。
本实施例的无菌的纯化小孢子在后续培养中的污染率仅为5％。后续培养2-4天后，小孢子可以正常膨大和分裂。
实施例4：
一种黄瓜(品种为“粤秀1号”)游离小孢子的灭菌方法，该方法包括以下步骤：
(1)、花蕾消毒：先将黄瓜花蕾在体积比为75％的酒精溶液中浸泡振荡30s，再在质量比为4％的次氯酸钠溶液中浸泡振荡15min，最后用无菌水冲洗3-5次，每次60s，得到消毒后的花蕾；
(2)、小孢子释放：将消毒后的花蕾平铺于无菌的滤纸上，并用镊子轻压，尽量吸干多余水份，再把花蕾放入10ml离心管中；在离心管中加入2-3ml的、在B5基本培养基的基础上添加质量体积比为13％的蔗糖的基本提取液，再用玻璃棒挤压花蕾，使小孢子释放出来，再用200目细胞筛过滤，得到小孢子滤液，放入离心管中；
(3)、小孢子离心：先将小孢子滤液在室温下于转速900rpm离心4min，弃上清液保留沉淀；重复离心2次后，向得到的沉淀中加入在基本提取液的基础上添加质量体积比为0.3％的植物组培抗菌剂的灭菌提取液；再将离心管放置在摇床中40rpm振荡摇动30min；再将离心管中的液体于转速900rpm离心4min，弃上清液保留沉淀，即为无菌的纯化小孢子。
本实施例的无菌的纯化小孢子在后续培养中的污染率仅为3％。后续培养2-4天后，小孢子可以正常膨大和分裂。
实施例5：
一种黄瓜(品种为“北京403”)游离小孢子的灭菌方法，该方法包括以下步骤：
(1)、花蕾消毒：先将黄瓜花蕾在体积比为75％的酒精溶液中浸泡振荡30s，再在质量比为4％的次氯酸钠溶液中浸泡振荡15min，最后用无菌水冲洗3-5次，每次60s，得到消毒后的花蕾；
(2)、小孢子释放：将消毒后的花蕾平铺于无菌的滤纸上，并用镊子轻压，尽量吸干多余水份，再把花蕾放入10ml离心管中；在离心管中加入2-3ml的、在B5基本培养基的基础上添加质量体积比为14％的蔗糖的基本提取液，再用玻璃棒挤压花蕾，使小孢子释放出来，再用200目细胞筛过滤，得到小孢子滤液，放入离心管中；
(3)、小孢子离心：先将小孢子滤液在室温下于转速700rpm离心3min，弃上清液保留沉淀；重复离心2次后，向得到的沉淀中加入在基本提取液的基础上添加质量体积比为0.3％的植物组培抗菌剂的灭菌提取液；再将离心管放置在摇床中50rpm振荡摇动40min；再将离心管中的液体于转速700rpm离心3min，弃上清液保留沉淀，即为无菌的纯化小孢子。
本实施例的无菌的纯化小孢子在后续培养中的污染率可达到0％。后续培养2-4天后，小孢子可以正常膨大和分裂。
对比例1：
本对比例的灭菌方法中，灭菌提取液中添加的植物组培抗菌剂的用量较大，虽然在摇床中振荡摇动的时间适合，但是最后会对小孢子的生长和分化造成不良影响。
本对比例相比实施例1的灭菌方法的区别在于：小孢子离心步骤中，在重复离心2次后，向得到的沉淀中加入以基本提取液为基础的添加质量体积比为0.4％的植物组培抗菌剂的灭菌提取液；再将离心管放置在摇床中50rpm振荡摇动40min；
除此之外，本对比例中的灭菌方法的黄瓜品种、各个操作步骤均与实施例1相同。如图1所示，后续培养2-4天后，小孢子发生收缩、凋亡和停止发育的现象。
对比例2：
本对比例的灭菌方法中，灭菌提取液中添加的植物组培抗菌剂的用量适中，但在摇床中振荡摇动的时间过长，摇床的转速也过高，最后对小孢子的生长和分化造成不良影响。
本对比例相比实施例1的灭菌方法的区别在于：小孢子离心步骤中，在重复离心2次后，向得到的沉淀中加入以基本提取液为基础的添加质量体积比为0.3％的植物组培抗菌剂的灭菌提取液；再将离心管放置在摇床中60rpm振荡摇动70min；
除此之外，本对比例中的灭菌方法的黄瓜品种、各个操作步骤均与实施例1相同。后续培养2-4天后，小孢子发生收缩、凋亡和停止发育的现象。

Claims (10)

1.一种黄瓜游离小孢子的灭菌方法，其特征在于：该方法将黄瓜花蕾进行消毒处理步骤、小孢子释放处理步骤、小孢子离心处理步骤，得到无菌的纯化小孢子；所述小孢子离心处理步骤使用的灭菌提取液中含有抗菌剂。
2.根据权利要求1所述黄瓜游离小孢子的灭菌方法，其特征在于：所述抗菌剂为植物组培抗菌剂。
3.根据权利要求1或2所述黄瓜游离小孢子的灭菌方法，其特征在于：所述灭菌提取液中，抗菌剂的质量体积比为0.2-0.3％。
4.根据权利要求3所述黄瓜游离小孢子的灭菌方法，其特征在于：所述灭菌提取液为：以基本提取液为基础，添加质量体积比为0.2-0.3％的抗菌剂。
5.根据权利要求4所述黄瓜游离小孢子的灭菌方法，其特征在于：所述基本提取液是以B5基本培养基为基础，添加质量体积比为10-14％的蔗糖。
6.根据权利要求5所述黄瓜游离小孢子的灭菌方法，其特征在于：
所述花蕾消毒处理步骤为：将黄瓜花蕾依次用酒精溶液和次氯酸钠溶液消毒，再用无菌水冲洗，得到消毒后的花蕾；
所述小孢子释放处理步骤为：将所述消毒后的花蕾加入基本提取液，再进行挤压处理、过筛处理，得到小孢子滤液；
所述小孢子离心处理步骤为：将所述小孢子滤液进行第一轮离心处理，保留沉淀，再加入所述灭菌提取液；再进行振荡处理、第二轮离心处理，保留沉淀，得到所述无菌的纯化小孢子。
7.根据权利要求6所述黄瓜游离小孢子的灭菌方法，其特征在于：
所述小孢子离心处理步骤中，所述振荡处理的时间为20-40min，转速为30-50rpm。
8.根据权利要求6或7所述黄瓜游离小孢子的灭菌方法，其特征在于：
所述小孢子离心处理步骤中，所述第一轮离心处理的转速为500-1000rpm，时间为2-5min。
9.根据权利要求6或7所述黄瓜游离小孢子的灭菌方法，其特征在于：
所述小孢子离心处理步骤中，所述第二轮离心处理的转速为500-1000rpm，时间为2-5min。
10.根据权利要求1所述黄瓜游离小孢子的灭菌方法，其特征在于：所述灭菌方法适用的黄瓜品种为“中农26”、“津优35”、“北京403”、“粤秀1号”。
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