CN104604692B - 一种粉绿狐尾藻组织培养与快速繁殖方法 - Google Patents

一种粉绿狐尾藻组织培养与快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种粉绿狐尾藻组织培养与快速繁殖方法,其步骤是：A、外植体选择：选择生长健壮，颜色鲜绿，无病虫害的植物茎作为外植体。B、外植体灭菌：用酒精和氯化汞处理外植体。C、芽诱导：选择最佳的激素配比诱导芽生长。D、增殖培养：调整激素配比和培养基浓度进行增殖培养。E、生根：选择合适的细胞生长素进行生根诱导。F、炼苗和移栽：在培养箱中打开瓶口培养两天，在转入自然水体中培养。该技术可以不受季节和环境限制，培养出大量无菌苗，供水生生态系统恢复之用。

Description

一种粉绿狐尾藻组织培养与快速繁殖方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及沉水植物粉绿狐尾藻的组培和快速繁殖方法，该方法是利用完全无菌和严格的控温措施，实现了沉水植物在实验室大量生产，并可以推广到生态环境修复。
背景技术
粉绿狐尾藻属于被子植物门(Angiospermae)双子叶植物纲(Dicotyledoneae)小二仙草科(Haloragidaceae)。目前湖泊生态修复工程中作为净水工具种和植被恢复先锋物种、鱼虾蟹塘养殖过程中作为饵料、避难和产卵场所，以及室内观赏水族养殖过程中作为布景材料的迫切需要。运用组织培养技术，获得并大规模扩繁其优质工程苗，以克服该物种在自然环境中种源有限且污染严重的问题。
目前关于狐尾藻组织培养的报道比较多，但是除了穗花狐尾藻外都没有具体落实到是何种狐尾藻。而且关于粉绿狐尾藻的生理生化，以及生态学方面的报道都非常稀少。虽然它有狐尾藻属的共同特性，但是其自身的特点也导致组培的方式和条件有变化。
发明内容
本发明提供了一种粉绿狐尾藻组织培养与快速繁殖方法。该方法是在无菌条件下，采取控温措施，给予固定光照，培养无菌苗体系，可常年提供大量无菌幼苗。方法易行，操作方便，产量高。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
一种粉绿狐尾藻组织培养与快速繁殖方法，其步骤是：
A、外植体选择与预处理：选择生长健壮，颜色鲜绿，无病虫害的茎段作为外植体，用碱性洗涤剂浸泡30min，再在自来水下冲洗2h，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用无菌水再反复清洗4-5次，置于无菌操作台。
B、外植体灭菌：在无菌操作台上首先用70％(体积比)乙醇浸泡15s，用无菌水冲洗4-5次，再用0.1％(质量体积比)氯化汞进行表面消毒2-5min，无菌水冲洗4-5次，放入0.15％(质量体积比)的无菌柠檬酸溶液中切割，在无菌滤纸上将水吸干，待用。
C、愈伤组织和芽诱导：选择诱导培养基，接入0.5-2cm的去除叶片的步骤B中的粉绿狐尾藻外植体，于光照培养箱中静置培养，诱导愈伤组织和幼芽；
所述的诱导培养基的配方为：MS固体培养基+6-BA 0.50-1.50mg/L+NAA 0.25-0.50mg/L+蔗糖3％(质量体积比)，pH5.8-6.0。
D、增殖培养：可不更换培养基继续使用步骤C的培养基，用于增殖培养。也可待幼芽生长到1.5-2cm，更换为增殖培养基，进一步扩大繁殖，形成幼苗；
所述的增殖培养基为：1/2MS液体培养基+6-BA 0.50-1.50mg/L+NAA 0.25-0.50mg/L+蔗糖1.5％(质量体积比)。每隔20-25d继代一次，形成的幼苗，切成1-2cm，转入诱导培养基或增殖培养基，在与步骤D相同培养条件下继续进行增殖培养，扩繁植株；
E、生根：愈伤组织不断生长，幼苗生长到4-6cm左右，可以不更换培养基继续在步骤C的培养基上长出根，也可以更换为生根培养基，更换了生根培养基，不仅可促进其生根，也可加速生长。
所述的生根培养基为：1/2MS液体培养基+NAA 0.10mg/L+蔗糖1.5％(质量体积比)。
F、炼苗和移栽：待不定根长至2.0cm以上时，打开瓶盖，室温下炼苗1-2d后，取出试管苗，洗净其根部培养基，移栽至室外水体中。
以上步骤C,D,E均为无菌环境，光照40-60μE/(m2·s)，光照周期为12h/d，室内温度25±2℃。
优选的，步骤B中氯化汞的消毒时间为2min；步骤C和D中，6-BA的浓度为0.50mg/L，NAA的浓度为0.25mg/L。
以上所述培养基的pH均为5.8-6.0。
MS培养基配方如下：单位mg/L
KNO3 1900
NH4NO3 1650
MgSO4·7H2O 370
KH2PO4 170
CaCl2·2H2O 440
MnSO4·4H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
H3BO3 6.2
KI 0.83
Na2MoO4·7H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
Na2-EDTA 37.3
FeSO4·7H2O 27.8
甘氨酸 2.0
盐酸吡哆醇 0.5
盐酸硫铵素 0.1
烟酸 0.5
肌酸 100
本发明所用的MS固体培养基为MS培养基添加7g/L的琼脂，pH5.8-6.0。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
本发明提供的粉绿狐尾藻组织培养与快速繁殖方法，可在短期提供大量的幼苗，为进一步对粉绿狐尾藻的生理生化特征的研究提供源源不断的资源。一个长1cm的茎段经过一周的培养，能行成一块面积为0.25cm2的愈伤组织，再经三周的培养可获得10-12个幼苗，每个幼苗长6-8cm，增殖倍数达到10-12，一年一个外植体可繁殖数亿棵以上幼苗。以一个幼苗20d继代一次，每次的增殖倍数为12计算。
天数/d 20 40 60 80 100 120
苗数/棵 12 122 123 124 125 126
具体实施方式
本发明实施例所使用的试剂，如未特别说明，市售的均为实现本发明，所述技术方案如未特别说明，均为本领域的常规技术。
实施例1：
一种粉绿狐尾藻组织培养与快速繁殖方法，包括以下步骤：
A、外植体选择与预处理：选择生长健壮，颜色鲜绿，无病虫害的茎段(有无幼芽均可)作为外植体，用碱性洗涤剂浸泡30min，再在自来水下冲洗2h，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用无菌水再反复清洗4-5次，置于无菌操作台。
B、外植体灭菌：在无菌操作台上首先用70％乙醇(体积比)浸泡15s，用无菌水冲洗4-5次，再用0.1％(质量体积比，0.1g氯化汞加入100ml水中)氯化汞进行表面消毒5m in，无菌水冲洗4-5次，放入0.15％(质量体积比)的无菌柠檬酸溶液中切割，在无菌滤纸上将水吸干，待用。
C、愈伤组织和幼芽诱导：选择诱导培养基，培养基装于50毫升三角瓶中，每瓶20毫升。培养基经过120℃灭菌处理20min后，接入去除叶片的步骤B中的长约1cm的外植体(有无幼芽均可)，每瓶接入一个外植体，于光照培养箱中静置培养，诱导愈伤组织和幼芽，诱导率为99％。
所述的诱导培养基的配方为：MS固体培养基+6-BA1.50mg/L+NAA 0.50mg/L+蔗糖3％(质量体积比)，pH5.8-6.0。
D、增殖培养：不更换培养基，步骤C的培养基继续用于增殖培养。外植体在膨大形成愈伤组织的同时也会产生大量的芽，芽逐渐分化成一整棵植株，并且源源不断的产生新的幼苗。每隔25d继代一次，形成的幼苗，切成2cm，转入诱导培养基，在与步骤D相同培养条件下继续进行增殖培养，扩繁植株。
E、生根：愈伤组织和幼苗生长到一定阶段，在步骤C的培养基上继续长出根。
F、炼苗和移栽：待不定根长至2.0cm以上时，打开瓶盖，室温下炼苗1-2d后(打开瓶盖，静置在培养箱内即可)，取出试管苗，洗净其根部培养基，移栽至室外水体中。
以上步骤中C,D,E均为无菌环境，光照40-60μE/(m2·s)，光照周期为12h/d，室内温度25±2℃。
本方法可以由一个外植体逐渐诱导出愈伤组织，并由愈伤组织分化出新的幼苗，增殖倍数可以达到10，使用一种培养基就就可以实现芽诱导，增殖和生根三种效果，减少操作步骤，节省生产成本。生根率100％，污染率小于2％，移栽存活率大于98％。
实施例2：
一种粉绿狐尾藻组织培养与快速繁殖方法，包括以下步骤：
A、外植体选择与预处理：选择生长健壮，颜色鲜绿，无病虫害的茎段(有无幼芽均可)作为外植体，去除幼叶，用碱性洗涤剂浸泡30min，再在自来水下冲洗2h，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用无菌水再反复清洗4-5次，置于无菌操作台。
B、外植体灭菌：在无菌操作台上首先用70％(体积比)乙醇浸泡15s，用无菌水冲洗4-5次，再用0.1％(质量体积比)氯化汞进行表面消毒2min，无菌水冲洗4-5次，放入0.15％(质量体积比)的无菌柠檬酸溶液中切割，在无菌滤纸上将水吸干，待用。
C、愈伤组织和芽诱导：选择诱导培养基，培养基装于50毫升三角瓶中，每瓶20毫升。培养基经过120℃灭菌处理20min后，接入去除叶片的步骤B中的1cm的外植体(有无幼芽均可)，接入培养基中，每瓶接入1个外植体，于光照培养箱中静置培养，诱导愈伤组织和幼芽，诱导率为99％。
所述的诱导培养基的配方为：MS固体培养基+6-BA 1.50mg/L+NAA 0.50mg/L+蔗糖3％(质量体积比)，pH5.8-6.0。
D、增殖培养：待步骤C中的幼芽生长到2cm，更换继代增殖培养基，进一步扩大繁殖，形成幼苗，每隔20d继代一次，形成的幼苗，切成2cm，转入增殖培养基，在与步骤D相同培养条件下继续进行增殖培养，扩繁植株。
所述的增殖培养基的配方为：1/2MS液体培养基+6-BA 0.50mg/L+NAA 0.25mg/L+蔗糖1.5％(质量体积比)，pH5.8-6.0。
E、生根：幼苗生长到5cm，更换生根培养基，可促进其生根，生根率达到100％；
所述的生根培养基的配方为：1/2MS液体培养基+NAA 0.10mg/L+蔗糖1.5％(质量体积比)，pH5.8-6.0。
F、炼苗和移栽：待不定根长至2.0cm及以上时，打开瓶盖，室温下炼苗1-2d后(打开瓶盖，静置在培养箱内即可)，取出试管苗，洗净其根部培养基，移栽至室外水体中。
步骤C,D,E均为无菌环境，光照40-60μE/(m2·s)，光照周期为12h/d，室内温度(25±2)℃。
本方法由一个外植体逐渐诱导出愈伤组织，由愈伤组织分化出新的幼苗，增殖系数可以达到12，在液体培养中诱导生根，生根率达100％，将5cm的幼苗接入生根培养基后5d可生根完毕。液体环境中的粉绿狐尾藻有两种状态，沉水的植株部分和挺水的植株部分差别很大，容易区分。本实施例方法减少了消毒灭菌的时间，污染率小于1％，也达到了很好灭菌的效果，移栽存活率大于99％。

Claims (2)

1.一种粉绿狐尾藻组织培养与快速繁殖方法，其步骤是：
A、外植体选择与预处理：选择生长健壮，颜色鲜绿，无病虫害的茎段作为外植体，用碱性洗涤剂浸泡30min，再在自来水下冲洗2h，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用无菌水再反复清洗4-5次，置于无菌操作台；
B、外植体灭菌：在无菌操作台上首先用70%乙醇浸泡15s，用无菌水冲洗4-5次，再用0.1%氯化汞进行表面消毒2-5min，无菌水冲洗4-5次，放入0.15%（质量体积比）的无菌柠檬酸溶液中切割，在无菌滤纸上将水吸干，待用；
C、愈伤组织和芽诱导：选择诱导培养基，接入0.5-2cm的去除叶片的步骤B中的粉绿狐尾藻外植体，于光照培养箱中静置培养，诱导愈伤组织和幼芽；
所述的诱导培养基的配方为：MS固体培养基+6-BA 0.50-1.50mg/L+NAA 0.25-0.50mg/L+蔗糖3%，pH5.8-6.0；
D、增殖培养： 继续使用步骤C的培养基，用于增殖培养，或待幼芽生长到1.5-2cm，更换至增殖培养基，进一步扩大繁殖，形成幼苗；每隔20-25d继代一次，形成的幼苗，切成1-2cm，转入诱导培养基或增殖培养基，在与步骤D相同培养条件下继续进行增殖培养，扩繁植株；
所述的增殖培养基为： 1/2MS液体培养基+6-BA 0.50-1.50mg/L+ NAA 0.25-0.50mg/L+蔗糖 1.5%；
E、生根：愈伤组织不断生长，幼苗生长到4-6cm，继续在步骤C的培养基上长出根，或更换至生根培养基，进行生根；
所述的生根培养基为： 1/2MS液体培养基+NAA 0.10mg/L+蔗糖1.5%；
F、炼苗和移栽：待不定根长至2.0cm时，打开瓶盖，室温下炼苗1-2d后，取出试管苗，洗净其根部培养基，移栽至室外水体中；
以上步骤C,D,E均为无菌环境，光照40-60μE/（m2·s），光照周期为12h/d，室内温度25±2℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤B中氯化汞的消毒时间为2min；步骤C-D中，6-BA的浓度为0.50mg/L，NAA 的浓度为0.25mg/L。
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