CN104855289A

CN104855289A - 一种利用浅层培养生产藏红花微球茎方法

Info

Publication number: CN104855289A
Application number: CN201510263701.9A
Authority: CN
Inventors: 周志疆; 陈明亮; 张丽丽; 韩婷
Original assignee: Jiangsu Good Harvest Earth Zhong Ye Development Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Good Harvest Earth Zhong Ye Development Co Ltd
Priority date: 2015-05-21
Filing date: 2015-05-21
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2035-05-21
Also published as: CN104855289B

Abstract

本发明公开了一种利用浅层培养生产藏红花微球茎的方法，该方法包括(1)培养容器灭菌；(2)外植体的获得及灭菌处理；(3)浅层培养的外植体的制备；(4)浅层培养；(A)丛生芽诱导；(B)微球茎形成；浅层培养阶段又分丛生芽诱导和微球茎形成两个过程。由于浅层培养采用的液体培养模式，培养体更易吸收培养基中的营养成分，所以种苗生长快，缩短了微球茎生产时间；同时浅层培养操作简单，成本低，更容易实现规模化和工业化生产。

Description

一种利用浅层培养生产藏红花微球茎方法

技术领域

本发明涉及植物种苗生产方法，具体涉及一种利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，属于生物技术领域。

背景技术

藏红花(Crocus sativus L.)别名番红花、西红花，是一种鸢尾科番红花属的多年生花卉，也是一种常见的香料。是西南亚原生种，最早由希腊人人工栽培。主要分布在欧洲、地中海及中亚等地，明朝时传入中国，《本草纲目》将它列入药物之类，中国浙江等地有种植。是一种名贵的中药材，具有强大的生理活性，其柱头在亚洲和欧洲作为药用，有镇静、祛痰、解痉作用，用于胃病、调经、麻疹、发热、黄胆、肝脾肿大等的治疗。

由于藏红花不能进行有性生殖，只能通过球茎进行无性繁殖，且栽培条件下其球茎退化现象严重，导致种质资源严重缺乏。我国自引种以来，栽培藏红花产量一直较低，远远不能满足人们的需要。近年来组织培养技术应用在藏红花种苗的生产上，为藏红花种球短缺与退化提供了一种解决方法，但是植株组织培养是一个劳动密集型产业，生产成本居高不下，种苗的生产也只停留在实验阶段。

本发明利用浅层培养技术生产藏红花微球茎，由于采用液体培养模式，更易实现产业化和自动化，将是解决藏红花种球短缺的一个有效方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种生长周期短、移栽存活率高、成本低、操作简单且适宜大规模生产的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：该利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，包括以下步骤：

(1)培养容器灭菌：将培养基放入培养容器中，并在高温高压湿热消毒灭菌后待用；

(2)外植体的获得及灭菌处理：将藏红花球茎放入含有消毒液的水中培养待其长出叶片，取下叶片，清水冲洗20～40分钟；在超净台中将上述藏红花叶片进行表面消毒灭菌处理；

(3)浅层培养的外植体的制备：将步骤(2)中已消毒灭菌的叶片在无菌环境下切成0.5～1.0cm的小段，并接种到已灭菌的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基中，获得藏红花愈伤组织；所述藏红花愈伤组织即为浅层培养的外植体；

(4)浅层培养：

(A)丛生芽诱导：将步骤(3)中获得的愈伤组织切成0.1～0.3cm³小块接种到液体浅层丛生芽诱导培养基中培养，培养时间为15～25d；

(B)微球茎形成：丛生芽诱导结束后，不移动组培苗及培养基，直接向组培瓶中添加诱导微球茎形成的培养基，培养时间为30～45d；即获得藏红花丛生微球茎。

采用上述技术方案，首先将灭菌后的藏红花叶片进行愈伤组织培养，在植物组织培养过程中，愈伤组织的培养是至关重要的步骤；愈伤组织的培养是无性繁殖且可以在短时间内大量扩繁，从而为后续浅层培养提供材料；将浅层培养过程分为丛生芽诱导步骤和微球茎形成步骤两个过程，且两个步骤之间不移动组培苗及培养基，直接在丛生芽诱导步骤的组培瓶中添加促进微球茎形成的培养基，由于所采用的液体培养基均为浅层培养，营养物质更易被吸收、利用充分，培养体生长速度快，从而快速获得大量用于生产的藏红花丛生微球茎；该方法解决了更换组培瓶及培养基时对丛生芽造成的伤害，提高了丛生芽接种至微球茎形成培养基时的存活率，提高了微球茎的增殖率。

通过大量的实验证实，将浅层培养过程分为丛生芽诱导步骤和微球茎形成步骤两个过程，且两个步骤之间不移动组培苗及培养基，直接在丛生芽诱导步骤的组培瓶中添加促进微球茎形成的培养基的操作过程更为简单方便，且极大的降低了操作过程中的污染率；从而提高了丛生芽的存活率；同时由于所采用的液体培养基均为浅层培养，营养物质更易被吸收、利用充分，培养体生长速度快。

本发明的进一步改进在于，所述步骤(2)中的灭菌处理的具体步骤为：首先在75％无水乙醇中浸泡15～30s，再用无菌水清洗2～4次，然后放入摩尔浓度为0.1％的升汞中浸泡3～5min，再用无菌水清洗5～8次。灭菌的处理对后续的培养过程非常关键，直接影响后续培养的诱导率、增殖率以及生根率，通过大量实验验证，该灭菌方法对本发明后续的培养最好。

本发明的进一步改进在于，所述步骤(3)中的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基的配方为：MS+0.5～1.5mg/L 6-BA+0.05～0.2mg/L NAA+藏红花汁液0.1～0.3g/L+蔗糖25g/L+琼脂5.5g/L，pH为5.6～6.0，培养时间为25～30d。愈伤组织的诱导培养基的组成直接关系到愈伤组织的诱导率以及愈伤组织的质量，为了提高藏红花外植体的愈伤组织的诱导率，本发明对藏红花外植体愈伤组织的诱导培养基进行了优化，如pH影响愈伤组织对NO^3-和NH⁴⁺的吸收利用，pH高有利于愈伤组织对NH⁴⁺的吸收利用，pH低则可以提高其对NO^3-的利用；通过大量的筛选试验最终确定，采用上述的愈伤组织诱导培养基进行藏红花外植体的愈伤组织诱导培养，愈伤组织的诱导效果最好。

本发明的进一步改进在于，所述步骤(4)中的(A)步骤中的液体培养基的配方为：MS+1.5～2.5mg/L 6-BA+0.05～0.15mg/L NAA+藏红花汁液0.1～0.3g/L+蔗糖20g/L+AC 0.1～0.3g/L，pH为5.6～6.0，将配制好的液体培养基倒入组培瓶中，液面高度为0.2～0.5cm，灭菌后使用。在该液面高度下进行浅层培养时营养物质更易被吸收、利用充分，培养体生长速度快，更有利于丛生芽的生长；此外如果液面高度过高，培养体完全浸泡在液体中易产生玻璃化；如果液面高度过低，营养不足影响培养体生长。

本发明的进一步改进在于，所述步骤(4)中的(B)步骤中的液体培养基的配方为：1/2MS+0.1～0.5mg/L IBA+0.05～0.2mg/L NAA+藏红花汁液0.1～0.3g/L+蔗糖30g/L，pH为5.6～6.0，将配制好的液体培养基灭菌后倒入组培瓶中，液面高度为0.5～1.0cm。此处，如果液面高度过高，培养体完全浸泡在液体中易产生玻璃化；如果液面高度过低，营养不足影响培养体生长。

通过大量的实验证实，在步骤(3)和步骤(4)的培养基中，藏红花汁液适宜添加量为0.1～0.3g/L，当培养基中藏红花汁液添加量低于0.1g/L时，获得的藏红花微球茎和普通培养获得的微球茎长势并没有显著差异，微球茎的直径、株高等小于添加量在0.1～0.3g/L时获得的微球茎，且差异显著；当藏红花汁液添加量高于0.3g/L时，随着添加量的增加微球茎并没有显著地变化。藏红花汁液中含有藏红花生长过程中所不可缺少而又无法人工合成的微量元素，经过大量的实验证明，添加藏红花汁液的培养液比普通培养液培养获得的藏红花组培苗更健壮。以普通培养液为对照，培养80天后比较藏红花组培苗长势情况如下表：

培养液	球茎直径(mm)
		藏红花汁液(0.2g/L)	0.45±0.08
普通培养基	0.22±0.07

本发明的进一步改进在于，所述步骤(3)中的诱导藏红花愈伤组织培养的环境为：暗培养30～40d，温度为19～22℃。暗培养可以减少外植体和愈伤组织的褐化，提高愈伤组织的诱导率；同时，暗培养有利于细胞脱分化产生愈伤组织，而光照培养容易分化产生维管等组织，不利于产生大量的愈伤组织。

本发明的进一步改进在于，所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(4)的(A)步骤中丛生芽生长的培养环境为：首先进行暗培养，暗培养时间为10～15d；然后进行光照培养，光照周期14h/d，光照强度1800～2000LX，培养时间为5～10d；所述培养环境温度为19～22℃。

本发明的进一步改进在于，所述步骤(4)的(B)步骤中微球茎产生的培养环境为：光照周期14h/d，光照强度2000～2500LX，温度18～20℃。

本发明的进一步改进在于，所述藏红花汁液的制备方法是鲜物研磨和/或榨汁。鲜物研磨和/或榨汁获得藏红花汁液既能满足破坏组织和细胞获得细胞内含物的目的，又不会破坏细胞内大分子结构。

作为本发明的优选方案，所述藏红花汁液的制作步骤为：将藏红花球茎洗净，除去皮膜，切成质量为1～5g的小块，研钵研磨获得所述汁液。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)培养周期短；本发明采用液体培养基浅层培养，营养物质更易被吸收、利用充分，培养体生长速度快；(2)种苗质量好，移栽成活率高；(3)操作简单，投资少，成本低，适宜大规模工业化生产藏红花微球茎。

具体实施方法

实施例1：

该利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，包括以下步骤：

(2)外植体的获得及灭菌处理：将藏红花球茎放入含有消毒液的水中培养待其长出叶片，取下叶片，清水冲洗30分钟；在超净台中将上述藏红花叶片进行表面消毒灭菌处理；具体步骤：75％酒精浸泡15s，无菌水清洗2次，0.1％的升汞浸泡3min，无菌水清洗5次；

(3)浅层培养的外植体的制备：将步骤(2)中已消毒灭菌的叶片在无菌环境下切成0.5cm的小段，并接种到已灭菌的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基中，诱导愈伤组织的固体培养基的配方为MS+0.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+藏红花汁液0.1g/L+蔗糖25g/L+琼脂5.5g/L，pH为6.0，暗培养时间为30d，获得藏红花愈伤组织，诱导率为75％；藏红花愈伤组织即为浅层培养的外植体；其中愈伤组织诱导率(％)＝产生愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100％；

(4)浅层培养：

(A)丛生芽诱导：将步骤(3)中获得的愈伤组织切成0.1～0.3cm³小块接种到液体浅层丛生芽诱导培养基中培养，液体培养基的液面高度为0.3cm左右，丛生芽诱导培养基的配方为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+藏红花汁液0.1g/L+蔗糖20g/L+AC 0.1g/L，pH为6.0，首先暗培养15d，然后光照周期间歇光照培养10d；

(B)微球茎形成：丛生芽诱导结束后，不移动组培苗及培养基，直接向组培瓶中添加诱导微球茎形成的培养基至液面高度0.5cm，诱导微球茎形成的培养基配方为：1/2MS+0.1mg/L IBA+0.05mg/L NAA+藏红花汁液0.1g/L+蔗糖30g/L，pH为6.0，间歇光照培养45d获得藏红花丛生微球茎；微球茎形成率为85％。

实施例2：

该利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，包括以下步骤：

(2)外植体的获得及灭菌处理：将藏红花球茎放入含有消毒液的水中培养待其长出叶片，取下叶片，清水冲洗35分钟；在超净台中将上述藏红花叶片进行表面消毒灭菌处理；具体步骤：75％酒精浸泡15s，无菌水清洗2次，0.1％的升汞浸泡4min，无菌水清洗6次；

(3)浅层培养的外植体的制备：将步骤(2)中已消毒灭菌的叶片在无菌环境下切成0.7cm的小段，并接种到已灭菌的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基中，愈伤组织的固体培养基的配方为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+藏红花汁液0.2g/L+蔗糖25g/L+琼脂5.5g/L，pH为6.0，暗培养时间为35d，获得藏红花愈伤组织，诱导率为78％；藏红花愈伤组织即为浅层培养的外植体；

(4)浅层培养：

(A)丛生芽诱导：将步骤(3)中获得的愈伤组织切成0.1～0.3cm³小块接种到液体浅层丛生芽诱导培养基中培养，液体培养基的液面高度为0.4cm左右，丛生芽诱导培养基的配方为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+藏红花汁液0.2g/L+蔗糖20g/L+AC 0.2g/L，pH为6.0，首先暗培养17d，然后光照周期间歇光照培养7d；

(B)微球茎形成：丛生芽诱导结束后，不移动组培苗及培养基，直接向组培瓶中添加诱导微球茎形成的培养基至液面高度0.8cm，诱导微球茎形成的培养基配方为：1/2MS+0.2mg/L IBA+0.1mg/L NAA+藏红花汁液0.2g/L+蔗糖30g/L，pH为6.0，间歇光照培养30d获得藏红花丛生微球茎；微球茎形成率为88％。

实施例3：

该利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，包括以下步骤：

(2)外植体的获得及灭菌处理：将藏红花球茎放入含有消毒液的水中培养待其长出叶片，取下叶片，清水冲洗40分钟；在超净台中将上述藏红花叶片进行表面消毒灭菌处理；具体步骤：75％酒精浸泡15s，无菌水清洗4次，0.1％的升汞浸泡5min，无菌水清洗8次；

(3)浅层培养的外植体的制备：将步骤(2)中已消毒灭菌的叶片在无菌环境下切成1.0cm的小段，并接种到已灭菌的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基中，愈伤组织的固体培养基的配方为MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+藏红花汁液0.3g/L+蔗糖25g/L+琼脂5.5g/L，pH为6.0，暗培养时间为30d，获得藏红花愈伤组织，诱导率为73％；藏红花愈伤组织即为浅层培养的外植体；

(4)浅层培养：

(A)丛生芽诱导：将步骤(3)中获得的愈伤组织切成0.1～0.3cm³小块接种到液体浅层丛生芽诱导培养基中培养，液体培养基的液面高度为0.3cm左右，丛生芽诱导培养基的配方为：MS+2.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+藏红花汁液0.3g/L+蔗糖20g/L+AC 0.3g/L，pH为6.0，首先暗培养20d，然后光照周期间歇光照培养5d；

(B)微球茎形成：丛生芽诱导结束后，不移动组培苗及培养基，直接向组培瓶中添加诱导微球茎形成的培养基至液面高度1.0cm，诱导微球茎形成的培养基配方为：1/2MS+0.5mg/L IBA+0.2mg/L NAA+藏红花汁液0.3g/L+蔗糖30g/L，pH为6.0，间歇光照培养40d获得藏红花丛生微球茎；微球茎形成率为80％。

实施例4：

该利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，包括以下步骤：

(2)外植体的获得及灭菌处理：将藏红花球茎放入含有消毒液的水中培养待其长出叶片，取下叶片，清水冲洗40分钟；在超净台中将上述藏红花叶片进行表面消毒灭菌处理；具体步骤：75％酒精浸泡20s，无菌水清洗2次，0.1％的升汞浸泡5min，无菌水清洗7次；

(3)浅层培养的外植体的制备：将步骤(2)中已消毒灭菌的叶片在无菌环境下切成1.0cm的小段，并接种到已灭菌的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基中，愈伤组织的固体培养基的配方为MS+1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+藏红花汁液0.1g/L+蔗糖25g/L+琼脂5.5g/L，pH为6.0，暗培养时间为40d，获得藏红花愈伤组织，诱导率为70％；藏红花愈伤组织即为浅层培养的外植体；

(4)浅层培养：

(A)丛生芽诱导：将步骤(3)中获得的愈伤组织切成0.1～0.3cm³小块接种到液体浅层丛生芽诱导培养基中培养，液体培养基的液面高度为0.3cm左右，丛生芽诱导培养基的配方为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+藏红花汁液0.2g/L+蔗糖20g/L+AC 0.2g/L，pH为6.0，首先暗培养15d，然后光照周期间歇光照培养10d；

(B)微球茎形成：丛生芽诱导结束后，不移动组培苗及培养基，直接向组培瓶中添加诱导微球茎形成的培养基至液面高度0.5cm，诱导微球茎形成的培养基配方为：1/2MS+0.5mg/L IBA+0.1mg/L NAA+藏红花汁液0.3g/L+蔗糖30g/L，pH为6.0，间歇光照培养40d获得藏红花丛生微球茎；微球茎形成率为79％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用浅层培养生产藏红花微球茎的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(4)浅层培养：

2.根据权利要求1所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(2)中的灭菌处理的具体步骤为：首先在75％无水乙醇中浸泡15～30s，再用无菌水清洗2～4次，然后放入摩尔浓度为0.1％的升汞中浸泡3～5min，再用无菌水清洗5～8次。

3.根据权利要求2所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(3)中的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基的配方为：MS+0.5～1.5mg/L6-BA+0.05～0.2mg/L NAA+藏红花汁液0.1～0.3g/L+蔗糖25g/L+琼脂5.5g/L，pH为5.6～6.0，培养时间为25～30d。

4.根据权利要求2所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(4)中的(A)步骤中的液体培养基的配方为：MS+1.5～2.5mg/L6-BA+0.05～0.15mg/L NAA+藏红花汁液0.1～0.3g/L+蔗糖20g/L+AC 0.1～0.3g/L，pH为5.6～6.0，将配制好的液体培养基倒入组培瓶中，液面高度为0.2～0.5cm，灭菌后使用。

5.根据权利要求2所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(4)中的(B)步骤中的液体培养基的配方为：1/2MS+0.1～0.5mg/LIBA+0.05～0.2mg/L NAA+藏红花汁液0.1～0.3g/L+蔗糖30g/L，pH为5.6～6.0，将配制好的液体培养基灭菌后倒入组培瓶中，液面高度为0.5～1.0cm。

6.根据权利要求5所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(3)中的诱导藏红花愈伤组织培养的环境为：暗培养30～40d，温度为19～22℃。

7.根据权利要求6所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(4)中的(A)步骤中丛生芽生长的培养环境为：首先进行暗培养，暗培养时间为10～15d；然后进行光照培养，光照周期14h/d，光照强度1800～2000LX，培养时间为5～10d；所述培养环境温度为19～22℃。

8.根据权利要求7所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(4)中的(B)步骤中微球茎产生的培养环境为：光照周期14h/d，光照强度2000～2500LX，温度18～20℃。

9.根据权利要求1-8任一项所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述藏红花汁液的制备方法是鲜物研磨或榨汁。

10.根据权利要求9所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述藏红花汁液的制作步骤为：将藏红花球茎洗净，除去皮膜，切成质量为1～5g的小块，研钵研磨获得所述汁液。