CN1954668A - 一种藏红花种球(苗)规模化组培快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种藏红花种球(苗)规模化组培快繁方法，首先诱导出不同类型的藏红花愈伤(普通愈伤、胚性愈伤等)，在相应的生物反应器(鼓泡式、周期浸没式、雾化反应器等)中进行大规模培养，最终大量生长出藏红花种球和种苗直接用于大田种植，球茎还可经适度脱水，长时间保藏。采用本发明繁育的藏红花球茎，不但可以减少或消除病害浸染，而且可以解决长期依靠进口种球以及花产量与球茎繁殖的矛盾，为规模化种植藏红花奠定基础，从根本上解决藏红花资源短缺的问题。

Description

一种藏红花种球(苗)规模化组培快繁方法

技术领域

本发明属于生化工程领域，涉及一种藏红花种球(苗)规模化组培快繁方法。

背景技术

藏红花(Crocus sativus L)也称西红花、番红花，系鸢尾科(Iridaceae)番红花属(CrocusL.)多年生草本植物。

藏红花原产于西班牙、希腊等南欧各国以及伊朗、印度等地，主要用作天然食用香料和调料以及化妆美容用品。取其柱头入药，有活血、化瘀、生新、镇痛、健胃、通经之效，在国内外都有较长的药用历史。近年来随着对藏红花活性成分的研究，发现藏红花成分藏红花酸(Crocetin)、藏红花醛(safranal)、藏红花素类(Crocins)和藏红花苦素(Picrocrocin)等都具有较强的抗肿瘤活性，特别对于血癌细胞、乳头癌、扁平细胞瘤和软组织肉瘤等都具有较强的抑制作用，有望发展成新的抗肿瘤制剂。藏红花在世界范围内广泛应用，需求日增，而藏红花仅用其柱头，产量低，7-15万朵花经400小时的劳动才能加工成1公斤干柱头，因此造成供不应求的局面。

我国历来进口藏红花以供药用，从60年代开始从日本、德国引种藏红花，在浙江、江苏、山东、北京等地有栽培，但亩产仅0.5公斤，产量远满足不了市场需求，而且种植过程中存在的萎花现象、病毒病菌侵染造成藏红花产量质量下降、种球退化，损失更为严重(陈书安等，中草药，32(12)：1137-1139，2001)。另外，藏红花靠球茎无性繁殖，繁殖系数低，而提高繁殖系数导致子球茎小，花产量下降，难以同时扩大种植面积和提高花产量。

由于栽培用的种球需进口，生产成本高，因此采用组培技术大规模繁育脱毒的种球，可实现种球的国产化，扩大种源，有利于降低生产成本、扩大种植面积，形成规模效益，同时还不占耕地，不受节气限制，具有极高的经济效益和社会效益。

目前已研究了球茎的多种诱导方法，以叶、球茎为外植体均分化出苗或球茎。

以叶基切段(黄守印，植物生理学通讯，6：17-19，1987)为外植体诱导愈伤组织，并分化、生根、移栽。以球茎作为外植体，研究报道较多。丁葆祖等用热处理提高了藏红花球茎愈伤组织的诱导率(丁葆祖等，植物学报，23(5)：419-420，1981)。桂耀林等诱导球茎切块生成丛生芽，然后再诱导球茎的形成(桂耀林等，植物学报，30(2)：338-340，1988)。何凯等以当年新生小球茎为外植体，可定向诱导大量丛生芽，在光照条件下分化出小球茎，长成完整植株(何凯等，四川大学学报，39(6)：1127-1130，2002)。刘咏梅等诱导球茎出芽，然后长出球茎(刘咏梅等，西南师范大学学报，20(2)：183-186，1995)。关萍等诱导球茎切块出芽，然后诱导出球茎(关萍等，贵州农学院学报，14(4)：47-49，1995)。国外报道，藏红花球茎的分裂组织可诱导出瘤状愈伤，进而形成原球茎组织，逐渐生成球茎(Abel Piqueras，et al，Agronomie 19：603-610，1999)。体胚诱导方面，球茎分裂组织直接诱导出体胚组织或经胚性愈伤组织转化得到，并进一步萌发得到全苗(Ashok Ahuja，et al，Indian Journal of Experimental Biology，32(2)，1994，135-140；George P S，et al，FoodBiotechnology，6(3)，1992，217-223)。

本发明同已有的相关研究报道比较可以看出：目前藏红花球茎的诱导多是在固体培养基上进行，在大规模生产中受到限制，且多数新球茎由母球茎的芽体外培养生成，增殖量有限；丛生芽培养可扩大增殖量，但丛生芽经球茎芽原基诱导生成，分化后增殖量有限，难以扩大规模；体胚诱导率低，尚未得到高频发生的材料和方法，目前扩大生产的条件不足；胚性愈伤可保持旺盛的增殖能力，改变培养条件可分化出芽成苗，可作为规模化培养的材料，目前国外仅有摇瓶培养的初步结果，国内外尚无生物反应器方面的研究。采用萌芽后的球茎切块材料可诱导出两类愈伤材料，一类白色、光滑瘤状组织，可分化出芽，有研究者称为胚性愈伤或原球茎组织；一类淡黄色、疏散颗粒组织，增殖快于前者，经诱导也可转化成前者。因此一方面可以采用白色瘤状材料直接增殖、分化，另一方面也可利用淡黄色愈伤快速增殖，再转化成瘤状组织，从而保证规模化生产的材料来源。另外这种白色瘤状组织也能分化出不定根，若芽分化前出根则显著降低出芽率及成苗率，在出芽培养基中加入适量生长调节物质可抑制不定根的产生，促进芽的萌发，而适宜浓度的生长调节物质在诱导、增殖培养基中则可抑制芽分化，起到同步化调控的作用。本发明建立了新的藏红花种球(苗)生产技术，并结合生物反应器培养技术进行规模化培养，不仅得到大量种苗、种球，还减少操作环节，通过培养基的更换控制胚性愈伤的生长分化，实现材料在同一反应器的连续培养，解决了继代问题，避免污染并降低生产成本和劳动强度，为替代藏红花进口种球，推广种植打下基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用生物技术快速、规模化繁育藏红花球茎的方法。采用本发明繁育的藏红花球茎，不但可以减少或消除病害浸染，而且可以解决长期来依靠进口种球以及花产量与球茎繁殖的矛盾，为规模化种植藏红花奠定基础，从根本上解决藏红花资源短缺的问题。

本发明提出一种采用生物技术快速、规模化繁育藏红花球茎的方法，该方法步骤如下：

1)在任选其一的MS、1/2MS、B5、LS、N6组织培养基中，添加细胞生长素0-10mg/L和细胞分裂素0-10mg/L或其他生长调节剂，再加入5-90g/L蔗糖，用酸或碱调节pH到5-7，加1-10g/L的琼脂加热溶解后分装在三角瓶中或不加琼脂直接分装，经105-125℃高温或0.1-0.15MPa压力下消毒后，冷却至室温作基本固体或液体培养基；

2)藏红花球茎经70％乙醇和2％活性氯的次氯酸钠溶液消毒后，球茎切块作为外植体在步骤1)的培养基上15-25℃，暗培养2-8周，可诱导出淡黄色愈伤组织，光强1000-5000lux，光照周期4-16h/d下培养，可直接诱导出白色瘤状材料；

3)步骤2)得到的淡黄色愈伤组织在步骤1)的培养基于15-25℃，暗培养1-8周，可转化为白色瘤状材料；

4)步骤2)、3)得到的白色瘤状材料转至反应器培养，培养基为步骤1)不加琼脂的液体增殖培养基，于15-25℃暗培养3周，瘤状材料大量增殖；然后更换为分化培养基，周期浸没、雾化反应器内的材料继续培养，鼓泡塔反应器培养的材料也转入这两种反应器，分化出芽；再次更换反应器的培养基，改为球茎诱导培养基，并转入光照培养，光强1000-5000lux光周期4-16h/d下培养1-8周形成绿苗及球茎；形成的球茎分拣后移栽或保藏，非球茎材料按分化情况，重复以上操作，进行增殖、分化、球茎诱导；

5)形成的球茎或苗于室内自然条件下炼苗一周后，取出苗或球茎，洗去培养基，于壤质土或蛭石等基质中移栽，10-20℃下先散射光，逐渐过渡到直射光，适期浇营养液，至成活；球茎还可经适度脱水，能长时间保藏，以供大田种植。

采用本发明繁育的球茎，可以解决长期来依靠进口种球以及花产量与球茎繁殖的矛盾，为规模化种植藏红花奠定基础，从根本上解决藏红花资源短缺的问题。

具体实施方式

实施例一：

1.在MS培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2mg/L、N⁶-苄基腺嘌呤0.25mg/L、噻苯隆0.5mg/L，再加入30g/L蔗糖，用酸或碱调节pH到5.9，加7g/L的琼脂加热溶解后分装在三角瓶中121℃消毒后，冷却至室温作基本培养基；

2.藏红花球茎经70％乙醇杀菌0.5分钟，再用2％活性氯的次氯酸钠溶液消毒10分钟，用无菌水冲洗三次后，切成1cm²的切块作为外植体在上述培养基上23℃，暗培养4周，可诱导出淡黄色愈伤组织；

3.淡黄色愈伤组织在添加2，4-二氯苯氧乙酸0.25mg/L和N⁶-苄基腺嘌呤2mg/L的MS基本培养基上23℃暗培养3-6周可部分转化为白色瘤状愈伤，将白色瘤状愈伤挑出，在添加萘乙酸2mg/L、N⁶-苄基腺嘌呤2mg/L、噻苯隆0.5mg/L和200mg/L酸水解酪蛋白的N6基本培养基上暗培养3-6周增殖；

5.白色瘤状材料在添加萘乙酸1mg/L、N⁶-苄基腺嘌呤2mg/L、300mg/L酸水解酪蛋白的MS液体培养基上23℃暗培养增殖，继代周期3周，鼓泡塔反应器，接种量15g/L，通气量0.4vvm；周期浸没反应器、雾化反应器接种量10g/L，周期浸没反应器浸没周期5min/h，通气量0.1vvm；雾化反应器雾化周期5min/h，通气量0.1vvm，培养周期结束时鼓泡塔反应器、周期浸没反应器、雾化反应器的生物量为51、60、55g/L；然后鼓泡塔反应器培养的材料转入周期浸没反应器或雾化反应器，接种量50g/L，周期浸没反应器、雾化反应器更换培养基后继续培养，培养基改为萘乙酸0.5mg/L、N⁶-苄基腺嘌呤5mg/L、300mg/L酸水解酪蛋白的MS培养基，周期浸没反应器浸没周期5min/2h，通气量0.1vvm，雾化反应器雾化周期5min/2h，通气量0.1vvm，暗培养分化出芽成苗，6周出芽率分别为50％、65％；然后培养基改为吲哚-3-乙酸0.5mg/L、N⁶-苄基腺嘌呤0.1mg/L、300mg/L酸水解酪蛋白的1/2MS培养基，23℃，光强3000lux光周期16h/d培养，藏红花苗形成球茎，4周诱导率可达60％；分拣形成的球茎，非球茎材料按分化情况于反应器内重复培养；

6.球茎或根苗于室内自然条件下炼苗一周后，取出苗或球茎，洗去培养基，上层蛭石、下层壤质土的基质中移栽，10-25℃下先散射光，逐渐过渡到直射光，适期浇水，至成活，成活率可达70％以上；球茎还可脱水10％，在相对湿度80％下长时间保藏，以供大田种植。

实施例二：

1.在LS培养基中添加萘乙酸1mg/L、N⁶-苄基腺嘌呤2mg/L和噻苯隆0.5mg/L，再加入30g/L蔗糖，用酸或碱调节pH到5.9，加7g/L的琼脂加热溶解后分装在三角瓶中121℃消毒后，冷却至室温作基本培养基；

2.藏红花球茎经70％乙醇杀菌0.5分钟，再用2％活性氯的次氯酸钠溶液消毒10分钟，用无菌水冲洗三次后，切成1cm²的切块作为外植体在上述培养基上于23℃，2000lux、12h/d光照条件下培养4周，可诱导出白色瘤状组织；

3.瘤状组织在添加萘乙酸0.5mg/L、激动素1mg/L、噻苯隆0.5mg/L和300mg/L酸水解酪蛋白的1/2MS基本培养基上于23℃暗培养增殖；

4.白色瘤状材料在添加萘乙酸2mg/L、激动素3mg/L和300mg/L酸水解酪蛋白的1/2MS液体培养基上23℃暗培养，继代周期3周，鼓泡塔反应器，接种量20g/L，通气量0.4vvm；周期浸没反应器、雾化反应器接种量10g/L，周期浸没反应器浸没周期10min/2h，通气量0.1vvm；雾化反应器雾化周期10min/2h，通气量0.1vvm，培养周期结束后鼓泡塔反应器、周期浸没反应器、雾化反应器的生物量可达82、65、60g/L；然后鼓泡塔反应器培养的材料转入周期浸没反应器、雾化反应器，接种量50g/L，周期浸没反应器、雾化反应器更换培养基后继续培养；周期浸没反应器浸没周期5min/2h，通气量0.1vvm，雾化反应器雾化周期5min/2h，通气量0.1vvm，培养基改为萘乙酸0.5mg/L、玉米素4mg/L、300mg/L酸水解酪蛋白的1/2MS培养基，暗培养分化出芽成苗，出芽率分别为50％、70％；然后培养基改为吲哚-3-丁酸0.5mg/L、N⁶-苄基腺嘌呤0.1mg/L、300mg/L酸水解酪蛋白的1/2MS培养基，22℃光照16h/d、光强3000lux培养，3周即形成球茎，可达53％；分拣形成的球茎，非球茎材料按分化情况于反应器内重复培养；

5.球茎或根苗于室内自然条件下炼苗一周后，取出苗或球茎，洗去培养基，上层蛭石、下层壤质土的基质中移栽，10-25℃下先散射光，逐渐过渡到直射光，适期浇水，至成活；球茎还可经适度脱水10％，相对湿度80％下长时间保藏，以供大田种植。

实施例三：

1.如实施例二得到的白色瘤状组织，在添加萘乙酸0.2mg/L、玉米素2mg/L、噻苯隆0.5mg/L和300mg/L酸水解酪蛋白的B5培养基上21℃暗培养增殖；

2.增殖的瘤状组织转入周期浸没反应器、雾化反应器，接种量50g/L，培养基改为吲哚-3-乙酸0.5mg/L、N⁶-苄基腺嘌呤0.5mg/L、300mg/L酸水解酪蛋白的1/2MS培养基，18℃光照12h/d、2000lux培养，周期浸没反应器浸没周期5min/2h，通气量0.1vvm，雾化反应器雾化周期10min/2h，通气量0.1vvm，6-8周形成球茎，诱导率为22％、28％；分拣形成的球茎，非球茎材料按分化情况于反应器内如实例一的步骤5、实例二的步骤4法培养，以生产更多的球茎；

3.球茎或根苗于室内自然条件下炼苗一周后，取出苗或球茎，洗去培养基，上层蛭石、下层壤质土的基质中移栽，10-25℃下先散射光，逐渐过渡到直射光，适期浇水，至成活；球茎还可经适度脱水10％，相对湿度80％下长时间保藏，以供大田种植。

Claims (6)

1.一种藏红花种球(苗)规模化组培快繁方法，其特征在于以下步骤：

1)藏红花球茎经70％乙醇和2％活性氯的次氯酸钠溶液消毒后，球茎切块作为外植体在愈伤诱导培养基上15-25℃，暗培养2-8周，可诱导出淡黄色愈伤组织，在光强1000-5000lux，光照周期4-16h/d下胚性愈伤诱导培养基上培养，可直接诱导出白色瘤状材料，

2)步骤1)得到的淡黄色愈伤组织可迅速增殖，在转化培养基于15-25℃，暗培养1-8周，可转化为白色瘤状材料，

3)步骤1)、2)得到的白色瘤状材料转至反应器培养，培养基为不加琼脂的增殖培养基，于15-25℃暗培养3周，瘤状材料大量增殖；然后更换为分化培养基，周期浸没、雾化反应器内的材料继续培养，鼓泡塔反应器培养的材料也转入这两种反应器，分化出芽；再次更换反应器的培养基，改为球茎诱导培养基，并转入光照培养，光强1000-5000lux光周期4-16h/d下培养1-8周形成绿苗及球茎；形成的球茎另行处理，非球茎材料按分化情况，重复以上操作，进行增殖、分化、球茎诱导，

4)形成的球茎或苗于室内自然条件下炼苗一周后，取出苗或球茎，洗去培养基，于壤质土或蛭石等基质中移栽，10-20℃下先散射光，逐渐过渡到直射光，适期浇营养液，至成活；球茎还可经适度脱水，能长时间保藏，以供大田种植。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤1)、2)、3)中的培养基为任选其一的MS、1/2MS、B5、LS、N6常规植物组织培养基并添加细胞生长素0-10mg/L和细胞分裂素0-10mg/L或其他生长调节剂，步骤3)中的培养基不加琼脂。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤1)、2)、3)各培养基使用的细胞分裂素为N⁶-苄基腺嘌呤、玉米素、激动素。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤1)、2)、3)各培养基使用的细胞生长素为2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤1)、2)、3)的生长调节物质为任选的多效唑、酸水解酪蛋白、活性炭、噻苯隆。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤5)使用的反应器为鼓泡塔、周期浸没及雾化反应器。