CN115885853B - 一种促进西红花胚性愈伤诱导和出芽的组培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物组培的技术领域，公开了一种促进西红花胚性愈伤诱导和出芽的组培方法，包括如下步骤：(1)配置诱导培养基，所述诱导培养基包括以下组分：MS、卡拉胶、蔗糖、0.2‑1.0mg/L萘乙酸、3.0‑6.0mg/L6‑苄氨基嘌呤、1.0‑100.0mg/LAgNO3，pH为5.8；(2)挑选初代诱导的西红花普通愈伤，切除褐化部分，接种至诱导培养基中，温度18±1‑20±1℃，黑暗培养，本发明的组培方法能够有效诱导西红花的非胚性愈伤转化成胚性愈伤并同时促进愈伤组织的出芽，提高出芽率，有效的提高了西红花的组培繁殖系数。
Description
技术领域
本发明涉及植物组培的技术领域，特别是一种促进西红花胚性愈伤诱导和出芽的组培方法。
背景技术
植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。植物组织培养在离体繁殖诱变、种质资源保存、无毒苗生产、快速繁殖、周年生产等方面具有十分突出的作用。
西红花(Crocus sativus L.)又称藏红花、番红花，是一种鸢尾科番红花属的多年生花卉。球茎扁圆球形，外有黄褐色的膜质包被，叶丛基部包有多片膜质的鞘状叶，花呈淡蓝色、红紫色或白色，有香味，花柱橙红色。西红花在染料、香料、功能性食品及保健品开发、妇科用药及抗癌抗肿瘤制药方面具有广泛应用。但西红花种质资源严重缺乏，价格昂贵，一直被誉为“红色黄金”。由于西红花染色体是三倍体，花粉败育高，开花后不能结实，要靠球茎繁殖，而在栽培过程中球茎会逐渐退化。随着组织培养技术在药用植物上的广泛应用，通过植物组培技术能够在较短时间内获得大量的微球茎，解决西红花资源短缺、品质下降的问题。
组培技术在培养西红花的一般过程包括选取合适外植体，脱分化生成愈伤组织后诱导分化出芽、不定芽经过增殖培养再经过诱导成微球茎，最后进行炼苗种植，西红花的组培中在脱分化成愈伤组织和愈伤组织分化出芽阶段容易产生褐化。
现有技术中西红花的外植体经过脱分化后产生的是非胚性愈伤组织，非胚性愈伤组织质地松散，组织松散，活性低，诱导不定芽时出芽率低和容易褐化。
现有的组培技术中为了解决非胚性愈伤繁殖系数低的问题，在植物的外植体脱分化后增加胚性愈伤的诱导过程，通过培养基组分的调节从而形成胚性愈伤。
现有的技术中针对植物的非胚性愈伤组织的分化培养的主要研究是通过将诱导培养基的组分的配置降低其褐化效果，并增加其出芽率，现有非胚性组织的分化培养基无法诱导完成非胚性愈伤和胚性愈伤之间的转化。
发明内容
为此，需要提供一种促进西红花胚性愈伤诱导和出芽的组培方法，解决现有非胚性组织的分化培养基无法诱导完成非胚性愈伤和胚性愈伤之间的转化。
为实现上述目的，本发明提供了一种促进西红花胚性愈伤诱导和出芽的组培方法，包括如下步骤：
(1)配置诱导培养基，所述诱导培养基包括以下组分：MS、卡拉胶、蔗糖、0.2-1.0mg/L萘乙酸、3.0-6.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、1.0-100.0mg/L AgNO3，pH为5.8；
(2)挑选初代诱导的西红花普通愈伤，切除褐化部分，接种至诱导培养基中，温度18±1-20±1℃，黑暗培养。
进一步，所述诱导培养基由以下组分组成：MS、6-8g/L卡拉胶、20-50g/L蔗糖、0.2-1.0mg/L萘乙酸、3.0-6.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、1.0-100.0mg/L AgNO3，pH为5.8。
进一步，所述诱导培养基由以下组分组成：MS、7g/L卡拉胶、30g/L蔗糖、0.5mg/L萘乙酸、4.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、10.0mg/L AgNO3，pH＝5.8。
进一步，步骤(2)中的培养温度为18±1℃。
进一步，步骤(2)的培养时间为60d。
上述技术方案具有以下有益效果：
本发明中，在配置一种新的诱导培养基，除了基础培养基和萘乙酸、6-苄氨基嘌呤植物生长激素外，还增加了硝酸银组分，之后配合低温(18-20℃)和黑暗环境能够将西红花的非胚性愈伤组织转化为胚性愈伤，并使得其分化出不定芽，有效的提高了西红花组培的出芽率并降低褐化率，同时由于非胚性愈伤组织转化为胚性愈伤分化的不定芽为胚性芽，质地紧密厚实，具有较高的生长活性，有利于后续继续进行增殖培养，提高西红花组培的繁殖系数。
附图说明
图1为具体实施方式挑选的西红花普通非胚性愈伤组织的结构图。
图2为具体实施方式所述实施例1-11的实验图片。
图3-4为具体实施方式所述对比例1-20的实验图片。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
一、培养基组分和诱导环境的选择
实施例1
(1)配制培养基
培养基由以下成分组成：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-苄氨基嘌呤2.0mg，pH＝5.8。
(2)选取初代诱导的西红花普通非胚性愈伤组织(如图1)，接种至步骤(1)的培养基中，在18±1℃黑暗中培养60d。
实施案例2
(1)配制培养基
每升有效控制培养基由以下成分组成：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-苄氨基嘌呤4.0mg，pH＝5.8。
(2)选取初代诱导的西红花普通愈伤，接种至步骤(1)的培养基中，在18±1℃黑暗中培养60d。
实施例3
(1)配制培养基
每升有效控制培养基由以下成分组成：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.2mg+6-苄氨基嘌呤6.0mg，pH＝5.8。
(2)选取初代诱导的西红花普通愈伤，接种至步骤(1)的培养基中，在18±1℃黑暗中培养60d。
实施例4-8
(1)配制培养基
每升有效控培养基由以下成分组成：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-苄氨基嘌呤4.0mg+AgNO31.0mg-100mg，pH＝5.8。
(2)选取初代诱导的西红花普通愈伤，接种至步骤(1)的培养基中，在18±1℃黑暗中培养60d。
实施例4-8的培养基中AgNO3的用量分别为1.0mg、5.0mg、10.0mg、50.0mg、100mg。
实施例9
(1)配制培养基
每升有效控制培养基由以下成分组成：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-苄氨基嘌呤4.0mg+AgNO310.0mg，pH＝5.8。
(2)选取初代诱导的西红花普通愈伤，接种至步骤(1)的培养基中，在18±1℃、48μmol·m-2·s-1，每日光照10h，培养60d。
实施例10
(1)配制培养基
每升有效培养基由以下成分组成：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-苄氨基嘌呤4.0mg+AgNO310.0mg，pH＝5.8。
(2)选取初代诱导的西红花普通愈伤，接种至步骤(1)的培养基中，在25±1℃黑暗培养60d。
实施例11
(1)配制培养基
每升有效控制培养基由以下成分组成：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-苄氨基嘌呤4.0mg+AgNO310.0mg，pH＝5.8。
(2)选取初代诱导的西红花普通愈伤，接种至步骤(1)的培养基中，在25±1℃、48μmol·m-2·s-1，每日光照10h，培养60d。
以上每个实施例进行接种5-6瓶，每瓶接种4-5个非胚性愈伤，
每个实施例总共接种的非胚性愈伤数量为a,诱导后形成胚性愈伤的数量为b，愈伤褐化的数量为c，有分化出不定芽的胚性愈伤的数量为d。
胚性诱导率＝(b/a)×100％；褐化率＝(c/a)×100％；出芽率＝(d/a)×100％；
实施例1-11的实验结果如下表1，实验结果如图2所示。
表1.实施例1-11的诱导结果
由实施例4-8的结果可知，本发明的方法能够有效的减少愈伤组织的褐化，褐化率可以降低至18％，在将非胚性愈伤组织转化为胚性愈伤的同时，能够同时完成不定芽的分化，分化成带叶原基的完整不定芽，质地紧密，增殖活性强，有利于后续进行芽的增殖，进而能够有效促进西红花的组培繁殖系数。
由实施例9-11与实施例6对比可知，本发明中培养基和培养环境(黑暗、低温)是相互配合、相互协同促进的关系，通过本发明的诱导方法，能够将西红花的非胚性愈伤组织诱导成为胚性愈伤，褐化率可以降低至18％，出芽率可以提高至57.1％，本发明的诱导方法能够起到意想不到的技术效果。
二、培养基组分范围的确定
以下实验例12-20中西红花非胚性愈伤在培养基中诱导的条件均为：18±1℃，黑暗中培养60d，不同点是培养基的不同，具体如下
实施例12-20：每升有效控培养基由以下成分组成：MS+卡拉胶6-8+蔗糖20-50g+萘乙酸0.2-1.0mg+6-苄氨基嘌呤3.0-6.0mg+AgNO310mg，pH＝5.8。
卡拉胶、蔗糖、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤进行多因素实验如表2
表2.培养基组分不同浓度的组合
实施例21：每升有效控培养基由以下成分组成：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-苄氨基嘌呤4.0mg+AgNO310mg，pH＝5.8，西红花非胚性愈伤在培养基中诱导的条件均为：20±1℃，黑暗中培养60d。
实施例22：每升有效控培养基由以下成分组成：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-苄氨基嘌呤4.0mg+AgNO3200mg，pH＝5.8。
实施例12-22的实验结果如下表3
表3.实施例12-12的诱导结果
三、西红花的非胚性愈伤组织在常规诱导分化培养基中，出芽率低，且容易褐化，以下对比例用于证明常规的组培试剂难以应用在本发明方案中。
以下对比例实验中西红花非胚性愈伤在培养基中诱导的条件均为：18±1℃，黑暗中培养60d，不同点是培养基的不同，具体如下：
对比例1：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g。
对比例2：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.2mg。
对比例3：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+6-BA6.0mg。
对比例4：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸2.0mg+6-BA 1.0mg。
对比例5：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA 4.0mg+AgNO3500.0mg。
对比例6：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA 4.0mg+PVP 0.5g。
对比例7：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA 4.0mg+PVP 1.0g。
对比例8：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA 4.0mg+VC 0.2g。
对比例9：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA 4.0mg+VC 0.5g。
对比例10：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA4.0mg+AC 0.4g。
对比例11：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA4.0mg+AC 0.8g。
对比例12：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA4.0mg+CA 0.2g。
对比例13：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA4.0mg+CA 0.5g。
对比例14：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA4.0mg+PVP 0.5g+VC 0.2g。
对比例15：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA4.0mg+PVP 0.5+AC 0.4g。
对比例16：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA4.0mg+PVP 0.5+CA 0.2g。
对比例17：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA4.0mg+VC 0.2+AC0.4g。
对比例18：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA4.0mg+VC 0.2+CA0.2g。
对比例19：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA4.0mg+AC 0.4+CA0.2g。
对比例20：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA4.0mg+CA 0.5g+AgNO310.0mg。
对比例21：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA4.0mg+PVP 1.0g+AgNO310.0mg。
对比例22：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA4.0mg+VC 0.5g+AgNO310.0mg。
对比例23：培养基为：MS+卡拉胶7g+蔗糖30g+萘乙酸0.5mg+6-BA4.0mg+AC 0.8g+AgNO310.0mg。
对比例1-20的诱导结果如下表4，实验结果如图3-4
表4对比例1-20的诱导结果
由对比例1-19可知，常规组培试剂PVP、VC、AC(活性炭)、CA(柠檬酸)在西红花愈伤组织的培养中无法有效的促进其出芽分化和抑制其褐变，同时易引起细菌污染和愈伤生根，且由对比例20-23和实施例4相比可知，本发明中培养基的组分不能包含有其它组培试剂(PVP、VC、AC、CA)否则对褐化率和出芽率将起到一定的反作用。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (5)
1.一种促进西红花胚性愈伤诱导和出芽的组培方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配置诱导培养基，所述诱导培养基由以下组分组成：MS、卡拉胶、蔗糖、0.2-1.0mg/L萘乙酸、3.0-6.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、1.0-100.0mg/L AgNO3，pH为5.8；
(2)挑选初代诱导的西红花普通非胚性愈伤，切除褐化部分，接种至诱导培养基中，温度18±1-20±1℃，黑暗培养。
2.如权利要求1所述的促进西红花胚性愈伤诱导和出芽的组培方法，其特征在于，所述诱导培养基由以下组分组成：MS、6-8g/L卡拉胶、20-50g/L蔗糖、0.2-1.0mg/L萘乙酸、3.0-6.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、1.0-100.0mg/L AgNO3，pH为5.8。
3.如权利要求2所述的促进西红花胚性愈伤诱导和出芽的组培方法，其特征在于，所述诱导培养基由以下组分组成：MS、7g/L卡拉胶、30g/L蔗糖、0.5mg/L萘乙酸、4.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、10.0mg/LAgNO3，pH＝5.8。
4.如权利要求1所述的促进西红花胚性愈伤诱导和出芽的组培方法，其特征在于，步骤(2)中的培养温度为18±1℃。
5.如权利要求1所述的促进西红花胚性愈伤诱导和出芽的组培方法，其特征在于，步骤(2)的培养时间为60d。
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