CN111004765A - 促进黄瓜小孢子分裂的方法以及黄瓜小孢子的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了促进黄瓜小孢子分裂的方法以及黄瓜小孢子的培养方法。本发明公开的促进黄瓜小孢子分裂的方法包括：在33℃下利用纤维素酶和果胶酶处理处于单核靠边期的黄瓜小孢子2小时，以促进黄瓜小孢子分裂。利用本发明的促进黄瓜小孢子分裂的方法，不仅可以克服黄瓜小孢子壁障碍，还不影响小孢子内容物的完整性与活性，所得小孢子可以分裂与进一步发育，实现小孢子的培养，本发明的方法以及植物小孢子的培养方法可以用于制备黄瓜单倍体以及单倍体胚。

Description

促进黄瓜小孢子分裂的方法以及黄瓜小孢子的培养方法
技术领域
本发明涉及领域生物技术中，促进黄瓜小孢子分裂的方法以及黄瓜小孢子的培养方法。
背景技术
黄瓜小孢子培养通过诱导黄瓜游离小孢子产生胚状体，再经过染色体加倍成二倍体,可以快速产生纯合的育种新材料(纯系)，提高育种效率，还可用作遗传转化的优良受体材料。此技术在国际上尚未建立起完善且稳定的培养技术体系，培养过程中的关键技术之一就是如何启动小孢子的孢子体分裂，但是由于小孢子外壁的坚硬结构，使得小孢子不能轻易突破孢子壁的物理限制，即使其他培养条件适合，也不能成功启动分裂发育。
普通的花粉破壁研究的目的是为了生产容易被人体吸收、营养丰富的花粉，因此强调的是花粉内容物的溢出，目前成功的花粉破壁技术如机械法、超声法、温差解冻法、水合破壁法、发酵法、酶法等等，而小孢子的外壁结构和花粉壁结构不完全相同。而且游离小孢子培养是在无菌环境下操作，对酶解处理的特异性、可操控性、广普性要求严苛，既要求对小孢子壁尤其是小孢子外壁造成轻微的破损，而且必须要保证小孢子内容物的完整、有活力，所以如何达到这些条件实现小孢子的培养，是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何在保证小孢子内容物的完整、有活力的前提下克服小孢子壁障碍，以进一步实现小孢子的培养。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种植物小孢子的培养方法，所述方法包括：在33℃下利用纤维素酶和果胶酶处理小孢子，得到酶解后的小孢子；培养所述酶解后的小孢子，实现植物小孢子的培养。
上述方法中，利用纤维素酶和果胶酶处理小孢子可包括：利用酶解液处理所述小孢子，得到所述酶解后的小孢子，所述酶解液中纤维素和果胶酶的浓度分别为7.5U/mL～30U/mL和15U/mL～60U/mL。
上述方法中，所述酶解液中纤维素和果胶酶的浓度分别可为14U/mL和38U/mL。
所述酶解液可为向基本提取液中添加纤维素酶和果胶酶得到的液体，所述基本提取液的成分及含量如下：硝酸钾(KNO3)2500mg/L，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)250mg/L，二水氯化钙(CaCl2·2H2O)750mg/L，硫酸铵((NH4)2SO4)134mg/L，二水磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)150mg/L；碘化钾(KI)0.75mg/L，硼酸(H3BO3)3mg/L，一水硫酸锰(MnSO4·H2O)5mg/L，七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)2mg/L，二水钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/L，六水氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L，五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/L；二水合乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)37.3mg/L，四水硫酸亚铁(FeSO4·4H2O)27.8mg/L；肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，烟酸硫铵10mg/L；10-14mg/100mL蔗糖；余量为水，pH值5.8。
进一步，所述基本提取液中蔗糖的浓度可为11-14mg/100mL。
更进一步，所述基本提取液中蔗糖的浓度可为12-14mg/100mL，如13mg/100mL。
上述方法中，利用纤维素酶和果胶酶处理小孢子的时间可为2小时。
上述方法中，所述小孢子可处于单核靠边期。
所述处理可在摇床上进行。所述摇床的转速可为50-60r·min-1。
上述方法中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为葫芦科植物。所述葫芦科植物可为黄瓜，如黄瓜品种“中农16”、“津优35”、“北京403”或“粤秀1号”。
本发明还提供了促进植物小孢子分裂的方法，所述方法包括：按照所述植物小孢子的培养方法，在33℃下利用纤维素酶和果胶酶处理小孢子，以促进植物小孢子分裂。
所述植物小孢子的培养方法或所述促进植物小孢子分裂的方法在制备植物单倍体中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述植物小孢子的培养方法或所述促进植物小孢子分裂的方法在制备植物单倍体胚中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明中，所述纤维素酶可为Sigma-Aldrich产品，货号为C2730。所述果胶酶可为Sigma-Aldrich产品，货号为P2611。
利用本发明的促进植物小孢子分裂的方法，不仅可以克服小孢子壁障碍，还不影响小孢子内容物的完整性与活性，所得小孢子可以分裂与进一步发育，实现小孢子的培养，本发明的促进植物小孢子分裂的方法以及植物小孢子的培养方法可以用于制备单倍体以及单倍体胚。
附图说明
图1为酶解前的小孢子，未见小孢子启动分裂。
图2为酶解后的小孢子，小孢子壁变薄膨大。
图3为小孢子成功启动分裂。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
B5基本培养基：硝酸钾(KNO3)2500mg/L，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)250mg/L，二水氯化钙(CaCl2·2H2O)750mg/L，硫酸铵((NH4)2SO4)134mg/L，二水磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)150mg/L；碘化钾(KI)0.75mg/L，硼酸(H3BO3)3mg/L，一水硫酸锰(MnSO4·H2O)5mg/L，七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)2mg/L，二水钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/L，六水氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L，五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/L；二水合乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)37.3mg/L，四水硫酸亚铁(FeSO4·4H2O)27.8mg/L；肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，烟酸硫铵10mg/L；余量为水，pH值5.8。
实施例1、黄瓜小孢子的培养方法
本实施例提供了一种黄瓜游离小孢子克服孢子壁障碍的培养方法，该方法包括：黄瓜花蕾消毒处理、小孢子释放处理、小孢子离心处理、小孢子酶解处理、酶解后无菌的纯化小孢子的悬浮培养。具体步骤如下：
步骤一、花蕾消毒处理：
将黄瓜(中农16号，中国农业科学院蔬菜花卉研究所)花蕾(所选花蕾中小孢子位于单核靠边期)在体积比为75％的乙醇水溶液中浸泡振荡30s后，再在质量比为4％的次氯酸钠水溶液中浸泡振荡15min，最后用无菌水冲洗3-5次，每次60s，得到消毒后的花蕾。
步骤二、小孢子释放处理：
将消毒后的花蕾平铺于无菌的滤纸上，轻压花蕾，尽量吸干花蕾附着的多余水分后，将其置于10ml离心管中；向离心管中加入2-3ml基本提取液，再挤压花蕾使小孢子释放出来，再用200目细胞筛过滤，收集滤液，得到小孢子悬液，此时的小孢子如图1所示；
其中，基本提取液(洗液)为向B5基本培养基中添加13mg/100mL蔗糖得到的液体。
步骤三、小孢子离心处理：
步骤二所得小孢子悬液于室温下以800rpm离心3min，弃上清液，收集沉淀即得到小孢子。
步骤四、小孢子酶解处理：
1.向步骤三所得小孢子中加入10mL酶解液，得到酶解体系；其中，酶解液为向基本提取液中添加纤维素酶和果胶酶得到的液体，该酶解液中，纤维素酶的浓度为14U/mL，果胶酶的浓度为1％(即38U/mL)；
其中，纤维素酶为Sigma-Aldrich产品，货号为C2730，700U/mL；果胶酶为Sigma-Aldrich产品，货号为P2611，3800U/mL。
2.将该酶解体系于33℃下酶解2小时，得到酶解产物，酶解过程中酶解体系位于摇床上震，摇床的转速为50-60r·min-1；
3.将酶解产物经800r·min-1(离心力为106×g)离心3min,弃上清液，沉淀为酶解后的游离小孢子，酶解后的小孢子如图2所示。
步骤五、小孢子悬浮培养：
1.将步骤3所得酶解后的游离小孢子利用基本提取液洗2次后，离心(离心条件同步骤四的3)弃上清液保留沉淀，即为酶解后的无菌纯化小孢子；
2.向酶解后的无菌纯化小孢子中加入液体培养液悬浮小孢子，得到小孢子悬浮液，用血球计数板计数，调整小孢子密度为1.0×105个·ml-1；所用液体培养液为向B5基本培养基中添加2，4-D、6-BA和蔗糖得到的培养基，该培养基中2，4-D、6-BA和蔗糖的浓度分别为0.5mg/L、0.2mg/L和13mg/100mL；
3.将小孢子悬浮液加入到直径60mm的培养皿中，每皿2ml，用封口膜封口后，在25℃下进行静置暗培养，每次5个皿，3次重复，培养3天(72小时)后显微镜观察启动分裂的小孢子的数量并计算启动分裂的小孢子所占总小孢子的百分比，拍照，启动分裂的小孢子如图3所示。
结果显示，培养3天后启动分裂的小孢子百分比为0.1％。表明，上述方法不仅可以克服小孢子壁障碍，还不影响小孢子的分裂与进一步发育，可以用于小孢子的培养以及制备单倍体。

Claims (10)

1.植物小孢子的培养方法，包括：在33℃下利用纤维素酶和果胶酶处理小孢子，得到酶解后的小孢子；培养所述酶解后的小孢子，实现植物小孢子的培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：利用纤维素酶和果胶酶处理小孢子包括：利用酶解液处理所述小孢子，得到所述酶解后的小孢子，所述酶解液中纤维素和果胶酶的浓度分别为7.5U/mL～30U/mL和15U/mL～60U/mL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述酶解液中纤维素和果胶酶的浓度分别为14U/mL和38U/mL。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：利用纤维素酶和果胶酶处理小孢子的时间为2小时。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述小孢子处于单核靠边期。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为葫芦科植物。
8.促进植物小孢子分裂的方法，包括：在33℃下利用纤维素酶和果胶酶处理小孢子，以促进植物小孢子分裂。
9.权利要求1-8中任一所述的方法在制备植物单倍体中的应用。
10.权利要求1-8中任一所述的方法在制备植物单倍体胚中的应用。
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