CN104094747B - 一种油茶组培苗瓶外生根方法 - Google Patents

一种油茶组培苗瓶外生根方法 Download PDF

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本发明公开了一种油茶组培苗瓶外生根方法。它是选取4～5片叶、顶叶展开微红发亮、茎杆绿色、苗高2～4cm的油茶继代增殖得到的微枝接种到根原基诱导培养基上培养，直至基部产生白色根原基，所述的根原基诱导培养基每升含有NAA3.0～5.0mg，其余为1/2HB培养基；取出基部长有白色根原基的微枝，洗去其无根苗基部的培养基，滤干后浸蘸200～600mg/L的GGR，立即扦插到扦插基质上，再浇足定根水，生长期间保持充足的水肥供应，长成生根苗，所述的扦插基质按质量份由黄心土2～6份和草木灰1～2份均匀混合而成。本发明是在试管外生根，打破了传统的组培瓶内诱导根系的方式，把生根与驯化有机结合，实现了油茶组培苗在瓶外直接生根，具有生根时间短、根系发育良好、吸收功能、移栽成活高优点。

Description

一种油茶组培苗瓶外生根方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种油茶组培苗瓶外生根方法。
背景技术：
油茶(Camelliaoleifem)是我国的特有木本油料树种，油茶生产的茶油含90％以上不饱和脂肪酸，易被人体吸收、消化，对降低血清胆固醇和预防高血脂和心血管疾病具有良好的作用；榨油后的茶枯和茶壳也是提取茶皂素、木糖醇、生产高蛋白饲料和高级活性炭等综合利用产品的原料。油茶全株都是宝，其经济价值极高，用途广、适应性强、综合开发利用价值潜力大，被誉为“东方的橄榄油”。随着近年来农业产业结构的调整和优化，油茶产业性生产出现前所未有的发展机遇，现市场对优质油茶种苗的需求量与高品质种源匮乏的状况不相适应，急需培育优质、丰产的油茶良种苗。而采用生物技术方法，合理地利用现有资源以最安全、高效的方式培育大量优质油茶种苗，是缓解目前油茶种苗供需矛盾行之有效的方法。
组培苗的生根和移栽是决定能否进行大量生产和应用实际的关键环节。目前我国采用传统瓶内生根(试管内无菌环境下的生根培养基上诱导生根、生根后的小苗再移栽到试管外有菌环境下驯化培养的方法)比较多；而微枝试管外生根(直接将未生根微枝扦插到试管外有菌环境的基质中，微枝的生根诱导同驯化培养结合起来，边诱导生根边驯化培养)还处于研发的初级阶段。
目前检索到“一种油茶无性系组培苗高效生根方法”(CN102007867A)以及“油茶组培苗繁殖用继代培养基及其繁殖方法”(CN103039362)两种专利文献已公开。两种专利的组培苗生根方法都是采用传统组培苗瓶内生根方式，即在试管内无菌环境下的生根培养基上诱导生根，生根后的小苗再移栽到试管外有菌的环境下驯化移栽的方法。采用此方法培育的苗木存在根系发育不好、无根毛、木质化程度低、分生能力弱、生长速度缓慢，茎干皮层细胞个体小、叶片角质层不发达，长期的白炽灯光照叶肉细胞叶绿素含量低、光合能力弱、抗蒸腾能力和适应能力差，直接影响组培苗移栽成活；且专利繁殖方法中是将一次培养的丛生芽分别截取成含有一个嫩芽的无菌苗进行二次继代培养，通过此方式转接单株嫩芽继代培养后只会产生1-2个腋芽，随着继代次数的增加，此芽木质化程度越高，茎干变成褐色状，很难生根，增殖率很低。经过试验研究采用MS为基本培养基作为油茶的继代培养，虽能发生丛生芽，增殖系数在5以上，但丛生芽产生的有效苗(高2-3cm)数量很少，也影响了油茶组培苗规模化生产的进程。
发明内容：
本发明的针对当前油茶组培苗传统瓶内生根技术的不足，提供一种生根时间短、根系发育良好、吸收功能好、能提高移栽成活率，可缩短育苗周期，节省生产成本及育苗空间，加速了种苗繁殖进程的油茶组培苗瓶外生根方法。
本发明针对油茶这种叶面革质、扦插移栽不易失水的特性，开展了油茶试管苗瓶外生根技术研究，并且开始应用于生产，取得了很大成功，从而实现了本发明的目的。
本发明的油茶组培苗瓶外生根方法，其特征在于，包括以下步骤：
选取4～5片叶、顶叶展开微红发亮、茎杆绿色、苗高2～4cm的油茶继代增殖得到的微枝接种到根原基诱导培养基上培养，直至基部产生白色根原基，所述的根原基诱导培养基每升含有NAA3.0～5.0mg，其余为1/2HB培养基；
取出基部长有白色根原基的微枝，洗去其无根苗基部的培养基，滤干后浸蘸200～600mg/L的GGR(双吉尔)，然后立即扦插到扦插基质上，再浇足定根水，使扦插基质与苗木紧密融合，生长期间保持充足的水肥供应，所述的扦插基质按质量份由黄心土2～6份和草木灰1～2份均匀混合而成。
所述的生长期间保持充足的水肥供应可以是扦插后一周内用喷雾器每天给叶面补充水分3～5次，30d后无根微枝产生根系数量可达4～5条，移栽生根成活率达85％以上。1个月后1000ppmHB补充叶面肥，待顶部有紫红的新芽长出后即表示苗木长出新根系，即可进入常规育苗。
所述的HB培养基每升含有花宝1号1500mg、花宝2号1500mg、FeSO4.7H2O6.95mg、Na2EDTA9.325mg、H3BO31.55mg、Mn2SO4.H2O4.125mg、ZnSO4.7H2O2.15mg、Na2MnO4.2H2O0.062mg、CuSO4.5H2O0.0062mg、CoCl2.6H2O0.0062mg、KI0.207mg、肌醇25mg、卡拉胶5000mg、白糖30000mg，余量为水，pH5.8～6.0，所述的1/2HB培养基是指将HB培养基中除水、白糖、卡拉胶外，其他各成分含量减半而形成的培养基。
所述的油茶继代增殖得到的微枝优选通过以下方法制备：
a、无菌系的建立：以油茶母树当年生半木质化枝条为外植体，经洗净、消毒后，再用无菌水冲洗干净后，剪去外植体的切口两端后，接入诱导培养基中进行培养，诱导出无菌芽，所述的诱导培养基为每升含有6-BA2.0～3.0mg、IAA1.5～2.0mg、ZT0.2～0.5mg和CH500mg，余量为HB培养基；
b、增殖培养：将无菌芽转入到增殖培养基中进行诱导丛芽分化，培养温度23～28℃，光照强度为2500～3000LUX，光照12h/d，丛芽分化后再放至23～28℃玻璃房内、自然光光照条件下培养，40～50天即可增殖产生微枝，丛生芽的增殖系数可在4～6，年繁殖率达2×104，产生有效苗(高2～4cm微枝)数量15～20棵/瓶(瓶规格直径9.65cm、高14cm)，所述的增殖培养基为每升含有BA1.0～2.0mg和IAA0.5～1.0mg，余量为HB培养基。
所述的油茶优选为“赣无”系列优良无性系。进一步优选为树龄25年的“赣无”系列优良无性系的油茶母树。
本发明是在试管外生根，打破了传统的组培瓶内诱导根系的方式，把生根与驯化有机结合，实现了油茶组培苗在瓶外直接生根，具有生根时间短、根系发育良好、吸收功能、移栽成活高优点，本发明可缩短育苗周期，节省生产成本及育苗空间，加速了种苗繁殖的进程，因此是一项值得应用和推广的技术。
附图说明：
图1是油茶的无菌芽诱导；
图2是油茶增殖过程中微枝的培养；
图3是油茶微枝在瓶内诱导根原基；
图4是诱导时基部长有白色根原基的微枝；
图5是微枝扦插基质中30天生根情况；
图6是油茶瓶外两年生生根苗。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
本实施例的HB培养基的配方如表1所示，其每升是这样配制的：除水外，将各组份溶于少量水中，然后加水定容至1L，灭菌备用。所述的1/2HB培养基是指将HB培养基中除水、白糖、卡拉胶外，其他各成分含量减半而形成的培养基。
本实施例的油茶组培苗瓶外生根方法，其步骤如下：
1、无菌系的建立—以油茶“赣无”系列优良无性系，树龄25年的母树上当年生半木质化枝条为外植体，剪除叶片后，再用洗涤剂浸泡30分钟，毛刷清洗表面，置流水下冲洗1～2小时，拿到超净工作台上用酒精浸过45s后，用质量分数0.1％的升汞消毒6～8分钟，再用无菌水冲洗数遍，获得的材料剪去浸泡药水的切口两端后接入备好的诱导培养基中，其培养条件为：无菌环境，培养温度为23～28℃，光照强度约为2000LUX，人工光照条件为12h/d。所述的诱导培养基每升含有6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2.0mg、IAA(吲哚-3-乙酸)1.5mg、ZT(玉米素)0.2mg和CH(水解酪蛋白)500mg，余量为HB培养基(将各组分溶于HB培养基灭菌备用，以下培养基的配置方式与此类似)。放在培养室培养大概15天后，茎段上腋芽处开始膨大，20d同时诱导2-3个簇生无菌芽(如图1所示)，继而叶片慢慢伸展出，未被污染的材料即可为下一步的增殖培养材料。
2、增殖培养—将无菌芽转入增殖培养基中，其培养条件为：无菌环境，培养温度为23～28℃，光照条件为：光照强度为2500～3000LUX，光照和黑暗的比例1.2:1，所述的增殖培养基为每升含有6-BA1.0mg和IAA0.5mg，余量为HB培养基，PH值5.8～6.0，诱导丛芽分化，丛芽分化后，再放至玻璃阳光房保持23～28℃的情况下用自然光光照培养40～50天即可增殖产生微枝(如图2所示)，丛生芽的增殖系数可在4～6，年繁殖率达2×104，产生有效苗(高2～4cm微枝)数量15～20棵/瓶。
3、根原基的诱导—在增殖的瓶苗中选用4～5片叶、顶叶展开微红发亮、茎杆绿色、苗高2～4cm的微枝接种到根原基诱导培养基中，其培养条件为：无菌环境，培养温度为15-28℃，靠近窗边或移至温室大棚接受自然光照，所述的根原基诱导培养基每升含有NAA(萘乙酸)3.0mg/L，其余为1/2HB培养基，10天可在基部产生白色根原基(如图3和4所示)。
4、移栽前预处理—把基部长有白色根原基的微枝从瓶中取出，洗去无根苗基部的培养基，用筛盆滤干水后浸蘸200mg/L的GGR(双吉尔-绿色植物生长调节剂GGR)立即扦插到扦插基质上，所述的扦插基质是这样配制的：取新鲜的黄心土在太阳下暴晒消毒后，用铁锹拍碎成细小颗粒，按黄心土2质量份、草木灰1质量份均匀混合，用30cm×60cm的育苗盆或6cm×8cm的育苗袋容器装盆，装好盆的扦插基质栽前3～4天需浇微量水。
5、微枝扦插移栽—用竹签在扦插基质上插一小孔，将浸蘸有200mg/LGGR的微枝放入小孔中，把土盖平，每扦插完一批浇足定根水，使扦插基质与苗木紧密融合，一周内用喷雾器每天给叶面补充水分3～5次，30天后无根微枝产生根系数量可达4～5条(如图5所示)，移栽生根成活率达85％以上。1个月后1000ppmHB补充叶面肥，待顶部有紫红的新芽长出后即表示苗木长处新根系，即可进入常规育苗。两年生的苗如图6所示。
表1：油茶基本培养基(HB)组成
成分 用量mg/L
花宝1号 1500
花宝2号 1500
FeSO4.7H2O 6.95
Na2EDTA 9.325
H3BO3 1.55
Mn2SO4.H2O 4.125
ZnSO4.7H2O 2.15
Na2MnO4.2H2O 0.062
CuSO4.5H2O 0.0062
CoCl2.6H2O 0.0062
KI 0.207
肌醇 25
卡拉胶 5000
白糖 30000
pH值 5.8～6.0
实施例2
本实施例的HB培养基的配方如表1所示，其每升是这样配制的：除水外，将各组份溶于少量水中，然后加水定容至1L，灭菌备用。所述的1/2HB培养基是指将HB培养基中除水外，其他各成分含量减半而形成的培养基。
本实施例的油茶组培苗瓶外生根方法，其步骤如下：
1、无菌系的建立—以油茶“赣无”系列优良无性系，树龄25年的母树上当年生半木质化枝条为外植体，剪除叶片后，再用洗涤剂浸泡30分钟，毛刷清洗表面，置流水下冲洗1～2小时，拿到超净工作台上用酒精浸过45s后，用质量分数0.1％的升汞消毒6～8分钟，再用无菌水冲洗数遍，获得的材料剪去浸泡药水的切口两端后接入备好的诱导培养基中，其培养条件为：无菌环境，培养温度为23～28℃，光照强度约为2000LUX，人工光照条件为12h/d，所述的诱导培养基每升含有6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)3.0mg、IAA(吲哚-3-乙酸)2mg、ZT(玉米素)0.5mg和CH(水解酪蛋白)500mg，余量为HB培养基(将各组分溶于HB培养基灭菌备用，以下培养基的配置方式与此类似)。放在培养室培养大概15天后，茎段上腋芽处开始膨大，20天同时诱导2-3个簇生无菌芽(如图1所示)，继而叶片慢慢伸展出，未被污染的材料即可为下一步的增殖培养材料。
2、增殖培养—将无菌芽转入增殖培养基中，其培养条件为：无菌环境，培养温度为23～28℃，光照条件为：光照强度2500～3000LUX，光照和黑暗的比例1.2:1，所述的增殖培养基为每升含有6-BA2.0mg和IAA1.0mg，余量为HB培养基，PH值5.8～6.0，诱导丛芽分化，丛芽分化后，再放至玻璃阳光房保持23～28℃的情况下用自然光光照培养40～50天即可增殖产生微枝(如图2所示)，丛生芽的增殖系数可在4～6，年繁殖率达2×104，产生有效苗(高2～4cm微枝)数量15～20棵/瓶。
3、根原基的诱导—在增殖的瓶苗中选用4～5片叶、顶叶展开微红发亮、茎杆绿色、苗高2～4cm的微枝接种到根原基诱导培养基中，其培养条件为：无菌环境，培养温度为15～28℃，靠近窗边或室外接受自然光照，所述的根原基诱导培养基每升含有NAA(萘乙酸)5.0mg/L，其余为1/2HB培养基，10d可在基部产生白色根原基(如图3和4所示)。
4、移栽前预处理—把基部长有白色根原基的微枝从瓶中取出，洗去无根苗基部的培养基，用筛盆滤干水后浸蘸600mg/L的GGR(双吉尔-绿色植物生长调节剂GGR)立即扦插到扦插基质上，所述的扦插基质是这样配制的：取新鲜的黄心土在太阳下暴晒消毒后，用铁锹拍碎成细小颗粒，按黄心土6质量份、草木灰2质量份均匀混合，用30cm×60cm的育苗盆或6cm×8cm的育苗袋容器装盆，装好盆的扦插基质栽前3～4天需浇微量水。
5、微枝扦插移栽—用竹签在扦插基质上插一小孔，将浸蘸有600mg/LGGR的微枝放入小孔中，把土盖平，每扦插完一批浇足定根水，使扦插基质与苗木紧密融合，一周内用喷雾器每天给叶面补充水分3～5次，30天后无根微枝产生根系数量可达4～5条(如图5所示)，移栽生根成活率达85％以上。1个月后1000ppmHB补充叶面肥，待顶部有紫红的新芽长出后即表示苗木长处新根系，即可进入常规育苗。两年生的苗如图6所示。

Claims (4)

1.一种油茶组培苗瓶外生根方法，其特征在于，包括以下步骤：
选取4～5片叶、顶叶展开微红发亮、茎杆绿色、苗高2～4cm的油茶继代增殖得到的微枝接种到根原基诱导培养基上培养，直至基部产生白色根原基，所述的根原基诱导培养基每升含有NAA3.0～5.0mg，其余为1/2HB培养基；
取出基部长有白色根原基的微枝，洗去其无根苗基部的培养基，滤干后浸蘸200～600mg/L的GGR，然后立即扦插到扦插基质上，再浇足定根水，生长期间保持充足的水肥供应，长成生根苗，所述的扦插基质按质量份由黄心土2～6份和草木灰1～2份均匀混合而成；
所述的HB培养基每升含有花宝1号1500mg、花宝2号1500mg、FeSO4.7H2O6.95mg、Na2EDTA9.325mg、H3BO31.55mg、Mn2SO4.H2O4.125mg、ZnSO4.7H2O2.15mg、Na2MnO4.2H2O0.062mg、CuSO4.5H2O0.0062mg、CoCl2.6H2O0.0062mg、KI0.207mg、肌醇25mg、卡拉胶5000mg、白糖30000mg，余量为水，pH5.8～6.0，所述的1/2HB培养基是指将HB培养基中除水、白糖、卡拉胶外，其他各成分含量减半而形成的培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的油茶继代增殖得到的微枝是通过以下方法制备：
a、无菌系的建立：以油茶母树当年生半木质化枝条为外植体，经洗净、消毒后，再用无菌水冲洗干净后，剪去外植体的切口两端后，接入诱导培养基中进行培养，诱导出无菌芽，所述的诱导培养基为每升含有6-BA2.0～3.0mg、IAA1.5～2.0mg、ZT0.2～0.5mg和CH500mg，余量为HB培养基；
b、增殖培养：将无菌芽转入到增殖培养基中进行诱导丛芽分化，培养温度23～28℃，光照强度为2500～3000LUX，光照12h/d，丛芽分化后再放至23～28℃玻璃房内、自然光光照条件下培养，增殖产生微枝，所述的增殖培养基为每升含有BA1.0～2.0mg和IAA0.5～1.0mg，余量为HB培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的油茶为“赣无”系列优良无性系。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的油茶为树龄25年的“赣无”系列优良无性系的油茶母树。
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