CN115927168A - 全能样细胞高效产生类囊胚的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了体外高效产生类囊胚的方法，所述方法包括利用微孔板培养全能性细胞的步骤。
Description
技术领域
本发明属于哺乳动物生殖领域，具体地涉及哺乳动物胞类囊胚的体外培养。
背景技术
自然囊胚植入子宫内后变成胚胎，但是，小鼠胚胎发生和着床的研究很难进行，因为动物模型(例如小鼠)每次只能产生有限的囊胚。哺乳动物的胚胎发生始于全能性合子。现有技术的研究显示囊胚样结构可以在三维(3D)培养系统中被具有扩展型多能干细胞(EPS)聚合形成。然而，这种方法产生类囊胚的效率很低，目前尚不清楚其他报道的全能型干细胞是否具有类似的能力。EPS类囊胚只有15％的形成效率，且滋养层细胞少，存在大量中胚层样细胞，而小鼠体内胚胎数量有限。
现有技术中报道了通过利用剪接体抑制剂抑制剪接体，实现了小鼠全能性干细胞的体外建立和培养，且这种细胞在分子和功能上接近体内2细胞和4细胞时期胚胎，因此被命名为TBLC(totipotent blastomere-like cells)。但是现有技术中并未利用TBLC经3D培养获得类囊胚结构，也未报到由TBLC单细胞形成类囊胚。植入前类囊胚(blastocyst)模型不能高效获得极大地限制了植入前胚胎发育的研究。
植入前胚胎发育的研究，胚胎发生和着床的研究亟需高效产生类囊胚的体外培养方法。
发明内容
本发明证实了剪接体抑制剂诱导的小鼠全能性卵裂球样细胞(TBLC)在约80％的AggreWellTM400微孔内形成囊胚样结构。同时，本发明还实现了从单个TBLC中产生类囊胚。且由TBLC形成的类囊胚表达囊胚组成细胞谱系的特异性标记物，并与正常囊胚相似。单细胞RNA测序也显示TBLC形成的类囊胚与正常胚胎具有相似的转录谱，表明本发明的技术方案成功构建了一种全能样细胞高效产生类囊胚的方法，为早期小鼠胚胎发生和着床的研究提供了一种高效产生类囊胚的替代模型。
第一方面，本发明提供了体外产生类囊胚的方法，所述方法包括利用培养板培养全能性细胞的步骤。
在一些实施方案中，所述全能性干细胞包括但不限于全能性合子、2-细胞期细胞、4-细胞期细胞、TBLC。
优选地，所述全能性干细胞不是扩展型多能干细胞(EPS)。
在一些实施方案中，所述培养板为微孔板。
优选地，所述微孔板为AggreWellTM400微孔板。
在一些实施方案中，利用用于培养EPS-类囊胚的培养基培养所述全能性干细胞。所述用于培养EPS-类囊胚的培养基为EPS-blastoid培养基。
优选地，所述培养基包含iBlastoid培养基。
在一些实施方案中，所述iBlastoid培养基包含TSC基础培养基，N2B7基础培养基，和M16培养基。
优选地，所述iBlastoid培养基包含20％-30％的TSC基础培养基，20％-30％N2B7基础培养基，和40-60％的M16培养基。
在一些实施方案中，所述培养基还包含rhFGF4，Heparin，CHIR99021，BMP4和A83-01。
在一些实施方案中，所述第1天时，所述iBlastoid培养基还补充添加Y-27632。
在一些实施方案中，所述方法包括如下步骤：
(1)用抗粘附液预处理培养板，优选地，所述培养板为AggreWellTM400培养板；
(2)用iBlastoid培养基悬浮全能性干细胞然后接种到预处理的培养板，于5％二氧化碳37℃恒温培养箱中进行培养；
优选地，第一天所述iBlastoid培养基中补充ROCK inhibitor Y-27632；
(3)每隔一天用不含Y-27632的新鲜iBlastoid培养基更换一半的培养基，培养6～7天后收集囊胚样结构。
在一些实施方案中，所述步骤(2)中，按每个微孔5-50个TBLC细胞接种到预处理的AggreWellTM400培养板，优选地，按每个微孔20-30个TBLC细胞接种到预处理的AggreWellTM400培养板。
优选地，所述Y-27632的浓度为为2μM。
优选地，所述步骤(2)中，按每个微孔25个TBLC细胞接种到预处理的AggreWellTM400培养板。
在一些实施方案中，按每个微孔1个TBLC细胞接种到预处理的AggreWellTM400培养板，确保1200个微孔中每个微孔内一个细胞。所述方法包括如下步骤：
(1)用抗粘附液预处理培养板，优选地，所述培养板为AggreWellTM400培养板；
(2)用TBLC条件培养基悬浮全能性干细胞然后接种到预处理的AggreWellTM400培养板，于5％二氧化碳37℃恒温培养箱中培养4天；
优选地第1天所述TBLC条件培养基中补充ROCK抑制剂Y-27632，；
(4)培养4天后，将TBLC条件培养基改为iBlastoid培养基，每隔一天更换一半的培养基，培养6或7天后收集囊胚样结构。
所述TBLC条件培养基包含新鲜的TBLC培养基和与MEF孵育2-3天的TBLC培养上清(1:1-1:2)。
在一些实施方案中，所述TBLC培养基包含mESC培养基和PlaB。
优选地，所述PlaB的浓度为2.5nM
在一些实施方案中，所述方法还包括利用TBLC培养基培养TBLC细胞的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括获得TBLC细胞，包括如下步骤：
(1)将小鼠胚胎干细胞(mESC)接种在灭活的小鼠MEF上培养3-4天；
(2)使用胰蛋白酶-EDTA消化，然后以1:3-1:5的比例传代至新的灭活MEF上；
(3)进行超过6代的连续培养，mESC转变成TBLC。
在一些实施方案中，所述灭活的小鼠MEF获自E13.5天ICR小鼠胚胎。
第二方面，本发明提供了由第一方面的体外产生类囊胚的方法获得的类囊胚。
所述类囊胚具有正常囊胚相似的谱系组成和细胞转录组。
在一些实施方案中，所述类囊胚和正常体内囊胚具有类似比例的TE样细胞和ICM样细胞。
在一些实施方案中，所述类囊胚表达NANOG、CDX2和/或GATA6。
在一些实施方案中，所述类囊胚表达所有正常体内囊胚的谱系标记基因，所述谱系标记基因包括ICM/EPI:Pou5f1、Nanog、Tdgf1、Sox2、Klf4、Klf2；PrE:Gata4、Gata6、Sox17、Sox7、Pdgfra、Col4a1、Dab2；TE:Cdx2、Tfap2c、Eomes、Krt8、Krt18、Gata2、Gata3、Tead4、Ascl2、Tacstd2；。
在一些实施方案中，所述类囊胚ICM/EPI、TE和PrE谱系与正常的囊胚细胞谱系聚在一起。
TBLC形成的类囊胚表达正常体内囊胚组成细胞谱系的特异性标记物，并与正常体内囊胚相似。单细胞RNA测序也显示TBLC形成的类囊胚与正常胚胎具有相似的转录谱。
第三方面，本发明提供了用于从全能性干细胞体外产生类囊胚的培养基，所述培养基为用于培养EPS-类囊胚的培养基培养或为TBLC培养基。
所述用于培养EPS-类囊胚的培养基为EPS-blastoid培养基。
优选地，所述培养基包含iBlastoid培养基。
在一些实施方案中，所述iBlastoid培养基包含TSC基础培养基，N2B7基础培养基，和M16培养基。
优选地，所述iBlastoid培养基包含20％-30％的TSC基础培养基，20％-30％的N2B7基础培养基，和40-60％的M16培养基。
在一些实施方案中，所述培养基还包含rhFGF4，Heparin，CHIR99021，BMP4和A83-01。
在一些实施方案中，所述TBLC培养基包含mESC培养基和PlaB。
第四方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第三方面的培养基和ROCK抑制剂Y-27632。
第五方面，本发明提供了第三方面的培养基或第四方面的试剂盒在从全能性干细胞体外产生类囊胚中的用途。
第六方面，本发明提供了第一方面的方法，第二方面的类囊胚，第三方面的培养基，或第四方面的试剂盒在构建类囊胚，或研究植入前和植入后早期胚胎发生，或筛选早期胚胎发育缺陷的关键基因，或研究影响胚胎着床的关键基因或研究敲除文库或过表达文库对早期胚胎发育的影响中的用途。
本发明实现了剪接体抑制剂诱导的小鼠全能性卵裂球样细胞(TBLC)在约80％的微孔内形成囊胚样结构。同时，本发明还实现从单个TBLC中产生了类囊胚。本发明提供了高效产生类囊胚的方法，为获取大量类囊胚进行后续功能验证提供了一种重要的手段，避免了小鼠体内收集囊胚数量有限和不易大规模编辑等问题，同时为筛选早期胚胎发育缺陷的关键基因提供一种重要的手段和工具。
本发明从全能性特征的细胞体外产生囊胚样结构，为研究植入前和植入后早期胚胎发生提供了一个容易获得、可扩展、易处理和高度可塑性的系统。现有技术显示小鼠类囊胚生成效率很低，EPS类囊胚只有15％的形成效率，且存在大量中胚层样细胞。本发明中TBLC在体外3D分化系统中聚集时，高效形成囊胚样结构(第7天1200个微孔中约80％形成囊胚样结构)，相比于EPS-blastoid，本发明的方法中形成的类囊胚中TE细胞的比例更高，也更接近于正常囊胚中TE细胞的比例。本发明的方法可以提供大量类囊胚，而从体内获取胚胎难以获得大量囊胚，因此，本发明的方法提供了一种重要的高效产生类囊胚的替代模型。
本发明还提供了从单细胞形成类囊胚的方法，为研究敲除文库或过表达文库对早期胚胎发育的影响提供一种重要手段，结合体外着床系统为研究早期胚胎着床机制提供一种重要工具。为了高通量筛选基因操作对早期胚胎发生的影响，从单个TBLC中产生类囊胚至关重要。
可以将Cas9文库或者多基因的过表达文库导入细胞中，在微孔中种入单个TBLC细胞培养至类囊胚，检测敲除基因或者过表达基因对形成类囊胚的影响，从而检测影响类囊胚发育的关键基因，为筛选早期胚胎发育缺陷的关键基因提供一种重要的手段和工具。
可以将Cas9文库或者多基因的过表达文库导入细胞中，在微孔中种入单个TBLC细胞培养至类囊胚，结合体外着床系统，为研究早期胚胎着床机制提供一种重要工具。
名词解释：
所述哺乳动物可以为任何哺乳动物，包括和不限于啮齿目(如小鼠和大鼠)，兔形目(兔子)、食肉目(猫科动物和犬科动物)、偶蹄目(牛科动物和猪科动物)、奇蹄目(马科动物)，或为灵长目和猿猴亚目(人或猴)。所述哺乳动物优选为人或小鼠。
在本发明中，胚胎包括着床前胚胎阶段，其涵盖从卵母细胞受精，桑椹胚、胚泡阶段、孵化和植入的所有发育阶段。术语“胚胎”可包括在子宫中植入后受精的卵母细胞，直至受精后8周，在该阶段其成为例如人类胎儿。受精的卵母细胞通常称为着床前胚胎，直到植入发生。
胚胎为近似球形，并且由称为透明带的无细胞基质包围的一个或多个细胞(卵裂球)组成。胚胎发育期间，卵裂球数量以几何方式(1-2-4-8-16-等)增加。在人类胚胎中，同步细胞分裂通常保持到8-细胞阶段。此后，细胞分裂变得异步并且最后个体细胞拥有自己的细胞周期。
胚胎的发育一般包括以下阶段：受精的卵母细胞、全能性合子、2-细胞期细胞、4-细胞期细胞、8-细胞期细胞、16-细胞期细胞、桑椹胚、胚泡、扩张的胚泡和孵化胚泡，以及之间的阶段(如3-细胞或5-细胞)。
具有最高潜能的干细胞被称为全能性干细胞，一般指体内的全能性合子，2-细胞期细胞，4-细胞期细胞，它可以发育到胚内和胚外组织。多能性干细胞，一般来源于囊胚的内细胞团，它的发育潜能是受限的，只能发育到胚内组织。
囊胚是一种球形结构，是正常发育的标志，对子宫着床至关重要，受精后第4天，其形成便始于桑椹胚表面的滋养外胚层细胞的分层。滋养外胚层形成一个充满液体的空腔，内部内细胞团(ICM)细胞进一步分化为两个的谱系——外胚层和下胚层(也称为原始内胚层)。类囊胚，或者称作囊胚样结构不仅能模拟囊胚的整体结构，系统性模拟受精胚胎早期发育，还能支持多能干细胞和滋养层干细胞的生长。现有技术中，小鼠类囊胚生成效率很低，EPS类囊胚只有15％的形成效率，且存在大量中胚层样细胞。
EPS(Extended pluripotent stem cells)，扩展型多能干细胞是从被重编程为诱导性多能干细胞(iPSC)，然后将它们或胚胎干细胞ES在特殊的培养基中进行培养，获得EPS，同时具有胚内和胚外的发育潜能。但是，这种扩展型多能性干细胞的分子特征和功能等方面和体内真正的全能性胚胎细胞仍存在较大差距。由小鼠扩展型多能干细胞(EPS)构建的“扩展型多能干细胞类囊胚(EPS-blastoids)”结构是含有极少的滋养外胚层和较多比例的中胚层样细胞。但是，EPS-blastoids存在严重的植入后发育缺陷，不能形成有功能的植入后胚胎，这极大的限制了其进一步的应用。
表达全能性基因Zscan4C和Mervl的2C-like细胞是最早报道的能够产生胚内和胚外组织的细胞。但是，2C-like细胞在培养基中是亚稳态的，仅以极低的百分比(0.1％-1％)存在。
TBLC(totipotent blastomere-like cell)，是通过抑制剪接体，实现了小鼠全能性干细胞的体外建立和培养，且这种细胞在分子和功能上接近体内2细胞和4细胞时期胚胎。剪接因子在早期胚胎发育中是动态变化的，有一类剪接因子在胚胎发育早期低表达，在后期表达量逐渐升高。敲低这一类关键剪接因子能广泛激活全能性基因(如Zscan4s，Plk2，Btg1/2以及转座子Mervl和Mt2)，沉默多能性基因(如Utf1，Tdgf1，Sox2)，从而将小鼠多能性的ESC重编程为全能性状态。TBLC在单细胞转录组、蛋白组、DNA甲基化组和染色质可及性上具有与2细胞期细胞和4细胞期细胞相似的分子特征。
Aggrewell400培养板是在一个24孔板中每个大孔中包括1200个400μm的倒置微孔，向Aggrewell培养板中加入细胞时，细胞会均匀的落入每个微孔孔中，如果每个大孔中每个微孔一个细胞，那么每个大孔大约容纳1200个细胞。
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
附图说明
图1显示了小鼠TBLC细胞自组装高效形成类囊胚。
图2显示了小鼠单个TBLC细胞自组装形成类囊胚。
图3显示了类囊胚单细胞转录本测序分析。
实施例1灭活小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层的制备
本实施例所用灭活MEF取自E13.5天ICR小鼠胚胎。首先选取适龄公母鼠合笼交配，次日查栓后，标记分笼记为E0.5天，待E13.5天时，取妊娠母鼠，断颈处死，酒精浸泡3-5分钟后放入无菌操作台，解剖取出胎鼠，清洗后去除头尾四肢和内脏，留下躯干部分用剪刀剪碎后，使用0.1％trypsin-EDTA于37℃恒温水浴锅中消化10-15分钟。终止消化后，接种于15cm培养盘中，DMEM(添加10％胎牛血清)培养基培养，1:3传代至P3代，检测支原体为阴性后，消化使40Gray辐照灭活后分装冻存。使用时，提前1天复苏接种在培养板中，使MEF细胞贴附铺展。
实施例2小鼠胚胎干(mESC)细胞的培养
mESC培养基使用DMED高糖培养基补充添加15％胎牛血清(Gibco,16000-044)，1％非必需氨基酸混合溶液(Gibco,11140-050)，1％ GlutaMAX(Gibco,35050-061)，1％丙酮酸钠溶液(Gibco,11360-070)，1U/mL青霉素和1mg/mL链霉素(Gibco,15070063)，0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma,63689)和103U/mL LIF(Merck,ESG1107)。mESC每次以1:10传代至明胶预包被后的培养板上，置于5％二氧化碳浓度37℃恒温培养箱中培养，每2天传代一次。
实施例3TBLC细胞的培养
为了获得稳定的TBLC(totipotent blastomere-like cells)细胞株，将mESC接种在灭活的ICR小鼠MEF上培养，培养基使用mESC培养基补充添加2.5nM的PlaB(Tocris,6070)。这些细胞将在该条件下连续培养3-4天，使用0.05％trypsin-EDTA消化，以1:3-1:5的比例传代至新的灭活MEF上。在超过6代的连续培养后，mESCs将转变成后续实验所需的TBLC。
实施例4类囊胚结构的3D培养
使用AggreWellTM400(STEMCELL Technologies,34415)对TBLCs聚球进行体外3D培养。AggreWellTM400培养板的使用根据操作说明进行：首先将抗粘附液(Anti-AdherenceRinsing Solution，STEMCELL Technologies，07010)加入培养板中，1300g离心5分钟，常温孵育20分钟以上后，移除抗粘附液使用培养基洗涤去除多余的抗粘附液，培养基保持湿润待用。iBlastoid培养基的配制：25％ TSC基础培养基(RPMI 1640(11875-093)添加20％FBS(16000-044),1％ GlutaMAX(35050-061),1％ Sodium pyruvate(11360-070),和0.1mM2-mercaptoethanol(21985-023),均购自Thermo Fisher Scientific)与25％ N2B7基础培养基(1:1DMEM/F-12(11330-032)和Neurobasal(21103-049)的混合物，添加0.5％N2(17502-048),0.5％ B27(17504-044),1％ NEAA(11140-050),1％ GlutaMAX(35050-061),0.1mM2-mercaptoethanol(21985-023)和5％ KnockOut Serum Replacement(Optional,10828-028),均购自Thermo Fisher Scientific)以及50％ M16(Sigma,M7292)培养基混合，同时补充添加12.5ng/mL rhFGF4(R&D,235F4025),0.5μg/mL Heparin(Sigma-Aldrich,H3149),3μM CHIR99021(Reagents Direct,27-H76),5ng/mL BMP4(Proteintech,HZ-1040),和0.5μM A83-01(Axon Medchem,1421)。将适量的细胞使用1mL iBlastoid培养基重悬后接种于预处理好后的AggreWellTM 400培养板中，细胞充分摇匀后，培养板200g离心3-5分钟，使混合均匀的细胞离心至微孔底部，便于细胞聚合，培养于5％二氧化碳37℃恒温培养箱中。在D0时培养基中补充添加2μM ROCK inhibitor Y-27632(Reagents Direct,53-B80-50)，防止细胞凋亡，次日换为不含Y-27632的培养基。24小时后(第1天)每孔移除1mL培养基并加入1mL新鲜培养基，每隔一天用不含Y-27632的新鲜培养基更换一半的培养基(动作轻柔，可以采用半换液的形式保留部分原有培养基，避免扰动孔内微球)。培养6或7天后收集囊胚样结构。
实施例5从单个TBLC细胞中产生类囊胚
本实施例将约1200-1500个TBLC细胞在2mL TBLC条件培养基(新鲜TBLC培养基：与MEFs孵育2-3天的TBLC培养上清＝1:1-1:2)中混合均匀并接种在AggreWellTM400培养板的一个孔中，确保一个大孔的1200个微孔中每个微孔内一个细胞。放入5％二氧化碳37℃恒温培养箱中继续培养4天，并在第一天添加2μM Y-27632，防止细胞凋亡。4天后，将培养基改为iBlastoid培养基，每隔一天更换一半培养基。将细胞再培养7天产生类囊胚。
实施例6小鼠TBLC细胞自组装高效形成类囊胚
胚胎干细胞ESC在含有2.5nM PlaB的mES培养基中培养6代以上形成TBLC(图1A)。TG2A和mCMG两株ESC形成的TBLC细胞分别按5、10、25和50个TBLC细胞每个微孔转移至AggrewellTM400微孔板中，每个孔中加入2mL培养基继续培养7天聚合形成类囊胚(图1B)。定量分析显示25个TBLC细胞聚合后1200个微孔中近80％的微孔内形成类囊胚(图1C)。25个细胞产生的类囊胚平均直径约为160μm，略大于正常囊胚，虽然5个细胞聚合的类囊胚和正常囊胚大小差不多，但只有4％的微孔中形成类囊胚(图1C和1D)。为了研究TBLC形成的类囊胚的谱系组成，对TBLC囊胚中的NANOG(外胚层的标记)和CDX2(TE的标记)或NANOG和GATA6(PrE的标记)进行了免疫荧光染色，结果表明大多数TBLC类囊胚表达NANOG、CDX2和GATA6(图1E和1F)。虽然小部分TBLC类囊胚中没有CDX2阳性细胞(16％)或NANOG阳性细胞(3％)(图1F)，但71.32％(乘以80.34％乘以88.78％)的TBLC类囊胚与正常体内囊胚3个谱系位置相似(图1G)。这些结果表明TBLC可以高效形成类囊胚。
实施例7小鼠TBLC单细胞自组装形成类囊胚
为了高通量筛选基因操作对早期胚胎发生的影响，从单个TBLC中产生类囊胚至关重要。参见图2A，本实验将步骤3中的TBLC细胞约1200–1500个在2mL TBLC条件培养基(新鲜TBLC培养基：与MEFs孵育2天的TBLC培养上清＝1:1)中混合均匀并接种在AggreWell400的一个孔中，确保1200个微孔中每个微孔内一个细胞；条件培养基中继续培养4天，并在第一天添加2μM Y-27632。4天后当微孔中细胞数变为16–22时，将条件培养基全部更换为iBlastoid培养基，每隔一天更换一半培养基；将细胞在AggreWell400继续培养7天产生类囊胚。虽然约34.8％的微孔中没有形成囊胚样结构，但几乎30％的存活细胞团形成囊胚样结构(18.6％的微孔)(图2B,2C和2D)。免疫荧光染色显示scTBLC类囊胚细胞表达了ICM、TE和PrE特异性蛋白NANOG、CDX2和GATA6，和正常囊胚中具有类似的分布(图2E)。定量分析显示所有scTBLC类囊胚均表达NANOG和GATA6，但只有一半表达TE的特异性蛋白CDX2(图2F)。因此，1200微孔培养板中约9.3％的单细胞微孔(18.6％乘以50％)产生了囊胚样结构，表达所有3个谱系标记的特异性基因，和正常囊胚具有类似的分布。这些结果表明单细胞TBLC可以形成类囊胚。
实施例8类囊胚单细胞转录本测序分析
为了进一步评估TBLC形成的类囊胚和正常囊胚的一致性，对TBLC囊胚的10068个细胞进行了单细胞(sc)RNA测序，并将数据与正常胚胎E3.5至E4.5(687个细胞)的scRNA测序结果、EPS类囊胚(2518个细胞)的数据、ETS类囊胚(768个细胞)和TPS类囊胚(916个细胞)。使用R包SEURAT进行综合分析表明类囊胚和正常囊胚中的细胞基本上彼此重叠(图3A)。使用特定谱系标记基因鉴定ICM、TE和PrE三个细胞群体，以及这些样本中未定义的细胞群体(图3A)。结果显示TBLC类囊胚表达所有相应的谱系标记基因(图3B)。ICM/外胚层和EPS胚泡中未定义的群体表达中胚层标记基因T(Brachyury)，而其它胚泡的情况并非如此(图3B)。统计每个细胞谱系在类囊胚和囊胚中的比例，结果显示与囊胚相比，TBLC类囊胚和正常囊胚具有类似比例的TE样细胞和ICM样细胞，但PrE样细胞较少(图3C)。而EPS类囊胚中只有少数TE样细胞，ETS胚泡中没有PrE细胞(图3C)。对不同类囊胚的不同细胞谱系进行聚类分析显示，TBLC类囊胚的ICM/EPI、TE和PrE谱系与正常的囊胚细胞谱系聚在一起，但其它类囊胚的细胞谱系并不能和正常囊胚直接聚类在一起(图3D)。这些数据均表明TBLC类囊胚具有正常囊胚相似的谱系组成和细胞转录组。参考文献：
(1)Li,R.,Zhong,C.,Yu,Y.,Liu,H.,Sakurai,M.,Yu,L.,Min,Z.,Shi,L.,Wei,Y.,Takahashi,Y.,et al.(2019).Generation of Blastocyst-like Structures from MouseEmbryonic and Adult Cell Cultures.Cell 179,687-702e618.
(2)Rivron,N.C.,Frias-Aldeguer,J.,Vrij,E.J.,Boisset,J.C.,Korving,J.,Vivie,J.,Truckenmuller,R.K.,van Oudenaarden,A.,van Blitterswijk,C.A.,andGeijsen,N.(2018).Blastocyst-like structures generated solely from stemcells.Nature 557,106-111.
(3)Xu,Y.,Zhao,J.,Ren,Y.,Wang,X.,Lyu,Y.,Xie,B.,Sun,Y.,Yuan,X.,Liu,H.,Yang,W.,et al.(2022).Derivation of totipotent-like stem cells withblastocyst-like structure forming potential.Cell Res 32,513-529.
(4)Hao,Y.,Hao,S.,Andersen-Nissen,E.,Mauck,W.M.,Zheng,S.,Butler,A.,Lee,M.J.,Wilk,A.J.,Darby,C.,Zager,M.,et al.(2021).Integrated analysis ofmultimodal single-cell data.Cell184,3573-3587.e3529.
(5)Shen,H.,Yang,M.,Li,S.,Zhang,J.,Peng,B.,Wang,C.,Chang,Z.,Ong,J.,andDu,P.(2021).Mouse totipotent stem cells captured and maintained throughspliceosomal repression.Cell 184,2843-2859e2820.
Claims (12)
1.体外产生类囊胚的方法，所述方法包括利用培养板培养全能性细胞的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，所述全能性干细胞为全能性合子、2-细胞期细胞、4-细胞期细胞，2-细胞样细胞或全能卵裂球样细胞(TBLC)，优选地，所述全能性干细胞不是扩展型多能干细胞(EPS)。
3.根据权利要求1的方法，其中利用用于培养EPS-类囊胚的培养基培养所述全能性干细胞，
优选地，所述培养基包含iBlastoid培养基，所述iBlastoid培养基包含TSC基础培养基，N2B7基础培养基，和M16培养基；
优选地，所述iBlastoid培养基包含20％-30％的TSC基础培养基，20％-30％N2B7基础培养基，和40-60％的M16培养基；
所述培养基还包含rhFGF4，Heparin，CHIR99021，BMP4和A83-01。
4.根据权利要求1的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)用抗粘附液预处理培养板；
(2)用iBlastoid培养基悬浮全能性干细胞然后接种到预处理的培养板，每个微孔中含有5-50个细胞，于5％二氧化碳37℃恒温培养箱中进行培养；
优选地，每个微孔含有20-30个TBLC细胞；
优选地，第一天所述iBlastoid培养基中含有Y-27632；
优选地，所述Y-27632的浓度为2μM；
(3)每隔一天用不含Y-27632的新鲜iBlastoid培养基更换一半的培养基，培养6～7天后收集囊胚样结构。
5.根据权利要求1的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)用抗粘附液预处理培养板；
(2)用TBLC条件培养基悬浮全能性干细胞然后接种到预处理的培养板，每个微孔中含有1个细胞，于5％二氧化碳37℃恒温培养箱中培养4天；
优选地，第一天所述TBLC条件培养基中含有Y-27632，
优选地，所述Y-27632的浓度为2μM；
(3)培养4天后，将TBLC条件培养基改为iBlastoid培养基，每隔一天更换一半的培养基，培养6或7天后收集囊胚样结构，
所述TBLC条件培养基包含TBLC培养基和与MEF孵育2-3天的TBLC培养上清(1:1-1:2)，
所述TBLC培养基包含mESC培养基和PlaB；优选地，所述PlaB的浓度为2.5nM。
6.根据权利要求2的方法，还包括获得TBLC细胞，其包括如下步骤：
(1)将小鼠胚胎干细胞(mESC)接种在灭活的小鼠MEF上培养3-4天；
(2)使用胰蛋白酶-EDTA消化，然后以1:3-1:5的比例传代至新的灭活MEF上；
(3)进行超过6代的连续培养，mESC转变成TBLC，
所述灭活的小鼠MEF获自E13.5天ICR小鼠胚胎。
7.类囊胚，其由权利要求1-6任一项的方法获得。
8.根据权利要求7的类囊胚，其具有正常体内囊胚的谱系组成和细胞转录组，
优选地，所述类囊胚具有正常体内囊胚比例的TE样细胞和ICM样细胞；
优选地，所述类囊胚表达NANOG、CDX2和/或GATA6；
优选地，所述类囊胚表达所有正常体内囊胚的谱系标记基因，所述谱系标记基因包括ICM/EPI:Pou5f1、Nanog、Tdgf1、Sox2、Klf4、Klf2；PrE:Gata4、Gata6、Sox17、Sox7、Pdgfra、Col4a1、Dab2；TE:Cdx2、Tfap2c、Eomes、Krt8、Krt18、Gata2、Gata3、Tead4、Ascl2、Tacstd2；。
9.一种用于从全能性干细胞体外产生类囊胚的培养基，所述培养基为用于培养EPS-类囊胚的培养基培养，
优选地，所述培养基包含iBlastoid培养基，
优选地，所述iBlastoid培养基包含TSC基础培养基，N2B7基础培养基，和M16培养基；
优选地，所述iBlastoid培养基包含20％-30％的TSC基础培养基，20％-30％N2B7基础培养基，和40-60％的M16培养基；
优选地，所述培养基还包含rhFGF4，Heparin，CHIR99021，BMP4和A83-01。
10.试剂盒，所述试剂盒包括权利要求9的培养基和Y-27632。
11.权利要求9的培养基或权利要求10的试剂盒在从全能性干细胞体外产生类囊胚中的用途。
12.权利要求1-6任一项的方法，权利要求7或8的类囊胚，权利要求9的培养基，或权利要求10的试剂盒在构建类囊胚，或研究植入前和植入后早期胚胎发生，或筛选早期胚胎发育缺陷的关键基因，或研究敲除文库或过表达文库对早期胚胎发育的影响中的用途。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160060593A1 (en) * | 2013-04-16 | 2016-03-03 | Universiteit Maastricht | Blastoid, cell line based artificial blastocyst |
| CN112574944A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-03-30 | 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） | 基于体外诱导eps发育形成类囊胚结构的方法 |
| WO2021067854A1 (en) * | 2019-10-03 | 2021-04-08 | Salk Institute For Biological Studies | Blastocyst-like structures from extended pluripotent stem cells |
| WO2021079992A1 (ja) * | 2019-10-25 | 2021-04-29 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞からの胚盤胞様構造体の作製法 |
| US20210189330A1 (en) * | 2017-03-23 | 2021-06-24 | The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads | Induced totipotent stem cells and methods for making and using the same |
| CN114480259A (zh) * | 2022-01-29 | 2022-05-13 | 中山大学 | 一种诱导小鼠全能样干细胞的培养基及诱导方法 |
| CN114891726A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-08-12 | 中山大学 | 一种人类全能样干细胞诱导培养基及其应用 |
| US20220259566A1 (en) * | 2020-11-24 | 2022-08-18 | Monash University | Methods and cellular structures |
-
2023
- 2023-01-13 CN CN202310087457.XA patent/CN115927168A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160060593A1 (en) * | 2013-04-16 | 2016-03-03 | Universiteit Maastricht | Blastoid, cell line based artificial blastocyst |
| CN105683363A (zh) * | 2013-04-16 | 2016-06-15 | 马斯特里赫特大学 | 类胚体，基于细胞系的人工囊胚 |
| US20210189330A1 (en) * | 2017-03-23 | 2021-06-24 | The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads | Induced totipotent stem cells and methods for making and using the same |
| WO2021067854A1 (en) * | 2019-10-03 | 2021-04-08 | Salk Institute For Biological Studies | Blastocyst-like structures from extended pluripotent stem cells |
| WO2021079992A1 (ja) * | 2019-10-25 | 2021-04-29 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞からの胚盤胞様構造体の作製法 |
| US20220259566A1 (en) * | 2020-11-24 | 2022-08-18 | Monash University | Methods and cellular structures |
| CN112574944A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-03-30 | 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） | 基于体外诱导eps发育形成类囊胚结构的方法 |
| CN114480259A (zh) * | 2022-01-29 | 2022-05-13 | 中山大学 | 一种诱导小鼠全能样干细胞的培养基及诱导方法 |
| CN114891726A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-08-12 | 中山大学 | 一种人类全能样干细胞诱导培养基及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| XU Y ET AL.: "Derivation of totipotent-like stem cells with blastocyst-like structure forming potential", 《CELL RES》, vol. 32, no. 6, 30 June 2022 (2022-06-30), pages 513 - 527, XP055943409, DOI: 10.1038/s41422-022-00668-0 * |
| ZHANG P ET AL.: "Highly efficient generation of blastocyst-like structures from spliceosomes-repressed mouse totipotent blastomere-like cells", 《SCI CHINA LIFE SCI.》, vol. 66, no. 3, 10 January 2023 (2023-01-10), pages 423 - 433 * |
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Application publication date: 20230407 |
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |