CN115298211A - 用于培养一牛祖细胞的无血清培养基 - Google Patents

用于培养一牛祖细胞的无血清培养基 Download PDF

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赫尔德·克鲁兹
伊娃·克莱弗尼克
安娜·科尔克曼
安儂·范·埃森
马克·波斯特
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Mosamit Co ltd
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Abstract

一种培养一牛祖细胞的方法，包括以下步骤：在用于培养一牛祖细胞的一无血清培养基中培养一牛祖细胞，其中所述无血清培养基包含一白蛋白；及一成纤维细胞生长因子。

Description

用于培养一牛祖细胞的无血清培养基
技术领域
本发明属于用于动物细胞培养的无血清培养基的领域，更具体地，是用于培养一牛祖细胞(bovine progenitor cell)，包括(骨骼)肌肉组织衍生的数个祖细胞及脂肪组织衍生的数个祖细胞。本发明还涉及使用本发明的一培养基来培养数个牛祖细胞的方法。更具体而言，本发明的无血清培养基可用于这种祖细胞的增殖(扩增)。
背景技术
来自不同来源的血清已被用作动物细胞培养基中的一重要成分，因为它提供了多种重要的数个营养物质、数个维生素、数个生长因子及数个粘附蛋白等成分。然而，血清是细菌、支原体、病毒及朊病毒等污染物的潜在来源，而后者是最近引起关注的来源，因为它们是人类及其他动物传染性神经退行性疾病的病原体，而血清最常获得自这些其他动物，例如获得自牛。尤其是当动物细胞类型被培养用于食品应用时，例如基于细胞培养的肉类生产供人类食用，这些考虑因素扮演重要角色。
此外，血清代表了生物过程的高成本，并且由于血清的批次间差异而引入了性能的可变性。如果在细胞培养应用中使用血清，动物福祉将成为另一个令人担忧的问题。
因此，需要避免在细胞培养应用中使用血清(即，使用一无血清培养基)，同时在细胞增殖方面仍能达到可接受的性能，例如细胞生长速率或寿命(细胞总数倍增)，所述可接受的性能最好与含血清培养基进行比较。
尤其对于用于人类消费的基于细胞培养的肉制品生产，需要允许牛肌肉组织衍生的及牛脂肪组织衍生的祖细胞增殖而不是分化的无血清培养基。此类扩增的祖细胞群随后可在分化培养基中培养，以将所述祖细胞分化成肌肉细胞及肌肉纤维或脂肪组织细胞，其可掺入基于细胞培养的肉制品中以供人类食用。不幸的是，目前用于牛祖细胞增殖的无血清培养基是有限的，并且可用培养基的性能通常不能令人满意。
发明内容
本发明人发现了一种无血清培养基，所述无血清培养基可用于非人哺乳动物祖细胞，尤其是牛祖细胞(bovine progenitor cells)，例如牛肌肉组织衍生的祖细胞及牛脂肪组织衍生的祖细胞的培养及增殖(扩增)。
因此，本发明在一第一方面提供了一种培养一牛祖细胞的方法，包括以下步骤：在用于培养一牛祖细胞的一无血清培养基中培养一牛祖细胞，其中所述无血清培养基包含一白蛋白(albumin)；一成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)。
以同样的方式，本发明提供了一种用于培养一牛祖细胞的一无血清培养基，其包含一白蛋白；一成纤维细胞生长因子(FGF)。
本发明人的发现之一是所述数个牛祖细胞在无血清培养时强烈依赖于白蛋白及成纤维细胞生长因子的存在，以用于增殖(扩增)目的。图4显示在无血清培养基中缺乏白蛋白及FGF的情况下将强烈影响牛祖细胞增殖率。这是一个新的见解。
以同样的方式，本发明还提供了一种用于培养一牛祖细胞的无血清培养基，包含一白蛋白；如本文所述的一生长因子及/或一细胞因子，优选为一成纤维细胞生长因子(FGF)。
发明人的另一重要成就是他们能够化学地定义一无血清培养基，所述无血清培养基可用于增殖祖细胞，尤其是牛祖细胞。本发明的一无血清培养基的数个优点是它不含血清并且优选也不含动物成分。与含有血清的培养基相比，这种无血清培养基的生产成本显着降低，这是获得基于活细胞培养的肉制品的必要条件。此外，出人意料地确定了牛祖细胞在本发明的无血清培养基中的生长(曲线)比所述细胞在含血清培养基中的生长(曲线)更稳定，因为在本发明的无血清培养基中的生长速率后者逐渐减少，直到细胞生长停止(参见图3)。图3还显示牛祖细胞在本发明的无血清培养基中的生长速率是有利的，并且至少与使用含血清培养基达到的生长速率相当。实验数据进一步表示出，用于人类消费的基于细胞培养的肉类生产的牛祖细胞在一系列浓度的培养基成分中表现出良好的性能(图2及图4)。
因此，在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的一优选实施例中，所述培养基进一步包含：一或多种维生素及/或激素，选自由抗坏血酸(ascorbic acid)或其一衍生物、一胰岛素、一生长激素及一氢化可的松(hydrocortisone)所组成的群组；及一或多种细胞因子及/或生长因子，选自由一血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、一胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、一血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)、一肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)及一白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)所组成的群组。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述培养基进一步包含：一或多种维生素及/或激素，选自由抗坏血酸或其一衍生物、一胰岛素、一生长激素及一氢化可的松所组成的群组；及/或一或多种细胞因子及/或生长因子，选自由一血小板衍生生长因子(PDGF)、一胰岛素样生长因子(IGF)、一血管内皮生长因子(VEGF)、一肝细胞生长因子(HGF)及一白细胞介素6(IL-6)所组成的群组。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述无血清培养基包含以下以作为所述一或多种细胞因子及/或生长因子：一IL-6；一IL-6及一IGF；一IL-6、一IGF及一HGF；一IL-6、一IGF、一HGF及一PDGF；一IL-6、一IGF及一VEGF；一IL-6、一IGF及一PDGF；一IL-6、一PDGF及一VEGF；一IL-6、一IGF、一PDGF及一VEGF；或一IL-6、一IGF、一HGF、一PDGF及一VEGF。优选地，本发明的无血清培养基中所含的一或多种细胞因子及/或生长因子至少是FGF；FGF+IL-6、FGF+IGF、FGF+HGF、FGF+PDGF、FGF+VEGF；更优选为至少FGF+IL-6+IGF+HGF或FGF+IL-6+IGF+VEGF+PDGF；最优选为FGF+IL-6+IGF+VEGF或FGF+IL-6+IGF+HGF，或FGF+IL-6+IGF1+HGF+PDGF+VEGF。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述培养基进一步包含：抗坏血酸或其一衍生物；一胰岛素；一生长激素；及一氢化可的松；一PDGF、一VEGF及一HGF，任选与一IGF及/或一IL-6组合。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述培养基进一步包含：抗坏血酸或其一衍生物；一胰岛素；一生长激素；及一氢化可的松；及/或一PDGF、一VEGF及一HGF，任选地与一IGF及/或一IL-6组合。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述培养基进一步包含：抗坏血酸或其一衍生物；一胰岛素；一生长激素；及一氢化可的松；一PDGF、一VEGF、一HGF、一IGF及一IL-6。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述培养基进一步包含：一基础培养基；一葡萄糖源(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；一谷氨酰胺源(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；一脂肪酸源(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；一铁源或一铁转运体(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；亚硒酸钠(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)。或者，所述培养基还可以包括以下中的一者或多者：一基础培养基；一葡萄糖源(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；一谷氨酰胺源(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；一脂肪酸源(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；一铁源或一铁转运体(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；一亚硒酸钠(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)。优选地，所述无血清培养基至少包含一基础培养基，并且优选为还包含一葡萄糖源、一谷氨酰胺源、及一脂肪酸源；并且优选还有一铁源或铁转运体及/或亚硒酸钠。
优选地，本发明的无血清培养基包含一基础培养基，所述基础培养基可能已经包含一葡萄糖源及/或一谷氨酰胺源；并且可以任选地还包含一脂肪酸源；一铁源或一铁转运体；及/或亚硒酸钠。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当存在一基础培养基时，所述基础培养基包含DMEM及/或汉姆氏F12培养基，优选为DMEM及汉姆氏F12培养基，例如分别为1:10至10:1的比例，更优选为1:1的比例。图1显示同时包含DMEM及汉姆氏F12培养基的基础培养基表现特别好。图7显示包含RPMI或α-MEM的基础培养基也表现良好，当以不同比率提供时，包含DMEM/F12的基础培养基也是如此。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当存在一脂肪酸源时，所述脂肪酸源包括α-亚麻酸。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述培养基进一步包含一蛋白质水解物，优选为一大豆蛋白质水解物。出乎意料地，向一无血清生长培养基中添加一蛋白质水解物，例如一大豆蛋白质水解物，可以提高牛祖细胞的生长速率(图5)。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述培养基还包含一生物胺(biogenic amine)，优选为一生物单胺或多胺，优选为一乙醇胺(ethanolamine)、一腐胺(putrescine)、一亚精胺(spermidine)及/或一精胺(spermine)。出乎意料地发现，添加生物胺可提高牛祖细胞的生长速率(图5及图6)。同样，发现当组合使用时，生物胺可改善脂肪组织衍生的祖细胞的生长(图6)。优选地，一或多种生物胺存在于本发明的无血清培养基中，更优选为至少两种生物胺，例如至少精胺及亚精胺。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述培养基还包含一或多种附着因子(attachment factors)。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的优选实施例中，当所述培养基包含依附着因子时，所述附着因子是纤连蛋白(fibronectin)。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述无血清培养基包含：一白蛋白；一成纤维细胞生长因子(FGF)；一或多种维生素及/或激素，选自由抗坏血酸或其一衍生物、一胰岛素、一生长激素及一氢化可的松所组成的群组；一或多种细胞因子及/或生长因子，选自由一血小板衍生生长因子(PDGF)、一胰岛素样生长因子(IGF)、一血管内皮生长因子(VEGF)、一肝细胞生长因子(HGF)及一白细胞介素6(IL-6)所组成的群组；一基础培养基；一葡萄糖源(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；一谷氨酰胺源(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；一脂肪酸源(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；一铁源或一铁转运体(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；亚硒酸钠(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；及任选的一蛋白质水解物、一生物胺及/或一附着因子。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述无血清培养基包含：一白蛋白；一成纤维细胞生长因子(FGF)；抗坏血酸或其一衍生物、一胰岛素、一生长激素及一氢化可的松；一血小板衍生生长因子(PDGF)、一胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、一肝细胞生长因子(HGF)及一白细胞介素6(IL-6)；一基础培养基；一葡萄糖源(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；一谷氨酰胺源(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；一脂肪酸源(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；一铁源或一铁转运体(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；亚硒酸钠(可以(即可以包含在)所述基础培养基的形式提供)；及任选的一蛋白质水解物、一生物胺及/或一附着因子。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述白蛋白、所述FGF、所述一或多种细胞因子及/或生长因子、所述一或多种维生素及/或激素、所述基础培养基、所述葡萄糖源、所述谷氨酰胺源、所述脂肪酸源、所述铁源或所述铁转运体源、所述亚硒酸钠、所述蛋白水解物、所述生物胺及/或所述附着因子，存在于一有效量中，以用于培养中的一牛祖细胞的增殖。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述培养基是一无血清培养基，以用于一牛祖细胞的增殖。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述培养基进一步包含一或多种维生素及/或激素，优选为抗坏血酸(ascorbic acid)(或其一衍生物，例如L-抗坏血酸2-磷酸(L-ascorbic acid 2-phosphate))、胰岛素、生长激素及氢化可的松(hydrocortisone)中的一者或多者。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述培养基进一步包含一葡萄糖源、一谷氨酰胺源、及/或一铁源或一铁转运体。优选地，本发明的无血清培养基包含一葡萄糖源及一谷氨酰胺源。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述细胞因子及/或生长因子是一血小板衍生生长因子(PDGF)、一成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)及白细胞介素6(IL-6)中的一者或多者。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一个实施例中，所述培养基进一步包含一脂肪酸源。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的更进一步优选实施例中，所述培养基包含一基础培养基，例如一液体基础培养基，所述基础培养基可包含一葡萄糖源及/或一谷氨酰胺源；并且可以任选地还包含一脂肪酸源；一铁源或一铁转运体；及/或亚硒酸钠。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的一优选实施例中，当所述培养基包含一葡萄糖源及一谷氨酰胺源时，所述谷氨酰胺源包括谷氨酰胺(glutamine)或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine)，及/或所述葡萄糖源包括葡萄糖。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的一优选实施例中，当所述培养基包含一铁转运体时，所述铁转运体是一转铁蛋白(transferrin)。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的一优选实施例中，所述白蛋白(albumin)是一人白蛋白(human albumin)，优选为一重组产生的人白蛋白。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的一优选实施例中，所述培养基的所有组分均不含动物。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当一基础培养基存在于所述培养基中时，所述基础培养基包含DMEM及/或汉姆氏F12培养基，优选为DMEM及汉姆氏F12培养基，例如分别为1:10至10:1的比例，更优选为1:1的比例。或者，所述基础培养基可包含RPMI或α-MEM。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当一脂肪酸源存在于所述培养基中时，所述脂肪酸源包括α-亚麻酸(α-linolenic acid)。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当一葡萄糖源存在于所述培养基中时，所述葡萄糖源以0.01-75g/l的浓度存在，更优选以0.1-4.5g/l的浓度存在。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述FGF以0.1-1000μg/l的浓度存在，优选以1-100μg/l的浓度存在，更优选以5-50μg/l的浓度存在，甚至更优选以约10μg/l的浓度存在。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当一谷氨酰胺源存在于所述培养基中时，所述谷氨酰胺源以0.01-100mM的浓度存在，更优选以0.1-8mM的浓度存在，例如以约2mM的浓度存在。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，所述白蛋白以0.01-50g/l的浓度存在，优选以0.1-10g/l的浓度存在，更优选以0.5-5g/l的浓度存在。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当一铁转运体存在于所述培养基中时，所述铁转运体是以0.1-75mg/l的浓度存在，优选以1-10mg/l的浓度存在，更优选以约5.5mg/l的浓度存在。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当胰岛素存在于所述培养基中时，所述胰岛素以0.1-100mg/l的浓度存在，优选以5-75mg/l的浓度存在，更优选以约10mg/l的浓度存在。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当亚硒酸钠存在于所述培养基中时，所述亚硒酸钠以0.01-1000μg/l的浓度存在，优选以0.1-100μg/l的浓度存在，更优选以1-100μg/l的浓度存在，最优选以约6.7μg/l的浓度存在。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当一生物胺(例如乙醇胺(ethanolamine)、腐胺(putrescine)、亚精胺(spermidine)及/或精胺(spermine))存在于所述培养基中，所述生物胺以0.01-100mg/l的浓度存在，更优选以0.1-10mg/l的浓度存在，甚至更优选以2-5mg/l的浓度存在。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当抗坏血酸或其一衍生物(例如L-抗坏血酸2-磷酸盐(L-ascorbicacid 2-phosphate))存在于所述培养基中，所述抗坏血酸或其所述衍生物以0.01-10000mg/l的浓度存在，优选以1-500mg/l的浓度存在，更优选以约50mg/l的浓度存在。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当生长激素(somatotropin)存在于所述培养基中时，所述生长激素以0.01–200μg/l的浓度存在，优选以0.1–20μg/l的浓度存在，更优选以约2μg/l的浓度存在。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当氢化可的松(hydrocortisone)存在于所述培养基中时，所述氢化可的松(hydrocortisone)以0.01–1000μg/l的浓度存在，优选以1–500μg/l的浓度存在，更优选以约36μg/l的浓度存在。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当纤连蛋白(fibronectin)存在于所述培养基中时，所述纤连蛋白以0-1000mg/l的浓度存在，优选以0.1-100mg/l的浓度存在，更优选以约1-10mg/l的浓度存在。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当所述PDGF、FGF、IGF、VEGF、HGF及IL-6中的一者或多者存在于所述培养基中，所述PDGF、FGF、IGF、VEGF、HGF及IL-6中的一者或多者分别以1-100μg/l、1-100μg/l、0-1000μg/l、1-100μg/l、0.5-50μg/l及0.5-50μg/l的浓度存在，更优选分别以约10μg/l、约10μg/l、0-100μg/l、约10μg/l、约5μg/l及约5μg/l的浓度存在。在某些实施例中，本发明的无血清培养基中可以不存在IGF。图2及图4表示出，数个生长因子的添加及数个生长因子的组合有利于细胞生长。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当所述脂肪酸源存在于所述培养基中时，所述脂肪酸源以0.01-100mg/l的浓度存在，更优选以0.1-10mg/l的浓度存在，更优选以约1mg/l的浓度存在。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当所述蛋白质水解物存在于所述培养基中时，所述蛋白质水解物是以0-20％(w/v)的浓度存在、优选以0.001-10％(w/v)的浓度存在、更优选以0.01-1％(w/v)的浓度存在、甚至更优选以0-0.25％(w/v)的浓度存在或0.01-0.25％(w/v)的浓度存在、甚至更优选以0-0.1％(w/v)的浓度存在或以0.01-0.1％(w/v)的浓度存在、最优选以约0.05％(w/v)的浓度存在。
在本发明的无血清培养基或其中使用本发明的无血清培养基的本发明的培养方法的另一优选实施例中，当所述一或多种生物胺存在于所述培养基中时，所述一或多种生物胺(例如乙醇胺、腐胺、亚精胺及/或精胺)以0-10mg/l的浓度存在、更优选以2-5mg/l的浓度存在或以6-10mg/l的浓度存在、最优选以约2或5mg/l的浓度存在。
在又一方面，本发明提供了生产本发明的无血清培养基的方法，包括以下步骤：将如本文公开的本发明的一无血清培养基的所述数个成分或数个组分添加到一基础培养基中。如果本发明的无血清培养基的一或多种组分或组分已经包含在基础培养基中，则可以省略将所述无血清培养基的所述数个组分或数个组分添加到所述基础培养基中。
在生产本发明培养基的方法的一优选实施例中，所述基础培养基是一液体或粉状基础培养基，优选为包含DMEM及/或汉姆氏F12培养基的液体基础培养基，优选为DMEM及汉姆氏F12培养基，例如在分别为1:10至10:1的比例，更优选为1:1的比例。或者，所述基础培养基可包含RPMI或α-MEM。
在生产本发明培养基的方法的一优选实施例中，本文公开的本发明无血清培养基的所述成分或组分包括一白蛋白；一成纤维细胞生长因子(FGF)；抗坏血酸或其一衍生物、一胰岛素、一生长激素及一氢化可的松；一血小板衍生生长因子(PDGF)、一胰岛素样生长因子(IGF)、一血管内皮生长因子(VEGF)、一肝细胞生长因子(HGF)及一白细胞介素6(IL-6)；一葡萄糖源(如果尚未包含在所述基础培养基中)；一谷氨酰胺源；一脂肪酸源；一铁源或一铁转运体；亚硒酸钠；及任选的一蛋白质水解物、一生物胺及/或一附着因子，所有这些组分优选地如本文所公开的，并且优选地处于如本文所公开的任何一种组合中。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，包含本发明的一无血清培养基及一牛祖细胞。
在本发明的无血清培养基或本发明的组合物的一优选实施例中，所述祖细胞是(i)牛肌肉祖细胞或一牛脂肪(脂肪组织)祖细胞或(ii)一牛肌肉组织衍生的祖细胞或一牛脂肪组织衍生的祖细胞。
在本发明的用于培养祖细胞的方法的一优选实施例中，所述祖细胞是(i)牛肌肉祖细胞或一牛脂肪(脂肪组织)祖细胞或(ii)一肌肉组织衍生的祖细胞或一牛、绵羊或猪脂肪组织衍生的祖细胞。
在本发明的用于培养牛祖细胞的方法的一优选实施例中，所述牛祖细胞是一未经遗传修饰的细胞，或者是一经遗传修饰的细胞。
在本发明的用于培养牛祖细胞的方法的优选实施例中，所述牛祖细胞是一未经遗传修饰的牛肌卫星细胞(bovine myosatellite cell)，或一未经遗传修饰的牛脂肪组织(衍生的)祖细胞。
在另一方面，本发明提供了本文公开的无血清培养基用于培养牛祖细胞的用途。以同样的方式，本发明提供了本文公开的无血清培养基用于培养牛肌肉祖细胞的用途。
在另一方面，本发明提供了本发明的无血清培养基在生产用于人类消费的基于细胞培养的肉制品中的用途。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“无血清”(serum-free)包括指在不存在血清(例如人血清或牛血清)的情况下配制的培养基。通过将所述血清白蛋白补充到所述培养基中，无血清培养基可以含有血清蛋白，例如血清白蛋白(serum albumin)。然而，优选地，所述培养基的所有组分均不含动物成分。例如，白蛋白(albumin)优选为重组产生的。本发明的无血清培养基的组分浓度可以针对例如牛祖细胞的祖细胞的培养及增殖(扩增)进行调整及优化。无血清培养基可以包括补充或不补充其他组分(例如糖源、脂肪酸源、氨基酸源、维生素源、激素源、细胞因子源、生长因子源或矿物质源)的一无血清基础培养基。优选地，在本发明的无血清培养基中，所述白蛋白、所述FGF、所述一或多种细胞因子及/或生长因子、所述一或多种维生素及/或激素、所述基础培养基、所述葡萄糖源、所述谷氨酰胺源、所述脂肪酸源、所述铁源或所述铁转运体、所述亚硒酸钠、所述蛋白质水解物、所述生物胺及/或所述附着因子，存在于一有效量中，以用于培养中的一祖细胞的增殖。
如本文所用，术语“培养”包括提及祖细胞例如牛祖细胞的增殖及/或增殖(扩增)。在本发明的上下文中，所述术语优选为包括提及牛祖细胞群的增殖并因此扩增。然而，应当理解，本发明的无血清培养基也可用于增殖(扩增)其他非人类哺乳动物祖细胞，例如绵羊及猪祖细胞。因此，本文描述的关于牛祖细胞的任何实施例也适用于绵羊(例如绵羊)及猪(例如猪)祖细胞，即绵羊或猪衍生的祖细胞。因此，在本发明的培养方法的数个方面及/或数个实施例中，可以使用本发明的一无血清培养基或本发明的一组合物，而不是使用一牛祖细胞、一羊祖细胞(优选为一羊肌肉祖细胞或羊脂肪组织(脂肪)祖细胞)或一猪祖细胞(优选为一猪肌肉祖细胞或猪脂肪组织(脂肪)祖细胞)。
如本文所用，术语“增殖”及“扩展”可以互换使用。这些术语包括提及在细胞培养中增加祖细胞(例如牛祖细胞)的群体大小，即祖细胞通过细胞增殖产生其他祖细胞。这种扩增的牛祖细胞群随后可以在分化培养基中培养，以将所述祖细胞分化成肌肉细胞或脂肪组织，肌肉细胞或脂肪组织可以掺入基于细胞培养的肉制品中以供人类食用。然而，首先，在分化之前，需要通过增殖/扩增产生足够量的祖细胞，例如牛祖细胞。
如本文所用，术语“祖细胞”(progenitor cell)包括指致力于分化成特定类型的细胞或形成特定类型的组织的细胞。术语“祖细胞”可包括指具有自我更新及多潜能分化成尤其是肌细胞(myocytes)(肌肉细胞(muscle cells))及脂细胞(adipocytes)(脂肪细胞(fat cells))的能力的多能基质细胞(multipotent stromal cells)(间充质干细胞(mesenchymal stem cells))。
优选地，所述祖细胞是一肌肉祖细胞或一脂肪祖细胞。更优选地，所述祖细胞是一牛祖细胞，更优选为一牛肌肉祖细胞或一牛脂肪组织(脂肪)祖细胞。
一祖细胞可以是一组织衍生的祖细胞，源自一野生型(例如家牛、羊或猪)或一转基因动物(例如转基因牛、羊或猪)。所述祖细胞本身可以被遗传修饰或可以不被遗传修饰。例如，祖细胞可以是由牛、绵羊或猪衍生的细胞产生的一诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cell，iPS)。优选地，所述祖细胞是未经基因修饰的肌肉组织或脂肪组织(衍生)的祖细胞。
如本文所用，术语“牛祖细胞”(bovine progenitor cells)包括指致力于分化成特定类型的牛细胞或形成特定类型的牛组织的牛细胞。术语“牛祖细胞”可包括指具有自我更新及多潜能分化成尤其是肌细胞(肌肉细胞)及脂细胞(脂肪细胞)的能力的多能牛基质细胞(multipotent bovine stromal cells)(间充质干细胞)。优选地，牛祖细胞是牛肌肉祖细胞或牛脂肪祖细胞。一牛祖细胞可以是一组织衍生的牛祖细胞，源自自一野生型(例如家牛)或一转基因动物(例如转基因牛)。所述牛祖细胞本身可以进行基因改造或不进行基因改造。例如，牛祖细胞可以是由牛细胞产生的诱导多能干细胞(iPS)。优选地，牛祖细胞是未经基因修饰的组织衍生的牛祖细胞。
如本文所用，术语“牛”(bovine)包括指牛科(Bovidae)中的的动物，包括牛(Bos)属。如在本文所述的数个方面及数个实施例中使用的术语“牛”可以由术语“牛科动物”(Bovidae)代替。术语“牛科”可以用来指代牛科中的任何动物。牛科包括野牛、水牛、羚羊、角马、黑斑羚、瞪羚、绵羊、山羊、麝牛及牛(cattle)(如奶牛(cows))，包括家牛(domesticcattle)。特别优选为的牛物种是Bos taurus(奶牛)。
如本文所用，术语“绵羊”(ovine)包括对属于绵羊(Ovis)属的任何动物，其包括物种Ovis aries。所述术语包括对绵羊(sheep)的叙述，其可以是驯化的或野生的物种。
如本文所用，术语“猪”(porcine)包括指猪科(Suidae)中的任何动物，包括猪亚科(Suinae)及猪属(Sus)。所述术语包括对猪(pigs)的叙述，其可以是驯化的或野生的物种。
如本文所用，术语“肌肉祖细胞”或“肌肉组织衍生的祖细胞”可与术语“肌肉干细胞”或“肌原性祖细胞(细胞)”互换使用。这些术语包括对存在于肌肉组织如骨骼肌组织中的成体干细胞的叙述，它们是多能的并且可以自我更新并且能够产生肌肉细胞如骨骼肌细胞。术语“肌肉祖细胞”也可以称为“肌肉祖细胞”。优选的肌肉祖细胞是牛肌肉祖细胞，例如牛肌卫星细胞。优选地，肌肉祖细胞，更优选为肌卫星细胞(myosatellite cell)，是(骨骼)肌肉组织衍生的祖细胞。这样的细胞可以被基因修饰或未被基因修饰，优选为未被基因修饰。如前所述(Ding等人，Sci.Rep.17(8):10808(2018))，可以根据它们的CD29阳性表达从肌肉中分离祖细胞。
如本文所用，术语“肌卫星细胞”(myosatellite cell)包括对小的多能细胞的叙述并且可以在成熟的肌肉组织中找到。肌卫星细胞是骨骼肌细胞的前体，能够产生卫星细胞或分化的骨骼肌细胞。它们是可以从肌肉组织中获得的前体细胞。它们有可能为其母体肌纤维提供额外的肌核，或恢复到静止状态。更具体地说，在激活后，卫星细胞可以重新进入细胞周期以增殖或分化成成肌细胞。肌卫星细胞一般位于肌纤维的基底膜及肌膜之间。肌卫星细胞通常表达许多独特的遗传标记。大多数卫星细胞表达PAX7及PAX3。
如本文所用，术语“脂肪祖细胞”或“脂肪组织(衍生)(脂肪)祖细胞”可与术语“脂肪干细胞”、“基质血管部分(stromal vascular fraction，SVF)细胞”或“脂肪组织衍生干细胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSC)”。这些术语包括成体干细胞的叙述，成体干细胞例如存在于脂肪组织或其他组织中，它们是多能的并且可以自我更新并且能够产生脂肪细胞样细胞，例如脂肪组织细胞。术语“脂肪祖细胞”也可以称为“脂肪细胞祖细胞”。例如，可以从牛皮下脂肪组织中分离牛基质血管细胞，将其切碎成小块并进行胶原酶消化。然后可以通过离心回收基质血管细胞并进行培养。在数个实施例中，脂肪祖细胞是牛脂肪组织衍生的(脂肪)祖细胞。这样的祖细胞可以被遗传修饰或不被遗传修饰。在数个其他实施例中，脂肪(脂肪组织)祖细胞衍生于除脂肪组织之外的组织。
如本文所用，术语“蛋白质水解物”(protein hydrolysate)包括指通过数个蛋白质的酸、酶或其他水解衍生的一蛋白质的一消化物，所述数个蛋白质包括植物蛋白质，例如大豆蛋白质，并且包含组成氨基酸残基以及不同大小的肽而代表源蛋白质。
如本文所用，术语“生物胺”(biogenic amine)包括提及含有一或多个胺基的生物分子。包含在此群组的生物胺包括单胺(monoamines)及多胺(polyamines)。单胺的群组中包括乙醇胺(ethanolamine)，多胺的群组中包括胍丁胺(agmatine)、尸胺(cadaverine)、腐胺(putrescine)、精胺(spermine)及亚精胺(spermidine)。优选地，在本发明的培养基中使用至少两种生物胺，例如至少精胺及亚精胺。
如本文所用，术语“铁”包括指含铁的盐，例如硝酸铁及硫酸亚铁。
如本文所用，术语“生长因子”包括一生物分子的叙述，即调节细胞功能方面例如存活及增殖的蛋白质。在所述蛋白质的群组中，包括FGF(例如FGF2或碱性FGF)、IL-6、VEGF、IGF(例如IGF1)、HGF及PDGF(例如PDGF-BB)。优选地，本文提到的生长因子及/或激素是人类衍生的，并且优选地是重组产生的。一般而言，当提及作为蛋白质的生长因子、激素或附着因子时，此类蛋白质可以是野生型蛋白质或与其野生型等同物(例如其人野生型)相比发生突变或以其他方式修饰的一蛋白质。
如本文所用，术语“附着因子”(attachment factor)包括一结构蛋白的叙述，更优选为一糖蛋白(glycoprotein)。糖蛋白的群组包括纤连蛋白(fibronectin)及层粘连蛋白(laminin)。这样的附着因子可以包含在本发明的一无血清培养基中。
如本文所用，术语“来源/源”(source of)包括对作为所述培养基组分的前体提供或作为培养基组分本身提供的培养基组分的叙述。本领域技术人员非常了解本文所述的培养基组分的合适前体。例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine)或谷氨酰胺(glutamine)可用作谷氨酰胺源，α-亚麻酸(α-linolenic acid)可用作脂肪酸源，葡萄糖可用作葡萄糖源。
本发明的无血清培养基
本发明提供了一种用于培养一牛祖细胞的一无血清培养基，包括一白蛋白；一成纤维细胞生长因子(FGF)。或者，本发明提供用于培养一牛祖细胞的一无血清培养基，包含一白蛋白；及如本文所述的一或多种生长因子及/或细胞因子，优选为至少成纤维细胞生长因子(FGF)。成纤维细胞生长因子(FGF)优选为人FGF，更优选为人FGF碱性(FGFb，也称为FGF2)，甚至更优选为人重组FGF碱性，例如来自R&D Systems的233-FB。优选地，所述白蛋白是一人白蛋白，例如一重组人白蛋白，例如从Biorbyt(orb419911)获得。所述白蛋白可以0.01-100g/l、优选为0.01-50g/l、更优选为0.1-10g/l、更优选为0.5-5g/l、例如约5g/l的浓度存在于培养基中。所述FGF可以0.1-1000μg/l、优选为1-100μg/l、更优选为5-50μg/l、甚至更优选为约10μg/l的浓度存在于培养基中。
这种无血清培养基可以有益地用于培养，更具体地用于牛祖细胞的增殖(扩增)。其中，已确定尤其是一白蛋白及一成纤维细胞生长因子(FGF)的存在提供了改善的牛祖细胞增殖率(图4)。已经确定，使用本发明的无血清培养基，可以实现与含血清培养基相当的生长速率(图3)。或者，本发明的无血清培养基可用于羊或猪祖细胞的培养，更具体地可用于羊或猪祖细胞的增殖(扩增)。
优选地，本发明的一无血清培养基还包含一蛋白水解物，优选为一植物蛋白水解物，更优选为一大豆蛋白水解物。已确定一蛋白质水解物的存在会增加牛祖细胞的生长速率(图5)。可以使用的大豆蛋白水解物的一范例是大豆水解物UF溶液50X(Sigma Aldrich58903C)，它是大豆的超滤酶消化物。它是用250.0g/L大豆水解物超滤液在细胞培养级水中制备的，并经过无菌过滤。蛋白质水解物在培养基中的浓度可以为0-20％(w/v)，优选为0.001-10％(w/v)，更优选为0.01-1％(w/v)，甚至更优选为0-0.25％(w/v)或0.01-0.25％(w/v)，甚至更优选为0-0.1％(w/v)或0.01-0.1％(w/v)，最优选为约0.05％(w/v)。
优选地，本发明的一无血清培养基还包含一生物胺，例如一单胺或一多胺，包括乙醇胺、腐胺、亚精胺及/或精胺。已经确定，一或多种生物胺的存在会增加肌肉组织衍生祖细胞(图5)及脂肪组织(衍生)(脂肪)祖细胞(图6)的生长速率。最优选地，所述生物胺是乙醇胺或亚精胺，或至少精胺及亚精胺的一组合。所述生物胺可以0-10mg/l，更优选为2-5mg/l或6-10mg/l，最优选为约2或5mg/l的浓度存在于培养基中。当本文公开的蛋白质水解物及本文公开的生物胺都存在于本发明的一无血清培养基中时，这是特别有利的。
优选地，本发明的一无血清培养基还包含一或多种维生素及/或激素，优选为抗坏血酸或其一衍生物(例如L-抗坏血酸2-磷酸(L-ascorbic acid 2-phosphate))、胰岛素、生长激素(somatotropin)及氢化可的松(hydrocortisone)中的一者或多者。优选地，激素(包括胰岛素、生长激素及氢化可的松)是动物激素，优选为哺乳动物激素，更优选为人或牛激素，例如人氢化可的松(来自Sigma Aldrich的H6909)、重组牛生长激素蛋白(来自Abcam的ab123464)，及重组人胰岛素(来自Sigma Aldrich的91077C)。更优选地，所有抗坏血酸或其一衍生物(例如L-抗坏血酸2-磷酸(L-ascorbic acid 2-phosphate)(A8960))、胰岛素、生长激素及氢化可的松都存在于本发明的一无血清培养基中。抗坏血酸或其一衍生物(例如L-抗坏血酸2-磷酸(L-ascorbic acid 2-phosphate))可以0.01-10000mg/l、优选以1-500mg/l、更优选以约50mg/l的浓度存在于所述培养基中。胰岛素可以0.1-100mg/l、优选以5-75mg/l、更优选以约10mg/l的浓度存在于所述培养基中。生长激素可以0.01-200μg/l、优选以0.1-20μg/l、更优选以约2μg/l的浓度存在于所述培养基中。氢化可的松可以0.01-1000μg/l、优选以1-500μg/l、更优选以约36μg/l的浓度存在于所述培养基中。本文公开的一或多种维生素及/或激素优选为与本文公开的所述蛋白质水解物及本文公开的所述生物胺一起存在于本发明的一无血清培养基中。
优选地，本发明的一无血清培养基还包含一葡萄糖源、一谷氨酰胺源及/或一铁源或一铁转运体。优选的葡萄糖源包括葡萄糖，优选的谷氨酰胺源包括谷氨酰胺，并且优选的铁转运体是转铁蛋白(transferrin)。葡萄糖源可以0.01-75g/l、更优选以0.1-4.5g/l的浓度存在于所述培养基中。谷氨酰胺源可以0.01-100mM、更优选以0.1-8mM、例如约2mM的浓度存在于所述培养基中。铁转运体可以0.1-75mg/ml、优选以1-10mg/l、更优选以约5.5mg/l的浓度存在于所述培养基中。所述葡萄糖源、所述谷氨酰胺源及所述铁源或铁转运体优选为与本文公开的所述蛋白质水解物、本文公开的所述生物胺及如本文所公开的所述维生素及/或激素。
优选地，本发明的一无血清培养基还包含一或多种细胞因子及/或生长因子。这样的细胞因子及/或生长因子优选选自PDGF、IGF、VEGF、HGF、FGF及IL-6。所有细胞因子及/或生长因子优选为人蛋白，更优选为重组人蛋白，例如重组人PDGF(例如来自R&D Systems的220-BB)、重组人IGF(例如来自R&D Systems的291-G1)、重组人HGF(例如来自R&D Systems的294-HG)、重组人VEGF(例如来自R&D Systems的293-VE)、重组人FGF(例如来自R&DSystems的233-FB)及重组人IL-6(例如来自R&D Systems的206-IL)。优选地，所述PDGF是一PDGF-BB。优选地，所述IGF是一IGF1。优选地，所述IGF是一人IGF1。优选地，所述PDGF是一人PDGF-BB。优选地，所述FGF是一人FGF2，也称为bFGF。优选地，所有PDGF、IGF、VEGF、HGF、FGF及IL-6都存在于本发明的一无血清培养基中。或者，IL-6及IGF是可选的，以及PDGF、VEGF、HGF及FGF存在于本发明的一无血清培养基中。所述PDGF可以0.1-1000μg/l、优选以1-100μg/l、更优选以约10μg/l的浓度存在于所述培养基中。所述IGF可以0-10000μg/l、优选以0-1000μg/l、更优选以约0-100μg/l的浓度存在于所述培养基中。所述VEGF可以0.1-1000μg/l、优选以1-100μg/l、更优选以约10μg/l的浓度存在于所述培养基中。所述HGF可以0.05-100μg/l、优选以0.5-50μg/l、更优选以约5μg/l的浓度存在于所述培养基中。所述IL-6可以0.05-100μg/l、优选以0.5-50μg/l、更优选以约5μg/l的浓度存在于所述培养基中。本文公开的一或多种细胞因子及/或生长因子优选与本文公开的所述蛋白质水解物、本文公开的所述生物胺、本文公开的所述维生素及/或激素、本文公开的所述葡萄糖源、所述谷氨酰胺源及所述铁源或铁转运体一起存在于本发明的一无血清培养基中。
优选地，本发明的一无血清培养基还包含脂肪酸源。优选的脂肪酸源包括α-亚麻酸(例如来自Sigma Aldrich的L2376)。脂肪酸源可以0.01-100mg/l、更优选以0.1-10mg/l、更优选以约1mg/l的浓度存在于所述培养基中。本文公开的脂肪酸源优选与本文公开的所述蛋白质水解物、本文公开的所述生物胺、本文公开的所述维生素及/或激素、本文所公开的葡萄糖源、所述谷氨酰胺源及所述铁源或铁转运体以及所述一或多种细胞因子及/或生长因子一起存在于本发明的一无血清培养基中。
优选地，本发明的一无血清培养基还包含基础培养基，优选为一液体或粉末状基础培养基。优选地，这种基础培养基包含(i)DMEM及/或汉姆氏F12培养基，优选为DMEM及汉姆氏F12培养基，例如分别为1:10至10:1的比率，更优选为1:1的比率，(ii)RPMI培养基及/或(iii)α-MEM(也称为最低必需培养基α、MEM alpha、MEMα或AlphaMEM)培养基。本领域技术人员非常了解这种介质并且知道如何获得它们。本文公开的基础培养基优选与本文公开的所述蛋白质水解物、本文公开的所述生物胺、本文公开的所述维生素及/或激素、所述葡萄糖源、所述谷氨酰胺源、及本文公开的所述铁源或铁转运体、本文公开的所述一或多种细胞因子及/或生长因子及本文公开的所述脂肪酸源一起存在于本发明的一无血清培养基中。本领域技术人员理解基础培养基本身可能已经包含如本文公开的无血清培养基的一些组分或成分，这意味着如果这些组分或成分已经包含在基础培养基中，则可以省略添加这些组分或成分。
优选地，本发明的一无血清培养基还包含亚硒酸钠(sodium selenite)。如本文所公开的亚硒酸钠(例如来自Sigma Aldrich的S5261)优选与如本文所公开的所述蛋白质水解物、如本文所公开的所述生物胺、如所公开的所述维生素及/或激素、所述葡萄糖源、所述谷氨酰胺源、及如本文所公开的所述铁源或铁转运体、如本文所公开的所述一或多种细胞因子及/或生长因子、如本文所公开的所述脂肪酸源及如本文所公开的所述基础介质一起存在于本发明的无血清培养基中。亚硒酸钠可以0.01-1000μg/l、优选以0.1-100μg/l、更优选以1-50或1-100μg/l、最优选以约6.7μg/l的浓度存在于无血清培养基中。
优选地，在本发明的无血清培养基中，所有组分都不是从动物材料中获得的，因此是非动物性的(例如重组产生的)。
优选地，本发明的一无血清培养基是用于一祖细胞增殖的一无血清培养基。
本发明还提供了一种组合物，其包含本发明的一无血清培养基及一牛(bovine)(或绵羊(ovine)或猪(porcine))祖细胞，优选为一牛(或绵羊或猪)肌肉组织衍生的祖细胞(例如肌卫星细胞)或脂肪组织(衍生)(脂肪)祖细胞。所述组合物可以是一细胞培养物。
本发明还提供了一种用于培养一牛祖细胞的一无血清培养基，其包含白蛋白(约5mg/ml)、生长激素(约2ng/ml)、L-抗坏血酸2-磷酸盐(约50μg/ml)，氢化可的松(约36ng/ml)、α-亚麻酸(约1μg/ml)、胰岛素(约10μg/ml)、转铁蛋白(约5.5μg/ml)、亚硒酸钠(约0.0067μg/ml)、乙醇胺(约2μg/ml)、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine)或谷氨酰胺(glutamine)(约2mM)、IL-6(约5ng/ml)、FGF2(也称为bFGF)(约10ng/ml)、IGF1(约100ng/ml)、VEGF(约10ng/ml)、HGF(约5ng/ml)、PDGF-BB(约10ng/ml)及DMEM/F12基础培养基。所述无血清培养基可以任选地进一步包含(i)一植物蛋白水解物(例如本文所述的一大豆蛋白水解物)及/或(ii)本文所述的一或多种生物源单胺或多胺，包括乙醇胺、腐胺、亚精胺及精胺中的一者或多者，优选为至少亚精胺及精胺。此外，所述无血清培养基可以含有一或多种附着蛋白，例如纤连蛋白。
本发明还提供了生产根据前述权利要求中任一项所述的培养基的方法，包括以下步骤：将与本发明的无血清培养基相关的实施例中任一项所述的培养基组分添加到基础培养基中。
培养数个祖细胞的数个方法
本发明还提供了一种培养一牛祖细胞的方法，包括以下步骤：在本发明的一无血清培养基中培养一牛祖细胞。
优选地，所述祖细胞是一未经遗传修饰的细胞，或者是一经遗传修饰的细胞。优选地，所述祖细胞是一牛、绵羊或猪祖细胞，优选为一牛、绵羊或猪肌肉组织衍生的祖细胞或一牛、绵羊或猪脂肪组织衍生的祖细胞。
如本文所述的祖细胞的示例性培养条件如下。牛祖细胞，例如肌肉组织衍生的祖细胞或脂肪组织衍生的祖细胞，以3000-5000个细胞/cm2的密度接种在一合适的细胞培养容器中的本发明的一无血清培养基中。上述细胞培养容器可以预涂有一涂层，例如但不限于胶原蛋白。所述数个细胞可以在达到90％汇合度(confluency)时进行细胞传代(passaged)。简而言之，可以用磷酸盐缓冲盐水(PBS，20012027，来自ThermoFischerScientific)冲洗细胞一次，然后加入胰蛋白酶(25200072，来自ThermoFischerScientific)。一旦细胞分离，可以通过添加来自Glycine max的胰蛋白酶抑制剂(来自Sigma Aldrich的T6522)中及胰蛋白酶，将细胞收集到PBS中并以350g离心。可以吸出上清液并根据需要重新悬浮细胞沉淀。然后可以将细胞保持在37℃的95％空气/5％CO2湿润环境(humidified atmosphere)中。
本发明还提供了本发明的一无血清培养基用于培养一祖细胞(例如牛、绵羊或猪祖细胞)的一用途。
以下编号的实施例也是本发明的一部分：
1、一种用于培养一祖细胞的无血清培养基，包括：
一白蛋白；及
一成纤维细胞生长因子(FGF)。
2、根据实施例1的无血清培养基，进一步包含一蛋白质水解物，优选为一大豆蛋白质水解物。
3、根据实施例1或实施例2所述的无血清培养基，进一步包含一生物胺，优选为一乙醇胺(ethanolamine)、腐胺(putrescine)、亚精胺(spermidine)及/或精胺(spermine)。
4、根据实施例1-3中任一项所述的无血清培养基，进一步包含一或多种维生素及/或激素，优选为抗坏血酸(ascorbic acid)或其一衍生物、胰岛素、生长激素(somatotropin)及氢化可的松(hydrocortisone)中的一者或多者。
5、根据实施例1-4中任一项所述的无血清培养基，进一步包含一葡萄糖源、一谷氨酰胺源(source of glutamine)及一铁源或一铁转运体(iron transporter)。
6、根据实施例5所述的无血清培养基，其中所述铁转运体是转铁蛋白(transferrin)。
7、根据实施例5或实施例6所述的无血清培养基，其中谷氨酰胺源包括谷氨酰胺及/或其中葡萄糖源包括葡萄糖。
8、根据实施例1-7中任一项所述的无血清培养基，进一步包含一或多种的细胞因子及/或生长因子，所述一或多种的细胞因子及/或生长因子选自一PDGF、一IGF、一VEGF、一HGF及一IL-6。
9、根据实施例1-8中任一项所述的无血清培养基，进一步包含一脂肪酸源。
10、根据实施例9的无血清培养基，其中所述脂肪酸源包括α-亚麻酸(α-linolenicacid)。
11、根据实施例1-10中任一项所述的无血清培养基，进一步包含一基础培养基，优选为一液体基础培养基，例如一液体最低必需培养基。
12、根据实施例11所述的无血清培养基，其中基础培养基包含(i)DMEM及/或汉姆氏F12培养基，优选为DMEM及汉姆氏F12培养基，例如分别地为1:10至10:1的比例，更多优选为1:1的比例；(ii)RPMI培养基；及/或(iii)α-MEM培养基。
13、根据实施例1-12中任一项所述的无血清培养基，进一步包含亚硒酸钠(sodiumselenite)。
14、根据实施例1-13中任一项所述的无血清培养基，其中所述白蛋白是一人白蛋白，优选为一重组人白蛋白。
15、根据实施例1-14中任一项所述的无血清培养基，其中所述白蛋白、所述FGF、所述一或多种细胞因子及/或生长因子、所述一或多种维生素及/或激素、所述基础培养基、所述葡萄糖源、所述谷氨酰胺源、所述脂肪酸源、所述铁源或所述铁转运体、所述亚硒酸钠、所述蛋白质水解物、所述生物胺及/或所述附着因子(当存在所述附着因子时)，存在于一有效量中，以用于培养中的一祖细胞的增殖。
16、根据实施例1-15中任一项所述的无血清培养基，其中所有组分均为非动物性的。
17、一种组合物，包含如实施例1-16中任一项所定义的一培养基及一祖细胞，所述祖细胞优选为一牛、绵羊或猪肌肉组织(衍生)祖细胞或脂肪组织(衍生)祖细胞。
18、根据实施例1-16中任一项所述的制备介质的方法，包括以下步骤：
将如实施例1-16中任一项所定义的一培养基的所述数个组分添加到一基础培养基中。
19、一种用于培养一祖细胞的方法，包括以下步骤：在根据实施例1-16中任一项所述的一培养基中培养一祖细胞。
20、根据实施例19所述的培养方法，其中所述祖细胞是一未经遗传修饰的细胞，或者是一经遗传修饰的细胞。
21、根据实施例19或实施例20所述的培养方法，其中所述祖细胞是一牛、绵羊或猪肌肉(组织衍生)祖细胞或脂肪(组织衍生)祖细胞。
22、根据实施例1-16中任一项所述的培养基用于培养一祖细胞(优选为一牛、绵羊或猪肌肉(组织衍生)祖细胞或脂肪(组织衍生)祖细胞)的用途。
为了清楚及简明描述的目的，本文将特征描述为相同或分开的数个实施例的一部分，然而，应当理解，本公开包括具有所描述的所有或一些特征的数个组合的数个实施例。例如，在本发明的一培养方法或本发明的一组合物是指本发明的一无血清培养基的情况下，关于本发明的一无血清培养基描述的数个实施例也相关地公开于所述培养方法及所述组合物。
本文引用的文献的内容通过引用并入本文。
图例
图1
在本发明的无血清培养基中用作一碱基(base)的F10及DMEM/F12培养基的比较。牛肌肉祖细胞在基础培养基F10或DMEM/F12 1:1的胶原蛋白包被的96孔板中培养4天及7天(n＝3)。用增殖测定MTS试剂盒(Promega,CellTiter
Figure BDA0003771348930000271
AQueous One Solution CellProliferation Assay(MTS))测量细胞数量。
图2
与对照血清培养基相比，牛肌肉祖细胞在无血清培养基中以不同的生长因子组合培养4天时的生长情况。无血清培养基对照含有DMEM/F12 1:1，辅以1％青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)/两性霉素(amphotericin，PSA)、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine)、5μg/ml牛血清白蛋白(bovine serum albumin)、75ng/ml IL-6及5μg/l FGF。
含血清培养基对照含有DMEM/F12 1:1及20％FBS。
所测试的生长因子浓度为：100μg/l的IGF1、5μg/l的HGF、10μg/l的VEGF、10μg/l的PDGF-BB。
图3
牛肌肉祖细胞在含血清的生长培养基(对照GM)及本发明的无血清培养基(SFM1)中的长期增殖。测试的含血清生长培养基含有DMEM/F12+20％胎牛血清+5ng/ml bFGF+1％青霉素-链霉素-两性霉素B)，测试的无血清培养基(SFM1)含有：白蛋白(5mg/ml)、生长激素(2ng/ml)、L-抗坏血酸2-磷酸(50μg/ml)、氢化可的松(36ng/ml)、α-亚麻酸(1μg/ml)、胰岛素(10μg/ml)、转铁蛋白(5.5μg/ml)、亚硒酸钠(0.0067μg/ml)、乙醇胺(2μg/ml)、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或谷氨酰胺(2mM)、IL-6(5ng/ml)、FGF2(也称为bFGF)(10ng/ml)、IGF1(100ng/ml)、VEGF(10ng/ml)、HGF(5ng/ml)、PDGF-BB(10ng/ml)及DMEM/F12基础培养基。
细胞在涂有胶原蛋白的组织培养容器中培养数周，并在80％-90％汇合度时进行传代(passed)。在每次进行传代时，用countess自动细胞计数器对细胞进行计数。增殖显示在总人口倍增(population doublings，PDs)中。
图4
牛肌肉祖细胞在具有不同浓度的几种成分的无血清培养基(对照)中的生长。将细胞在胶原蛋白包被的96孔板中培养4天(n＝4)，其中含有不同浓度的以下成分：重组人白蛋白(2、1、0.5或0mg/ml)、来自牛血浆的纤连蛋白(fibronectin)(5、2、1或0μg/ml)，重组人IL-6(25、10、5、2或0ng/ml)、重组人胰岛素样生长因子1(25、10、5、2或0ng/ml)及重组成纤维细胞生长因子2(5、2、1或0ng/ml)。通过高内涵分析仪ImageXpress Pico自动细胞成像系统对细胞进行计数。显示出白蛋白及FGF的缺乏将导致牛肌肉祖细胞的生长高度降低。
图5
不同浓度的亚精胺及大豆水解物UF溶液形式的大豆水解物对牛肌卫星细胞增殖的影响。细胞在涂有不同浓度亚精胺(0、1、2、3、4、5或10μg/ml)及不同浓度大豆水解物(0、0.05、0.1、0.15、0.2及0.25％(w/v)。通过高含量分析仪ImageXpress Pico自动细胞成像系统对细胞进行计数。显示出亚精胺及大豆蛋白水解物可提高细胞生长速度。
图6
在含血清培养基或无血清培养基中添加或不添加多胺的情况下，脂肪组织祖细胞(即，基质血管部分细胞(stromal vascular fraction cells)(来自Bos taurus))的生长的短期培养比较。将细胞接种在48孔板中的含血清培养基(DMEM/F12+10％胎牛血清+2ng/ml bFGF)、无血清培养基(SFM1)或补充有1ug/ml亚精胺(spermidine，SPMD)及10ug/ml精胺(spermine，SPMN)。培养6天后，通过高含量分析仪ImageXpress Pico自动细胞成像系统对细胞进行计数。
图7
在基础培养基类型不同的本发明无血清培养基中短期培养均来自家牛(Bostaurus)的卫星细胞及脂肪组织祖细胞(即，基质血管部分细胞(stromal vascularfraction cells，SVF))。将细胞接种在本发明的无血清培养基中的胶原蛋白包被的96孔板中，其中包括不同的基础培养基(即1:10的RPMI培养基、α-MEM培养基、F12培养基及DMEM/F12培养基，1:1及10:1的比例)。培养6天后，通过高含量分析仪ImageXpress Pico自动细胞成像系统对细胞进行计数。
数个范例
范例1、本发明的一无血清培养基的生产
数个材料及数个方法
数个牛肌肉祖细胞从一牛肌肉组织(Bos taurus)中分离出来，并根据它们的CD29阳性表达进行分类，如前所述(Ding等人，Sci.Rep.，17(8):10808(2018))。
细胞在胶原蛋白包被的96孔板中以1:1的基础培养基DMEM/F12培养，补充有1％PSA、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5μg/ml牛血清白蛋白及5μg/l FGF(重组人蛋白FGF碱性(FGFb)，来自R&D Systems的233-FB)5天(n＝3)。所述培养基构成无血清对照，如图2的图例所示。对于基于血清的对照，DMEM/F12 1:1培养基补充了20％FBS。对于测试条件，培养基中添加了100μg/l的IGF1(人重组IGF(来自R&D Systems的291-G1))、5μg/l的HGF(重组人HGF(来自R&D Systems的294-HG))、单独或联合使用10μg/l的VEGF(重组人VEGF(来自R&DSystems的293-VE))及10μg/l的PDGF-BB(人重组PDGF(来自R&D Systems的220-BB))。进行了两水平的全因子实验设计(full factorial design of experiments，DoE)以测试其他生长因子的不同组合对牛肌肉祖细胞增殖的影响。细胞在37℃、5％CO2下培养4天。4天后，它们用2％的多聚甲醛固定并用Hoechst染色法染色。使用高内涵分析仪ImageXpress Pico自动细胞成像系统确定每孔的细胞数量。进行统计分析(JMP软件)以研究测试的生长因子(IGF1、HGF、VEGF及PDGF-BB)之间的主效应及相互作用效应。
结果
与含血清的对照相比，细胞的相对(以百分比表示)生长如图2所示。这些结果的统计分析显示IGF1及VEGF添加的显着正效应以及IGF1与HGF的正协同作用。添加了100μg/l的IGF1、5μg/l的HGF、10μg/l的VEGF及10μg/l的PDGF-BB的无血清培养基与含有血清的对照及与无血清对照(仅含有5ng/mL FGF及75ng/ml IL-6作为生长因子)相比，生长增加了4.7倍。
范例2、在本发明的一培养基中培养一肌肉祖细胞。
数个材料及数个方法
数个牛肌肉祖细胞从一牛肌肉组织(Bos taurus)中分离出来，并根据它们的CD29阳性表达进行分类，如前所述(Ding等人，Sci.Rep.，17(8):10808(2018))。
在一适当的胶原蛋白涂层细胞培养容器中，数个肌肉祖细胞以3000-5000个细胞/cm2的密度接种在本发明的无血清培养基(即，SFM1培养基)或含血清培养基(补充有20％胎牛血清、5ug/ml的DMEM/F12 bFGF及2mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)中。细胞在达到90％汇合度后进行传代。简而言之，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS，20012027，来自ThermoFischerScientific)冲洗一次，然后加入胰蛋白酶(25200072，来自ThermoFischer Scientific)。一旦细胞分离，通过添加来自Glycine max的胰蛋白酶抑制剂(来自Sigma Aldrich的T6522)中及胰蛋白酶，将细胞收集到PBS中并以350g离心。吸出上清液并根据需要重新悬浮细胞沉淀。细胞保持在37℃的95％空气/5％CO2湿润环境(humidified atmosphere)中。
结果
在含血清培养基中培养的肌肉祖细胞具有随时间降低的初始较高生长速率，而无血清生长的细胞具有较低生长速率，但保持相对恒定(更稳定)。随着时间的推移，两种培养基中细胞的总生长是相当的。参见图3所示。
范例3、在具有不同基础培养基的本发明的一无血清培养基中培养数个卫星细胞及数个脂肪组织祖细胞。
数个材料及数个方法
将数个卫星细胞及数个脂肪组织祖细胞(例如均来自家牛(Bos taurus)的基质血管部分(stromal vascular fraction，SVF)细胞)接种在胶原蛋白包被的96孔板中，并在本发明的无血清培养基中在37℃的95％空气/5％CO2湿润环境中培养6天，本发明的无血清培养基由白蛋白(5mg/ml)、生长激素(2ng/ml)、L-抗坏血酸2-磷酸(L-Ascorbic acid 2-phosphate)(50μg/ml)、氢化可的松(36ng/ml)、α-亚麻酸(1μg/ml)、胰岛素(10μg/ml)、转铁蛋白(5.5μg/ml)、亚硒酸钠(0.0067μg/ml)、乙醇胺(2μg/ml)、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或谷氨酰胺(2mM)、IL-6(5ng/ml)、FGF2(也称为bFGF)(10ng/ml)、IGF1(100ng/ml)、VEGF(10ng/ml)、HGF(5ng/ml)、PDGF-BB(10ng/ml)所组成，并使用不同的基础培养基(即RPMI培养基(11875093，Thermo Fischer Scientific)、α-MEM培养基(12561056，Thermo FischerScientific)、F12培养基(11765054，Thermo Fischer Scientific)、均使用上述F12及DMEM(A1443001，Thermo Fischer Scientific)制成的DMEM/F12 1:1培养基、DMEM/F12 10:1培养基及DMEM/F12 1:10培养基)。培养6天后，通过高含量分析仪ImageXpress Pico自动细胞成像系统对细胞进行计数。通过将某种培养基中的细胞数除以天数并标准化为对照(DMEM：F12中的生长)来计算相对生长速率。
结果
观察到，数个卫星细胞及数个脂肪组织祖细胞的有利生长(增殖)速率是用包含一系列不同基础培养基的本发明的一无血清培养基实现的，并且此类细胞的生长(增殖)速率不取决于一特定的基础培养基(图7)。

Claims (19)

1.一种培养一牛祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
在用于培养一牛祖细胞的一无血清培养基中培养一牛祖细胞，
其中所述无血清培养基包含：
一白蛋白；及
一成纤维细胞生长因子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无血清培养基进一步包含：
一或多种维生素及/或激素，选自由抗坏血酸或其一衍生物、一胰岛素、一生长激素及一氢化可的松所组成的群组；及
一或多种细胞因子及/或生长因子，选自由一血小板衍生生长因子、一胰岛素样生长因子、一血管内皮生长因子、一肝细胞生长因子及一白细胞介素6所组成的群组。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述无血清培养基包含以下以作为所述一或多种细胞因子及/或生长因子：
一白细胞介素6；
一白细胞介素6及一胰岛素样生长因子；
一白细胞介素6、一胰岛素样生长因子及一肝细胞生长因子；
一白细胞介素6、一胰岛素样生长因子、一肝细胞生长因子及一血小板衍生生长因子；
一白细胞介素6、一胰岛素样生长因子及一血管内皮生长因子；
一白细胞介素6、一胰岛素样生长因子及一血小板衍生生长因子；
一白细胞介素6、一血小板衍生生长因子及一血管内皮生长因子；
一白细胞介素6、一胰岛素样生长因子、一血小板衍生生长因子及一血管内皮生长因子；或者
一白细胞介素6、一胰岛素样生长因子、一肝细胞生长因子、一血小板衍生生长因子及一血管内皮生长因子。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述无血清培养基包含：
抗坏血酸或其一衍生物；一胰岛素；一生长激素；及一氢化可的松；以及
一血小板衍生生长因子、一血管内皮生长因子、一肝细胞生长因子、一胰岛素样生长因子及一白细胞介素6。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述无血清培养基进一步包含：
一基础培养基；
一葡萄糖源；
一谷氨酰胺源；
一脂肪酸源；
一铁源或一铁转运体；及/或
亚硒酸钠。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基础培养基包括(i)DMEM及/或汉姆氏F12培养基，优选为DMEM及汉姆氏F12培养基，例如分别1:10至10:1的比例，更优选为分别1：1的比例，(ii)RPMI培养基及/或(iii)α-MEM培养基。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸源包括α-亚麻酸。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述无血清培养基还包含一蛋白质水解物，优选为一大豆蛋白质水解物。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述无血清培养基还包含一生物胺，优选为一乙醇胺、腐胺、亚精胺及/或精胺。
10.一种培养一牛祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
在用于培养一牛祖细胞的一无血清培养基中培养一牛祖细胞，
其中所述无血清培养基包含：
一白蛋白；
一成纤维细胞生长因子；
一或多种维生素及/或激素，选自由抗坏血酸或其一衍生物、一胰岛素、一生长激素及一氢化可的松所组成的群组；
一或多种细胞因子及/或生长因子，选自由一血小板衍生生长因子、一胰岛素样生长因子、一血管内皮生长因子、一肝细胞生长因子及一白细胞介素6所组成的群组；
一基础培养基；
一葡萄糖源；
一谷氨酰胺源；
一脂肪酸源；
一铁源或一铁转运体；及
亚硒酸钠；
及可选地一蛋白质水解物、一生物胺及/或一附着因子。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述白蛋白、所述成纤维细胞生长因子、所述一或多种细胞因子及/或生长因子、所述一或多种维生素及/或激素、所述基础培养基、所述葡萄糖源，所述谷氨酰胺源、所述脂肪酸源、所述铁源或所述铁转运体源、所述亚硒酸钠、所述蛋白质水解物、所述生物胺及/或所述附着因子，存在于一有效量中，以用于培养中的一牛祖细胞的增殖。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述无血清培养基是用于一牛祖细胞的增殖的一无血清培养基。
13.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含如前述权利要求中任一项所定义的一无血清培养基及一牛祖细胞。
14.一种用于培养一牛祖细胞的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基包括：
一白蛋白；及
一成纤维细胞生长因子。
15.如权利要求14所述的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基进一步包含：
一白细胞介素6。
16.如权利要求14或15所述的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基如权利要求2至12中任一项所定义。
17.如权利要求14至16中任一项所述的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基进一步包含：
一蛋白质水解物，优选为一大豆蛋白质水解物；
一基础培养基，包含DMEM及汉姆氏F12培养基；
一生长激素；
一氢化可的松；
精胺；及/或
亚精胺。
18.如权利要求1至12中任一项所述的方法、或如权利要求13所述的组合物、或如权利要求14至17中任一项所述的无血清培养基，其特征在于，所述牛祖细胞是一牛肌肉祖细胞或一牛脂肪祖细胞。
19.如权利要求14至17中任一项所述的无血清培养基在生产供人类消费的一基于细胞培养的肉制品中的用途。
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