JP2023521273A - ウシ前駆細胞を培養する為の無血清培地 - Google Patents

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Abstract

ウシ前駆細胞を培養する方法であって、ウシ前駆細胞を培養する為の無血清培地中でウシ前駆細胞を培養する工程を含み、ここで、前記無血清培地が、アルブミン、及び線維芽細胞成長因子（FGF）を含む上記方法。【選択図】なし

Description

本発明の分野
本発明は、動物細胞培養の為の無血清培地、より特には、ウシ前駆細胞、例えば（骨格）筋組織由来前駆細胞及び脂肪組織由来前駆細胞を包含するウシ前駆細胞、を培養する方法において用いる為の無血清培地、の分野である。本発明はまた、本発明の培地を用いてウシ前駆細胞を培養する方法に関する。より特には、本発明の無血清培地は、そのような前駆細胞の増殖（proliferation）（拡大（expansion））に用いられることができる。
種々の由来の血清は、動物細胞培地中の必須成分として用いられてきたが、これは、他の成分の中で、複数の重要な栄養素、ビタミン、成長因子（growth factors）及び接着タンパク質を提供するためである。しかしながら、血清は、汚染物質、例えば、細菌、マイコプラズマ、ウイルス及びプリオン、の潜在源であり、プリオンは、ヒト、及び血清が最も多く得られる他の動物、例えばウシ、における感染性神経変性疾患の作用物質であることから、より最近の関心事になっている。これらの考慮すべき事柄は、特に動物細胞型が食品用途、例えば、細胞培養ベースのヒト食用食肉製造（cell culture-based meat production for human consumption）、の為に培養されるときに重要な役割を果たす。
更に、血清は、バイオプロセスに高いコストを示し、血清のロット間のばらつきを考慮すると、性能にばらつきをもたらす。細胞培養用途に血清が用いられる場合、動物の幸福は更なる関心事になっている。
それ故に、細胞培養の用途において、血清の使用を避けつつ（すなわち、無血清培地を使用して）、好ましくは血清含有培地の細胞増殖と同程度の、細胞増殖の点から許容可能な性能、例えば細胞成長率（cell growth rate）又は寿命（総細胞倍加数）、を達成することが必要とされている。
特に、細胞培養ベースのヒト食用食肉製造では、ウシ筋組織由来前駆細胞及びウシ脂肪組織由来前駆細胞を分化させずに増殖させることができる無血清培地が求められている。このように増殖させた前駆細胞集団は、その後、分化培地中で培養し、細胞培養ベースのヒト食用食肉製品に取り込むことが可能な筋細胞及び筋線維又は脂肪組織細胞に該前駆細胞を分化させることができる。残念ながら、ウシ前駆細胞の増殖の為の無血清培地の提供は現在限られており、入手可能な培地の性能は不十分であることが多い。
本発明の概要
本発明者等は、ヒト以外の哺乳類前駆細胞、特にウシ前駆細胞、例えばウシ筋組織由来前駆細胞（bovine muscle tissue-derived progenitor cells）及びウシ脂肪組織由来前駆細胞（bovine adipose tissue-derived progenitor cells）、の培養及び増殖（proliferation）（拡大（expansion））に用いることができる無血清培地を見いだした。
それ故に、本発明は、第１の観点において、ウシ前駆細胞を培養する方法であって、ウシ前駆細胞を培養する為の無血清培地中でウシ前駆細胞を培養する工程を含み、ここで、該無血清培地が、アルブミン及び線維芽細胞成長因子（FGF：fibroblast growth factor）を含む、上記の培養方法を提供する。
同様に、本発明は、ウシ前駆細胞を培養する為の無血清培地であって、アルブミン及び線維芽細胞成長因子（FGF）を含む該無血清培地を提供する。
本発明者等の知見の一つは、ウシ前駆細胞が、増殖（proliferation）（拡大（expansion））目的で無血清培養されるとき、アルブミン及び線維芽細胞成長因子の存在に強く依存することである。図4は、無血清培地中のアルブミン及びFGFの存在しない状態が、ウシ前駆細胞の増殖率に強く影響することを示す。これは、新しい洞察である。
同様に、本発明はまた、ウシ前駆細胞を培養する為の無血清培地であって、アルブミン；並びに本明細書に記載されている成長因子及び／又はサイトカイン、好ましくは線維芽細胞成長因子（FGF）、を含む無血清培地を提供する。
本発明者等の別の重要な成果は、前駆細胞、特にウシ前駆細胞、の増殖に使用することができる無血清培地を化学的に定義することができたことであった。本発明の無血清培地の利点は、血清を含まないことであり、好ましくは、動物成分をまた含まないことである。そのような無血清培地は、生存細胞培養ベースの食肉製品を得る為に必要とされる血清を含む培地よりも有意に低いコストで製造されることができる。更に、予想外にも、本発明の無血清培地におけるウシ前駆細胞の成長（曲線）は、血清含有培地における該細胞の成長率が、細胞成長が停止するまで、徐々に減少するため、血清含有培地における該細胞の成長（曲線）よりも安定していることが立証された（図3を参照）。図3はまた、本発明の無血清培地におけるウシ前駆細胞の成長率が効果的であり、少なくとも、血清含有培地を用いて達成されたものと同程度であることを示している。更に、実験データは、細胞培養ベースのヒト食用食肉製造に用いられるウシ前駆細胞が、培地成分の一定の濃度範囲において良好な性能を示すことを示す（図2及び4）。
それ故に、本発明の無血清培地の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の好ましい実施態様において、該培地は更に、アスコルビン酸又はその誘導体、インスリン、ソマトトロピン及びヒドロコルチゾンからなる群より選択されるビタミン及び／又はホルモンのうちの１以上；並びに、血小板由来成長因子（PDGF：platelet-derived growth factor）、インスリン様成長因子（IGF：insulin-like growth factor）、血管内皮成長因子（VEGF：vascular endothelial growth factor）、肝細胞成長因子（HGF：hepatocyte growth factor）及びインターロイキン6（IL-6：interleukin 6）からなる群より選択される１以上のサイトカイン及び／又は成長因子を含む。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、該培地は更に、アスコルビン酸若しくはその誘導体、インスリン、ソマトトロピン及びヒドロコルチゾンからなる群より選択されるビタミン及び／又はホルモンのうちの１以上；及び／又は、血小板由来成長因子（PDGF）、インスリン様成長因子（IGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、肝細胞成長因子（HGF）及びインターロイキン6（IL-6）からなる群より選択される１以上のサイトカイン及び／又は成長因子を含む。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、該無血清培地は、該１以上のサイトカイン及び／又は成長因子として、IL-6；IL-6及びIGF；IL-6、IGF及びHGF；IL-6、IGF、HGF及びPDGF；IL-6、IGF及びVEGF；IL-6、IGF及びPDGF；IL-6、PDGF及びVEGF；IL-6、IGF、PDGF及びVEGF；又はIL-6、IGF、HGF、PDGF及びVEGFを含む。好ましくは、本発明の無血清培地中に含む該１以上のサイトカイン及び／又は成長因子は、少なくとも、FGF；FGF+IL-6、FGF+IGF、FGF+HGF、FGF+PDGF、FGF+VEGFであり、より好ましくは、少なくとも、FGF+IL-6+IGF+HGF、又はFGF+IL-6+IGF+VEGF+PDGFであり、最も好ましくは、FGF+IL-6+IGF+VEGF、又はFGF+IL-6+IGF+HGF、又はFGF+IL-6+IGF1+HGF+PDGF+VEGFである。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、該培地は、アスコルビン酸又はその誘導体；インスリン；ソマトトロピン；及びヒドロコルチゾン；並びに、任意的にIGF及び／又はIL-6と組み合わせられていてもよい、PDGF、VEGF及びHGFを更に含む。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、該培地は、アスコルビン酸若しくはその誘導体；インスリン；ソマトトロピン；及びヒドロコルチゾン；及び／又は、任意的にIGF及び／又はIL-6と組み合わせられていてもよい、PDGF、VEGF及びHGFを更に含む。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、該培地は、アスコルビン酸又はその誘導体；インスリン；ソマトトロピン；及びヒドロコルチゾン；並びにPDGF、VEGF、HGF、IGF及びIL-6を更に含む。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、該培地は更に、基礎培地；グルコース源（それは、該基礎培地の形態で用意されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；グルタミン源（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；脂肪酸源（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；鉄源又は鉄輸送体（それらは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；及び亜セレン酸ナトリウム（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））を含む。代替的には、該培地は更に、基礎培地；グルコース源（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；グルタミン源（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；脂肪酸源（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；鉄源又は鉄輸送体（それらは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；及び亜セレン酸ナトリウム（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））のうちの１以上を含みうる。好ましくは、該無血清培地は、少なくとも基礎培地を含み、好ましくは更に、グルコース源、グルタミン源及び脂肪酸源を含み、好ましくは、これらに加えて、鉄源若しくは鉄輸送体及び／又は亜セレン酸ナトリウムを含む。
好ましくは、本発明の無血清培地は、グルコース源及び／又はグルタミン源を既に含んでいてもよい基礎培地を含み、及び任意的に、脂肪酸源、鉄源若しくは鉄輸送体、及び／又は亜セレン酸ナトリウムをまた含んでいてもよい。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、基礎培地が存在する場合、該基礎培地は、DMEM及び／又はハムF12培地（Ham's F12 medium）を含み、好ましくは、DMEM及びハムF12培地をそれぞれ、例えば1:10～10:1、より好ましくは1:1、の比で含む。図1は、DMEMとハムF12培地の両方を含む基礎培地が特に良好に機能することを示す。図7は、RPMI又はアルファ-MEMを含む基礎培地がまた良好に機能し、これはDMEM／F12を含む基礎培地が種々の比により供給される場合にまた同様であることを示す。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、脂肪酸源が存在する場合、該脂肪酸源はα-リノレン酸を含む。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、該培地は更に、タンパク質加水分解物を含み、好ましくは大豆タンパク質加水分解物を含む。予想外にも、タンパク質加水分解物、例えば大豆タンパク質加水分解物、を無血清成長培地に添加することにより、ウシ前駆細胞の成長率を向上させることが立証された（図5）。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、該培地は更に、生体アミンを含み、好ましくは、生体モノアミン又はポリアミンを含み、好ましくは、エタノールアミン、プトレシン、スペルミジン及び／又はスペルミンを含む。予想外にも、生体アミンを添加することにより、ウシ前駆細胞の成長率が向上することが見いだされた（図5及び6）。同様に、組み合わせて用いられる場合、生体アミンが脂肪組織由来前駆細胞の成長を向上させることが見いだされた（図6）。好ましくは、１以上の生体アミンが本発明の無血清培地中に存在し、より好ましくは、少なくとも2種の生体アミン、例えば少なくともスペルミン及びスペルミジン、が存在する。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、該培地は更に、１以上の付着因子を含む。
本発明の無血清培地の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の好ましい実施態様において、該培地が付着因子を含む場合、該付着因子はフィブロネクチンである。
本発明の無血清培地の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、該無血清培地は、アルブミン；線維芽細胞成長因子（FGF）；アスコルビン酸又はその誘導体、インスリン、ソマトトロピン及びヒドロコルチゾンからなる群より選択されるビタミン及び／又はホルモンのうちの１以上；血小板由来成長因子（PDGF）、インスリン様成長因子（IGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、肝細胞成長因子（HGF）及びインターロイキン6（IL-6）からなる群より選択される１以上のサイトカイン及び／又は成長因子；基礎培地；グルコース源（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；グルタミン源（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；脂肪酸源（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；鉄源又は鉄輸送体（それらは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；並びに亜セレン酸ナトリウム（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））を含み、及び任意的に、タンパク質加水分解物、生体アミン及び／又は付着因子（attachment factor）を含んでいてもよい。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、該無血清培地は、アルブミン；線維芽細胞成長因子（FGF）；アスコルビン酸又はその誘導体、インスリン、ソマトトロピン及びヒドロコルチゾン；血小板由来成長因子（PDGF）、インスリン様成長因子（IGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、肝細胞成長因子（HGF）及びインターロイキン6（IL-6）；基礎培地；グルコース源（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；グルタミン源（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；脂肪酸源（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；鉄源又は鉄輸送体（それらは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））；並びに、亜セレン酸ナトリウム（それは、該基礎培地の形態により供給されることができる（すなわち、該基礎培地中に含まれることができる））を含み、及び任意的に、タンパク質加水分解物、生体アミン及び／又は付着因子を含んでいてもよい。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、該アルブミン、該FGF、該１以上のサイトカイン及び／又は成長因子、該ビタミン及び／又はホルモンのうちの１以上、該基礎培地、該グルコース源、該グルタミン源、該脂肪酸源、該鉄源若しくは該鉄輸送体、該亜セレン酸ナトリウム、該タンパク質加水分解物、該生体アミン及び／又は該付着因子が、培養中のウシ前駆細胞の増殖に有効な量で存在する。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、該培地は、ウシ前駆細胞増殖の為の無血清培地である。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、該培地は更に、ビタミン及び／又はホルモンのうちの１以上を含み、好ましくは、アスコルビン酸（又はその誘導体、例えばL-アスコルビン酸2-リン酸）、インスリン、ソマトトロピン及びヒドロコルチゾンのうちの１以上を含む。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、該培地は更に、グルコース源、グルタミン源、及び／又は鉄源若しくは鉄輸送体を含む。好ましくは、本発明の無血清培地は、グルコース源及びグルタミン源を含む。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、該サイトカイン及び／又は成長因子は、血小板由来成長因子（PDGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、インスリン様成長因子（IGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、肝細胞成長因子（HGF）及びインターロイキン6（IL-6）のうちの１以上である。
本発明の無血清培地の更なる実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更なる実施態様において、該培地は更に、脂肪酸源を含む。
本発明の無血清培地の更に好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に好ましい実施態様において、該培地は、グルコース源及び／又はグルタミン源を含んでいてもよい基礎培地、例えば液体培地、を含み、及び任意的に、脂肪酸源；鉄源若しくは鉄輸送体；及び／又は亜セレン酸ナトリウムをまた含んでいてもよい。
本発明の無血清培地の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の好ましい実施態様において、該培地がグルコース源及びグルタミン源を含む場合に、該グルタミン源はグルタミン又はL-アラニル-L-グルタミンを含み、及び／又は該グルコース源はグルコースを含む。
本発明の無血清培地の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の好ましい実施態様において、該培地が鉄輸送体を含む場合に、該鉄輸送体はトランスフェリンである。
本発明の無血清培地の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の好ましい実施態様において、該アルブミンは、ヒトアルブミンであり、好ましくは、組換えにより生産されるヒトアルブミンである。
本発明の無血清培地の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の好ましい実施態様において、該培地の全ての成分は、動物質を含まない。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、基礎培地が該培地中に存在する場合、該基礎培地は、DMEM及び／又はハムF12培地を含み、好ましくは、DMEM及びハムF12培地をそれぞれ、例えば1:10～10:1、より好ましくは1:1、の比で含む。代替的には、該基礎培地は、RPMI又はアルファ-MEMを含みうる。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、脂肪酸源が該培地中に存在する場合、該脂肪酸源はα-リノレン酸を含む。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、グルコース源が該培地中に存在する場合、該グルコース源は、0.01～75g／l、より好ましくは0.1～4.5g／l、の濃度で存在する。
本発明の無血清培地の別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の別の好ましい実施態様において、該FGFは、0.1～1000μg／l、好ましくは1～100μg／l、より好ましくは5～50μg／l、更により好ましくは約10μg／l、の濃度で存在する。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、グルタミン源が該培地中に存在する場合、該グルタミン源は、0.01～100mM、より好ましくは0.1～8mM、例えば約2mM、の濃度で存在する。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、該アルブミンは、0.01～50g／l、好ましくは0.1～10g／l、より好ましくは0.5～5g／l、の濃度で存在する。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、鉄輸送体が該培地中に存在する場合、該鉄輸送体は、0.1～75mg／ml、好ましくは1～10mg／l、より好ましくは約5.5mg／l、の濃度で存在する。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、インスリンが該培地中に存在する場合、該インスリンは、0.1～100mg／l、好ましくは5～75mg／l、より好ましくは約10mg／l、の濃度で存在する。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、亜セレン酸ナトリウムが該培地中に存在する場合、該亜セレン酸ナトリウムは、0.01～1000μg／l、好ましくは0.1～100μg／l、より好ましくは1～100μg／l、最も好ましくは約6.7μg／l、の濃度で存在する。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、生体アミン、例えばエタノールアミン、プトレシン、スペルミジン及び／又はスペルミン、が該培地中に存在する場合、該生体アミンは、0.01～100mg／l、より好ましくは0.1～10mg／l、更により好ましくは2～5mg／l、の濃度で存在する。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、アスコルビン酸又はその誘導体、例えばL-アスコルビン酸2-リン酸、が該培地中に存在する場合、該アスコルビン酸又は該その誘導体は、0.01～10000mg／l、好ましくは1～500mg／l、より好ましくは約50mg／l、の濃度で存在する。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、ソマトトロピンが該培地中に存在する場合、該ソマトトロピンは、0.01～200μg／l、好ましくは0.1～20μg／l、より好ましくは約2μg／l、の濃度で存在する。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、ヒドロコルチゾンが該培地中に存在する場合、該ヒドロコルチゾンは、0.01～1000μg／l、好ましくは1～500μg／l、より好ましくは約36μg／l、の濃度で存在する。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、フィブロネクチンが該培地中に存在する場合、該フィブロネクチンは、0～1000mg／l、好ましくは0.1～100mg／l、より好ましくは約1～10mg／l、の濃度で存在する。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、該PDGF、FGF、IGF、VEGF、HGF及びIL-6のうちの１以上が該培地中に存在する場合、該PDGF、FGF、IGF、VEGF、HGF及びIL-6のうちの１以上はそれぞれ、1～100μg／l、1～100μg／l、0～1000μg／l、1～100μg／l、0.5～50μg／l及び0.5～50μg／l、より好ましくは、それぞれ、約10μg／l、約10μg／l、0～100μg／l、約10μg／l、約5μg／l及び約5μg／l、の濃度で存在する。特定の実施態様において、IGFは、本発明の無血清培地中に含まれないことができる。図2及び図4は、成長因子及び成長因子の組み合わせの添加が細胞成長に有益であることを示す。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、該脂肪酸源が該培地中に存在する場合、該脂肪酸源は、0.01～100mg／l、より好ましくは0.1～10mg／l、より好ましくは約1mg／l、の濃度で存在する。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、該タンパク質加水分解物が該培地中に存在する場合、該タンパク質加水分解物は、0～20％（w／v）、好ましくは0.001～10％（w／v）、より好ましくは0.01～1％（w／v）、更により好ましくは0～0.25％（w／v）又は0.01～0.25％（w／v）、更により好ましくは0～0.1％（w／v）又は0.01～0.1％（w／v）、最も好ましくは約0.05％（w／v）、の濃度で存在する。
本発明の無血清培地の更に別の好ましい実施態様において、又は本発明の無血清培地が採用される本発明の培養方法の更に別の好ましい実施態様において、該１以上の生体アミンが該培地中に存在する場合、該１以上の生体アミン、例えば、エタノールアミン、プトレシン、スペルミジン及び／又はスペルミン、は、0～10mg／l、より好ましくは2～5mg／l又は6～10mg／l、最も好ましくは約2mg／l又は5mg／l、の濃度で存在する。
更に別の観点において、本発明は、本明細書に開示されている本発明の無血清培地の構成成分又は成分を基礎培地に添加する工程を含む、本発明の無血清培地の製造方法を提供する。本発明の無血清培地の該構成成分又は成分のうちの１以上が既に基礎培地中に含まれている場合は、該無血清培地の該構成成分又は成分を該基礎培地に添加することは省略されることができる。
本発明の培地の製造方法の好ましい実施態様において、該基礎培地は、液体又は粉末状の基礎培地であり、好ましくは、DMEM及び／又はハムF12培地を含む液体基礎培地であり、好ましくは、DMEM及びハムF12培地をそれぞれ、例えば1:10～10:1、より好ましくは1:1、の比で含む液体基礎培地である。代替的には、該基礎培地は、RPMI又はアルファ-MEMを含みうる。
本発明の培地を製造する方法の好ましい実施態様において、本明細書に開示されている本発明の無血清培地の該構成成分又は成分は、アルブミン；線維芽細胞成長因子（FGF）；アスコルビン酸又はその誘導体、インスリン、ソマトトロピン及びヒドロコルチゾン；血小板由来成長因子（PDGF）、インスリン様成長因子（IGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、肝細胞成長因子（HGF）及びインターロイキン6（IL-6）；グルコース源（該基礎培地中に既に含まれていない場合）；グルタミン源；脂肪酸源；鉄源又は鉄輸送体；並びに、亜セレン酸ナトリウムを含み、及び任意的に、タンパク質加水分解物、生体アミン及び／又は付着因子を含んでいてもよく、ここで、これらの成分の全ては、本明細書において開示されているものであることが好ましく、本明細書に開示されている組み合わせのうちのいずれか１種であることが好ましい。
別の観点において、本発明は、本発明の無血清培地とウシ前駆細胞とを含む組成物を提供する。
本発明の無血清培地の好ましい実施態様において、又は本発明の組成物の好ましい実施態様において、該前駆細胞は、（i）ウシ筋前駆細胞若しくはウシ脂肪（脂肪組織）前駆細胞、又は（ii）ウシ筋組織由来前駆細胞若しくはウシ脂肪組織由来前駆細胞である。
本発明の前駆細胞培養方法の好ましい実施態様において、該前駆細胞は、（i）ウシ筋前駆細胞若しくはウシ脂肪（脂肪組織）前駆細胞、又は（ii）筋組織由来前駆細胞又はウシ、ヒツジ若しくはブタの脂肪組織由来前駆細胞である。
本発明のウシ前駆細胞培養方法の好ましい実施態様において、該ウシ前駆細胞は、遺伝子的に組換えされていない細胞であるか、又は遺伝子的に組換えされた細胞である。
本発明のウシ前駆細胞培養方法の好ましい実施態様において、該ウシ前駆細胞は、遺伝子的に組換えされていないウシ筋衛星細胞（myosatellite cell）、又は遺伝子的に組換えされていないウシ脂肪組織（由来）前駆細胞である。
別の観点において、本発明は、ウシ前駆細胞の培養における、本明細書に開示されている無血清培地の使用を提供する。同様に、本発明は、ウシ筋前駆細胞の培養における、本明細書に開示されている無血清培地の使用を提供する。
別の観点において、本発明は、細胞培養ベースのヒト食用食肉製品の製造における、本発明の無血清培地を使用する方法を提供する。
本発明の詳細な説明
定義
本明細書において用いられる場合、語「無血清（serum-free）」は、血清、例えばヒト血清又はウシ血清、の非存在下で配合される培地への言及を包含する。無血清培地は、血清アルブミンを該培地に添加することにより、血清タンパク質、例えば血清アルブミン、を含みうる。しかしながら、好ましくは、該培地の全ての成分は、動物質を含まない。例えば、アルブミンは、組換えにより生産されることが好ましい。本発明の無血清培地の該成分の濃度は、前駆細胞、例えばウシ前駆細胞、の培養及び増殖（proliferation）（拡大（expansion））に対して調節され、そして最適化されることができる。無血清培地は、他の成分、例えば、糖、脂肪酸、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、成長因子又は無機質、を補充された又は補充されていない無血清基礎培地を含むことができる。好ましくは、本発明の無血清培地中には、該アルブミン、該FGF、該１以上のサイトカイン及び／又は成長因子、該ビタミン及び／又はホルモンのうちの１以上、該基礎培地、該グルコース源、該グルタミン源、該脂肪酸源、該鉄源若しくは該鉄輸送体、該亜セレン酸ナトリウム、該タンパク質加水分解物、該生体アミン及び／又は付着因子が、培養中の前駆細胞の増殖に有効な量で存在する。
本明細書において用いられる場合、語「培養（培養する）（culturing）」は、前駆細胞、例えばウシ前駆細胞、の増殖（propagation）及び／又は増殖（proliferation）（拡大（expansion））への言及を包含する。本発明の文脈において、この語は好ましくは、拡大（expansion）への言及、それ故にウシ前駆細胞集団の増殖（proliferation）を包含する。しかしながら、本発明の無血清培地はまた、ヒツジ及びブタの前駆細胞といったヒト以外の他の哺乳類前駆細胞を増殖（proliferation）（拡大（expansion））する為に採用されることができることを理解されたい。それ故に、ウシ前駆細胞に関して本明細書に記載されている、あらゆる実施態様はまた、ヒツジ（ヒツジ等）の前駆細胞及びブタ（ブタ等）の前駆細胞、すなわち、ヒツジ又はブタ由来の前駆細胞に適用可能である。従って、本発明の培養方法、本発明の無血清培地又は本発明の組成物の観点及び／又は実施態様において、ウシ前駆細胞の代わりに、ヒツジ前駆細胞（好ましくは、ヒツジ筋前駆細胞若しくはヒツジ脂肪組織（脂肪）前駆細胞）、又はブタ前駆細胞（好ましくは、ブタ筋前駆細胞若しくはブタ脂肪組織（脂肪）前駆細胞）が採用されることができる。
本明細書において用いられる場合、語「増殖（proliferation）」及び「拡大（expansion）」は、交換可能に用いられることができる。これらの語は、細胞培養における前駆細胞、例えばウシ前駆細胞、の集団サイズの増加、すなわち、前駆細胞が細胞増殖によって他の前駆細胞を発生させていることへの言及を包含する。そのように増殖させたウシ前駆細胞集団は、その後、分化培地中で培養され、細胞培養ベースのヒト食用食肉製品に取り込まれることができる筋細胞又は脂肪組織に該前駆細胞を分化させることができる。しかしながら、分化前に、最初に、前駆細胞、例えばウシ前駆細胞、の十分な量が、増殖（proliferation）／拡大（expansion）によって生産される必要がある。
本明細書において用いられる場合、語「前駆細胞（progenitor cell）」は、特定型の細胞に分化すること、又は特定型の組織を形成することが約束されている細胞への言及を包含する。語「前駆細胞」は、自己再生能、及び、特に筋細胞（myocytes）（筋細胞（muscle cells））及び脂肪細胞（adipocytes）（脂肪細胞（fat cells））への多分化能を有する多能性間質細胞（multipotent stromal cells）（間葉系幹細胞）への言及を包含しうる。
好ましくは、該前駆細胞は、筋前駆細胞又は脂肪前駆細胞である。より好ましくは、該前駆細胞は、ウシ前駆細胞であり、より好ましくは、ウシ筋前駆細胞又はウシ脂肪組織（脂肪）前駆細胞である。
前駆細胞は、野生型動物（例えば、家畜の雌ウシ、ヒツジ若しくはブタ）、又は遺伝子導入動物（例えば、遺伝子導入雌ウシ、ヒツジ若しくはブタ）から得られる、組織由来前駆細胞であることができる。該前駆細胞それ自体は、遺伝子的に組換えされていてもよく、又は遺伝子的に組換えされていなくてもよい。例えば、該前駆細胞は、ウシ、ヒツジ又はブタ由来の細胞から作製される人工多能性幹細胞（iPS：induced pluripotent stem cell）であることができる。好ましくは、該前駆細胞は、遺伝子的に組換えされていない筋組織前駆細胞又は脂肪組織（由来）前駆細胞である。
本明細書において用いられる場合、語「ウシ前駆細胞（bovine progenitor cells）」は、特定型のウシ細胞に分化すること、又は特定型のウシ組織を形成することが約束されているウシ細胞への言及を包含する。語「ウシ前駆細胞」は、自己再生能、及び、特に筋細胞（myocytes）（筋細胞（muscle cells））及び脂肪細胞（adipocytes）（脂肪細胞（fat cells））への多分化能を有する多能性ウシ間質細胞（間葉系幹細胞）への言及を包含しうる。好ましくは、該ウシ前駆細胞は、ウシ筋前駆細胞又はウシ脂肪前駆細胞である。ウシ前駆細胞は、野生型動物（例えば、家畜の雌ウシ）、又は遺伝子導入動物（例えば、遺伝子導入雌ウシ）から得られる、組織由来ウシ前駆細胞であることができる。該ウシ前駆細胞それ自体は、遺伝子的に組換えされていてもよく、又は遺伝子的に組換えされていなくてもよい。例えば、該ウシ前駆細胞は、ウシ細胞から作製される人工多能性幹細胞（iPS）であることができる。好ましくは、該ウシ前駆細胞は、遺伝子的に組換えされていない組織由来ウシ前駆細胞である。
本明細書において用いられる場合、語「ウシの（bovine）」は、ウシ科（Bovidae）、例えばウシ属（Bos）を包含するウシ科、に属する動物への言及を包含する。本明細書に記載されている観点及び実施態様に用いられる場合、語「ウシの」は、語「ウシ科（bovid）」に置き換えられうる。語「ウシ科」は、ウシ科のあらゆる動物を云う為に用いられることができる。ウシ科は、バイソン、バッファロー（buffalo）、アンテロープ、ヌー（wildebeest）、インパラ、ガゼル、ヒツジ、ヤギ、ジャコウネコ、及びウシ（例えば、雌ウシ）、例えば家畜のウシを包含するウシ、を包含する。特に好ましいウシの種は、ウシ（Bos taurus）（雌ウシ）である。
本明細書において用いられる場合、語「ヒツジの（ovine）」は、ヒツジ属（Ovis）、例えばヒツジ（Ovis aries）種を包含するヒツジ属、に属するあらゆる動物への言及を包含する。該語は、家畜化された種又は野生種であることができるヒツジへの言及を包含する。
本明細書において用いられる場合、語「ブタの（porcine）」は、イノシシ科、例えばイノシシ科（Suidae）の亜科及びイノシシ属（Sus）を包含する含む、のあらゆる動物への言及を包含する。該語は、家畜化された種又は野生種であることができるブタへの言及を包含する。
本明細書において用いられる場合、語「筋前駆細胞（muscle progenitor cell）」、又は「筋組織由来前駆細胞（muscle tissue-derived progenitor cell）」は、語「筋幹細胞（muscle stem cell）」又は「筋原性前駆（細胞）（myogenic progenitor (cell)）」と交換可能に用いられることができる。これらの語は、成体幹細胞であって、筋組織、例えば骨格筋組織、中に存在し、多能性を有し、自己再生が可能であり、骨格筋細胞等の筋細胞を生み出すことが可能な成体幹細胞への言及を包含する。語「筋前駆細胞」はまた、「筋細胞前駆細胞（muscle cell progenitor）」と言及されることがある。好ましい筋前駆細胞は、ウシ筋前駆細胞、例えばウシ筋衛星細胞、である。好ましくは該筋前駆細胞、より好ましくは該筋衛星細胞、は、（骨格）筋組織由来前駆細胞である。そのような細胞は、遺伝子的に組換えされていてもよく、又は遺伝子的に組換えされていなくてもよく、好ましくは遺伝子的に組換えされていない。筋肉由来の前駆細胞は、過去に記載されているCD29の陽性発現に基づいて単離されることができる（Ding et al.，Sci．Rep．17(8)：10808(2018)）。
本明細書において用いられる場合、語「筋衛星細胞（myosatellite cell）」は、小型の多能性細胞への言及を包含し、且つ、成熟筋組織において見いだされることができる。筋衛星細胞は、骨格筋細胞の前駆体であり、衛星細胞又は分化した骨格筋細胞を生み出すことができる。筋衛星細胞は、筋組織から得られることができる前駆細胞である。筋衛星細胞は、親筋線維に筋核（myonuclei）を追加供給する可能性、又は静止状態に戻る可能性を有する。より特には、衛星細胞は活性化に応じて、細胞周期に再び入り増殖するか又は筋芽細胞に分化しうる。筋衛星細胞は、概して、筋線維の基底膜と筋線維鞘との間に存在する。筋衛星細胞は、概して、多数の特徴的な遺伝子マーカーを発現する。大部分の衛星細胞は、PAX7及びPAX3を発現する。
本明細書において用いられる場合、語「脂肪前駆細胞（fat progenitor cell）」又は「脂肪組織（由来）（脂肪）前駆細胞（adipose tissue(-derived) (fat) progenitor cell）」は、語「脂肪幹細胞（adipose stem cell）」、「間質血管細胞群（stromal vascular fraction）（SVF）細胞（cells）」、又は「脂肪組織由来幹細胞（adipose tissue-derived stem cells）（ADSC）」と交換可能に用いられることができる。これらの語は、成体幹細胞であって、例えば脂肪組織又は他の組織中に存在し、それは多能性であり、且つそれは自己再生であることができ、且つ脂肪細胞様細胞、例えば脂肪組織細胞、を生み出すことが可能な成体幹細胞への言及を包含する。語「脂肪前駆細胞」はまた、「脂肪細胞前駆細胞（fat cell progenitor）」と云われることができる。例として、ウシ間質血管細胞は、細かく刻んで小片にしてコラゲナーゼ消化に供するウシ皮下脂肪組織から、単離されてもよい。その後、間質血管細胞は、遠心分離によって回収され、培養物中に加えられてもよい。実施態様において、該脂肪前駆細胞は、ウシ脂肪組織由来（脂肪）前駆細胞である。そのような前駆細胞は、遺伝子的に組換えされていてもよく、又は遺伝子的に組換えされていなくてもよい。他の実施態様において、該脂肪（脂肪組織）前駆細胞は、脂肪組織以外の組織から得られる。
本明細書において用いられる「タンパク質加水分解物（protein hydrolysate）」は、植物性タンパク質、例えば大豆タンパク質、を包含するタンパク質の酸加水分解、酵素加水分解又は他の加水分解によって得られるタンパク質の消化物への言及が含まれ、この語は、原料タンパク質に対応する、構成アミノ酸残基及び種々のサイズのペプチドを含む。
本明細書において用いられる場合、語「生体アミン（biogenic amine）」は、1個以上のアミン基を含む生体分子への言及を包含する。モノアミン及びポリアミンが、このグループの生体内アミンに包含される。モノアミンのグループには、エタノールアミンが包含され、ポリアミンのグループには、アグマチン、カダベリン、プトレスシン、スペルミン及びスペルミジンが包含される。好ましくは、少なくとも2種の生体アミン、例えば少なくともスペルミン及びスペルミジン、が本発明の培地に採用される。
本明細書において用いられる場合、語「鉄（iron）」は、鉄、例えば硝酸第二鉄及び硫酸第一鉄、を含む塩への言及を包含する。
本明細書において用いられる場合、語「成長因子（growth factor）」は、生体分子、すなわち、細胞機能、例えば生存及び増殖、の観点を制御するタンパク質への言及を包含する。該タンパク質のグループには、FGF（FGF2又は塩基性FGF等）、IL-6、VEGF、IGF（IGF1等）、HGF及びPDGF（PDGF-BB等）が包含される。好ましくは、本明細書に記載されている該成長因子及び／又はホルモンは、ヒト由来であり、及び、組換えにより生産されることが好ましい。一般的に、タンパク質である、成長因子、ホルモン又は付着因子に言及される場合、そのようなタンパク質は、野生型タンパク質、又はその野生型等価物、例えばヒト野生型等価物、と比較して変異されているか若しくは修飾されたタンパク質であることができる。
本明細書において用いられる場合、語「付着因子（attachment factor）」は、構造タンパク質、より好ましくは糖タンパク質への言及を包含する。糖タンパク質のグループには、フィブロネクチン及びラミニンが包含される。そのような付着因子は、本発明の無血清培地中に含められることができる。
本明細書において用いられる場合、語「～源（source of）」は、該培地成分の前駆物質として供給される培地成分、又は該培地成分自体として供給される培地成分への言及を包含する。当業者は、本明細書に記載されている培地成分に適した前駆物質を十分に理解している。例えば、グルタミン源としてL-アラニル-L-グルタミン又はグルタミンが用いられることができ、脂肪酸源としてα-リノレン酸が用いられることができ、グルコース源としてグルコースが用いられることができる。
本発明の無血清培地
本発明は、アルブミン及び線維芽細胞成長因子（FGF）を含む、ウシ前駆細胞を培養する為の無血清培地を提供する。代替的には、本発明は、アルブミン；並びに、本明細書に記載されている１以上の成長因子及び／又はサイトカイン、好ましくは少なくとも線維芽細胞成長因子（FGF）、を含む、ウシ前駆細胞を培養する為の無血清培地を提供する。該線維芽細胞成長因子（FGF）は、好ましくはヒトFGF、より好ましくはヒトFGF basic（FGFb、FGF2とまた称される）、更により好ましくはヒト組換えFGF basic、例えばR&D Systems社製の233-FB、である。好ましくは、該アルブミンはヒトアルブミンであり、例えばBiorbyt社（orb419911）から入手される、組換えヒトアルブミン等である。該アルブミンは、0.01～100g／l、好ましくは0.01～50g／l、より好ましくは0.1～10g／l、より好ましくは0.5～5g／l、例えば約5g／l、の濃度で該培地中に存在することができる。該FGFは、0.1～1000μg／l、好ましくは1～100μg／l、より好ましくは5～50μg／l、更により好ましくは約10μg／l、の濃度で該培地中に存在することができる。
そのような無血清培地は、ウシ前駆細胞の培養、より特には、増殖（propagation）（拡大（expansion））に有益に採用されることができる。中でも、特にアルブミン及び線維芽細胞成長因子（FGF）の存在により、ウシ前駆細胞の増殖率が向上することが立証された（図4）。本発明の無血清培地を用いれば、血清含有培地と同程度の成長率が達成されうることが立証された（図3）。代替的には、本発明の無血清培地は、ヒツジ又はブタの前駆細胞の培養、より特には、増殖（propagation）（拡大（expansion））、において採用されることができる。
好ましくは、本発明の無血清培地は更に、タンパク質加水分解物、好ましくは植物性タンパク質加水分解物、より好ましくは大豆タンパク質加水分解物を含む。タンパク質加水分解物の存在により、ウシ前駆細胞の成長率を向上させることが立証された（図5）。用いられることができる大豆タンパク質加水分解物の一例は、大豆の限外ろ過酵素消化物であるSoy Hydrolysate UF溶液50X（Sigma Aldrich社製、58903C）である。それは、細胞培養グレードの水に250.0g／Lの大豆加水分解物限外ろ過液を加えて調製され、そして、無菌ろ過される。該タンパク質加水分解物は、0～20％（w／v）、好ましくは0.001～10％（w／v）、より好ましくは0.01～1％（w／v）、更により好ましくは0～0.25％（w／v）又は0.01～0.25％（w／v）、更により好ましくは0～0.1％（w／v）又は0.01～0.1％（w／v）、最も好ましくは約0.05％（w／v）、の濃度で該培地中に存在することができる。
好ましくは、本発明の無血清培地は更に、エタノールアミン、プトレシン、スペルミジン及び／又はスペルミンを含む、モノアミン又はポリアミン等の生体アミンを含む。１以上の生体アミンの存在により、筋組織由来前駆細胞（図5）と脂肪組織（由来）（脂肪）前駆細胞（図6）の両方の成長率が向上することが立証された。最も好ましくは、該生体アミンは、エタノールアミン若しくはスペルミジン、又は、少なくともスペルミンとスペルミジンとの組み合わせである。該生体アミンは、0～10mg／l、より好ましくは2～5mg／l又は6～10mg／l、最も好ましくは約2mg／ml又は5mg／l、の濃度で該培地中に存在することができる。本発明の無血清培地中に、本明細書に開示されているタンパク質加水分解物と本明細書に開示されている生体アミンの両方が存在する場合、特に効果的である。
好ましくは、本発明の無血清培地は更に、ビタミン及び／又はホルモンのうちの１以上、好ましくは、アスコルビン酸又はその誘導体、例えばL-アスコルビン酸2-リン酸、インスリン、ソマトトロピン及びヒドロコルチゾンのうちの１以上を含む。好ましくは、該ホルモン（インスリン、ソマトトロピン及びヒドロコルチゾンを包含する）は、動物ホルモン、好ましくは哺乳類ホルモン、より好ましくはヒト又はウシホルモン、例えば、ヒトヒドロコルチゾン（Sigma Aldrich社製のH6909）、組換えウシ成長ホルモンタンパク質（Abcam社製のab123464）、及び組換えヒトインスリン（Sigma Aldrich社製の91077C）、である。より好ましくは、アスコルビン酸又はその誘導体、例えばL-アスコルビン酸2-リン酸（A8960）、インスリン、ソマトトロピン及びヒドロコルチゾンの全ては、本発明の無血清培地中に存在する。アスコルビン酸又はその誘導体、例えばL-アスコルビン酸2-リン酸、は、0.01～10000mg／l、好ましくは1～500mg／l、より好ましくは約50mg／l、の濃度で該培地中に存在することができる。インスリンは、0.1～100mg／l、好ましくは5～75mg／l、より好ましくは約10mg／l、の濃度で該培地中に存在することができる。ソマトトロピンは、0.01～200μg／l、好ましくは0.1～20μg／l、より好ましくは約2μg／l、の濃度で該培地中に存在することができる。ヒドロコルチゾンは、0.01～1000μg／l、好ましくは1～500μg／l、より好ましくは約36μg／l、の濃度で該培地中に存在することができる。本明細書に開示されている該ビタミン及び／又はホルモンのうちの１以上は、本発明の無血清培地中に、本明細書に開示されている該タンパク質加水分解物及び本明細書に開示されている該生体アミンと組み合わせて存在することが好ましい。
好ましくは、本発明の無血清培地は更に、グルコース源、グルタミン源、及び／又は鉄源若しくは鉄輸送体を含む。好ましいグルコース源はグルコースを含み、好ましいグルタミン源はグルタミンを含み、好ましい鉄輸送体はトランスフェリンである。該グルコース源は、0.01～75g／l、より好ましくは0.1～4.5g／l、の濃度で該培地中に存在することができる。該グルタミン源は、0.01～100mM、より好ましくは0.1～8mM、例えば約2mM、の濃度で該培地中に存在することができる。該鉄輸送体は、0.1～75mg／ml、好ましくは1～10mg／l、より好ましくは約5.5mg／l、の濃度で該培地中に存在することができる。該グルコース源、該グルタミン源、及び該鉄源又は鉄輸送体は、本発明の無血清培地中に、本明細書に開示されている該タンパク質加水分解物、本明細書に開示されている該生体アミン、並びに本明細書に開示されている該ビタミン及び／又はホルモンと組み合わせて存在することが好ましい。
好ましくは、本発明の無血清培地は更に、１以上のサイトカイン及び／又は成長因子を含む。そのようなサイトカイン及び／又は成長因子は、PDGF、IGF、VEGF、HGF、FGF及びIL-6によって形成される群から選択されることが好ましい。全てのサイトカイン及び／又は成長因子は、好ましくはヒトタンパク質、より好ましくは組換えヒトタンパク質、例えば組換えヒトPDGF（例えば、R&D Systems社製の220-BB）、組換えヒトIGF（例えば、R&D Systems社製の291-G1）、組換えヒトHGF（例えば、R&D Systems社製の294-HG)、組換えヒトVEGF（例えば、R&D Systems社製の293-VE）、組換えヒトFGF（例えば、R&D Systems社製の233-FB）、及び組換えヒトIL-6（例えば、R&D Systems社製の206-IL）、である。好ましくは、該PDGFはPDGF-BBである。好ましくは、該IGFはIGF1である。好ましくは、該IGFはヒトIGF1である。好ましくは、該PDGFはヒトPDGF-BBである。好ましくは、該FGFは、bFGFとまた称されるヒトFGF2である。好ましくは、PDGF、IGF、VEGF、HGF、FGF及びIL-6の全ては、本発明の無血清培地中に含まれる。代替的には、IL-6及びIGFは任意であり、PDGF、VEGF、HGF及びFGFは、本発明の無血清培地中に含まれる。該PDGFは、0.1～1000μg／l、好ましくは1～100μg／l、より好ましくは約10μg／l、の濃度で該培地中に存在することができる。該IGFは、0～10000μg／l、好ましくは0～1000μg／l、より好ましくは約0～100μg／l、の濃度で該培地中に存在することができる。該VEGFは、0.1～1000μg／l、好ましくは1～100μg／l、より好ましくは約10μg／l、の濃度で該培地中に存在することができる。該HGFは、0.05～100μg／l、好ましくは0.5～50μg／l、より好ましくは約5μg／l、の濃度で該培地中に存在することができる。該IL-6は、0.05～100μg／l、好ましくは0.5～50μg／l、より好ましくは約5μg／l、の濃度で該培地中に存在することができる。本明細書に開示されている該１以上のサイトカイン及び／又は成長因子は、本発明の無血清培地中に、本明細書に開示されている該タンパク質加水分解物、本明細書に開示されている該生体アミン、本明細書に開示されている該ビタミン及び／又はホルモン、並びに、本明細書に開示されている該グルコース源、該グルタミン源及び該鉄源又は鉄輸送体と組み合わせて存在することが好ましい。
好ましくは、本発明の無血清培地は更に、脂肪酸源を含む。好ましい脂肪酸源は、α-リノレン酸（例えば、Sigma Aldrich社製のL2376）を含む。該脂肪酸源は、0.01～100mg／l、より好ましくは0.1～10mg／l、より好ましくは約1mg／l、の濃度で該培地中に存在することができる。本明細書に開示されている該脂肪酸源は、本発明の無血清培地中に、本明細書に開示されている該タンパク質加水分解物、本明細書に開示されている該生体アミン、本明細書に開示されている該ビタミン及び／又はホルモン、本明細書に開示されている該グルコース源、該グルタミン源及び該鉄源又は鉄輸送体、並びに本明細書に開示されている該１以上のサイトカイン及び／又は成長因子と組み合わせて存在することが好ましい。
好ましくは、本発明の無血清培地は更に、基礎培地、好ましくは液体又は粉末状の基礎培地を含む。好ましくは、そのような基礎培地は、（i）DMEM及び／又はハムF12（Ham’s F12）培地、好ましくは、DMEM及びハムF12培地をそれぞれ、例えば1:10～10:1、より好ましくは1:1、の比、（ii）RPMI培地、及び／又は（iii）アルファ-MEM（最小必須培地α、MEMα、MEMアルファ若しくはアルファMEMとまた称される）培地を含む。当業者は、そのような培地を十分に理解しており、それらをどのように入手するかを分かっている。本明細書に開示されている該基礎培地は、本発明の無血清培地中に、本明細書に開示されている該タンパク質加水分解物、本明細書に開示されている該生体アミン、本明細書に開示されている該ビタミン及び／又はホルモン、本明細書に開示されている該グルコース源、該グルタミン源及び該鉄源又は鉄輸送体、本明細書に開示されている該１以上のサイトカイン及び／又は成長因子、並びに本明細書に開示されている該脂肪酸源と組み合わせて存在することが好ましい。当業者は、基礎培地がそれ自体で、本明細書に開示されている無血清培地の該成分又は構成成分の一部を既に含んでいてもよいことを理解し、このことは、そのような成分又は構成成分が該基礎培地中に既に存在している場合には、それらの添加は省略されてもよいことを意味する。
好ましくは、本発明の無血清培地は、更に、亜セレン酸ナトリウムを含む。本明細書に開示されている該亜セレン酸ナトリウム（例えば、Sigma Aldrich社製のS5261）は、本発明の無血清培地中に、本明細書に開示されている該タンパク質加水分解物、本明細書に開示されている該生体アミン、本明細書に開示されている該ビタミン及び／又はホルモン、本明細書に開示されている該グルコース源、該グルタミン源及び該鉄源又は鉄輸送体、本明細書に開示されている該１以上のサイトカイン及び／又は成長因子、本明細書に開示されている該脂肪酸源、並びに本明細書に開示されている該基礎培地と組み合わせて存在することが好ましい。亜セレン酸ナトリウムは、無血清培地中に、0.01～1000μg／l、好ましくは0.1～100μg／l、より好ましくは1～50μg／l又は1～100μg／l、最も好ましくは約6.7μg／l、の濃度で存在することができる。
好ましくは、本発明の無血清培地において、全ての成分は動物性材料から得られず、それ故に、動物質を含まない（例えば、遺伝子組み換えにより生産される）。
好ましくは、本発明の無血清培地は、前駆細胞の増殖の為の無血清培地である。
本発明はまた、本発明の無血清培地と、ウシ（又は、ヒツジ若しくはブタ）前駆細胞、好ましくはウシ（又は、ヒツジ若しくはブタ）筋組織由来前駆細胞（例えば、筋衛星細胞）又は脂肪組織（由来）（脂肪）前駆細胞、とを含む組成物を提供する。該組成物は、細胞培養物であることができる。
本発明は、ウシ前駆細胞を培養する為の無血清培地であって、アルブミン（約5mg／ml）、ソマトトロピン（約2ng／ml）、L-アスコルビン酸2-リン酸（約50μg／ml）、ヒドロコルチゾン（約36ng／ml）、α-リノレン酸（約1μg／ml）、インスリン（約10μg／ml）、トランスフェリン（約5.5μg／ml）、亜セレン酸ナトリウム（約0.0067μg／ml）、エタノールアミン（約2μg／ml）、L-アラニル-L-グルタミン又はグルタミン（約2mM）、IL-6（約5ng／ml）、bFGFとまた称されるFGF2（約10ng／ml）、IGF1（約100ng／ml）、VEGF（約10ng／ml）、HGF（約5ng／ml）、PDGF-BB（約10ng／ml）及びDMEM／F12基礎培地を含む無血清培地をまた提供する。該無血清培地は任意的に、（i）本明細書に記載されている植物性タンパク質加水分解物、例えば大豆タンパク質加水分解物、及び／又は（ii）本明細書に記載されている１以上の生体モノアミン若しくはポリアミン、例えば、エタノールアミン、プトレシン、スペルミジン及びスペルミンのうちの１以上、好ましくは少なくともスペルミジン及びスペルミン、を包含する生体モノアミン若しくはポリアミン、を更に含んでいてもよい。加えて、上記の該無血清培地は、１以上の付着タンパク質、例えばフィブロネクチン、を含みうる。
本発明はまた、先行請求項のうちのいずれか一項に記載された培地を製造する方法であって、基礎培地に、本発明の無血清培地に関する該実施態様のうちのいずれか１つに記載されている該培地成分を添加する工程を含む方法を提供する。
前駆細胞の培養方法
本発明はまた、ウシ前駆細胞を培養する方法であって、本発明の無血清培地中でウシ前駆細胞を培養する工程を含む上記の方法を提供する。
好ましくは、該前駆細胞は、遺伝子的に組換えされていない細胞であるか、又は遺伝子的に組換えされた細胞である。好ましくは、該前駆細胞は、ウシ、ヒツジ若しくはブタの前駆細胞であり、好ましくは、ウシ、ヒツジ若しくはブタの筋組織由来前駆細胞、又は、ウシ、ヒツジ若しくはブタの脂肪組織由来前駆細胞である。
本明細書に記載されている前駆細胞の例示的な培養条件は、次のとおりである。ウシ前駆細胞、例えば筋組織由来前駆細胞又は脂肪組織由来前駆細胞、は、適切な細胞培養容器内で、本発明の無血清培地中に、3000～5000 細胞／cm2の密度で播種される。前述の細胞培養容器は、被覆、例えばコラーゲン、により予め被覆されていてもよいが、コラーゲンに限定されない。該細胞は、90％の培養密度に達した時に、継代されることができる。簡単に言えば、該細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、Thermo Fischer Scientific社製の20012027）により1回リンスされ、その後、トリプシン（Thermo Fischer Scientific社製の25200072）が添加されることができる。該細胞が剥離すると、トリプシンは、ダイズ（Glycine max）由来のトリプシンインヒビター（Sigma Aldrich社製のT6522）を加えて中和され、該細胞は、PBSに集められ、350gで遠心分離される。必要に応じて、上清は吸引され、そして、細胞ペレットは再懸濁されることができる。次に、該細胞は、37℃、95％空気／5％ CO2の加湿雰囲気中で維持されることができる。
本発明はまた、前駆細胞、例えばウシ、ヒツジ又はブタの前駆細胞、を培養する為の、本発明の無血清培地を使用する方法を提供する。
番号が付けられた下記の実施態様がまた、本発明の一部である。
1. 前駆細胞培養用の無血清培地であって、
アルブミン、及び
線維芽細胞成長因子（FGF）
を含む上記の前駆細胞培養用の無血清培地。
2. タンパク質加水分解物、好ましくは大豆タンパク質加水分解物、を更に含む、実施態様1に記載された該無血清培地。
3. 生体アミン、好ましくは、エタノールアミン、プトレシン、スペルミジン及び／又はスペルミン、を更に含む、実施態様1又は実施態様2に記載された該無血清培地。
4. ビタミン及び／又はホルモンのうちの１以上、好ましくは、アスコルビン酸又はその誘導体、インスリン、ソマトトロピン及びヒドロコルチゾンのうちの１以上、を更に含む、実施態様1～3のうちのいずれか１つに記載された該無血清培地。
5. グルコース源、グルタミン源、及び鉄源又は鉄輸送体を更に含む、実施態様1～4のうちのいずれか１つに記載された該無血清培地。
6. 該鉄輸送体がトランスフェリンである、実施態様5に記載された該無血清培地。
7. 該グルタミン源がグルタミンを含み、及び／又は該グルコース源がグルコースを含む、実施態様5又は実施態様6に記載された該無血清培地。
8. PDGF、IGF、VEGF、HGF及びIL-6によって形成される群から選択される１以上のサイトカイン及び／又は成長因子を更に含む、実施態様1～7のうちのいずれか１つに記載された該無血清培地。
9. 脂肪酸源を更に含む、実施態様1～8のうちのいずれか１つに記載された該無血清培地。
10. 該脂肪酸源がα-リノレン酸を含む、実施態様9に記載された該無血清培地。
11. 基礎培地、好ましくは液体基礎培地、例えば液体最小必須培地、を更に含む、実施態様1～10のうちのいずれか１つに記載された該無血清培地。
12. 該基礎培地が、（i）DMEM及び／又はハムF12培地、好ましくは、DMEM及びハムF12培地をそれぞれ、例えば1:10～10:1、より好ましくは1:1、の比、（ii）RPMI培地及び／又は（iii）アルファ-MEM培地を含む、実施態様11に記載された該無血清培地。
13. 亜セレン酸ナトリウムを更に含む、実施態様1～12のうちのいずれか１つに記載された該無血清培地。
14. 該アルブミンがヒトアルブミンであり、好ましくは組換えヒトアルブミンである、実施態様1～13のうちのいずれか１つに記載された該無血清培地。
15. 該アルブミン、該FGF、該１以上のサイトカイン及び／又は成長因子、該ビタミン及び／又はホルモンのうちの１以上、該基礎培地、該グルコース源、該グルタミン源、該脂肪酸源、該鉄源若しくは該鉄輸送体、該亜セレン酸ナトリウム、該タンパク質加水分解物、該生体アミン及び／又は（該付着因子が存在する場合は）該付着因子が、培養中の前駆細胞の増殖に有効な量で含まれる、実施態様1～14のうちのいずれか１つに記載された該無血清培地。
16. 全ての成分が動物質を含まない、実施態様1～15のうちのいずれか１つに記載された該無血清培地。
17. 実施態様1～16のうちのいずれか１つに記載された培地と、前駆細胞、好ましくは、ウシ、ヒツジ若しくはブタの筋組織（由来）前駆細胞又は脂肪組織（由来）前駆細胞と、を含む組成物。
18. 実施態様1～16のうちのいずれか１つに記載された培地の該成分を基礎培地に添加する工程
を含む、実施態様1～16のうちのいずれか１つに記載された培地を製造する方法。
19. 実施態様1～16のうちのいずれか１つに記載された培地中で前駆細胞を培養する工程を含む、前駆細胞を培養する方法。
20. 該前駆細胞が、遺伝子的に組換えされていない細胞であるか、又は遺伝子的に組換えされた細胞である、実施態様19に記載された該培養方法。
21. 該前駆細胞が、ウシ、ヒツジ若しくはブタの筋（組織由来）前駆細胞又は脂肪（組織由来）前駆細胞である、実施態様19又は実施態様20に記載された該培養方法。
22. 前駆細胞、好ましくは、ウシ、ヒツジ若しくはブタの筋（組織由来）前駆細胞又は脂肪（組織由来）前駆細胞、の培養における、実施態様1～16のうちのいずれか１つに記載された培地の使用方法。
明確性及び簡潔な説明の為に、本明細書において、特徴が同一又は別々の実施態様の一部として説明されており、しかしながら、本開示は、記載されている該特徴の全て又は一部の組み合わせを有する実施態様を包含することが理解されるであろう。例えば、本発明の培養方法又は本発明の組成物は、本発明の無血清培地を意味し、本発明の無血清培地に関して記載されている実施態様はまた、該培養方法及び該組成物に関して開示されている。
本明細書において言及されている文書の内容は、参照により本明細書に取り込まれる。
本発明の無血清培地における塩基として用いられたF10とDMEM／F12培地との比較。ウシ筋前駆細胞は、コラーゲン被覆96穴プレート内、F10基礎培地又はDMEM／F12基礎培地 1:1中で、4日間及び7日間培養させた（n=3）。細胞数は、増殖アッセイMTSキット（Promega社、CellTiter 96（登録商標）AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（MTS））により測定された。 対照血清ベース培地と比較した、種々の成長因子の組み合わせによる無血清培地中で4日間培養したときのウシ筋前駆細胞の成長。無血清培地対照は、1％ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン（PSA）、2mM L-アラニル-L-グルタミン、5μg／mlウシ血清アルブミン、75ng／ml IL-6及び5μg／l FGFを添加した、DMEM／F12／F12 1:1を含む。血清含有培地対照は、20％ FBSとDMEM／F12 1:1とを含む。試験された成長因子の濃度は、IGF1が100μg／l、HGFが5μg／l、VEGFが10μg／l、PDGF-BBが10μg／lであった。 血清含有成長培地（対照GM）及び本発明の無血清培地（SFM1）中のウシ筋前駆細胞の長期増殖。試験された血清含有成長培地は、DMEM／F12+20％ウシ胎児血清+5ng／ml bFGF+1％ペニシリン-ストレプトマイシン-アンホテリシンBを含有し、試験された無血清培地（SFM1）は、アルブミン（5mg／ml）、ソマトトロピン（2ng／ml）、L-アスコルビン酸2-リン酸（50μg／ml）、ヒドロコルチゾン（36ng／ml）、α-リノレン酸（1μg／ml）、インスリン（10μg／ml）、トランスフェリン（5.5μg／ml）、亜セレン酸ナトリウム（0.0067μg／ml）、エタノールアミン（2μg／ml）、L-アラニル-L-グルタミン又はグルタミン（2mM）、IL-6（5ng／ml）、bFGFとまた称されるFGF2（10ng／ml）、IGF1（100ng／ml）、VEGF（10ng／ml）、HGF（5ng／ml）、PDGF-BB（10ng／ml）及びDMEM／F12基礎培地を含む。該細胞は、コラーゲン被覆組織培養容器内で数週間培養させ、80％～90％のコンフルエントな状態の時に継代された（passed）。それぞれの継代では、該細胞は、countess自動セルカウンターにより計数された。増殖は、全集団倍加（PD）により示されている。 数種の成分を種々の濃度で含む無血清培地（対照）中のウシ筋前駆細胞の成長。該細胞は、コラーゲン被覆96穴プレート内で、次の成分を種々の濃度で添加して4日間培養させた（n=4）。組換えヒトアルブミン（2、1、0.5又は0mg／ml）、ウシ血漿由来のフィブロネクチン（5、2、1又は0μg／ml）、組換えヒトIL-6（25、10、5、2又は0ng／ml）、組換えヒトインスリン様成長因子1（25、10、5、2又は0ng／ml）、及び組換え線維芽細胞成長因子2（5、2、1又は0ng／ml）。細胞は、ハイコンテンツアナライザー（high content analyser）ImageXpress Pico Automated Cell Imaging Systemにより計数された。アルブミン及びFGFの存在しない状態では、ウシ筋前駆細胞の成長が大幅に減少することが示されている。 ウシ筋衛星細胞の増殖に対する、種々の濃度のスペルミジン及び大豆加水分解物UF溶液の形態の大豆加水分解物の影響。該細胞は、コラーゲン被覆96穴プレート上で、種々の濃度のスペルミジン（0、1、2、3、4、5又は10μg／ml）、並びに種々の濃度の大豆加水分解物（0、0.05、0.1、0.15、0.2及び0.25 ％（w／v））により、4日間成長させた（n=2）。細胞は、ハイコンテンツアナライザーImageXpress Pico Automated Cell Imaging Systemにより計数された。スペルミジン及び大豆タンパク質加水分解物が、細胞成長率を向上させることが示されている。 ポリアミン添加又は無添加の血清含有培地又は無血清培地中の、脂肪組織前駆細胞、すなわち、間質血管細胞群細胞（ウシ（Bos taurus）由来）の成長の短期培養比較。該細胞は、48穴プレート内で、血清含有培地（DMEM／F12+10％ウシ胎児血清+2ng／ml bFGF）、無血清培地（SFM1）、又は、1μg／mlスペルミジン（SPMD）及び10μg／mlスペルミン（SPMN）を添加した無血清培地（SFM1）中に播種された。培養6日後に、該細胞は、ハイコンテンツアナライザーImageXpress Pico Automated Cell Imaging Systemにより計数された。 基礎培地の種類を変えた本発明の無血清培地中の、全てウシ（Bos taurus）由来の衛星細胞及び脂肪組織前駆細胞、すなわち、間質血管細胞群細胞（SVF）の短期培養。該細胞は、コラーゲン被覆96穴プレート内で、種々の基礎培地（すなわち、RPMI培地、アルファ-MEM培地、F12培地、並びに1:10、1:1及び10:1の比のDMEM／F12培地）が含まれる本発明の無血清培地中に播種された。培養6日後に、該細胞は、ハイコンテンツアナライザーImageXpress Pico Automated Cell Imaging Systemにより計数された。
実施例
実施例1. 本発明の無血清培地の製造
材料及び方法
ウシ筋前駆細胞は、ウシ筋組織（ウシ（Bos taurus））から単離され、過去に記載されているCD29の陽性発現に基づいて選別された（Ding et al., Sci. Rep., 17(8): 10808 (2018)）。
細胞は、コラーゲン被覆96穴プレート内、1％ PSA、2mM L-アラニル-L-グルタミン、5μg／mlウシ血清アルブミン、及び5μg／l FGF（組換えヒトタンパク質FGF basic（FGFb）、R&D Systems社製の233-FB）を添加したDMEM／F12基礎培地 1:1中で、5日間培養させた（n=3）。この培地は、図2の説明において示されているように、無血清対照に該当する。血清ベースの対照については、該DMEM／F12 1:1培地には、20％ FBSが添加された。試験された条件では、該培地には、IGF1（ヒト組換えIGF（R&D Systems社製の291-G1））100μg／l、HGF（組換えヒトHGF（R&D Systems社製の294-HG））5μg／l、VEGF（組換えヒトVEGF（R&D Systems社製の293-VE））10μg／l、及びPDGF-BB（ヒト組換えPDGF（R&D Systems社製の220-BB））10μg／lが単独で又は組み合わせて添加された。ウシ筋前駆細胞の増殖に対する追加成長因子の種々の組み合わせによる効果を検証する為に、2水準の実験完全実施要因計画（DoE）（two level, full factorial design of experiments）が実施された。細胞は、37℃、5％ CO2において4日間培養させた。4日後、それらは、パラホルムアルデヒド2％により固定し、ヘキスト（Hoechst）染色により染色された。穴当たりの細胞数は、ハイコンテンツアナライザーImageXpress Pico Automated Cell Imaging Systemにより測定された。試験された成長因子（IGF1、HGF、VEGF及びPDGF-BB）間の主作用及び相互作用効果を調べる為に、統計解析が実施された（JMPソフトウェア）。
結果
図2には、血清含有対照と比較した該細胞の相対的な成長（百分率として表す）が示されている。これらの結果の統計解析では、IGF1及びVEGFの添加による有意な正の効果とともに、IGF1とHGFとの正の相乗効果が示された。IGF1を100μg／l、HGFを5μg／l、VEGFを10μg／l、及びPDGF-BBを10μg／l添加した該無血清培地は、該血清含有対照と比較して1.5倍の成長を示し、無血清ベースの対照（成長因子として5ng／ml FGF及び75ng／ml IL-6のみを含む）と比較して4.7倍の成長を示した。
実施例2. 本発明の培地中の筋前駆細胞の培養。
材料及び方法
ウシ筋前駆細胞は、ウシ筋組織（ウシ（Bos taurus））から単離され、過去に記載されているCD29の陽性発現に基づいて選別された（Ding et al., Sci. Rep., 17(8): 10808 (2018)）。
筋前駆細胞は、適切なコラーゲン被覆細胞培養容器内で、本発明の無血清培地（すなわち、SFM1培地）又は血清含有培地（20％ウシ胎児血清、5μg／ml bFGF及び2mM L-アラニル-L-グルタミンを添加したDMEM／F12）中に、3000～5000 細胞／cm2の密度で播種された。該細胞は、90％の培養密度に達した時に、継代された。簡単に言えば、該細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、ThermoFischer Scientific社製の20012027）により1回リンスされた後、トリプシン（ThermoFischer Scientific社製の25200072）が添加された。該細胞が剥離したら、トリプシンは、ダイズ（Glycine max）由来のトリプシンインヒビター（Sigma Aldrich社製のT6522）を加えて中和され、該細胞は、PBSに集められ、350gで遠心分離された。必要に応じて、上清は吸引され、細胞ペレットは再懸濁させた。その後、該細胞は、37℃、95％空気／5％ CO2の加湿雰囲気中で維持された。
結果
該血清含有培地中で培養させた筋前駆細胞は、初期の成長率が高く、この成長率が時間とともに減少したのに対して、無血清成長細胞は、成長率が低く、この成長率が比較的一定（より安定）していた。時間とともに、2種の培地中の細胞の全成長は、同程度であった。図3を参照されたい。
実施例3. 種々の基礎培地を含む本発明の無血清培地中の、衛星細胞及び脂肪組織前駆細胞の培養。
材料及び方法
全てウシ（Bos taurus）由来の衛星細胞及び脂肪組織前駆細胞、例えば、間質血管細胞群（SVF）細胞は、コラーゲン被覆96穴プレートに播種され、95％空気／5％ CO2の加湿雰囲気中、37℃で、種々の基礎培地（すなわち、RPMI培地（11875093、Thermo Fischer Scientific社製）、アルファ-MEM培地（12561056、Thermo Fischer Scientific社製）、全て上述のF12を用いて作製された、F12培地（11765054、Thermo Fischer Scientific社製）、DMEM／F12 1:1培地、DMEM／F12 10:1培地、及びDMEM／F12 1:10培地）、並びにDMEM（A1443001、Thermo Fischer Scientific社製）を含む、アルブミン（5mg／ml）、ソマトトロピン（2ng／ml）、L-アスコルビン酸2-リン酸（50μg／ml）、ヒドロコルチゾン（36ng／ml）、α-リノレン酸（1μg／ml）、インスリン（10μg／ml）、トランスフェリン（5.5μg／ml）、亜セレン酸ナトリウム（0.0067μg／ml）、エタノールアミン（2μg／ml）、L-アラニル-L-グルタミン又はグルタミン（2mM）、IL-6（5ng／ml）、bFGFとまた称されるFGF2（10ng／ml）、IGF1（100ng／ml）、VEGF（10ng／ml）、HGF（5ng／ml）、PDGF-BB（10ng／ml）からなる本発明の無血清培地中で、6日間培養させた。培養6日後に、該細胞は、ハイコンテンツアナライザーImageXpress Pico Automated Cell Imaging Systemにより計数された。相対成長率は、特定の培地における細胞数を日数で割って、対照（DMEM:F12中の成長）に正規化することにより、算出された。
結果
衛星細胞及び脂肪組織前駆細胞の効果的な成長（growth）（増殖（proliferation））率は、種々の基礎培地のスペクトルを含む本発明の無血清培地により達成され、そのような細胞の成長（growth）（増殖（proliferation））率は、特定の基礎培地に依存しないことが観察された（図7）。

Claims (19)

  1. ウシ前駆細胞を培養する方法であって、
    ウシ前駆細胞を培養する為の無血清培地中でウシ前駆細胞を培養する工程を含み、
    ここで、前記無血清培地が、
    アルブミン、及び
    線維芽細胞成長因子（FGF）
    を含む、前記方法。
  2. 前記無血清培地が、
    アスコルビン酸又はその誘導体、インスリン、ソマトトロピン及びヒドロコルチゾンからなる群より選択されるビタミン及び／又はホルモンのうちの１以上；並びに、
    血小板由来成長因子（PDGF）、インスリン様成長因子（IGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、肝細胞成長因子（HGF）及びインターロイキン6（IL-6）からなる群より選択される１以上のサイトカイン及び／又は成長因子
    を更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記無血清培地が、前記１以上のサイトカイン及び／又は成長因子として、
    IL-6；
    IL-6及びIGF；
    IL-6、IGF及びHGF；
    IL-6、IGF、HGF及びPDGF；
    IL-6、IGF及びVEGF；
    IL-6、IGF及びPDGF；
    IL-6、PDGF及びVEGF；
    IL-6、IGF、PDGF及びVEGF；又は
    IL-6、IGF、HGF、PDGF及びVEGF
    を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記無血清培地が、
    アスコルビン酸又はその誘導体、インスリン、ソマトトロピン、及びヒドロコルチゾン、並びに、
    PDGF、VEGF、HGF、IGF及びIL-6
    を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記無血清培地が更に、
    基礎培地、
    グルコース源、
    グルタミン源、
    脂肪酸源、
    鉄源又は鉄輸送体、及び／又は
    亜セレン酸ナトリウム
    を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記基礎培地が、（i）DMEM及び／又はハムF12（Ham’s F12）培地、好ましくは、DMEM及びハムF12培地をそれぞれ、例えば1:10～10:1、より好ましくは1:1、の比、（ii）RPMI培地、及び／又は（iii）アルファ-MEM培地を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記脂肪酸源がα-リノレン酸を含む、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 前記無血清培地が更に、タンパク質加水分解物、好ましくは大豆タンパク質加水分解物を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記無血清培地が更に、生体アミンを含み、好ましくは、エタノールアミン、プトレシン、スペルミジン及び／又はスペルミンを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. ウシ前駆細胞を培養する方法であって、ウシ前駆細胞を培養する為の無血清培地中でウシ前駆細胞を培養する工程を含み、ここで、該無血清培地が、
    アルブミン、
    線維芽細胞成長因子（FGF）
    アスコルビン酸又はその誘導体、インスリン、ソマトトロピン及びヒドロコルチゾンからなる群より選択されるビタミン及び／又はホルモンのうちの１以上、
    血小板由来成長因子（PDGF）、インスリン様成長因子（IGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、肝細胞成長因子（HGF）及びインターロイキン6（IL-6）からなる群より選択される１以上のサイトカイン及び／又は成長因子、
    基礎培地、
    グルコース源、
    グルタミン源、
    脂肪酸源、
    鉄源又は鉄輸送体、及び
    亜セレン酸ナトリウム、並びに、
    任意的に、タンパク質加水分解物、生体アミン及び／又は付着因子
    を含む、前記方法。
  11. 前記アルブミン、前記FGF、前記１以上のサイトカイン及び／又は成長因子、前記ビタミン及び／又はホルモンのうちの１以上、前記基礎培地、前記グルコース源、前記グルタミン源、前記脂肪酸源、前記鉄源又は鉄輸送体、及び前記亜セレン酸ナトリウム、前記タンパク質加水分解物、前記生体アミン及び／又は前記付着因子が、培養中のウシ前駆細胞の増殖に有効な量で存在する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記無血清培地が、ウシ前駆細胞の為の無血清培地である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 請求項１～１２のいずれか１項に定義されている無血清培地と、ウシ前駆細胞とを含む組成物。
  14. ウシ前駆細胞を培養する為の無血清培地であって、
    アルブミン、及び
    線維芽細胞成長因子（FGF）
    を含む、前記無血清培地。
  15. 前記無血清培地が更に、IL-6を含む、請求項１４に記載の無血清培地。
  16. 前記無血清培地が、請求項２～１２のいずれか１項に定義されている無血清培地である、請求項１４又は１５に記載の無血清培地。
  17. 前記無血清培地が更に、
    タンパク質加水分解物、好ましくは大豆タンパク質加水分解物
    DMEM及びハムF12培地を含む基礎培地、
    ソマトトロピン、
    ヒドロコルチゾン、
    スペルミン、及び／又は
    スペルミジン
    を含む、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の無血清培地。
  18. 前記ウシ前駆細胞が、ウシ筋前駆細胞又はウシ脂肪（脂肪組織）前駆細胞である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法、又は請求項１３に記載の組成物、又は請求項１４～１７のいずれか１項に記載の無血清培地。
  19. 細胞培養ベースのヒト食用食肉製品の製造における、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の無血清培地を使用する方法。
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