CN107699623A - 检测ucp1基因突变的pcr‑sscp引物及其在牦牛肉质性状鉴别方法中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了两对用于检测UCP1基因突变的PCR‑SSCP引物对，分别为P5、P6，其正反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1‑4；同时还提供了其在牦牛肉质性状预测和鉴别方法中的应用及鉴定方法和相应的试剂盒。本发明的有益效果为：本发明参照普通牛的UCP1基因序列设计引物P5、P6，扩增牦牛UCP1基因，分析UCP1基因检测区域的序列及群体遗传特征，结合甘南牦牛肉生产性能测定数据，分析UCP1基因突变对其胴体及肉质性状的影响，丰富牦牛重要经济性状候选基因分子遗传研究数据，从而预测牦牛的肉质性状，反应灵敏、特异性强、操作简单、精确度高，可进行快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及检测UCP1基因突变的PCR-SSCP引物及其在 牦牛肉质性状预测和鉴别方法中的应用。
背景技术
牦牛(Bos grunniens)是青藏高原及其毗邻高山、亚高山地区的特有牛种。中国现存栏 牦牛1400多万头，占世界牦牛总头数的90％以上，主要在西藏、青海、四川、甘肃、云南和 新疆等省(区)的高寒牧区，包括天祝白牦牛、甘南牦牛、九龙牦牛、青海高原牦牛等12个地方品种和1个大通牦牛选育品种。牦牛经过长期自然选择和人工选择，对高寒少氧环境形成了特殊的适应机制，是高寒牧区特色畜产品生产的主体，也是当地牧民重要的生产和生 活资源。牦牛一般以肉乳兼用型为选育方面，生产性能全面，但产乳量及屠宰性能均较低。 成年牦牛活重142.80kg，屠宰率为47.91％，牦牛肉蛋白质含量高，富含多种矿物质元素和 维生素，但肌纤维密度小，牦牛肌肉嫩度低于普通牛肉。如李鹏等报道甘南牦牛肌肉中干物 质的含量显著高于黄牛并且肌肉嫩度也低于黄牛。因此，牦牛肉成为具有特色的青藏高原畜 产品，但因为牦牛选育程度低，生产性能不高，限制了肉、乳产品的进一步开发利用。
基于牦牛肉品质的特殊性，以及现代生物技术在牦牛遗传育种中的应用现状，利用现代 分子育种技术研究牦牛高乳脂的分子遗传特性和达到改善牦牛肉质、提高产肉性能的目的， 开发与牦牛产乳性能有关和改善肉品质的候选基因标记，为牦牛重要性状候选基因分子遗传 研究积累数据。
胴体性状的研究主要体现在胴体重、净肉率、眼肌面积和屠宰率等方面，目前研究较多 的候选基因包括生长激素(GH)、生长激素受体(GHR)、胰岛素样生长因子链接蛋白3(IGFBP3)、 生肌决定因子(MyoD)基因等。肉质性状的研究主要在肌内脂肪含量(IMF)、大理石花纹、嫩 度、系水力等方面，目前研究发现的候选基因有线粒体转录因子A(TFAM)、钙蛋白酶基因 (CAPN)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因等。Kaplanová等研究发 现TFAM基因变异与杂交牛的嫩度、高品质牛肉比率、可分离牛肉脂肪率性状相关。侯冠彧 等报道CAPN3基因是影响牛肉质性状的主效应基因或与主效应基因连锁。Barendse等研究表 明甲状腺球蛋白(TG)基因的不同基因型显著影响牛肉的大理石评分。郝灵慧等研究发现生长 激素(GH)基因第5外显子多态性位点与胴体性状关联性分析表明不同基因型在胴体产肉率、 骨肉比性状中差异显著(P<0.05)。张春雷等研究阿片黑皮质素前体(POMC)发现该基因多态位 点与6月龄体重和平均日增重显著相关，BB型个体显著大于AA型(P<0.05)。侯冠彧等研究 发现钙蛋白酶3(CAPN3)影响胴体质量并存在显著差(P<0.05)。
牦牛胴体性状候选基因的研究与普通牛类似。候选基因主要包括MyoD、A-FABP、ANK1、 MSTN基因等。李天科等研究表明GDF-10基因的突变显著影响甘南牦牛的体斜长、体高、胸 围、体重。姚玉妮等报道IGF-1基因不同基因型与大通牦牛的体重和体斜长存在显著相关。 王丁科等研究表明IGF2基因第8内含子遗传突变发现AA和AB基因型个体质量显著高于BB 基因型个体。
牦牛肉质候选基因主要包括CAPN基因、CAST基因、Leptin基因、FABP基因、PRKAG3基因等。牦牛CAPN基因、CAST基因与嫩度、肉中脂肪含量、蛋白质含量、失水率、熟肉率 等肉质性状相关。牛晓亮等在牦牛CAPN4基因启动子区进行了SNPs位点检测，发现该基因 突变对不同年龄段牦牛熟肉率、失水率、眼肌面积显著相关。褚敏等发现牦牛FASN基因第3 内含子不同基因型对个体的脂肪含量有显著影响。焦斐等研究表明牦牛PRKAG3基因第3内 含子基因突变显著影响肉质的失水率，牦牛FAS基因突变显著影响肉质脂肪含量、熟肉率、 失水率。
UCP基因与机体能量代谢有关，对机体所涉及到的体重(肥胖)、食物转化率和静止代谢 率等性状具有显著的关系。UCP1是棕色脂肪细胞特异性表达蛋白,是棕色脂肪组织发挥产热 活性的最重要的分子。它能够降低氧化磷酸化过程中产生的质子浓度梯度,从而减少三磷酸 腺苷(ATP)的合成,使产生的能量以热辐射的形式释放出来。游离脂肪酸能够诱导UCP1蛋白 的表达增加,使棕色脂肪组织在UCP1的刺激下消耗大量脂肪酸,从而达到对脂肪酸的清除作 用。目前，在哺乳动物体内已经发现的解偶联蛋白有：UCP1、UCP2、UCP3、UCP4、UCP5、UCP6。 UCP1基因是1976年首次在聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳时发现，仅在棕色脂肪组织(Brown adipose tissue，BAT)中表达。但最新的研究表明，UCP1基因也在其他的一些组织中有表达， 如白色脂肪组织、骨骼肌等。UCP2能在白色脂肪组织、骨骼肌等多种组织中出现；UCP3主 要存在于骨骼肌和脂肪组织里。UCP4转录产物只在胎儿和成人脑组织表达，参与人脑适应性 产热和代谢。UCP5则在脑与睾丸中含量高，UCP4和UCP5可能与神经退行性病变有关。牛的 UCP1基因定位于17号染色体，UCP2、UCP3基因紧密连锁，以基因簇的形式存在于15号染 色体上。目前，UCP基因在人以及啮齿动物上研究较多，研究的热点主要在该基因与糖尿病 及肥胖方面。畜牧经济方面，UCP基因在鸡、猪上的研究较多。Raim-bault等研究发现，鸡 UCP基因仅在骨骼肌里表达，具有机体调热作用并且维持体温的功能。Damon等研究显示猪 UCP2、UCP3基因参与猪能量代谢的调控。
UCP1基因作用机制：根据的化学渗透学说线粒体发生氧化作用时,呼吸链进行电子传递, 氢以质子形式脱下,其结果是质子从线粒体基质泵入内外两层膜间形成靠内膜的质子电化学 梯度(ΔμH+)。这一梯度又驱动质子通过合成酶返回线粒体基质,并同时释放能量推动磷酸 化合成。若质子进入线粒体内膜,但不与合成过程偶联,能量则以热的形式散失,即形成“质 子漏”。质子漏是机体能耗的重要部分,它占到机体基础代谢的20％,而肝细胞和骨骼肌细胞 的氧耗分别有26％和5％来源于质子漏。解偶联蛋白作为线粒体内膜上转运的载体蛋白,最直 接作用在于转运质子进入线粒体基质,调节线粒体内的质子梯度,从而可能对机体的产热作 用、ATP生成及能量代谢产生影响。
解偶联蛋白1(UCP1)介导的适应性产热由食物或者温度诱导产生，其在控制能量和体重 中有重要作用。UCP1所介导的产热可分为短期和长期两种。短期反应一般在几分钟之内,而 长期反应一般为几小时或几天。短期反应的机制是寒冷可诱导交感神经系统释放去甲肾上腺 素,然后通过褐色脂肪细胞上的β-肾上腺素能受体(β-adrenergic receptor,β-AR)刺激 cAMP的产生,cAMP激活PKA,PKA使解脂产生,释放出脂肪酸,脂肪酸进而促进UCP1对H+的运 输；而长期反应中PKA激活一系列级联反应,最终导致UCP1的表达增加、新线粒体的合成和 褐色脂肪组织的增生。此外,在肾上腺素和甲状腺素等刺激下,棕色脂肪细胞的UCP1表达增 加,从而增加棕色脂肪组织的消耗脂肪酸的活性。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了检测UCP1基因突变的PCR-SSCP 引物及其在牦牛肉质性状预测和鉴别方法中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：两对用于检测UCP1基因突变的PCR-SSCP 引物对，所述两对PCR-SSCP引物对分别为P5、P6；所述引物对P5的正向引物的核苷酸序列 为序列表中的SEQ ID NO.1，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.2；所述引物 对P6的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.3，反向引物的核苷酸序列为序列表 中的SEQ ID NO.4。
本发明的第二个目的是提供了上述两对PCR-SSCP引物对在检测UCP1基因突变中的应 用。
本发明的第三个目的是提供了上述两对PCR-SSCP引物对在牦牛肉质性状预测和鉴别中 的应用。
本发明的第四个目的是提供了用于预示牦牛肉质性状的PCR-SSCP检测试剂盒，所述试 剂盒中包括有两对PCR-SSCP引物对P5、P6的正向引物、反向引物，所述引物对P5的正向 引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.2；所述引物对P6的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.3，反向引物的核苷 酸序列为序列表中的SEQ ID NO.4。
本发明的第五个目的是提供了一种牦牛肉质性状的鉴别方法，包括以下步骤：
1)采集样品和提取DNA；
2)待测样本DNA的PCR扩增，所用两对引物对分别为P5、P6；所述引物对P5的正向引物的 核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ IDNO.2； 所述引物对P6的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.3，反向引物的核苷酸序列 为序列表中的SEQ ID NO.4；
3)SSCP电泳检测，将步骤2)得到的PCR产物进行SSCP电泳，电泳结束后银染判定基因型， 再进行等位基因序列测定；
4)以测定后的等位基因序列进行结果分析，计算等位基因频率、基因型频率、纯合度、遗 传杂合度和有效等位基因数，同时计算多态信息含量，分析基因突变与胴体及肉品质性状的 相关性。
进一步的，上述的一种牦牛肉质性状的鉴别方法，所述步骤2)中的PCR扩增体系如下： 总体积20μL，其中DNA模板0.8μL，正、反向引物各0.8μL，TaKaRa Premix Taq聚合酶 10μL，ddH2O加至20μL。
进一步的，上述的一种牦牛肉质性状的鉴别方法，所述步骤2)中，PCR扩增时的反应 条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，P5引物对60℃退火30s，P6引物对63℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
进一步的，上述的一种牦牛肉质性状的鉴别方法，所述步骤3)中PCR产物的SSCP电泳 检测过程为：取2.5μL的PCR产物，加入10μL变性上样缓冲液，98℃变性10min，迅 速冰浴5min后，上样到14％非变性聚丙烯酰胺凝胶；P5引物对得到的产物是采用200V电 压、12％胶浓度，电泳室温度19～25℃、电泳槽水冷循环温度25℃，进行电泳18h，银染法 显色后判定基因型；P6引物对得到的产物是采用240V电压、14％胶浓度，电泳室温度19～ 18℃、电泳槽水冷循环温度12℃，进行电泳18h，银染法显色后判定基因型。
进一步的，上述的一种牦牛肉质性状的鉴别方法，所述变性上样缓冲液的组成为：98％ 的去离子甲酰胺、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯氰、10mmol/L的乙二胺四乙酸EDTA。
进一步的，上述的一种牦牛肉质性状的鉴别方法，所述的12％非变性聚丙烯酰胺凝胶中， Acr:Bis为39:1。
本发明的有益效果为：本发明提供的检测UCP1基因突变的PCR-SSCP引物及其在牦牛肉 质性状预测和鉴别方法中的应用，参照GenBank中普通牛的UCP1基因序列，设计特异性引 物P5、P6，扩增牦牛UCP1基因，分析UCP1基因检测区域的序列及群体遗传特征，结合甘南 牦牛肉生产性能测定数据，分析UCP1基因突变对其胴体及肉质性状的影响，以丰富牦牛重 要经济性状候选基因分子遗传研究数据，从而预测牦牛的肉质性状，其优点是反应灵敏、特 异性强、操作简单、精确度高，可进行快速检测。
附图说明
图1显示为牦牛UCP1基因PCR扩增产物琼脂糖电泳。
其中：M：DL-600Marker；1-4：PCR扩增产物；e、f、g和h分别为P5、P6、P7和P8 引物扩增产物琼脂糖电泳图。
图2显示为牦牛UCP1基因PCR-SSCP电泳图。
其中：e、f、g和h分别为P5、P6、P7和P8引物扩增产物SSCP电泳图。
图3显示为牦牛UCP1基因5’UTR-exon1-intron1区序列比对。
其中：下划线部分为引物结合区；实线框表示编码区序列。
图4显示为牦牛UCP1基因exon3-intron3-exon4区序列比对。
其中：下划线部分为引物结合区；实线框表示编码区序列。
具体实施方式
实施例1：
一、材料来源：
1.1试验牛只：
本试验选择3个牦牛类群为研究对象。甘南牦牛722头，其中432头甘南牦牛测定其胴体 及肉质性状。
所有牦牛群体均体念血样，每头牛颈静脉采血10mL，枸木缘酸钠葡萄糖 (Acid-Citrate-Dextrose，ACD)抗凝、-70℃保存；部分牦牛血样滴于FTA卡(Flinders technologyAssociates,FTA)(Whatman,Middlesex,UK)常温保存。
1.2所用试剂及来源：
TaKaPa Premix Taq聚合酶(北京百泰克生物技术有限公司)、Goldview核酸染料、Tris 平衡酚、氯仿、蛋白酶K、ddH2O、柠檬酸、柠檬酸钠、PBS缓冲液、DNA Marker、异戊醇、无水乙醇、75％酒精、10％SDS、琼脂糖(Agrose)、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺、乙二胺四乙 酸二钠(EDTA)、TE溶液(PH＝8)、硼酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、过硫酸铵、TEMED、 去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯氰、丙烯酰胺、无水乙醇、甲醛、硝酸银、氢氧化钠、乙酸。
二、试验方法：
2.1牦牛胴体及肉质性状测定：
在甘南藏族自治州夏河县和玛曲县屠宰场，测定甘南牦牛胴体性状及肉质性状，包括胴 体重、眼肌面积、嫩度、失水率、熟肉率，并采集相应牦牛的血样，记录其年龄和性别。
(1)胴体重(热胴体)：牦牛屠宰后，去头、皮、内脏、蹄后劈半，称取左右两半胴体即为胴体重。
(2)肉质嫩度：按《肉嫩度的剪切力测定法》(NY/T 1180-2006)，在眼肌切取约0.5kg的 肉块放入密封袋内，在80℃恒温水浴锅加热，当肉样中心温度达到70℃后取出肉样并冷却至 中心温度为0-4℃。冷却后的肉样用取样器取12个肉柱，用C-LM3型数显式嫩度仪测定肉样的 剪切力。肉样嫩度平均剪切力值的计算公式：
式中：X：肉样的剪切力值，单位(N)
X1……Xn：有效重复肉样的剪切力值,单位(N)
X0：空载运行最大剪切力(N)
n：有效肉样的数量
(3)失水率：牦牛屠宰后1～2h内，在眼肌部位用圆形取样器切取肌肉样品3 块并称重，将待测肉样放在上下各18层定性滤纸中间，置于钢环膨胀压力仪上加压至35kg， 保持5min，撤去压力后，立即称肉样质量。按下列公式计算失水率：
式中：A1：肉样压前质量；A2：肉样压后质量
(4)熟肉率：肉煮熟后重量与鲜肉重量的比率。牦牛宰后1h内，在切取肉样一块，去除 肌膜和附着脂肪，称重(W1)后将样品置于蒸锅上，加盖95℃蒸30min，取出蒸熟肉样于0～4℃ 冷却2h后，再称熟肉重量(W2)。熟肉率计算公式：
式中：W1：肉样蒸煮后的质量；W2：肉样蒸煮前的质量
(5)眼肌面积：牦牛第12-13肋骨间眼肌横截面的面积。用硫酸纸描下其横断面轮廓，再 用求积仪测量所描轮廓的面积即为眼肌面积。
2.2基因组DNA的提取：
冻存血样采用苯酚-氯仿法提取基因组DNA，牦牛FTA卡保存血样参考Zhou等报道的两步 法提取基因组DNA。
冻存血样中提取基因组DNA的方法：
(1)室温解冻冻存血液样品，调水浴锅温度至37℃，调高速冷冻离心机至4℃。
(2)抽取解冻血样500μL和PBS缓冲液500μL移至1.5mL离心管，混合摇匀，在4℃ 离心机下以12000r/min的转速离心10min后，去其上清液。
(3)再加PBS缓冲液500μL，重复步骤(1)。
(4)弃上清液后的离心管中加入500mL DNA抽提液，充分混匀后，再加入20mg/mL蛋白 酶K 10μL，充分摇匀，用封口膜将其封口，55℃水浴处理18h至澄清。
(5)将混合液冷却至室温后，加入等体积Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10min，直至两 相混合形成乳浊液，然后在4℃离心机内以12000r/min离心10min，吸上清液。
(6)取上清液，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)混合溶液，缓慢颠倒离心管 10min，然后在4℃内离心机以12000r/min离心10min，吸上清液。
(7)取上清液，加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)混合溶液，缓慢地颠倒离心管10min， 4℃离心机12000r/min离心10min，吸取上清液。
(8)取上清液，将-20℃无水乙醇加入离心管中的沉淀DNA，缓慢摇动离心管直至离心管 内出现白色絮状物，4℃离心机12000r/min离心10min，弃上清液。
(9)在弃去上清液后，加入在4℃保存的70％的乙醇600mL清洗两次，然后在4℃离心机 内以12000r/min离心10min后，去其上清液。
(10)在弃去上清液后，将DNA置于室温中风干，之后再加入200μL TE溶解，于-20℃冷冻保存。
FTA卡保存血样的基因组DNA提取方法：
(1)用圆形取样器在FTA卡血液样品区打孔取样，分别将血样小圆片置于已 编号的PCR管中。
(2)依次向装有血样小圆片的PCR管加入200μL 20mM NaOH溶液，然后置于65℃恒温 加热器上加热约15-20min(加热的时间根据FTA卡已经的保存时间的长短调整，时间较长的 血样可以适当延长加热时间)至小圆片由红色变为白色。
(3)用真空泵吸去PCR管中NaOH溶液，然后加入200μL 1xTE缓冲液在室温下浸泡5min。
(4)用真空泵吸去PCR管中1xTE缓冲液并置于室温中使剩余液体完全挥发，风干后的小 圆片上附着的DNA可作为PCR扩增模板。
2.3引物设计与PCR扩增：
2.3.1引物设计：
参照GenBank中普通牛的UCP1基因序列(AC_000174.1)，设计特异性引物P5、P6、P7、 P8，扩增牦牛UCP1基因。牦牛UCP1基因引物信息见表1。引物由华大生物工程有限公司合 成。
表1
2.3.2PCR扩增：
PCR反应总体积20μL：基因组DNA(50ng/μL)0.8μL(或FTA卡1.2mm血样圆片1 个)。上、下游引物(0.25μmol/L)各0.8μL，TaKaRa Premix Taq预混酶(5U/μL)10.0μL， ddH2O加至20μL。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s(不同引物对应退火温度 不相同,见表1)，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min后4℃保存。应用ABI Veriti梯度PCR仪(Gene Company Limited,USA)进行PCR扩增，扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶 电泳检测。
2.4SSCP检测：
2.4.1非变性聚丙烯酰胺凝胶配置：
(1)用蒸馏水将准备好的制胶架、玻璃板、胶条和梳子清洗后晾干，再将玻璃板等安装 到制胶架上。
(2)非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液包括40％非变性聚丙烯酰胺溶液(Acr：Bis＝39:1)、 10×TBE、去离子水、TEMED和10％APS，按照10％、12％、14％浓度的比例配置，将配置好的 胶溶液快速搅拌均匀后灌入玻璃板中。
(3)灌胶至距玻璃板上约0.5cm时停止，将准备好的梳子缓慢插入，不能出现气泡。
(4)计时(约45min)待胶凝固后拔出梳子，玻璃板安装到电泳槽中，预电泳15min。
2.4.2SSCP电泳：
取2.5μL的PCR产物，加入10μL变性上样缓冲液(98％去离子甲酰胺、0.025％溴酚蓝、 0.025％二甲苯氰、10mmol·L–1乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)， 98℃变性10min，迅速冰浴5min后，上样到14％非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr：Bis＝39:1)， 根据不同引物所对应的最佳电压、水循环温度、电泳时长进行调节。各引物扩增片段SSCP 电泳的最佳条件见表2。
表2
2.4.3银染：
根据Byun等描述的方法对非变性聚丙烯酰氨凝胶银染，判定基因型后用干胶仪干胶保 存。具体步骤为：
(1)在SSCP电泳结束后，加入染色固定液静置5min。
(2)弃去固定液，加入染色液静置10min。
(3)弃去染色液，加入蒸馏水漂洗2次。
(4)加入60℃左右显色液显色10-15min，至条带清晰后弃去显色液并判型。
(5)将凝胶置于A4纸上判型，拍照并在干胶仪上干燥后保存。
2.4.4等位基因序列测定：
根据PCR-SSCP电泳判型，检测到的等位基因如果存在纯合型个体，用其PCR产物直接测 序；如果等位基因仅存在杂合型个体中，参照Hu等的方法切胶后测序。等位基因序列测定在 上海生工生物工程公司完成。
2.5数据统计与分析：
2.5.1统计分析软件：
运用Popgen32软件计算等位基因频率、基因型频率、纯合度(homozygosity,Ho)、遗 传杂合度(heterozygosity,He)和有效等位基因数(effective number of alleles,Ne)， 运用LittlePrograme软件计算多态性信息含量(polymorphism informationcontent,PIC)。 基因突变与乳品质性状和胴体及肉品质质性状的相关分析用SPSS 19.0软件分析。
2.5.2基因型频率与基因频率：
(1)基因型频率：所研究群体中，某一种基因型个体数占群体内全部基因型个体数的百 分比。假设群体中检测到AA、BB、AB3种基因型，AA基因型频率计算方法如下：
式中：f(AA)表示AA的基因型频率，nAA表示AA基因型个体数、nBB表示BB基因型个体数、nAB表示AB基因型个体数。
(2)基因频率：所研究的群体中，某一种基因在群体中的总数占等位基因总数的比率。 假设某一群体检测到2个等位基因A和B，则等位基因A和B的计算公式如下：
式中：f(A)表示群体中等位基因A的频率，f(B)表示群体中等位基因B的频率，nAA、nAB、 nBB分别为AA、AB和BB基因型个体数。
2.5.3纯合度和杂合度：
纯合度是指在某一个群体内，在特定位点上的等位基因纯和的程度，其意义在于随机抽 取两个样品的等位基因相同的概率；一个群体的遗传变异程度，常用每一个基因座上基因的 遗传杂合度度量。杂合度与群体遗传变异呈正相关。计算公式如下：
纯合度：杂合度：
式中：P代表某一位点上第i个等位基因的基因频率；n代表某一位点上的等位基因个 数。
2.5.4有效等位基因数：
有效等位基因数是衡量基因纯合度的指标，反映了群体分布的均匀程度，与纯合度是倒 数的关系，计算公式为如下：
式中：Pi代表某一位点上第i个等位基因的频率；n代表某一位点上等位基因的个数。
2.5.5多态信息含量：
多态信息含量是衡量基因多态性的尺度，当PIC＞0.5时，表示该基因高度多态；当0.25 ＜PIC＜0.5时，表示中度多态；当PIC＜0.25时，呈现低度多态，其计算公式如下：
式中：n代表群体中等位基因总数；Pi代表某一位点上第i个等位基因的频率；Pj代表某 一位点上第j个等位基因的频率。
2.5.6连锁不平衡分析：
连锁不平衡，是在形成配子的过程中同源染色体非姐妹染色单体间发生了交换，或在连 锁遗传中，由于互换而使得基因发生重组，并产生不同于亲本类型的重组类型，但重组比率 明显少于自由组合的类型，D’值和r2值是衡量连锁不平衡的两个常用参数，D＇是与频率无 关的量，r2是与频率有关的量，两个位点无重组时，r2也不一定达到最大值1。
D＇＝0，r2＝0说明两位点连锁达到平衡，同时产生四种单倍型频率相同。
D＇＝0，r2＝0.33说明两位点自由组合，符合自由组合定律。
D＇＝0，r2＝1说明两位点没有发生重组，4种单倍型最多只能出现2种且等位基因频率 均相等。
2.5.7UCP1基因突变与胴体及肉质性状测定值的相关分析：
因牦牛年龄对其肉质及胴体性状有较大影响，所以甘南牦牛群体分年龄段进行相关性分 析，并在每一年龄段考虑性别及场(甘南牦牛来源)效应对性状的影响，其统计模型为：
Y ijk＝μ+G i+Sj+F k+e ijk
Y ijk＝μ+Ai+Sj+F k+e ijk
式中：Y ijk为性状表型值，μ为群体均值；Gi为基因型效应；Sj为性别效应；Ai为等位基因效应；F k为场效应；eijk为随机误差。
三、结果分析：
1、UCP1基因PCR扩增：
1.1牦牛UCP1基因PCR扩增：
牦牛UCP1基因5’UTR-exon1-intron1、exon3-intron3-exon4、exon 5和exon6区PCR 扩增产物琼脂糖电泳检测见图1(e-h)。4区域扩增产物长度与预期长度相符，电泳条带清晰 且没有非特异性条带。PCR扩增产物可用于SSCP分析。
2、牦牛UCP1基因SSCP检测：
2.1牦牛UCP1基因SSCP检测：
牦牛UCP1基因5′UTR-exon1-intron1区(P5引物)SSCP检测见图2(e)，引物扩增区域发现3种SSCP带型，代表3种等位基因A1、B1和C1，检测到3种基因型分别为A1A1、A1B1、 A1C1。牦牛UCP1基因exon3-intron3-exon4区(P6引物)SSCP检测图见图2(f)，引物扩增 区域发现2种SSCP带型，代表2种等位基因A2、B2，检测到3种基因型分别为A2A2、B2B2、 A2B2。牦牛UCP1基因exon5(P7引物)和exon6区(P8引物)SSCP检测分别见图2(g)和2(h)， 扩增区域均未检测到多态性。
3、UCP1基因序列比对：
3.1牦牛UCP1基因序列比对：
3.1.1牦牛UCP1基因5’UTR-exon1-intron1区等位基因序列比对：
牦牛UCP1基因5’UTR-exon1-intron1扩增区域等位基因序列比对见图3。以牦牛等位 基因B1序列为参照，等位基因A1和C1存在c.14A＞C、c.-23G＞C的2处SNPs；与普通牛UCP1基因序列(GenBank登录号：AC_000174.1)比对，牦牛等位基因存在c.14A＞C、c.138 +31A＞G、c.-23G＞C的3处SNPs。
3.1.2牦牛UCP1基因exon3-intron3-exon4区等位基因序列比对：
牦牛UCP1基因exon3-intron3-exon4扩增区域等位基因序列比对见图4。牦牛UCP1基 因等位基因A2序列与普通牛序列(GenBank登录号：AC_000174.1)相同，等位基因B2存在c.529 +7C＞G的SNPs。
4、牦牛UCP1基因群体遗传学分析：
4.1牦牛UCP1基因5′UTR-exon1-intron1和exon3-intron3-exon4区群体遗传学分析：
牦牛UCP1基因5′UTR-exon1-intron1区群体遗传学分析见表3-1。甘南牦牛基因型A1C1和等位基因A1频率最高为优势基因型和等位基因；天祝白牦牛和大通牦牛基因型A1B1和等位基因A1频率最高为优势基因型和等位基因。3类群牦牛PIC值0.2836～0.4963属中度多态，且甘南牦牛显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态。
牦牛UCP1基因exon3-intron3-exon4区群体遗传学分析见表3-2。甘南牦牛、天祝白牦 牛和大通牦牛基因型A2B2和等位基因A2频率最高为优势基因型和等位基因。3类群牦牛PIC 值0.228～0.362属中度多态，且甘南牦牛显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态。
表3-1
注：**表示极显著地偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)。
表3-2
注：**表示极显著地偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)。
5、牦牛UCP1基因单倍型及连锁不平衡分析：
5.1牦牛UCP1基因突变位点间单倍型及连锁不平衡分析：
3类群牦牛UCP1基因5′UTR-exon1-intron1与exon3-intron3-exon4单倍型种类及频 率见表3-3。牦牛UCP1基因5′UTR-exon1-intron1与exon3-intron3-exon4的3个突变位点在群体中实际形成6种单倍型，分别命名为F1～F6，单倍型A1A2频率最高为20.25％，B1B2频率最低为1.97％。
表3-3
| 单倍型序号 | 单倍型 | 频率(％) |
| F1 | A1A2 | 20.254 |
| F2 | A1B2 | 12.268 |
| F3 | B1A2 | 6.828 |
| F4 | B1B2 | 1.967 |
| F5 | C1A2 | 6.944 |
| F6 | C1B2 | 2.777 |
牦牛UCP1基因3个SNPs位点连锁不平衡分析见表3-4。牦牛UCP1基因c.-23G＞C位点 与c.14A＞C位点D'>0.8，但r2接近0(r2≈0)，两位点间存在强连锁关系但接近连锁平衡；其他各SNPs位点间均0<D”＜0.8且r2均接近0(r2≈0)，存在一定程度的连锁关系且接近于连锁平衡，表明他们趋向于相互独立遗传。
表3-4
| 突变位点 | c.14A＞C | c.529+7C＞G |
| c.-23G＞C | D'＝1；r2＝0.061 | D'＝0.124；r2＝0.002 |
| c.14A＞C | / | D'＝0.087；r2＝0.003 |
注：D'表示连锁不平衡区域内重组事件发生的概率；r2表示连锁分析的效力值。
6、甘南牦牛UCP1基因突变与胴体及肉质性状相关性分析：
6.1甘南牦牛UCP1基因5′UTR-exon1-intron1突变与胴体及肉质性状相关性分析：
不同年龄段甘南牦牛UCP1基因5′UTR-exon1-intron1基因型、等位基因与胴体及肉质 性状的关联分析见表3-5和表3-6，天祝白牦牛和大通牦牛因没有生产数据未做相关性分析。
UCP1基因5′UTR-exon1-intron1突变影响不同年龄段甘南牦牛熟肉率、失水率及胴体 重。各基因型间多重比较表明，3～6岁甘南牦牛A1C1型个体熟肉率均较高，3岁和5岁牦牛A1C1基因型个体的熟肉率显著高于A1A1型(P<0.05)；4岁牦牛基因型A1A1个体失水率显著高于A1C1。 3～6岁甘南牦牛A1B1基因型个体胴体重均较高，且携带等位基因B1的个体胴体重均高于缺失等 位基因B1的个体，其中3岁牦牛携带等位基因B1的个体胴体重显著高于未携带个体(P<0.05)。 UCP1基因5’UTR-exon1-intron1突变对各龄牦牛肌肉嫩度和眼肌面积无显著影响。
表3-5
注：同行不同小写字母表示差异显著；括号内数字为各基因型牦牛头数。下同。
表3-6
6.2甘南牦牛UCP1基因exon3-intron3-exon4突变与胴体及肉质性状相关性分析：
不同年龄段甘南牦牛UCP1基因exon3-intron3-exon4基因型、等位基因与胴体及肉质性 状的关联分析见表3-7和表3-8。方差分析表明，各基因型及等位基因对3～6岁甘南牦牛胴 体及肉质性状无显著影响。基因型A2A2个体胴体重均较高，而未携带等位基因B2的牦牛个体 胴体重也高于携带者。
表3-7
表3-8
6.3、甘南牦牛UCP1基因5′UTR-exon1-intron1与exon3-intron3-exon4单倍型与肉品质 性状相关性分析：
甘南牦牛UCP1基因5′UTR-exon1-intron1与exon3-intron3-exon4单倍型组合与乳品质 性状关联分析见表3-9，其中个体数小于3的单倍型组合不做方差分析。分析结果表明，单倍 型组合F2F2个体的嫩度剪切力值、胴体重及眼肌面积均低于其他单倍型个体，熟肉率均高于 其他单倍型，但无显著差异。
表3-9
四、结论：
1.牦牛UCP1基因多态性较丰富。其中UCP1基因5′UTR-exon1-intron1和 exon3-intron3-exon4区分别检测到2处和1处SNPs；检测区域为中度多态。
2.牦牛UCP1基因检测区域突变位点构建6种单倍型，检测区域突变位点间存在连锁遗 传但接近连锁平衡状态。
3.UCP1基因5′UTR-exon1-intron1突变影响不同年龄段甘南牦牛胴体重及部分肉质 性状，3-6岁牦牛基因型A1C1个体熟肉率、A1B1基因型个体胴体重均较高，而4岁牦牛基因型 A1A1个体失水率较高。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前 述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围 之内。
序 列 表
<110> 甘肃农业大学
<120> 检测UCP1基因突变的PCR-SSCP引物及其在牦牛肉质性状预测和鉴别方法中的应用
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> P5正向引物
<400> 1
ggagtgagaa gccaggcag 19
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> P5反向引物
<400> 2
tacctaaggt gagaaaggat g 21
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> P6正向引物
<400> 3
caaggtcaga ctgcaagctc 20
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> P6反向引物
<400> 4
cctgccatgt gagaaagaaa gt 22
Claims (10)
1.两对用于检测UCP1基因突变的PCR-SSCP引物对，其特征在于，所述两对PCR-SSCP引物对分别为P5、P6；所述引物对P5的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.2；所述引物对P6的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.3，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.4。
2.权利要求1所述的两对PCR-SSCP引物对在检测UCP1基因突变中的应用。
3.权利要求1所述的两对PCR-SSCP引物对在牦牛肉质性状预测和鉴别中的应用。
4.用于预示牦牛肉质性状的PCR-SSCP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括有两对PCR-SSCP引物对P5、P6的正向引物、反向引物，所述引物对P5的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.2；所述引物对P6的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.3，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.4。
5.一种牦牛肉质性状的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）采集样品和提取DNA；
2）待测样本DNA的PCR扩增，所用两对引物对分别为P5、P6；所述引物对P5的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ IDNO.2；所述引物对P6的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.3，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.4；
3）SSCP电泳检测，将步骤2）得到的PCR产物进行SSCP电泳，电泳结束后银染判定基因型，再进行等位基因序列测定；
4）以测定后的等位基因序列进行结果分析，计算等位基因频率、基因型频率、纯合度、遗传杂合度和有效等位基因数，同时计算多态信息含量，分析基因突变与胴体及肉品质性状的相关性。
6.根据权利要求5所述的一种牦牛肉质性状的鉴别方法，其特征在于，所述步骤2）中的PCR扩增体系如下：总体积20μL，其中DNA模板0.8μL，正、反向引物各0.8μL，TaKaRa PremixTaq聚合酶10μL，ddH2O加至20μL。
7.根据权利要求5所述的一种牦牛肉质性状的鉴别方法，其特征在于，所述步骤2）中，PCR扩增时的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，P5引物对60℃退火30s，P6引物对63℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
8.根据权利要求5所述的一种牦牛肉质性状的鉴别方法，其特征在于，所述步骤3）中PCR产物的SSCP电泳检测过程为：取2.5 μL的PCR产物，加入10μL变性上样缓冲液，98 ℃变性10 min，迅速冰浴5 min后，上样到14%非变性聚丙烯酰胺凝胶；P5引物对得到的产物是采用200V电压、12%胶浓度，电泳室温度19～25℃、电泳槽水冷循环温度25℃，进行电泳18h，银染法显色后判定基因型；P6引物对得到的产物是采用240V电压、14%胶浓度，电泳室温度19～18℃、电泳槽水冷循环温度12℃，进行电泳18h，银染法显色后判定基因型。
9.根据权利要求8所述的一种牦牛肉质性状的鉴别方法，其特征在于，所述变性上样缓冲液的组成为：98%的去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯氰、10 mmol/L的乙二胺四乙酸EDTA。
10.根据权利要求8所述的一种牦牛肉质性状的鉴别方法，其特征在于，所述的12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中，Acr:Bis为39:1。
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