CN110157814A - 一种与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的snp分子标记及其检测方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记及其检测方法与应用，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，且SEQ ID NO:1的第500位为A或C。本发明提供了一种与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记，可以用于家系选育中的早期选择，也可在选配中提供分子依据。本发明的SNP分子标记为鸡腿部皮肤毛囊密度性状的筛选提供了新的方法，可以节省生产成本并加快遗传发展，更好地服务于优质肉鸡的育种，具有很大的经济价值和科研价值。

Description

一种与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记及其检 测方法与应用

技术领域

本发明属于家禽基因工程的技术领域，更具体地，涉及一种与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记、检测引物、获取方法及应用。

背景技术

我国传统的优质肉鸡消费是以活鸡为主，消费者主要通过鸡的羽色外貌、胫色、冠的发育等简单且直观的特征与产品的内在质量联系在一起。截止目前通过国家审定的肉鸡新品种、配套系也大多是注重羽色外貌而迎合活鸡市场的类型，对鸡屠宰后的皮肤的屠体外观性状关注不高。然而，H7N9疫情给以活鸡方式交易的我国优质鸡产业带来了毁灭性的打击。“规模养殖、集中屠宰、冷链配送、冰鲜上市”成为国家主要推行的肉鸡销售模式。屠宰冷鲜上市后，原本能代表优质鸡的外观性状将不复存在。同时，现有的优质鸡的屠体色泽、毛囊大小、均一性等性状将直接影响消费者的购买意愿。毛囊密度的大小是屠宰后的鸡屠体外观的重要性状特征。消费者通常更青睐于密而小的皮肤毛囊屠体外观。因此，皮肤毛囊的大小将成为育种工作者重点关注和加强选择的性状。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP作为第三代分子标记，具有数量多、分布广、代表性强和遗传稳定性好等特点。目前已经在动植物的遗传多样性分析、基因作图、分子标记辅助育种和功能基因学的研究中得到了广泛的应用。因此，研究与毛囊密度性状相关的分子标记，并在分子育种中加以运用，能够实现鸡皮肤毛囊密度性状的早期选择，节省生产成本并加快遗传进展，更好地服务于整个肉鸡产业的发展需要。

Wnt3a(Wnt family member 3A)基因属于Wnt基因家族，能够通过调节与毛囊生长发育相关的信号通路如FGF、BMP、胞外基质信号等通路进而调节毛囊的生长发育。前期研究通过表达谱芯片技术筛选毛囊密度差异显著的鸡的不同部位皮肤毛囊的差异表达基因，发现Wnt3a基因在腿部皮肤毛囊组织中表达出现极显著下调。哺乳动物上的研究发现，Wnt3a基因在人、鼠、羊等动物皮肤毛囊的生长发育中具有重要的作用。关于其在鸡皮肤毛囊生长发育中的作用，相关报道甚少；且现有技术中还没有与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记的相关报道。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记及其检测方法与应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，且SEQ ID NO:1的第500位为A或C。

本发明还提供了一种上述与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记的检测引物，所述检测引物包括SEQ ID NO:2所示的上游引物，和SEQ ID NO:3所示的下游引物。

本发明还提供了一种用于鸡腿部皮肤毛囊密度性状检测的试剂盒，所述试剂盒包上述检测引物。

本发明还提供了上述的检测引物或试剂盒在早期选择鸡腿部皮肤毛囊密度性状中的应用。

本发明还提供了上述的检测引物或试剂盒在鸡遗传育种中的应用。

本发明又提供了所述的与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记的检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)PCR扩增待测鸡的基因组DNA，得到PCR扩增产物；

(2)将所得PCR扩增产物测序后，获得所述SNP分子标记的基因型。

进一步的，PCR扩增所用的上下游引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

本发明的有益效果：本发明提供了一种与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记，针对该分子标记位点的单核苷酸多态性，设计特定的引物扩增包含SNP位点的基因片段，通过测序分析，检测待测鸡SNP位点的基因型，能够简单、快速、成本低、精确地检测其单核苷酸的多态性，对鸡腿部皮肤毛囊密度性状进行早期选择，可以用于家系选育中的早期选择，也可在选配中提供分子依据。本发明的SNP分子标记为鸡腿部皮肤毛囊密度性状的筛选提供了新的方法，可以节省生产成本并加快遗传发展，更好地服务于优质鸡的育种，具有很大的经济价值和科研价值。

附图说明

图1是本发明实施例中的基因分型结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细地解释说明。

本发明的与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记，所述分子标记位于SEQID NO:1所示核苷酸序列的第500位，该位点的核苷酸为A或C，导致该基因位点的单核苷酸多态性。PCR扩增得到与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记来自Wnt3a基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列第500位碱基处的A/C突变。

针对上述SNP分子标记，本发明还公开了其获取方法，包括以下步骤：

(1)PCR扩增待测鸡基因组DNA，获得PCR扩增产物；

(2)将PCR扩增产物进行测序，通过分析判定基因型；

(3)将不同基因型与鸡腿部皮肤毛囊性状进行关联分析，从而获取所述SNP分子标记。

其中，步骤(1)中，PCR扩增所用正向引物序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物序列如SEQ ID NO:3所示。步骤(2)中，所述基因型为AA、AC或CC。步骤(3)中，所述性状为鸡腿部皮肤毛囊密度性状。

本发明还公开了包括上述引物组的检测试剂盒，所述检测试剂盒中除包含如上引物外，还包括：Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTPs、Mg²⁺、ddH₂O、DNA Marker。

本发明的与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记的检测方法，具体包括以下步骤：

(1)试验材料

待测鸡群体来自于江苏立华牧业股份有限公司培育的早熟、青脚、优质肉鸡新品系，自由采食，充足饮水。饲喂至9周龄，采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取1mL血液，注入装有抗凝剂的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号。同时测定每只鸡大腿部皮肤2×2cm²内的毛囊数量，并记录翅号，毛囊数量。

(2)基因组DNA的提取

取裂解血样0.3mL(抗凝血：裂解液＝1：10)，加入0.2mL TE、加入5μL RNase A(20μg/μL)、5μL蛋白酶K(50μg/μL)，重悬混匀，在55℃水浴12个小时；加入等体积Tris饱和酚，摇20分钟后，12000g离心10分钟；转移出上清液，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，摇10分钟后，12000g离心10分钟；抽提上清液中加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)摇10分钟，12000g离心10分钟；抽提上清液中加入2倍体积的冰无水乙醇，轻摇、沉淀DNA；7500g离心10分钟，倒出乙醇；70％乙醇洗涤2次。在超净工作台上风干，加200μLTE溶解，-20℃保存备用；即得到所提取的DNA。

(3)PCR扩增SNP位点所在片段

根据Wnt3a基因组序列，设计包含待测位点序列的引物，所述正向引物和反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:2-3所示；以上述鸡基因组DNA为模板，在包含待测位点序列的上下游引物、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTPs、Mg²⁺存在的情况下，在PCR反应条件下进行扩增，PCR产物大小为593bp。所述引物对序列如下：

F Primer：5’-GTCCATGCCATCGCCTCTG-3’(SEQ ID NO：2)；

R Primer：5’-TCCTACACCCAGGTACACATAGG-3’(SEQ ID NO：3)

PCR扩增反应的具体步骤为：

①PCR扩增反应体系准备：50ng/μl DNA模板1μl、2mM dNTP 5μl、3mM Mg²⁺0.6μl、1×PCR反应缓冲液5μl、10μM上下游引物各1μl、1U/μl Taq聚合酶2.5μl，加ddH₂O至总体积50μl。

②PCR扩增反应程序设置：在Perkin-Elmergene Amp PCRsystems 9600上进行扩增反应，PCR扩增反应程序为：95℃变性3min，35次循环(94℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 20s)72℃延伸5min，得到PCR扩增产物。

③反应结束后，取2μl反应产物在1.0％琼脂糖胶，0.5×TBE中电泳，检测反应是否成功，剩余反应产物在-20℃的条件下保存。

(4)基因型判定与关联分析

将PCR扩增产物送上海生物工程有限公司进行测序。根据测序的结果判定该位点在检测群体中的基因型。基因分型结果如图1所示，如果该样本是纯合子的话，就只有一个产物峰：A峰或C峰。如果是杂合，那么就会出现2个峰：A峰和C峰。

采用SAS统计分析软件包的GLM过程进行统计分析，对供试鸡群的基因型和鸡的腿部皮肤毛囊密度进行关联分析，P-value<0.05表示差异显著。

关联分析结果如表1所示，AA基因型个体鸡的腿部皮肤毛囊密度与CC型相近。AC基因型个体鸡的腿部皮肤毛囊密度显著高于AA型和CC型。所以AC基因型为优势基因型。在育种筛选中，只选择AC型，可以在群体中固定该基因型。该SNP位点可以作为鸡腿部皮肤毛囊密度性状的辅助选择和分子遗传育种标记。

表1不同基因型个体9周龄的鸡腿部皮肤毛囊密度统计分析

注：在同一列中小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

检测所述SNP分子标记的引物组或检测试剂盒在早期选择鸡腿部皮肤毛囊密度性状或鸡遗传育种中的应用，选择所述SNP分子标记的基因型为AC的个体。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江苏省家禽科学研究所

<120> 一种与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记及其检测方法与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 593

<212> DNA

<213> 鸡(Gallusgallus domesticus)

<400> 1

gtccatgcca tcgcctctgc cggagtggct tttgcagtga ccaggtcctg cgccgagggc 60

tcggccacca tctgcggctg tgacactcgt cacaagggat ctccagggga aggctggaaa 120

tggggaggct gcagtgagga cgtggagttt gggagcatgg tgtctcggga attcgccgat 180

gcccgagaga acagaccaga cgctcggtca gccatgaaca ggcacaacaa tgaagctgga 240

aggaccgtaa ggacatttga ttttaccttt cttgatctcc tgtgctgatt tcttacctcc 300

agggggaact aacaggagta atcaaacaga aatctgggct gctttatgtt gtgaagtggt 360

gatacgtgtc ccaaaatggt tctttactgg gaggtgacca atggatccct gtgcctggtc 420

ttaaagtaaa tccacccact cagatgtaaa tgtctaactt ggagttaatt gtccatatac 480

ctctgtagta agtggatcaa aacaggcagc actagggtgg aataggaagc acgaagtttt 540

ggatcttgaa atagctcagt tggacgatgc cctatgtgta cctgggtgta gga 593

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

gtccatgcca tcgcctctg 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 3

tcctacaccc aggtacacat agg 23

Claims (7)

1.一种与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，且SEQ ID NO:1的第500位为A或C。

2.权利要求1所述的与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记的检测引物，其特征在于，所述检测引物包括SEQ ID NO:2所示的上游引物，和SEQ ID NO:3所示的下游引物。

3.一种用于鸡腿部皮肤毛囊密度性状检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的检测引物。

4.权利要求2所述的检测引物或权利要求3所述的试剂盒在早期选择鸡腿部皮肤毛囊密度性状中的应用。

5.权利要求2所述的检测引物或权利要求3所述的试剂盒在鸡遗传育种中的应用。

6.权利要求1所述的与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)PCR扩增待测鸡的基因组DNA，得到PCR扩增产物；

(2)将所得PCR扩增产物测序后，获得所述SNP分子标记的基因型。

7.根据权利要求6所述的与鸡腿部皮肤毛囊密度性状相关的SNP分子标记的检测方法，其特征在于，PCR扩增所用的上下游引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。