KR20180055254A

KR20180055254A - 비타민 a 제한 급여에 따른 한우 품질 판별 방법

Info

Publication number: KR20180055254A
Application number: KR1020160152874A
Authority: KR
Inventors: 이홍구; 팽동교; 오영균; 백열창
Original assignee: 건국대학교 산학협력단; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2016-11-16
Publication date: 2018-05-25
Also published as: KR102076798B1

Abstract

본 발명은 a) 비타민 A가 제한 급여된 한우(Bos taurus coreanae)의 생체시료로부터 DNA를 추출하는 단계; b) 상기 DNA를 프라이머에 의해 PCR(Polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응)로 증폭한 후, 증폭된 PCR 산물에 제한효소를 처리하여 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소 절편 다형성) 분석을 수행하는 단계; c) 상기 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소 절편 다형성) 분석에 의해 검출된 한우 ADH1C 유전자의 개체별 단일염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 검출하고, 각각의 SNP 유전자형을 분석하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계의 분석을 통하여 유전적으로 근내지방(marbling) 및 도체중(carcass weight)이 높은 한우를 예측하고 판정하는 단계를 포함하는 한우 품질 판별 방법; 및 한우 품질 판별용 키트에 관한 것이다.

Description

비타민 A 제한 급여에 따른 한우 품질 판별 방법{METHOD OF DISCRIMINATING QUALITY OF HANWOO BY FEEDING RISTRICTION OF VITAMIN A}

본 발명은 비타민 A 제한 급여에 따른 한우 품질 판별 방법으로서, 더욱 상세하게는 비타민 A가 제한 급여된 한우(Bos taurus coreanae) ADH1C의 특정 SNP 유전자형을 분석함으로써 유전적으로 근내지방(marbling) 및 도체중(carcass weight)이 높은 한우를 예측하고 판정하는 단계를 포함하는 한우 품질 판별 방법에 관한 것이다.

1990년대 이후 쇠고기의 소비증가가 가속화되고 있으며, 쇠고기 수입 또한 지속적으로 증가 되고 있는 추세에 있다. 따라서 국내산 쇠고기의 국제경쟁력 향상 및 제고를 위해서는 한우육의 품질 고급화 개선을 통해 소비자 선호에 부흥하고 또한, 육생산량을 높여 경제성을 높이는 기술이 시급한 실정이다. 따라서, 한우의 경쟁력을 높이기 위해서는 한우의 주요 경제형질에 대한 능력개량이 가장 확실한 경쟁력의 확보 수단이라 할 수 있다.

쇠고기의 육질 특성은 근내지방도(marbling), 육색(meat color), 지방색(fat color), 조직감(meat texture) 및 성숙도(meat firmness)등이 있다. 이들 육질을 나타내는 특성 중에서 근내지방이 가장 높게 평가되고 있다. 근내지방은 근육지방중 1, 2차 근속 사이에 있는 지방을 말하며 일명 '마블링(Marbling)' 또는 '상강지방(霜降脂肪)'으로 불려지기도 하는데 붉은 살코기에 지방이 들어 있는 모양이 마치 서리가 내린 것처럼 보이거나 대리석 같기 때문이다. 근내지방은 고기의 품질(육질)을 결정하는 중요한 요소로 고기의 맛과 밀접한 관계가 있다. 또한, 한우 육량등급 판정의 경우 도체중(carcass weight), 도체율(dressing percentage), 등지방두께(backfat thickness) 및 배최장근단면적(M. longissimus dorsi area)등의 도체성적 항목을 이용하여 A, B, C 및 등외등급으로 육량등급을 판정하고 있는데 이들 항목 중에서 특히 도체중은 육량 등급을 결정하는데 매우 지대한 영향을 미치는 요인 중 하나이다. 따라서, 한우의 육질 품질과 경제성을 향상시키려면 유전적으로 근내지방도가 우수하고 도체중이 높은 우량 한우 개체를 조기에 진단하고 선발하여 최적의 환경에서 사육, 관리하는 것이 매우 중요하다.

한편, 비타민 A는 간(liver)과 지방조직(adipose tissue)에 저장되는 지용성비타민으로 정상적인 동물생리(시각, 항산화작용, 번식, 점막세포분화발달 등)에 필수적인 물질이다. 이러한 비타민 A가 지방전구세포의 분화를 억제하다는 사실이 밝혀지면서(Murray와 Russell, 1980), 제한시킬 경우 지방전구세포의 분화를 촉진함으로써 마블링을 향상시킨다는 일본의 Oka 등(1998)의 연구를 시작으로 지난 15년 동안 일본과 미국에서 많은 연구가 진행되어 왔고, 대부분 긍정적인 연구결과가 발표되었다. 또한 혈중 내 낮은 비타민A 농도는 높은 마블링 수준과 연관이 있다는 연구결과도 보고된 바 있다(Akio Oka,1997). 일본에서는 이미 수년전부터 화우농가에 비타민 A 제한 사양기술이 대부분 보급되어 있는 상태이며, 우리나라에서도 최근 3-4년 전부터 사료회사를 중심으로 비타민 A 제한 기술이 한우농가에 접목되고 있는 실정이다.

본 발명은 a) 비타민 A가 제한 급여된 한우(Bos taurus coreanae)의 생체시료로부터 DNA를 추출하는 단계; b) 상기 DNA를 프라이머에 의해 PCR(Polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응)로 증폭한 후, 증폭된 PCR 산물에 제한효소를 처리하여 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소 절편 다형성) 분석을 수행하는 단계; c) 상기 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소 절편 다형성) 분석에 의해 검출된 한우 ADH1C 유전자의 개체별 단일염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 검출하고, 각각의 SNP 유전자형을 분석하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계의 분석을 통하여 유전적으로 근내지방(marbling) 및 도체중(carcass weight)이 높은 한우를 예측하고 판정하는 단계를 포함하는 한우 품질 판별 방법 등을 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 a) 비타민 A가 제한 급여된 한우(Bos taurus coreanae)의 생체시료로부터 DNA를 추출하는 단계; b) 상기 DNA를 프라이머에 의해 PCR(Polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응)로 증폭한 후, 증폭된 PCR 산물에 제한효소를 처리하여 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소 절편 다형성) 분석을 수행하는 단계; c) 상기 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소 절편 다형성) 분석에 의해 검출된 한우 ADH1C 유전자의 개체별 단일염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 검출하고, 각각의 SNP 유전자형을 분석하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계의 분석을 통하여 유전적으로 근내지방(marbling) 및 도체중(carcass weight)이 높은 한우를 예측하고 판정하는 단계를 포함하는 한우 품질 판별 방법을 제공한다.

상기 a) 단계의 비타민 A는 100 IU/㎏ 내지 2000 IU/㎏의 농도일 수 있다.

상기 a) 단계의 한우의 생체시료는 혈액, 소변, 타액, 우유로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 b) 단계의 프라이머는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시될 수 있다.

상기 b) 단계의 제한효소는 BsⅡ 또는 2U인 것일 수 있다.

상기 c) 단계의 한우 ADH1C 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있다.

상기 c) 단계의 ADH1C 유전자의 SNP 서열은 염기서열 64번째 C↔T 염기치환에 의해 형성되는 것일 수 있다.

상기 c) 단계의 분석은 단일염기 다형성(SNP) 유전자형이 TT형 또는 TC형인 것을 확인하는 것일 수 있다.

상기 d) 단계는 한우 ADH1C 유전자의 단일염기 다형성(SNP) 유전자형 가운데 TC 유전자형을 나타내는 한우개체가 TT 유전자형을 나타내는 한우개체에 비해 유전적으로 근내지방도 및 도체중이 높은 한우로 예측하고 판정하는 것일 수 있다.

본 발명은 a) 비타민 A가 제한 급여된 한우(Bos taurus coreanae)로부터 혈액을 채취하는 단계; b) 상기 채취된 한우 혈액의 혈중 비타민 A 농도를 측정하는 단계; c) 상기 혈중 비타민 A 농도의 감소율로부터 근내지방도 및 도체중이 높은 한우로 예측하고 판정하는 것을 특징으로 하는 한우 품질 판별 방법을 제공한다.

상기 c) 단계의 혈중 비타민 A 농도 감소율은 10% 내지 60%인 것일 수 있다.

본 발명은 a) 비타민 A가 제한 급여된 한우(Bos taurus coreanae)로부터 혈액을 채취하는 단계; b) 상기 a) 단계의 혈액으로부터 한우의 혈중 비타민 A 농도를 측정하고 혈중 비타민 A 농도 감소율을 분석하는 단계; c) 상기 a) 단계의 혈액으로부터 DNA를 추출하고, 프라이머에 의해 PCR(Polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응)로 증폭한 후, PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소 절편 다형성) 분석에 의해 검출된 한우 ADH1C 유전자의 개체별 단일염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 검출하고, 각각의 SNP 유전자형을 분석하는 단계; 및 d) 상기 b) 단계 및 c) 단계을 통하여 유전적으로 근내지방(marbling) 및 도체중(carcass weight)이 높은 한우를 예측하고 판정하는 단계를 포함하는 한우 품질 판별 방법을 제공한다.

상기 b) 단계의 혈중 비타민 A 농도 감소율은 10% 내지 60%인 것일 수 있다.

본 발명은 비타민 A가 제한 급여된 한우(Bos taurus coreanae) DNA를 증폭시키기 위한 프라이머쌍; 및 상기 DNA 염기서열의 특정부위를 절단하기 위한 제한효소를 유효성분으로 포함하는 한우 품질 판별용 키트를 제공한다.

상기 프라이머쌍은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있다.

상기 제한효소는 BsⅡ 또는 2U인 것일 수 있다.

상기 한우 품질 판별용 키트는 한우의 생체시료를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 한우 ADH1C 유전자의 64번째 C↔T 염기치환으로 인한 단일 염기 다형성 마커(TT 및 TC형)을 이용하여 한우 개체의 근내지방 및 도체중에 대한 특성을 규명할 수 있는 바, ADH1C 유전자의 TC 유전자형을 보유하고 있는 개체를 조기에 진단하고 선발 육종함으로써 한우의 개량 및 생산성 증대에 기여할 수 있다.

또한, 본 발명은 한우의 genomic DNA를 대상으로 PCR-RFLP 분석 방법을 이용하는 최첨단 분자육종 기술로서 본 발명에서 이용한 PCR-RFLP 분석 기법은 신속하고 간편하며 정확성이 높아 선발의 효율성과 실용성을 극대화 할 수 있을 뿐만 아니라 다수의 시료를 대상으로 DNA marker 유전자형을 보다 간편하고 신속하며, 정확하게 판정할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 PCR-RFLP 분석법으로 검출한 한우 ADH1C 유전자 증폭 영역 내 64번째 C↔T 단일염기다형(SNP)로 인한 TT형 및 CC형 DNA marker의 전기영동 사진이다.

본 발명자들은 앵커스 비육우 개체에서 근내지방을 극대화시키는 요인으로써 혈중 비타민 A의 농도와 ADH1C 유전자형과의 상관관계가 있음을 확인하고, 한우에서의 ADH1C 유전자형을 조사한 후 한우에 비타민 A를 제한 급여하여 상기 ADH1C 유전자형과 근내지방과의 상관관계를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 내 "한우(韓牛, Korean Cattle, Hanwoo)"는 종래부터 한반도에서 운반용이나 농경용으로 사육해오던 재래종의 역우(役牛)를 말하는 것으로, 한국소(Bos taurus coreanae)를 의미한다.

본 명세서 내 "근내지방(marbling)"은 근육 내에 지방조직이 침착된 것으로, 동물의 지방조직량은 지방조직을 구성하는 지방세포의 숫자와 크기에 의해 결정되며, 근육 내 지방세포의 분화에 영향을 미치는 미량영양소인 비타민 A를 제한함으로써 근내지방도를 극대화시켜 쇠고기의 육질을 현저히 향상시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

한우 품질 판별 방법 1

먼저, 본 발명에 따른 한우 품질 판별 방법은 비타민 A가 제한 급여된 한우(Bos taurus coreanae)의 생체시료로부터 DNA를 추출하는 단계[(a) 단계]를 포함한다.

구체적으로, 상기 비타민 A는 100 IU/㎏ 내지 2000 IU/㎏의 농도일 수 있으며, 300 IU/㎏ 내지 1000 IU/㎏인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 비타민 A는 사료로부터 유래하는 chylomicron을 통하여 목표기관이나 조직에 작용하기도 하고, 간과 지방에 주로 축적된 비타민 A는 필요에 따라 동원(mobilization) 되어 목표기관이나 조직에 작용하는데, 상기 비타민 A의 효과를 나타낼 수 있는 대사물질로는 retinal(정상시각작용), retinol(항산화작용) 및 retinoic acid(정상성장 및 발달, 번식작용, 점막세포의 분화, 지방축적억제)가 있다. 이들 대사물질 중 마블링과 연관성이 있는 retinoic acid가 세포 내 지방세포분화를 억제함으로써 고급육을 생산할 수 있다.

또한, 상기 한우의 생체시료는 혈액, 소변, 타액, 우유로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

다음으로, 본 발명에 따른 한우 품질 판별 방법은 상기 DNA를 프라이머에 의해 PCR(Polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응)로 증폭한 후, 증폭된 PCR 산물에 제한효소를 처리하여 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소 절편 다형성) 분석을 수행하는 단계[(b) 단계]를 포함한다.

상기 프라이머는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 증폭된 PCR 산물을 절단하기 위한 제한효소는 Bs 또는 2U인 것일 수 있으며, BsⅡ인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

다음으로, 본 발명에 따른 한우 품질 판별 방법은 상기 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소 절편 다형성) 분석에 의해 검출된 서열번호 1의 한우 ADH1C 유전자의 개체별 단일염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 검출하고, 각각의 SNP 유전자형을 분석하는 단계[(c) 단계]를 포함한다.

구체적으로, 상기 c) 단계의 ADH1C 유전자는 서열번호 1로 표시될 수 있다.

또한, c) 단계의 ADH1C 유전자의 SNP 서열은 염기서열 64번째 C↔T 염기치환에 의해 형성될 수 있으며, 상기 염기치환에 의해 형성된 단일염기 다형성(SNP) 유전자형은 TT형 또는 TC형일 수 있다. 일반적으로, 앵거스 비육우에서 ADH1C 유전자의 단일염기 다형성(SNP) 유전자형은 TT형, TC형 및 CC형이 있으나, 한우에서는 TT형 및 TC형의 두 가지 유전자형이 존재하는 바, 두 품종을 구별할 수 있는 마커가 될 수 있다.

마지막으로, 본 발명에 따른 한우 품질 판별 방법은 상기 c) 단계의 분석을 통하여 유전적으로 근내지방(marbling) 및 도체중(carcass weight)이 높은 한우를 예측하고 판정하는 단계[(d) 단계]를 포함한다.

구체적으로, 상기 한우 ADH1C 유전자의 단일염기 다형성(SNP) 유전자형 가운데 TC형을 나타내는 한우개체가 TT형을 나타내는 한우개체에 비해 유전적으로 근내지방도 및 도체중이 높은 한우로 예측하고 판정하는 것을 특징으로 한다. 앵거스 비육우에서는 TT 유전자형을 나타내는 개체가 근내지방도 및 도체중이 높은 것으로 알려져 있는 바, 본 발명의 비타민 A 제한 급여 및 ADH1C 유전자형의 상관관계를 통하여 한우 품종의 품질을 독자적으로 판별 할 수 있다.

또한, 본 발명의 한우 품질 판별 방법을 축산 농가에서 적용하는 경우, 특정 SNP 유전자형을 보유하고 있는 개체를 조기에 진단하고 선발 육종함으로써 한우 육종개량사업의 효율성과 개량성과를 극대화할 수 있고, 동시에 우리나라 고유의 한우 유전자원을 보다 우수하게 개량 및 보존하는 효과를 얻을 수 있다.

한우 품질 판별 방법 2

먼저, 본 발명에 따른 한우 품질 판별 방법은 비타민 A가 제한 급여된 한우(Bos taurus coreanae)로부터 혈액을 채취하는 단계[(a) 단계]를 포함한다.

구체적으로, 상기 한우로부터 혈액을 채취하는 방법은 경정맥을 통하여 vacutainer needle 또는 주사기를 사용하여 채취할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

다음으로, 상기 채취된 한우 혈액의 혈중 비타민 A 농도를 측정하는 단계[(b) 단계]를 포함한다.

혈중 비타민 A 농도의 측정은 공지된 HPLC 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

마지막으로, 상기 혈중 비타민 A 농도의 감소율로부터 근내지방도 및 도체중이 높은 한우로 예측하고 판정하는 단계[(c) 단계]를 포함한다.

구체적으로, 혈중 비타민 A 농도 감소율은 10% 내지 60%일 수 있으며, 15% 내지 55%인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 하기 실시예 1-6에 나타난 바와 같이, 비타민 A을 8890IU/㎏의 농도로 급여한 한우 개체들에 비해 890IU/㎏의 농도로 제한 급여한 한우 개체들의 혈중 비타민 A 농도가 낮은 것을 확인할 수 있었다.

한우 품질 판별 방법 3

상기 혈액 채취의 구체적인 방법은 전술된 바와 같다.

다음으로, 본 발명에 따른 한우 품질 판별 방법은 a) 단계의 혈액으로부터 한우의 혈중 비타민 A 농도를 측정하고 혈중 비타민 A 농도 감소율을 분석하는 단계[(b) 단계]를 포함한다.

상기 구체적인 혈중 비타민 A 농도 측정방법은 전술한 바와 같다.

다음으로, 본 발명에 따른 한우 품질 판별 방법은 a) 단계의 혈액으로부터 DNA를 추출하고, 프라이머에 의해 PCR(Polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응)로 증폭한 후, PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소 절편 다형성) 분석에 의해 검출된 한우 ADH1C 유전자의 개체별 단일염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 검출하고, 각각의 SNP 유전자형을 분석하는 단계[(c) 단계]를 포함한다.

상기 구체적인 한우 ADH1C 유전자의 단일염기 다형성 유전자형을 분석하는 방법은 전술한 바와 같다.

마지막으로, 상기 b) 단계 및 c) 단계를 통하여 유전적으로 근내지방(marbling) 및 도체중(carcass weight)이 높은 한우를 예측하고 판정하는 단계[(d) 단계]를 포함한다.

본 발명의 방법에 따른 한우 품질 판별은 한우의 혈중 비타민 A 농도 감소율을 통하여 한우 ADH1C 유전자의 단일염기 다형성(SNP) 유전자형 가운데 TC 유전자형을 나타내는 한우개체가 TT 유전자형을 나타내는 한우개체에 비해 유전적으로 근내지방도 및 도체중이 높은 한우로 예측하고 판정할 수 있다.

구체적으로, 하기 실시예 1-6에 나타난 바와 같이, 비타민 A을 8890IU/㎏의 농도로 급여한 한우 개체들에 비해 890IU/㎏의 농도로 제한 급여한 한우 개체들의 혈중 비타민 A 농도가 낮은 것을 확인할 수 있었으며, TT 유전자형을 나타내는 한우개체에 비하여 TC 유전자형을 나타내는 한우개체의 혈중 비타민 농도가 감소하는 경향을 확인할 수 있었다.

즉, 한우의 혈중 비타민 A 농도가 낮을수록 한우의 근내지방이 높은 것으로 알려져 있는 바, 한우 ADH1C 유전자의 단일염기 다형성(SNP) 유전자형을 미리 예측하고, TC 유전자형을 나타내는 한우개체에 대하여 비타민 A 농도를 제한 급여함으로써 근내지방도 및 도체중이 높은 고품질의 한우를 생산할 수 있다.

한우 품질 판별용 키트

상기 프라이머쌍은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시될 수 있다.

상기 제한효소의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

또한, 상기 한우 품질 판별용 키트는 한우의 생체시료를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 생체시료의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1.

1-1. 공시축 배치 및 사양관리

공시축으로 비육전기(15개월령 거제 한우 60두(개시체중: 350±35 ㎏)를 선정한 후, 처리구간 개시체중의 차이가 크지 않도록 A 목장에 40두, B 목장에 20두씩 배치하였고, 물은 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다. 이하, 모든 실험은"건국대학교 동물실험윤리위원회(KU16134)"에 의거하여 수행하였다.

처리구는 대조구(c, 31두), 비타민 A 제한구(NA, 29구)의 처리구로 구분하였으며, 15개월령부터 24개월령까지 9개월동안 실험 사료를 급여하였다. 사료의 성분을 하기 표 1에 나타냈다.

영양성분	단위
영양성분	단위	NA	C
건물(DM)	%	87.80	87.74
조단백	% DM	15.95	15.96
조지방	% DM	3.44	3.52
조회분	% DM	8.23	8.06
중성세제	% DM	33.23	31.62
산성세제	% DM	14.38	14.26
조섬유	% DM	11.05	10.90
칼슘	% DM	0.98	0.95
인	% DM	0.58	0.52
NFC	% DM	35.10	36.15
TDN	% DM	82.37	82.85

대조구(c)에는 비타민 A 8,890 IU/㎏를 첨가하고, 비타민 A 제한구(NA)에는 비타민 A 890 IU/㎏를 첨가하였다.

실험 사료는 1일 2회 급여하였으며, 잔량의 측정을 통하여 매일 사료 섭취량을 기록하였다.

1-2. 한우의 DNA 추출

소고기 샘플을 추출한 후 작은 조각으로 잘라, 1.5㎖ tube에 넣고, 300㎕ TL buffer를 상기 tube에 첨가한 후 inverting하였다. 이후, Proteinase K 5㎕를 더 첨가하고 56℃에서 1일 동안 배양하였다. 상기 TL의 구성은 하기 표 2에 나타냈다.

이후, 300 ㎕ PPS를 tube에 첨가한 후, 원심분리기를 이용하여 20°C, 13,000 rpm 에서 15분 동안 원심분리 한 후, 별도의 1.5㎖ tube에 상층액 600㎕를 넣었다. RNase 1.5㎖를 상기 tube에 첨가한 후, 65℃에서 한 시간 동안 배양하였다.

이후, 600 ㎕ PPS를 tube에 첨가한 후, inverting 하고 원심분리기를 이용하여 20°C, 13,000 rpm 에서 15분 동안 원심분리 한 후, 별도의 1.5㎖ tube 2개 상층액 600㎕씩 각각 분주하고 isopropanol 600㎕씩 더 첨가하였다. 상기 tube를 inverting하고 1시간 동안 더 배양한 후에 원심분리기를 이용하여 4°C, 13,000 rpm 에서 5분 동안 원심분리 하였다.

이후, 상층액을 버리고 휴지로 tube 내부를 닦은 후, 공기 중에 1 내지 2시간 동안 건조하였으며, tube 당 TE buffer를 50㎕씩 첨가하였다.

Tissue Lysis Buffer (TLB): 500 ㎖
1M Tris-Cl (PH 8.0)	10 mM
0.5 M EDTA (PH 8.0)	10 mM
5 M Nacl	100 M
10 % SDS	2 %
ddH₂O	Up to 500 ㎖

1-3. 한우 ADH1C 유전자의 PCR 증폭

상기 1-2에서 추출한 한우 DNA로부터 중합효소연쇄반응(PCR)을 Eppendorf thermal cycler(에펜도르프(Eppendorf)사 제품)으로 수행하였다.

PCR 반응액의 총 부피는 30㎕로서, 실시예 1-2의 DNA 200ng, 및 증류수(distilled water; DW)를 혼합하여 제조하였으며, 서열번호 1로 표시되는 한우 ADH1C 유전자(GeneBank: BC111290.1) 250bp 크기의 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 Genebank 등록번호 NC007304.4호에 등록된 염기서열 정보를 참고하여 서열번호 2와 서열번호 3에 제시한 바와 같이 각각 설계 및 제작하였으며, 본 발명에서 사용한 프라이머 염기서열은 하기 표 3과 같다.

유전자명	프라이머 염기서열(5'→3')	서열번호
ADH1C	F- CAGGGCTTAAAGATCCCAGA	2
ADH1C	R- TAGCCAATGCTTGTCTCTCG	3

PCR 반응은 95에서 5분 동안 초기 변성(pre-denaturation)과정을 수행한 후, 95에서 30초, 55에서 30초, 72에서 60초로 구성된 증폭(amplifying) 과정을 35회 반복 수행하였고, 마지막 단계인 마지막 증폭(final extension) 과정은 72 에서 5분 동안 진행하였다.

PCR 증폭산물은 2% 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동하여 DNA 증폭 성공 여부를 검증하였다.

1-4. 한우 ADH1C 유전자의 단일염기다형(SNP) 검출

상기 실시예 1-3의 한우 ADH1C 유전자 PCR 증폭산물을 이용하여 direct sequencing 기법으로 염기서열을 분석한 결과, 총 250bp 크기의 염기를 검출하였으며, 검출된 염기에서 1개의 단일염기다형(SNP) 부위를 검출하였다.

즉, NCBI Genebank 등록번호 NC007304.4호(NCBI Submitted SNP Number: GQ862345)의 염기서열에서 C↔T 염기치환에 따른 SNP를 검출하였다.

1-5. PCR-RFLP 분석법에 의한 한우 ADH1C 유전자의 단일염기다형성 마커 유전자형 분석

검출된 한우 ADH1C 유전자의 증폭영역 내 64번째 CT SNP 부위에 BsⅡ 제한효소 인지부위(5'- CCNNNNNNNGG-3')가 존재하여 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 분석법으로 한우 ADH1C 유전자의 SNP 마커를 검출하였다.

구체적으로, 한우 ADH1C 유전자의 RFLP 분석은 10㎕의 PCR 증폭산물에 2 unit의 BsⅡ 제한효소를 첨가한 다음 55℃에서 약 3시간 이상 반응시켜 절단하였다. PCR 증폭산물을 상기의 제한효소로 각각 절단하여 얻어진 DNA 단편은 TEB(Tris/Borate/EDTA) buffer (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA, pH 8.0)를 이용하여 2% 아가로즈젤에 약 100volt 전압으로 약 25분 동안 전기영동하고 EcoDye Nucleic acid staining solution으로 염색한 후, DNA 단편 양상을 관찰하여 각 검정 개체별 SNP 유전자형을 판정하였다.

즉, TT 호모 유전자형을 가진 개체들에서는 제한효소 인지부위가 존재하지 않았는 바 1개의 DNA band가 검출되었고, TC 헤테로 유전자형을 가진 개체들에서는 1개 이상의 제한효소 인지부위가 존재하였으며 총 3개의 DNA band가 검출되었다.

상기 방법으로 실시예 1-1의 공시축 한우 총 60두를 대상으로 분석한 결과를 하기 표 4에 나타냈다.

	TT type	TC type	CC type
두수	51	9	0
비율 (%)	85 %	15 %	0 %

표 4에 나타난 바와 같이, 한우 ADH1C의 SNP 마커 유전자형은 TT형 85%, TC형 15%으로 TC형에 비해 TT형의 빈도가 높은 것으로 분석되었으며, CC형은 존재하지 않는 것으로 분석되었다.

1-6. 혈중 비타민 A 분석

(1) 혈액 샘플 준비

실시예 1-1의 모든 공시축 경정맥에서 혈액(20㎖)을 월 1회, 총 9개월 동안 채취하였다. 채취된 혈액은 빛에 의한 비타민의 파괴를 막기 위하여 빛이 차단된 혈청튜브에 보관하였다.

상기 채취된 혈액은 외부 빛이 완전 차단된 실험실에서 원심분리기를 이용하여 3500rpm에서 15분간 원심분리 후 상층액(혈정; serum)을 갈색튜브에 넣어 즉시, -80의 저온냉장고에 보관하였다.

(2) 내부 표준 용액 준비

Retinyl acetate (R7882, Sigma) 100㎎를 취하여 0.04% BHT-EtOH 용액에 넣어 최종 농도가 1㎎/㎖이 되도록 녹여 Stock solution을 제조하였다.

상기 Stock solution 25㎕를 취하여 0.04% BHT-EtOH 975㎕ 용액에 넣어 최종 농도가 25㎍/㎖이 되도록 녹여 Working solution A를 제조하였다.

상기 Stock solution 10㎕를 취하여 0.04% BHT-EtOH 990㎕ 용액에 넣어 최종 농도가 10㎍/㎖이 되도록 녹여 Working solution B를 제조하였다.

상기 Stock solution A 20㎕를 취하여 0.04% BHT-EtOH 480㎕ 용액에 넣어 최종 농도가 1㎍/㎖이 되도록 녹여 Working International Standard solution을 제조하였다.

(3) 표준 용액 준비

Retinoic acid (R7632, Sigma) 25mg을 취하여 0.04% BHT-EtOH 용액에 넣어 최종 농도가 100ug/0.9㎖이 되도록 녹인 후, 하기 표 5의 방법으로 최종농도 0.05㎍/㎖가 되도록 희석하여 표준 용액을 제조하였다.

저장용액	농도 (㎍/㎖)	표준용액	0.04% BHT-EtOH	용액 B
저장용액	100	저장용액의 450㎕
:	:	:	:	:
저장용액1	12.5	저장용액 0의 450㎕	450㎕	100㎕
저장용액2	6.25	저장용액 1의 450㎕	450㎕	100㎕
저장용액3	3.13	저장용액 2의 450㎕	450㎕	100㎕
저장용액4	1.56	저장용액 3의 450㎕	450㎕	100㎕
저장용액5	0.78	저장용액 4의 450㎕	450㎕	100㎕
저장용액6	0.39	저장용액 5의 450㎕	450㎕	100㎕
저장용액7	0.20	저장용액 6의 450㎕	450㎕	100㎕
저장용액8	0.10	저장용액 7의 450㎕	450㎕	100㎕
저장용액9	0.05	저장용액 8의 450㎕	450㎕	100㎕

(4) 비타민 A 분석

비타민의 산화를 방지하기 위해 어두운 곳 또는 노란색/빨간색 등이 있는 곳에서 수행하였고, HPLC(High Performance Liquid Chromatography, Agilent, 1100 series)를 이용하여 분석하였으며, HPLC 조건을 하기 표 6에 나타냈다.

Items	Condition
장치	Agilent 1100 series
컬럼	Stainless steel Nova pak C18 (3.9mm ID x 150mm); reverse phase
주사부피	20 ㎕
검출 파장	325 nm
이동상	메탄올 : DIW (95:5)
유량	1.0 ㎕/min
컬럼 온도	20

2㎖ micro tube에 혈청 200㎕와 내부 표준용액 20㎕을 첨가한 후, DIW 200㎕와 0.04% BHT-EtOH 400㎕를 추가적으로 첨가하여 강하게 voltexing하였다. 이후, 0.04% BHT-Hexane 800㎕을 첨가하여 강하게 voltexing하고 4℃에서 3500 ×g로 10분간 원심분리 하였다.

이후, 2㎖ amber tube에 상층액 700㎕를 옮기고 N2를 이용하여 완전히 증발시킨 후에 95% 메탄올 500㎕를 사용하여 용해시키고, Filtration 및 GC amber vial로 옮겨 혈중 비타민 A의 농도를 측정하였고 그 결과를 하기 표 7에 나타냈다.

	NA		C		P-value
	TT 형(26 두)	TC 형(3 두)	TT형(25 두)	TC 형(6 두)	G	VA	G×VA
비타민 A 농도	111.1±5.00	79.7±16.05	137.4±5.31	140.3±7.96	0.149	0.000^a	0.083^b

1: 표본 평균 분포의 표준 편차(Standard error of the mean)

^aP<0.05, 유의성 있음.

^bP<0.1, 경향성 있음.

표 7에 나타난 바와 같이, 비타민 A 제한구(NA, 29구)가 대조구(C, 31)에 비하여 혈중 비타민 A농도가 낮은 것을 확인할 수 있으며, 비타민 A 제한구 중 한우 ADH1C의 SNP 마커 TT 유전자형보다 TC 유전자형의 혈중 비타민 A 농도가 낮은 것을 확인 할 수 있었다. 즉, 비타민 A를 제한 급여한 한우의 ADH1C 유전자형과 혈중 비타민 A 농도간에 상관성이 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 2.

2-1. 공시축 배치 및 사양관리

한우 136 두를 공시축으로 선정하고, 처리구에 비타민 A 930 IU/㎏를 첨가하였다는 점을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였고, 사료의 성분을 하기 표 8에 나타냈다.

영양성분	단위	처리구
건물(DM)	%	88.19
조단백	% DM	14.74
조지방	% DM	4.15
조회분	% DM	7.11
중성세제	% DM	23.81
산성세제	% DM	9.89
조섬유	% DM	8.28
칼슘	% DM	0.91
인	% DM	0.54
NFC	% DM	49.70
TDN	% DM	84.39

2-2. 비타민 A 제한 급여와 한우 ADH1C 유전자형과의 상관성

실시예 2-1의 한우 136 두를 실시예 1-5와 동일한 방법으로 분석한 결과를 하기 표 9에 나타냈다.

	TT type	TC type	CC type
두수	102	34	0
비율(%)	75 %	25 %	0 %

표 9에 나타난 바와 같이, 한우 ADH1C의 SNP 마커 유전자형은 TT형 75%, TC형 25%으로 TC형에 비해 TT형의 빈도가 높은 것으로 분석되었으며, CC형은 존재하지 않는 것으로 분석되었다.

2-3. 비타민 A 제한 급여시 ADH1C 유전자형과 도축성적과의 상관성

상기 실시예 2-1의 한우는 30개월 후에 도축하였고, ADH1C 유전자의 SNP 유전자형과 한우의 육량 및 육질형질 관련 도체성적에 미치는 효과를 추정하기 위해 상용소프트웨어(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)프로그램을 이용하여 이들 중 유전자형 효과의 유의성이 인정된 형질에 대해 최소 유의차 검증(LSD, least significant differences test) 및 Duncan의 다중검증(one-way ANOVA, one-way analysis of variance)방법으로 각 유전자형의 최소자승평균치간의 차이에 의한 유의성 검정을 실시하였고, 그 결과를 하기 표 10에 나타냈다.

육량 및 육질형질	SNP marker 유전자형		P value
육량 및 육질형질	TT type	TC type	P value
등지방두께 (cm)	12.7±0.42¹	13.2±0.72	0.952
등심단면적 (cm²)	86.8^a±0.94	93.0^b±1.88	0.002
도체중 (kg)	411.0^a±5.04	444.2^b±9.83	0.002
육량지수	64.8±0.29	64.6±0.57	0.771
근내지방	5.2^a±0.16	6.3^b±0.28	0.001
육색	4.8±0.04	4.8±0.07	0.936
지방색	3.0±0.02	3.0±0.00	0.320
조직감	1.2±0.04	1.1±0.04	0.125
성숙도	2.1±0.03	2.2±0.06	0.410

1: 표본 평균 분포의 표준 편차(Standard error of the mean)

a,b 서로 다른 부호 간에는 유의차가 있음(p<0.05).

표 10에 나타난 바와 같이, TC형 한우의 등심 단면적 및 도체중이 TT형 한우에 비해 유의적으로 높은 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 한우에 비타민 A를 제한하여 급여할 경우, ADH1C 유전자의 TC형 한우가 TT형 한우에 비해 더 높은 수준의 마블링을 가진다는 것을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> METHOD OF DISCRIMINATING QUALITY OF HANWOO BY FEEDING RISTRICTION OF VITAMIN A <130> 1061640 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH1C(alcohol dehydrogenase 1C) of Bos taurus coreanae <400> 1 tgtatgtact tgaacaggga agagcctgta agtctgtaat tcacatctcc tgccagcaga 60 gaaaagaaga aacatgagca cggcaggaaa agtaataaaa tgcaaagcag ctgtgctgtg 120 ggagctcaat aaaccatttt ccattgagga ggtggaggtt gcacccccta aggcccatga 180 agttcgtatt aagatggtgg ccacaggaat ctgtcgctca gatgaccatg tggttaatgg 240 atctctggtc acacgtcttc ctgtggtctt aggtcatgag ggagccggca ttgtggagag 300 cattggagaa ggggtgacta cagtaagacc aggtgataaa gtcatcccac tctttattcc 360 ccagtgtgga aagtgcaatg tttgtaaaca cccagaagcc aacctttgcc tgaaattcca 420 gctgaaggag cctcggggga cccttaatga tggtacctgc aggttcacct gcagggggaa 480 gcccatccac cacttcctcg gcaccagcac cttcacccag tacacagtgg tggatgagat 540 gtcagtggcc aagatccatg cagactcacc actggagaaa gtctgtctca ttggctgcgg 600 attttctact ggttatgggt ctgcagtcaa aattgccaag gtcacccagg gctccacctg 660 tgccgtgttt ggccttggag gagttggcct gtctgttatc atgggctgca aagcagctgg 720 agcagccagg atcattgcag tggacatcaa caaagacaaa tttgcaaggg ccaaacaggt 780 gggtgccacg gagtgcatca accctcagga ctacgagaaa cccatcgagg aggtgctgaa 840 agaagtgagt ggtggaggtg tagatttttc atttgaagtc atcggtcggc ttgacaccat 900 gatgtctgcc ttgctgtgct gtcaagaagc atatggtgta agcgtcattg taggagtacc 960 tcctcatgcc caaaatatct ctatgaaccc catgttgctg ttgactggac gtacctggaa 1020 aggagctatt tttggtggct tcaaaagtaa agaatctgtc cccaaacttg tgactgattt 1080 catggctaag aagttttcac tggatcagtt aattacccat gttttaccac ttgaaaaaat 1140 aaacgaagga tttgacctgc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaaaaaaaaa 1320 aaaaaaa 1327 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of ADH1C(alcohol dehydrogenase 1C) of Bos taurus coreanae <400> 2 cagggcttaa agatcccaga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of ADH1C(alcohol dehydrogenase 1C) of Bos taurus coreanae <400> 3 tagccaatgc ttgtctctcg 20

Claims

a) 비타민 A가 제한 급여된 한우(Bos taurus coreanae)의 생체시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
b) 상기 DNA를 프라이머에 의해 PCR(Polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응)로 증폭한 후, 증폭된 PCR 산물에 제한효소를 처리하여 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소 절편 다형성) 분석을 수행하는 단계;
c) 상기 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소 절편 다형성) 분석에 의해 검출된 한우 ADH1C 유전자의 개체별 단일염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 검출하고, 각각의 SNP 유전자형을 분석하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계의 분석을 통하여 유전적으로 근내지방(marbling) 및 도체중(carcass weight)이 높은 한우를 예측하고 판정하는 단계를 포함하는
한우 품질 판별 방법.
제1항에 있어서,
상기 a) 단계의 비타민 A는 100 IU/㎏ 내지 2000 IU/㎏의 농도인 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별 방법.
제1항에 있어서,
상기 a) 단계의 한우의 생체시료는 혈액, 소변, 타액, 우유로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별 방법.
제1항에 있어서,
상기 b) 단계의 프라이머는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별 방법.
제1항에 있어서,
상기 b) 단계의 제한효소는 BsⅡ 또는 2U인 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별 방법.
제1항에 있어서,
상기 c) 단계의 한우 ADH1C 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별 방법.
제1항에 있어서,
상기 c) 단계의 ADH1C 유전자의 SNP 서열은 염기서열 64번째 C↔T 염기치환에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별 방법.
제1항에 있어서,
상기 c) 단계의 분석은 단일염기 다형성(SNP) 유전자형이 TT형 또는 TC형인 것을 확인하는 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별 방법.
제1항에 있어서,
상기 d) 단계는 한우 ADH1C 유전자의 단일염기 다형성(SNP) 유전자형 가운데 TC 유전자형을 나타내는 한우개체가 TT 유전자형을 나타내는 한우개체에 비해 유전적으로 근내지방도 및 도체중이 높은 한우로 예측하고 판정하는 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별 방법.
a) 비타민 A가 제한 급여된 한우(Bos taurus coreanae)로부터 혈액을 채취하는 단계;
b) 상기 채취된 한우 혈액의 혈중 비타민 A 농도를 측정하는 단계;
c) 상기 혈중 비타민 A 농도의 감소율로부터 근내지방도 및 도체중이 높은 한우로 예측하고 판정하는 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별 방법.
제10항에 있어서,
상기 c) 단계의 혈중 비타민 A 농도 감소율은 10% 내지 60%인 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별 방법.
a) 비타민 A가 제한 급여된 한우(Bos taurus coreanae)로부터 혈액을 채취하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 혈액으로부터 한우의 혈중 비타민 A 농도를 측정하고 혈중 비타민 A 농도 감소율을 분석하는 단계;
c) 상기 a) 단계의 혈액으로부터 DNA를 추출하고, 프라이머에 의해 PCR(Polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응)로 증폭한 후, PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소 절편 다형성) 분석에 의해 검출된 한우 ADH1C 유전자의 개체별 단일염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 검출하고, 각각의 SNP 유전자형을 분석하는 단계; 및
d) 상기 b) 단계 및 c) 단계을 통하여 유전적으로 근내지방(marbling) 및 도체중(carcass weight)이 높은 한우를 예측하고 판정하는 단계를 포함하는
한우 품질 판별 방법.
제12항에 있어서,
상기 b) 단계의 혈중 비타민 A 농도 감소율은 10% 내지 60%인 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별 방법.
제12항에 있어서,
상기 c) 단계의 분석은 단일염기 다형성(SNP) 유전자형이 TT형 또는 TC형인 것을 확인하는 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별 방법.
비타민 A가 제한 급여된 한우(Bos taurus coreanae) DNA를 증폭시키기 위한 프라이머쌍; 및
상기 DNA 염기서열의 특정부위를 절단하기 위한 제한효소를 유효성분으로 포함하는
한우 품질 판별용 키트.
제15항에 있어서,
상기 프라이머쌍은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별용 키트.
제15항에 있어서,
상기 제한효소는 BsⅡ 또는 2U인 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별용 키트.
제15항에 있어서,
상기 한우 품질 판별용 키트는 한우의 생체시료를 더 포함하는 것을 특징으로 하는
한우 품질 판별용 키트.