KR20070038836A

KR20070038836A - 한우 불포화지방산 생합성 효소 유전자를 이용한 육질 연관분자 마커 개발

Info

Publication number: KR20070038836A
Application number: KR1020050094157A
Authority: KR
Inventors: 정의룡; 신성철
Original assignee: 정의룡
Priority date: 2005-10-07
Filing date: 2005-10-07
Publication date: 2007-04-11

Abstract

본 발명은 우리나라 유일한 쇠고기 생산 자원이면서 토종가축인 한우의 육질개량에 관여하는 유전자 마커 개발에 관한 것으로서, 한우의 육질과 품질을 결정하는 근내지방도(marbling score)와 등지방두께(backfat thickness) 등 도체 및 육질관련 형질을 조기에 진단하여 선발하는 DNA 표지인자를 개발하여 한우의 육종개량 사업 및 고품질 한우고기 생산에 활용하기 위한 것이다.

더욱 상세하게는, 본 발명에서 동물의 불포화지방산 생합성의 핵심 효소로 알려져 있는 Stearoyl-CoA desaturase(SCD) 유전자의 특정한 단일염기다형(single nucleotide polymorphism; SNP)이 한우의 도체 및 육질형질에 미치는 영향을 분석하기 위해 SCD 유전자의 인트론(Intron) 6번과 엑손(Exon) 6번, 그리고 인트론(Intron) 7번 영역을 포함하는 유전자를 클로닝하고 염기서열 분석을 통하여 유전자 구조를 해석한 결과 각각 인트론 6번 영역에서 2개, 그리고 인트론 7번 영역에서 2개의 단일염기다형(SNP) 부위를 발견하였다. 그리고 이들 가운데 인트론 7번 영역에서 발견된 특정 SNP 마커가 한우의 도체 및 육질형질들과 유의적인 연관성이 존재한다는 사실이 본 발명에서 입증되었다.

즉, 한우 SCD 유전자 인트론 7번의 특정영역을 포함하는 총 211bp 크기의 염기서열에서 아데닌(A)↔구아닌(G) 염기치환으로 발생한 단일염기다형(SNP) 부위를 발견하였다. 이들 단일염기다형 염기서열 부위를 PCR-SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism; 단일쇄 형태구조다형성) 기법을 이용하여 3종류의 SNP 유전자형(A/A, A/G 및 G/G)을 검출하였다. 이 가운데 A/G 유전자형이 한우의 근내지방도와 등지방두께와 고도의 유의적 연관성이 있다는 새로운 사실을 발견하였다.

따라서, 본 발명을 통해 개발된 한우 SCD 유전자의 특정한 단일 염기다형 표지인자는 종래의 표현형 육종가에 전적으로 의존하여 선발하는 전통적인 선발 방법에 비하여 첨단 분자육종기술로서 한우의 연령 및 성별에 관계없이 육질이 우수한 고급육을 생산하는 우량 한우의 조기선발에 매우 유용한 DNA 표지인자 선발 도구로 활용할 수 있다.

한우, 근내지방도 및 등지방두께 연관 DNA 표지인자, Stearoyl-CoA Desaturase(SCD) 유전자, 단일염기다형(SNP) 마커, PCR-SSCP 분석

Description

한우 불포화지방산 생합성 효소 유전자를 이용한 육질 연관 분자 마커 개발{Development of molecular marker gene related with meat quality using stearoyl- CoA desaturase (SCD) gene of Hanwoo}

도면 1은 본 발명에서 한우 SCD 유전자의 염기서열도

도면 2는 본 발명에서 PCR-SSCP 기법으로 검출한 한우 SCD 유전자의 단일 염기다형(SNP) 유전자형 마커 전기영동 사진

도면 3은 본 발명에서 한우 SCD 유전자의 단일염기다형(SNP) 염기서열 분석 크로마토그램

일반적으로 가축의 유전적 능력 개량을 위한 전통적인 접근 방법은 선발과 교배체계를 반복적으로 이용하는 것이다. 그러나, 전통적인 선발육종에 의한 현행 한우 육종개량 체계는 고급육 한우생산을 위한 육질형질의 개량속도가 느리고 개량 효율성이 높지 않기 때문에 고급육 출현율이 매우 낮고 품질 경쟁력 향상에도 커다란 문제점으로 지적되고 있다. 또한, 종래의 통계육종 방법은 후대검정이나 능력검정을 통한 주요 경제 형질에 대한 표현형 정보를 얻기 위해서 상당히 오랜 시간이 소요되고 많은 경비와 노력이 요구된다. 한우와 같이 대가축인 경우 평균 세대간격이 길고 산자수가 적어 선발 강도가 낮기 때문에 유전적 변화속도가 느리고 유전적 개량 량도 미진하여 전통적인 육종방법만으로는 한우의 생산능력을 획기적으로 향상시키는데 많은 어려움이 있다. 특히, 육질과 같은 도체 형질의 경우 개체의 도축 후에나 관련 정보와 자료를 획득할 수 있어 기존의 방법으로는 분명한 한계가 있다고 할 수 있다.

그러나, 한우의 주요 경제형질에 영향을 미치거나 관련된 유용 유전자 및 DNA 표지인자를 탐색 발굴하고 이를 육종개량 사업에 이용할 경우 선발 정확도 향상, 선발 강도 증가 및 세대간격 단축으로 유전적 개량 량을 극대화하고 개량속도를 가속화할 수 있어 보다 효율적이고 경제적인 육종개량이 가능하다. 최근 유전공학 및 유전자 분석 기술의 눈부신 발달로 가축의 육종개량분야에 분자유전학적 첨단기술과 정보를 직접 이용할 수 있게 되어 새로운 육종 방법의 접근이 가능해 졌다.

쇠고기의 육질은 근내지방도, 육색 및 지방색, 조직감 등에 의해 결정된다. 고기의 맛은 연도, 다즙성 및 풍미에 의해 좌우되는데 근내지방이 많을수록 맛이 좋고 부드러운 고급육이라고 할 수 있다. 특히, 쇠고기의 근내지방을 구성하는 올레인산(oleic acid, 18: 1)은 풍미를 좋게 하는 물질로 작용한다. 쇠고기의 독특한 풍미는 불포화 지방산 함량이 미친다고 알려져 있는데 한우가 수입 쇠고기 품종들에 비해 불포화 지방산 특히, 올레인산 함량이 많은 것으로 보고된 바 있다. 그동안 발표된 쇠고기 품질에 관련된 연구결과를 살펴보면, 쇠고기내의 올레인산 함량은 소 품종에 따라 차이가 많고 쇠고기 내 올레인산 증가는 지방 품질 및 쇠고기의 기호성(맛)을 결정하는 주 요인이 된다(Melton, 1982; Yoshimura와 Namikawa, 1983). 결국 쇠고기의 풍미와 다즙성은 올레인산의 함량을 증가시킴으로서 향상시킬 수 있을 것이다.

Stearoyl-CoA desaturase(SCD)는 포화지방산을 불포화지방산으로 전환하는데 관여하는 효소로서 stearic acid 및 palmitic acid를 w-9 계열의 단일불포화지방산인 oleic acid로 전환하는 △9-desaturase이다(Ren 등, 2004; Yahyaoui 등, 2003). 소의 지방은 6종류의 주요 지방산으로 구성되어 있고 이 가운데 포화지방산의 하나가 stearic acid이다. Stearic acid는 축적된 체지방을 경화시키고 융점을 증가시킨다. 반대로 올레인산은 지방을 연화시키고 융점을 낮춘다(Mitsuhashi, 2004). 또한, SCD 효소 활성이 억제될 경우 지방 조직내 stearic acid의 포화지방산 축적을 가져와 실질적으로 지방 경화 증가를 초래한다(Smith 등, 1998; Yang 등, 1999; Campbel 등, 2001). 이처럼 SCD는 체지방의 융점을 결정하는데 중요한 역할을 담당하여 결과적으로 육질에 영향을 미친다(Kuchel 등, 2004). 따라서 이 같은 생리적 특성을 지닌 SCD 유전자를 이용할 경우 부드러운 연성 지방의 축적과 올레인 지방산이 풍부한 맛있고 영양가 높은 고품질 고급육 한우고기 생산이 가능할 것이다.

본 발명은 포유동물의 불포화지방산 합성과정을 조절하는 주요 효소이자 지방대사(lipid metabolism) 생리적 기능을 갖는 SCD 유전자의 특정 단일염기다형 마커를 이용하여 체지방 축적(근내지방도)과 등지방 두께가 높은 고품질의 한우 고급육을 생산하기 위한 DNA 분자표지를 이용하는 선발 육종기술을 제공한다.

본 발명은 한우에서 고등동물의 포화지방산을 불포화지방산으로 전환하는데 관여하는 효소로 알려져 있는 Stearoyl-CoA Desaturase(SCD) 유전자의 단일염기다형(SNP) 표지인자를 발굴하고 PCR-SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism; 단일쇄 형태구조다형성)분석기법을 이용하여 한우의 근내지방도(마블링)와 등지방 두께에 유의적으로 영향을 미치는 육질 연관 SNP 유전자형을 개발하고 궁극적으로 는 고품질 고급육을 생산하는 한우를 조기에 감별하여 선발할 수 있는 DNA 표지인자(DNA marker)를 제공하여 한우 선발육종 개량에 활용하는데 있다.

본 발명의 구체적인 실시 예를 통해 한우의 고급불포화 지방산 합성 및 조성에 유의적으로 영향을 미치는 Stearoyl-CoA desaturase(SCD) 효소 유전자와 근내지방도 및 등지방두께와 유의적으로 연관된 SCD 마커의 분석 방법을 제시한다.

<실험 예1> 한우 SCD 유전자의 검출

-제 1단계: 한우의 genomic DNA 추출

본 발명에서 능력검정을 통해 혈통기록과 검정성적을 보유하고 있는 한우개체를 대상으로 각 시험축으로부터 게놈 DNA의 분리 추출은 Miller 등(1988)의 방법을 일부 변경하여 분리 추출하였으며 DNA 농도 측정 후 TE buffer(10mM Tris-Hcl, pH 7.4; 1mM EDTA)에 용해하여 -20℃ 냉동고에 보존하고 공시재료로 사용하였다.

-제 2단계: SCD 유전자 분리를 위한 프라이머 (primer) 제작

한우 SCD 유전자의 인트론(intron) 7번 영역의 211 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 NCBI의 GenBank에 등록(DQ069783)된 염기서열 정보를 참고하여 [표 1]과 같은 염기서열을 갖는 프라이머를 고안하여 제작하였다.

한우 SCD 유전자의 primer 염기서열

Primer name	Primer sequence(5′- 3′)
SCD-F 4416	AGCAGTATCCACCATGAAGT
SCD-R 4626	ATAAAAAGGGAAAAATCCCA

-제 3단계: SCD 유전자의 PCR 증폭 조건 확립

한우 SCD 유전자의 PCR증폭을 위한 반응액은 template DNA 50ng, primer 각 10 pmol, dNTP 각 200μM, 10 X PCR buffer 5㎕, 1.5mM MgCl₂ 그리고 Taq DNA polymerase 1.0 unit를 첨가하여 PCR 반응액을 총 20㎕로 조정하였다. PCR cycle은 최초 94℃에서 5분간 예비가열 한 후 94℃에서 30초, 51℃에서 30초 그리고 72℃에서 45초 cycle을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 5분간 가열하고 DNA 증폭과정을 종료하였다. PCR 종료 후 약 5㎕의 PCR 증폭산물을 2.5%의 agarose gel에 전기영동 하여 DNA의 증폭여부 및 크기를 확인하였다.

<실험 예2> 한우 SCD 유전자의 단일염기다형(SNP) 검출

-제 1단계: Direct sequencing 기법에 의한 SNP 검출

혈연관계가 없는 한우 60두의 pooled DNA를 제작하고 direct sequencing 방법으로 PCR 증폭산물 DNA의 전체 염기서열을 분석하고 그 염기서열을 [도 1]에 제시하였다. 즉, DNA 시료와 primer를 BigDye Ver. 3.1을 이용하여 direct sequencing 반응을 수행하였다. 일차 반응산물을 BigDye clean up solution을 이용하여 BigDye 및 primer를 제거한 다음 70% ethanol로 세척하여 sequencing 반응물을 정제하였다. 그 다음 10㎕의 HiDi formamide로 반응물을 현탁하고 90℃에서 2분간 변성 과정을 거쳐 long read를 위해 50cm의 capillary를 장착한 ABI 3100 DNA analyzer을 이용하여 sequencing을 수행하였다.

-제 2단계:PCR-SSCP(단일쇄 형태구조다형성)기법에 의한 SNP 유전자형 판정

한우 SCD 유전자의 SSCP(single strand conformation polymorphism)분석은 PCR증폭 산물 2㎕에 8㎕의 formamide dye (98% formamide, 20mM EDTA, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylen cyanol)를 첨가하고 95℃에서 5분간 변성시킨 후 즉시 ice에 5분간 보관하여 reannealing을 방지한 다음 12% (49:1) non-denaturation polyacylamide gel을 이용하여 250 volt에서 약 6시간 동안 전기영동을 실시 한 후 silver staining(Bassam et al., 1991)으로 SSCP의 DNA band를 검출하고 각 banding pattern에 따른 SSCP 유전자형을 결정하였고 그 결과는 [도 2]에 나타내었다. 또한 [도 3]에 제시한 바와 같이 SCD 유전자의 SSCP 분석을 통하여 검출한 각 유전자형 marker의 염기서열을 크로마토그램으로 분석 비교하여 각각의 SSCP 유전자형에 상응하는 SNP 유전자형을 판정하였다.

이상과 같은 방법으로 검정 개체별 SCD 유전자의 SNP 유전자형을 결정하기 위하여 SNP의 염기치환 부위를 포함하는 211bp 단편을 증폭하여 SSCP를 분석한 결과 [도2]의 전기영동 사진에서 보는 바와 같이 단일 band를 갖는 homo형과 두개의 band를 갖는 hetero형의 3종류의 SSCP 유전자형이 검출되었다. 그리고 SSCP 유전자형의 염기변이를 확인하기 위하여 각 유전자형의 염기서열을 분석한 결과 [도 3]에서 보는 바와 같이 증폭부위의 122번째 염기에서 A/G의 염기 치환에 의한 A/A, G/G 및 A/G SNP 유전자형에 각각 해당하는 SSCP type을 결정하였다.

한우 집단을 대상으로 분석한 SCD 유전자의 SNP 대립유전자 빈도와 유전자형 출현율을 분석한 결과 A와 G 대립유전자빈도는 각각 0.46 과 0.54 로 G 대립유전자 빈도가 다소 높았고, SNP 유전자형은 AA형 21.1%, AG형 49.7% 그리고 GG형은 29.2%였다.

<실험예 3> 한우 SCD 유전자의 SNP 마커와 도체 및 육질관련 형질과의 연관성 분석

한우 SCD 유전자의 SNP 마커 유전자형이 도체형질 및 육질형질의 육종가 추정치에 미치는 효과를 규명하기 위하여 SASⓐ 8.1 Package/PC를 이용하여 PROC GLM으로 통계 처리하였으며, 유전자형의 효과가 유의성이 인정된 형질들에 대해 DMRT(Duncan`s Multiple Range Test) 방법으로 각 유전자형의 least square means간의 차이에 대한 유의성 검정을 실시하였다. 본 실험을 통해 발견된 SCD 유전자의 특정한 SNP 유전자형과 한우의 각종 도체 및 육질형질간의 관련성을 통계 분석한 결과 근내지방도 및 등지방 두께에 대한 고도의 유의적 연관성이 입증되었다[표 2]. 즉, A/G 유전자형을 가진 개체들의 근내지방도가 각각 A/A 유전자형을 가진 개체들에 비해 약 0.675(28.2%), 그리고 G/G 유전자형을 가진 개체들에 비해 0.624(26.1%) 높은 것으로 나타났다. 또한 등지방두께는 A/G 유전자형을 가진 개체들이 A/A 유전자형을 가진 개체들에 비해 약 0.334(76.3%), 그리고 G/G 유전자형을 가진 개체들에 비해 약 0.279(85.0%) 정도 높은 것으로 나타났다.

SCD 유전자의 SNP 표지인자가 육질에 미치는 영향

도체형질	SNP 유전자형			P-value
도체형질	A/A형	A/G형	G/G형	P-value
생체중/㎏	530.831± 9.100	551.153± 5.899	544.433± 7.858	0.1764
도체중/㎏	302.341± 5.837	315.791± 3.784	311.704± 5.040	0.1582
도체율/%	56.847± 0.279	57.276± 0.181	57.206± 0.241	0.4291
등심단면적/㎠	74.687± 1.485	75.367± 0.963	75.058± 1.282	0.9268
근내지방도/1~7	1.719± 0.209b	2.394± 0.135a	1.770± 0.180b	0.0045**
등지방 두께(육종가)/㎝	-0.104± 0.096b	0.230± 0.062a	-0.049± 0.019b	0.0013**

^**P<0.01

a,b : 서로 다른 부호간에는 유의차가 있음.

이상의 본 발명에 대한 결과를 종합해 볼 때 SCD 유전자의 특정 SNP 유전자형은 한우의 근내지방도 및 등지방두께에 대한 고도의 유의적 연관성이 입증되어 한우의 육질개량을 위한 DNA 표지인자로 이용 가능성이 확인되었다. 따라서, 본 연구를 통해 개발된 육질관련 분자표지의 활용으로 근내지방도(마블링)와 등지방두께가 우수한 고품질 고급육 생산 한우의 조기 선발을 위한 새로운 DNA 표지인자로 실용화가 가능할 것으로 사료된다.

기존의 전통적인 선발육종에 의한 한우 육종개량 체계는 고품질 고급육 한우생산과 관련된 도체 및 육질형질에 대한 유전적 개량속도가 느리고 개량 효율성이 저조하여 도체 등급판정시 1등급 출현율이 낮기 때문에 한우의 고급육 육종개량에 큰 장애 요인으로 지적되고 있다.

그러나, 본 발명의 SCD 효소 유전자의 분자표지인자는 한우 육종개량 사업에 활용하여 한우의 육질형질과 SCD 표지인자간의 연관성 분석을 통한 육질연관 DNA 표지인자 개발로 한우 개체의 육질에 대한 유전적 잠재능력의 조기예측과 고급육 계통 한우의 조기선발이 가능하다. 또한, 선발의 정확도 향상 및 선발 효율성을 극대화하고 개량속도를 가속화 할 수 있어 우량 종축의 생산과 사육농가의 소득 증대에 크게 기여 할 수 있다.

Claims

도면 1의 염기서열을 갖는 한우 불포화지방산 생합성 효소 유전자(SCD)의 인트론(Intron) 7번째 특정 영역의 DNA 염기서열 및 신규 단일염기다형.
한우의 엔씨비아이 젠뱅크(NCBI GenBank)에 등록된 등록번호 제 DQ069783 호 유전정보의 4416번째부터 4626번째까지의 프라이머(primer) 염기서열.
한우 SCD 유전자 염기서열(GenBank Accession No. DQ069783) 4537번째의 A→G 염기치환에 따른 단일염기다형(SNP)으로 한우 근내지방도 및 등지방 두께와 고도의 유의적 연관성을 갖는 SNP 유전자형 마커 및 PCR-SSCP(단일쇄 형태구조다형성) 유전자형 마커.