CN108048527A - 一种用capn3基因进行柴达木福牛标记辅助选择的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用CAPN3基因进行柴达木福牛标记辅助选择的方法，该方法是以柴达木福牛的全基因组DNA为模板，利用CAPN3基因标记进行PCR扩增获得PCR扩增产物，将获得的PCR扩增产物进行测序，最后对所检测到的基因进行分型和对比分析，即针对CAPN3基因5‘UTR的C2546T位点进行PCR扩增及测序，最后对所检测结果进行统计分析。通过本发明的方法，在柴达木福牛CAPN3基因5‘UTR中的CC、CT、TT三种基因型中，CT基因型的剪切力、活体重、胴体重与CC和TT的剪切力、活体重、胴体重个体差异显著。因此，在柴达木福牛的繁育体系设计上通过考虑SNP位点的效应，即可实现对柴达木福牛的肉质性状的改良，进一步提高柴达木福牛的生产效益。

Description

一种用CAPN3基因进行柴达木福牛标记辅助选择的方法
技术领域：
本发明涉及一种肉牛选育的标记辅助选择方法，特别涉及一种用CAPN3基因进行柴达木福牛标记辅助选择的方法。
背景技术：
柴达木福牛依托青海高原上的海西州长期开展生态畜牧业的丰厚积淀，以雪域牦牛为母本、黄牛为父本生产犏牛、母犏牛再以安格斯牛等优良肉牛为终端父本，应用牦牛远缘种间杂交技术生产的商品肉牛。因此，柴达木福牛既具有牦牛适应高寒气候、耐粗饲、抗病能力强的生物学特点，又具有初生重大、生长发育快、饲料回报高、产肉量高的基因禀赋，且具有营养丰富、低脂肪、高热量的优质牛肉品质。
在国际评价A级标准上，我们国家的牛肉一般都在3A以下，而青海的柴达木福牛通过农业部诸位专家的鉴定，可以达到6A的标准，这对中国高档牛肉来说填补了一个空白在高档商品牛肉领域里，中国是一个后起的国家。我们国家的牛都是以耕种为主，没有肉食品种牛。肉质是柴达木福牛最重要的性状之一，因此，如何针对肉质性状对柴达木福牛进行分子育种，将是柴达木福牛研究的核心热点之一。
肉的嫩度主要决定于肌纤维、肌节长度、肌内脂肪和结缔组织等。钙蛋白酶系统在细胞内参与机体生长与代谢过程，还在肌原纤维更新和宰后嫩化中扮演重要角色。钙蛋白酶(calpain)表达减少以及钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)表达量的增加，都会导致肌肉蛋白水解率及宰后肉嫩度的下降，这表明钙蛋白酶水解作用是导致肉嫩化的主要因素。其中CAPN3只在骨骼肌表达，其mRNA表达量为经典钙蛋白酶的10倍。
当前柴达木福牛存在的几个核心问题是：一是数量较少，总数仅为2-3万头；其次优良性状需要巩固，这些目的的实现都依赖于分子标记技术，因此，亟需建立一种分子标记辅助选择技术，从而为柴达木福牛的肉用性状改良奠定遗传学基础。
发明内容：
本发明的目的旨在提供一种用CAPN3基因进行柴达木福牛标记辅助选择的方法，实现对柴达木福牛的肉质性状进行改良。
为达到上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种用CAPN3基因进行柴达木福牛标记辅助选择的方法，是以柴达木福牛的全基因组DNA为模板，利用CAPN3基因标记进行PCR扩增获得PCR扩增产物，将获得的PCR扩增产物进行测序，最后对所检测到的基因进行分型和对比分析，即针对CAPN3基因5‘UTR的C2546T位点进行PCR扩增及测序，最后对所检测结果进行统计分析。
具体包括如下步骤：
1)采集柴达木福牛静脉血进行全基因组DNA提取，然后利用琼脂糖电泳及ND2000进行质量、浓度和纯度的检测；
2)以提取的全基因组DNA为模板，对CAPN3基因5‘UTR区进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；其中：
引物序列为：CATCAACAGCTACGAGATGCG(上游引物)，GGTCATATAGTAAGGTCAGT(下游引物)；
PCR反应体系：总体积20ul，其中Buffer(含5u mol.L-1Mg2+)2uL，10umol.L-1dNTPs0.4uL，10umol.L-1上、下游引物各0.6ul，模板DNA 50ng，5U.uL Taq DNA聚合酶0.4uL，用超纯水补至20uL；
PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30S，60℃退火30S，72℃延伸20S，36个循环；72℃延伸7min。
PCR扩增产物用2.0的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
3)将PCR扩增产物用测序仪进行测序，根据检测结果将所有个体按照基因型进行分类；检测的结果中显示存在一个SNP位点，所有个体按照基因型分为：CC型、CT型和TT型。
4)数据分析：对不同基因型个体的肉质及体尺性状中的剪切力、pH、屠宰率、眼肌面积、活体重、胴体重进行统计分析。
通过本发明方法中的数据分析：在柴达木福牛CAPN3基因5‘UTR中的CC、CT、TT三种基因型中，CT基因型的剪切力、活体重、胴体重与CC和TT的剪切力、活体重、胴体重个体差异显著。因此，在柴达木福牛的繁育体系设计上通过考虑SNP位点的效应，即可实现对柴达木福牛的肉质性状的改良，进一步提高柴达木福牛的生产效益。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
1.动物来源
本实验动物来自青海省海西州柴达木福牛养殖基地24月龄的50头公牛作为实验用牛。
2.采血
采血均为静脉血采血10ml，用抗凝管采血，冻存于-20℃冰箱。
3.检测肉质
肉质的检测按照国标(GB/T 17238-1998)严格执行。
4.PCR扩增
引物合成和测序皆由北京擎科生物技术有限提供，基因组提取使用天根生化科技(北京)有限公司(DP340)试剂盒，整个过程参照标准流程执行。
4.1PCR扩增以柴达木福牛全基因组为模板，对CAPN3基因5‘UTR区进行扩增，引物序列为：CATCAACAGCTACGAGATGCG(上游引物)，GGTCATATAGTAAGGTCAGT(下游引物)。
4.2PCR反应体系：总体积20ul，其中Buffer(含5u mol.L-1Mg2+)2uL，10umol.L-1dNTPs 0.4uL，10umol.L-1上、下游引物各0.6ul，模板DNA 50ng，5U.uLTaq DNA聚合酶0.4uL，用超纯水补至20uL。
4.3PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，36个循环；72℃延伸7min。
4.4PCR扩增产物用2.0的琼脂糖凝胶电泳检测。
5.测序
PCR扩增产物送至北京擎科生物技术有限公司在ABI3730XL测序仪上进行测序，结果中显示存在一个SNP位点，如下表1所示的基因分型统计指标，所有个体按照基因型分为：CC型、CT型和TT型。测序文件在chromas软件中进行编辑以备后续分析。
表1：基因分型统计指标
6.数据分析
利用PopGen32对测序结果进行分析，结果显示CAPN3基因5‘UTR中的C2546T位点未偏离哈代-温伯格平衡(P<0.05)，用SPSS Statistics17.0对基因型与性状数据结果进行最小二乘法统计分析，如下表2，结果显示CAPN3基因5‘UTR中的C2546T位点对剪切力、活体重、胴体重影响显著(P<0.05)，对屠宰率、pH、眼肌面积影响不显著(P>0.05)。
表2柴达木福牛CAPN3不同基因型各性状值差异显著性检验

Claims (7)

1.一种用CAPN3基因进行柴达木福牛标记辅助选择的方法，其特征在于：所述方法是以柴达木福牛的全基因组DNA为模板，利用CAPN3基因标记进行PCR扩增获得PCR扩增产物，将获得的PCR扩增产物进行测序，最后对所检测到的基因进行分型和对比分析，即针对CAPN3基因5‘UTR的C2546T位点进行PCR扩增及测序，最后对所检测结果进行统计分析。
2.根据权利要求1所述的用CAPN3基因进行柴达木福牛标记辅助选择的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)采集柴达木福牛静脉血进行全基因组DNA提取，然后利用琼脂糖电泳及ND2000进行质量、浓度和纯度的检测；
2)以提取的全基因组DNA为模板，对CAPN3基因5‘UTR区进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
3)将PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后，再用测序仪进行测序，根据检测结果将所有个体按照基因型进行分类；
4)数据分析：对不同基因型个体的肉质及体尺性状中的剪切力、pH、屠宰率、眼肌面积、活体重、胴体重进行统计分析。
3.根据权利要求2所述的用CAPN3基因进行柴达木福牛标记辅助选择的方法，其特征在于：步骤2)中所述PCR扩增的引物序列为：引物序列为：CATCAACAGCTACGAGATGCG(上游引物)，GGTCATATAGTAAGGTCAGT(下游引物)。
4.根据权利要求2所述的用CAPN3基因进行柴达木福牛标记辅助选择的方法，其特征在于：步骤2)中所述PCR扩增的反应体系包括含5umol/LMg2+的Buffer，10umol/L dNTPs，10umol/L上、下游引物，模板DNA，5U.uL Taq DNA聚合酶和超纯水。
5.根据权利要求2所述的用CAPN3基因进行柴达木福牛标记辅助选择的方法，其特征在于：步骤2)中所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30S，60℃退火30S，72℃延伸20S，36个循环；72℃延伸7min。
6.根据权利要求2所述的用CAPN3基因进行柴达木福牛标记辅助选择的方法，其特征在于：步骤3)中所述检测结果中显示存在一个SNP位点，所有个体按照基因型分为：CC型、CT型和TT型。
7.如权利要求1～6中任一权利要求所述的CAPN3基因在柴达木福牛肉质预测方面的应用。
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