CN103866001A - 牦牛胴体性状候选基因检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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CN103866001A CN201410023938.5A CN201410023938A CN103866001A CN 103866001 A CN103866001 A CN 103866001A CN 201410023938 A CN201410023938 A CN 201410023938A CN 103866001 A CN103866001 A CN 103866001A
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Abstract

本发明涉及动物生物技术领域中的牦牛分子标记辅助育种技术，具体涉及到牦牛胴体性状候选基因检测试剂盒及其测试方法。一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测试剂盒，包括有PCR反应液，ANK1*B的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0。本发明的优点是反应灵敏、特异性强、易操作，适用于各级畜牧兽医教学科研单位，兽用生物制品厂以及各大、中型牦牛养殖企业的生产性能的改良。

Description

牦牛胴体性状候选基因检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及动物生物技术领域中的牦牛分子标记辅助育种技术，具体涉及到牦牛胴体性状候选基因检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
ANK1（Ankyrin1）基因属锚蛋白基因家族（Ankyrins），编码的AnkR蛋白存在于肌肉中的肌原纤维之间和肌原纤维与肌膜之间，ANK1基因在人类医学领域研究较多，人类ANK1基因启动子区的碱基缺失与遗传性球形红细胞增多症相关，在ANK1启动子区域的碱基突变与日本人患2型糖尿病的易感度相关。ANK1基因与肌内脂肪关系的研究在猪和牛上有所报道，安格斯牛、夏洛来牛和利木辛牛ANK1基因1.11kb的启动子区域发现了7个多肽位点，其中5个SNPs与肌肉嫩度和大理石花纹相关，两个单倍型与肌肉嫩度相关；1个单倍型明显与肌内脂肪和肉的多汁性相关。皮特兰猪、杜洛克猪和大白猪ANK1基因启动子761bp区域发现了12个SNP，其中2个SNPs与肉质性状显著相关。1个SNP和1个单倍型与肌肉滴水损失相关而另一个SNP与肌内脂肪性状相关，在大白猪中1个单倍型与肌内脂肪相关，单倍型3在皮特兰中发现与失水率有关。单倍型5是与大白猪的肌内脂肪和肉质的滴水损失成正相关。猪ANK1基因3′UTR的一个SNP与肌肉剪切力、肌内脂肪及肌肉持水性相关。
ANK1基因已经成为肉质改良中最为主要的肉质候选基因之一。牛的ANK1基因图谱已经绘制完成，此基因在牛的第27号染色体上，与肉质脂肪和大理石纹等数量性状位点相邻。猪的ANK1基因在17号染色体上，其紧邻体重、背膘厚度和肌间脂肪等数量性状位点。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测试剂盒。以解决快速、敏感性高、成本低，用于牦牛胴体性状候选基因分子选种技术。
本发明的又一目的在于一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测方法。
通过PCR-SSCP对不同年龄和性别的牦牛个体ANK1基因第1外显子-第1内含子区进行遗传多态性分析，并测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合胴体性状相关的生产数据，确定对胴体性状影响显著的等位基因，为改善牦牛生产性能提供指导。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测引物，其主要特点在于：
ANK1-F:5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3'；
ANK1-R:5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3'。
一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测试剂盒，其主要特点在于包括有PCR反应液，ANK1*B的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；
所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0；（补充数量）
所述的PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ANK1-F:
5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3'和ANK1-R:
5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，1.0μL，ddH2O补充体积至20μL；
一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测方法，其主要特点在于，检测步骤如下：
（1）样品采集：牦牛颈静脉采血10ml,ACD抗凝，-20℃冻存；
（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；
（3）聚合酶链式反应：
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ANK1-F和ANK1-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH2O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火59℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃7min；
引物序列为：
ANK1-F:5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3'
ANK1-R:5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3'
（4）PCR产物的SSCP检测：
取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0，98℃变性10min，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，350V电压条件下，4℃电泳22h，银染法显色后拍照；
（5）结果判断：
对牦牛ANK1基因第1外显子-第1内含子的PCR-SSCP检测，有5个等位基因，对牦牛胴体性状具有影响的等位基因为ANK1*B;（对牦牛胴体性状无影响的等位基因为ANK1*A。
控制牦牛胴体性状的等位基因为ANK1*B的核苷酸序列ccttcacttggggaactcgtcccctctggacgcctcctccaggcagcacccctggctctgcaggactccagcacccaaactcagcagcaagcgcttggagtggccccccaccctactcacagcccaagggacccaaggagtggggccaggcttcccggctgagagcgggagagggcaccccagcaatctgtaggccccaggcaggcgcctcccctctgcttggctcctgggcccgatagcgcctgtgctgctgataaagcctcaaagggcctcgcagaggtgcggtggctccggcagcccgagacgtacccacagaccacggtgactgacctctgggacctgga；
对牦牛肉嫩度无影响的ANK1*A核苷酸序列为：
cagagtctccaggacactcacacaccccactcagcaagacaaaagccctgtttctagcaggacccaccttccttagagggcttcccttgtgactcagtggttaagagtttgcctgccagtgcaggagatgggagtttgatccctgggtcaggaagagtccctggagaaggaaacggctacccactccaacgttcttgcctggtaaaatcccatggacagaggagcctggcaggctaagtccatggggtcacgaggagtcagacatgacttagagactaaacaacaaccttccttagaaggcagctctgaaattgtg。
所述的牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其步骤为：
（A）待检牦牛基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火59℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃7min；
（B）用步骤（A）中扩增的PCR产物和ANK1*B的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；
（C）步骤（B）中检测到的带型与ANK1*B标准样带型一致的样品为携带控制牦牛胴体性状等位基因的个体。
本发明的有益效果：反应灵敏、特异性强、易操作，适用于各级畜牧兽医教学科研单位，兽用生物制品厂以及各大、中型牦牛养殖企业的生产性能的改良。
本发明利用PCR-SSCP对不同年龄和性别的牦牛个体ANK1基因第1外显子-第1内含子区进行遗传多态性分析，并测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合胴体性状相关的生产数据，确定胴体生产性状的等位基因，为改善牦牛生产性能提供指导。本发明通过对试验牦牛ANK1基因第1外显子-第1内含子区的SSCP分析，发现了5个（A、B、C、D和E）等位基因。其中，A、C、D和E等位基因对牦牛胴体性状影响不显著。
本发明对牦牛胴体性状的分子标记选种具有快速、敏感性高、成本低等特点。
附图说明：
图1是牦牛ANK1基因第1外显子-第1内含子区的PCR-SSCP检测凝胶图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面以甘南牦牛胴体性状分子选种技术的建立为例，对本发明的内容进行详细的说明。
实施例1：一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测引物，其主要特点在于：
ANK1-F:5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3'；
ANK1-R:5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3'。
实施例2：一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测试剂盒，包括有PCR反应液，ANK1*B的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；
所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0；
所述的PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2 +浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ANK1-F:
5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3'和ANK1-R:
5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，1.0μL，ddH2O补充体积至20μL；
所述的ANK1*B的DNA标准样的核苷酸序列为：
Figure BDA0000458252620000051
实施例3：一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测方法，其主要特点在于，检测步骤如下：
（1）样品采集：牦牛颈静脉采血10ml,ACD抗凝，-20℃冻存；
（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；
（3）聚合酶链式反应：
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ANK1-F和ANK1-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH2O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火59℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃7min；
引物序列为：
ANK1-F:5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3'
ANK1-R:5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3'
（4）PCR产物的SSCP检测：
取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0，98℃变性10min，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，350V电压条件下，4℃电泳22h，银染法显色后拍照；
（5）结果判断：
对牦牛ANK1基因第1外显子-第1内含子的PCR-SSCP检测，有5个等位基因，对牦牛胴体性状有影响的等位基因为ANK1*B;对牦牛胴体性状无影响的等位基因为ANK1*A。
控制牦牛胴体性状的等位基因为ANK1*B的核苷酸序列
ccttcacttggggaactcgtcccctctggacgcctcctccaggcagcacccctggctctgcaggactccagcacccaaactcagcagcaagcgcttggagtggccccccaccctactcacagcccaagggacccaaggagtggggccaggcttcccggctgagagcgggagagggcaccccagcaatctgtaggccccaggcaggcgcctcccctctgcttggctcctgggcccgatagcgcctgtgctgctgataaagcctcaaagggcctcgcagaggtgcggtggctccggcagcccgagacgtacccacagaccacggtgactgacctctgggacctgga；
对牦牛肉嫩度无影响的ANK1*A核苷酸序列为：
cagagtctccaggacactcacacaccccactcagcaagacaaaagccctgtttctagcaggacccaccttccttagagggcttcccttgtgactcagtggttaagagtttgcctgccagtgcaggagatgggagtttgatccctgggtcaggaagagtccctggagaaggaaacggctacccactccaacgttcttgcctggtaaaatcccatggacagaggagcctggcaggctaagtccatggggtcacgaggagtcagacatgacttagagactaaacaacaaccttccttagaaggcagctctgaaattgtg。
实施例4；所述的牦牛胴体性状候选基因等位基因PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其特征是步骤为：
（A）待检牦牛基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火59℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃7min；
（B）用步骤（A）中扩增的PCR产物和ANK1*B的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；
（C）步骤（B）中检测到的带型与ANK1*B标准样带型一致的样品为携带控制牦牛胴体性状等位基因的个体。
实验例1：
试验材料
甘南牦牛721头，其中328头来自甘南藏族自治州夏河县，393头来自甘南藏族自治州玛曲县，从屠宰场收集血样30mL，ACD（酸性柠檬酸葡萄糖）抗凝。在甘南藏族自治州夏河县和玛曲县屠宰场测定甘南牦牛胴体性状及肉质性状，包括胴体重、眼肌面积、嫩度、失水率、熟肉率，所测数据与血样记录一致并记录屠宰后牦牛的年龄和性别。
试验方法
1.引物设计和PCR扩增
根据GenBank已公布的海福特牛ANK1基因序列（GenBank no.:NW_003104610.1），应用Primer5.0软件设计特异性引物，扩增牦牛和普通牛ANK1基因第1外显子-第1内含子序列。引物由大连宝生物有限公司合成。引物序列如下：
ANK1-F:5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3'
ANK1-R:5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3'。
最佳反应体系及条件：
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ANK1-F和ANK1-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH2O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火59℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃7min；
引物序列为：
ANK1-F:5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3'
ANK1-R:5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3'。
得到344bp的特异性扩增产物，可直接进行SSCP检测。
2.SSCP检测
取步骤1中2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液[包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA(pH8.0)]，98℃变性10min，立即冰浴10min。12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（Arc:Bis=37.5:1）250V电压条件下，10℃电泳18h，银染法显色后拍照。其中，对PCR扩增产物进行SSCP检测，结果在所检测的721头牦牛中检测到5个等位基因，分别命名为ANK1*A、*B、*C、*D和*E。
甘南牦牛的ANK1*B的DNA标准样的核苷酸序列为：
3.不同等位基因的克隆测序
经SSCP检测后，利用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收不同等位基因的PCR产物。回收后的片段用载体连接，构建重组质粒，并转化大肠杆菌DH5α菌株，菌落PCR鉴定后送华大生物公司进行测序。
4.牦牛ANK1基因第1外显子-第1内含子区等位基因与胴体性状相关性分析
表1牦牛ANK1基因第1外显子-第1内含子区各等位基因与胴体及肉质性状关联性
注：（P<0.01）表示差异极显著；（P<0.05）表示差异显著。
5.结果分析
运用等位基因“存在/缺失”的方法分析了甘南牦牛ANK1基因第1外显子-第1内含子主要等位基因对胴体重及肉质性状的影响（表1），结果表明3岁携带等位基因A的牦牛个体眼肌面积显著（P<0.05）高于未携带者；3岁未携带等位基因B的牦牛个体的眼肌面积显著（P<0.05）高于携带者。5岁未携带等位基因B的牦牛个体的眼肌面积显著（P<0.05）低于携带者。即选留携带等位基因A的个体，或淘汰携带等位基因B的个体，能改善3岁甘南牦牛的眼肌面积；而选留携带等位基因B的个体，或淘汰携带等位基因A的个体，能提高5岁甘南牦牛眼肌面积。由于牦牛一般在5岁以上出栏，因此，根据牦牛生长发育规律，选择能够提高5岁牦牛眼肌面积的控制等位基因，对于牦牛产业发展具有重要的意义。为此，本发明主要针对在5岁出栏的胴体性状进行了选择。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0000458252620000101
Figure BDA0000458252620000111

Claims (4)

1.一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测引物，其特征在于：
ANK1-F:5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3'；
ANK1-R:5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3'。
2.一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测试剂盒，其特征在于包括有PCR反应液，ANK1*B的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；
所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0；
所述的PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ANK1-F:
5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3'和ANK1-R:
5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，ddH2O补充体积至20μL。
3.一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测方法，其特征在于，检测步骤如下：
（1）样品采集：牦牛颈静脉采血10ml,ACD抗凝，-20℃冻存；
（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；
（3）聚合酶链式反应：
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ANK1-F和ANK1-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH2O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火59℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃7min；
引物序列为：
ANK1-F:5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3'；
ANK1-R:5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3'；
（4）PCR产物的SSCP检测：
取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0，98℃变性10min，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，350V电压条件下，4℃电泳22h，银染法显色后拍照；
（5）结果判断：
对牦牛ANK1基因第2内含子的PCR-SSCP检测，有5个等位基因，控制牦牛胴体性状的等位基因为ANK1*B;
对牦牛胴体性状无影响的等位基因为ANK1*A。
4.如权利要求2所述的牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其特征在于步骤为：
（A）待检牦牛基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火59℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃7min；
（B）用步骤（A）中扩增的PCR产物和ANK1*B的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；
（C）步骤（B）中检测到的带型与ANK1*B标准样带型一致的样品为携带控制牦牛胴体性状等位基因的个体。
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CN104975101A (zh) * 2015-07-21 2015-10-14 甘肃农业大学 一种用于预示牦牛肌肉嫩度的pcr-sscp引物对及检测试剂盒

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