KR101277024B1

KR101277024B1 - 소 경제형질 진단용 다형성 마커 및 이를 이용한 소 경제형질의 진단방법

Info

Publication number: KR101277024B1
Application number: KR1020110121456A
Authority: KR
Inventors: 여정수; 이윤석; 오동엽
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2011-11-21
Filing date: 2011-11-21
Publication date: 2013-06-24
Also published as: KR20130055826A

Abstract

본 발명은 소 경제형질 진단용 다형성 (SNP) 마커, 이를 이용한 소 육질의 진단방법 및 진단키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 소 경제형질 진단용 다형성(SNP) 마커, 이를 이용한 경제형질의 진단방법 및 진단키트를 이용하여 근내지방도, 등지방두께, 도체중량, 또는 불포화지방산을 간편하고 신속하게 진단할 수 있으며, 이를 토대로 육질이 우수한 소품종을 조기에 선발하여 개량하여, 육질이 우수한 쇠고기를 소비자에게 제공하는데 사용될 수 있다.

Description

소 경제형질 진단용 다형성 마커 및 이를 이용한 소 경제형질의 진단방법 {Single Nucleotide Polymorphism Marker for Diagnosis of Economic traits in Cattle and Method of Diagnosing Economic traits in Cattle Using the Same Marker}

본 발명은 소 경제형질 진단용 다형성 마커 및 이를 이용한 소 경제형질의 진단방법에 관한 것이다.

일반적으로 가축의 유전적 능력 개량을 위한 전통적인 접근 방법은 선발과 교배체계를 반복적으로 이용하는 것이다. 그러나, 전통적인 선발육종에 의한 현행 한우 육종개량 체계는 고급육 한우생산을 위한 육질형질의 개량속도가 느리고 개량 효율성이 높지 않기 때문에 고급육 출현율이 매우 낮고 경제형질 경쟁력 향상에도 커다란 문제점으로 지적되고 있다. 또한, 종래의 통계육종 방법은 후대검정이나 능력검정을 통한 주요 경제 형질에 대한 표현형 정보를 얻기 위해서 상당히 오랜 시간이 소요되고 많은 경비와 노력이 요구된다. 한우와 같이 대가축인 경우 평균 세대간격이 길고 산자수가 적어 선발 강도가 낮기 때문에 유전적 변화속도가 느리고 유전적 개량 량도 미진하여 전통적인 육종방법만으로는 한우의 생산능력을 획기적으로 향상시키는데 많은 어려움이 있다. 특히, 육질과 같은 경제형질의 경우 개체의 도축 후에나 관련 정보와 자료를 획득할 수 있어 기존의 방법으로는 분명한 한계가 있다고 할 수 있다.

그러나, 한우의 주요 경제형질에 영향을 미치거나 관련된 유용 유전자 및 DNA 표지인자를 탐색 발굴하고 이를 육종개량사업에 이용할 경우 선발 정확도 향상, 선발 강도 증가 및 세대간격 단축으로 유전적 개량 량을 극대화하고 개량속도를 가속화할 수 있어 보다 효율적이고 경제적인 육종개량이 가능하다. 최근 유전공학 및 유전자 분석 기술의 눈부신 발달로 가축의 육종개량분야에 분자유전학적 첨단기술과 정보를 직접 이용할 수 있게 되어 새로운 육종 방법의 접근이 가능해 졌다.

일반적으로 쇠고기의 육질은 근내지방도, 육색, 지방색 및 조직감 등에 의해 결정되며 이러한 요인들은 관능적 특성의 기준이 되는 연도, 다즙성, 풍미 등과도 밀접하게 관련되는 것으로 보고되었는데 (Lee 등, 1994; Monson 등, 2005; Robins 등, 2003; Vander Wal 등, 1997), 근내지방이 많을수록 맛이 좋고 부드러운 고급육이라고 할 수 있다. 또한, 쇠고기의 독특한 풍미는 불포화지방산 함량이 영향을 미친다고 알려져 있는데 (Dryden and Marchello, 1970; Jeremiah, 1996; Melton 등, 1982; Studivant and Lunt 등, 1992) 한우가 다른 품종과는 달리 불포화지방산, 특히 올레인산 함량이 많은 것으로 알려져 있고 (Chung 등, 2007; May 등, 1993; Oka 등, 2002), 단일불포화지방산 (mono-unsaturated fatty acid)의 80% 이상을 차지하고 있는 올레인산 (C18:1)이 쇠고기의 풍미를 좌우하는 요소라는 사실도 입증되었다 (Dryden and Marchello, 1970; Tsuji, 2008; Yoshimura and Namikawa, 1983).

본 발명은 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 소 경제형질 진단용 다형성 (SNP) 마커를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 마커를 이용한 소 경제형질의 진단방법 및 진단용 키트를 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 소 경제형질 진단용 다형성 (SNP) 마커를 제공한다.

상기 경제형질은 근내지방도, 등지방두께, 도체중량, 및 불포화지방산의 함량으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 형질일 수 있다.

상기 소는 한우일 수 있다.

상기 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드의 유전자형이 CC일 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는 소 경제형질의 진단방법을 제공한다.

상기 경제형질의 진단방법은,

(1) 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계; 및

(2) 상기 (1)단계로부터 수득한 DNA을 주형으로 하여, 서열번호 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머를 포함하여 PCR을 수행하고, 상기 PCR결과물로부터 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 소 경제형질은 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드의 유전자형이 TT 유전자형 < CT 유전자형 < CC 유전자형 순으로 경제형질이 우수한 소로 진단할 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 포함하는 소 경제형질 진단용 키트를 제공한다.

상기 프라이머는 서열번호 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드는 근내지방도, 등지방두께, 도체중량, 또는 불포화지방산의 함량 등과 같은 소, 특히 한우의 경제형질을 진단할 수 있는 다형성 (SNP) 마커로써, 표지유전자에 의한 MAS의 분자 선발육종 기술을 실용화하여 소의 고급육 계통선발 육성에 이용할 경우 연령과 성에 관계없이 조기선발이 가능하여 세대간격을 단축시키고, 선발의 정확도를 증가시키며, 선발강도를 높이고, 계획교배가 가능하므로 소의 경제형질에 대한 개량이 이루어짐으로, 우량종축의 생산과 소농가 소득 증대에 기여할 뿐만 아니라, 육질이 우수한 쇠고기를 소비자들에게 제공할 수 있다.

도 1은 g.3977-325 T>C SNP를 포함하는 본 발명의 서열번호 1을 나타낸 도이다.

본 발명은 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 소 경제형질 진단용 다형성(SNP) 마커, 이를 이용한 소 경제형질의 진단방법 및 진단키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 소의 고급육 계통선발 육성에 이용할 경우 연령과 성에 관계없이 조기선발이 가능하여 세대간격을 단축시키며, 선발의 정확도 및 강도를 증가시키고, 계획교배가 가능하도록 소의 경제형질과 관련 있는 DNA 마커를 개발하고자 노력하던 중, 본 발명의 경제형질 진단용 다형성 (SNP) 마커를 사용할 경우 근내지방도, 등지방두께, 도체중량 또는 불포화지방산의 함량이 뛰어난 맛있고 육질 좋으며 경제적 가치가 높은 소를 조기에 발견할 수 있어 상기 목표를 달성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 다형성 (단일염기다형성, single nucleotide polymorphism; SNP)은 생물의 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이일 수 있으며, 이는 한 생물집단에서 1%이상의 빈도로 존재하는 2개의 대립염기서열 (bi-allelic)이 발생하는 위치를 말할 수 있다.

상기 소의 품종은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 한우일 수 있다.

상기 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 g.3977-325 T>C 또는 g.3977-325 Y로도 표시하여 기재할 수 있다.

상기 서열번호 1은 FABP4 (fatty acid binding protein 4) 유전자에 위치하는 SNP인 g.3977-325 T>C를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 쇠고기에서 맛에 영향을 미치는 불포화지방산과 근내지방도, 등지방두께, 도체중량과 강한 유의적 관련성을 나타낼 수 있다.

실시예 1에서 나타난 바와 같이, 상기 서열번호 1의 g.3977-325 T>C SNP의 유전자형 빈도는 0.480 이라는 이형접합체의 추정치에서 다형성을 확인할 수 있으며, minor allele frequency의 수치 또한 0.264로 0.100 보다 높게 나타난 점을 볼 때 연관불평등에서 분리가 잘 이루어져 분석의 정확도를 높일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 경제형질은 가축들이 가지고 있는 수많은 형질 중에서 경제적 가치가 있는 근내지방도, 등지방두께, 도체중량, 불포화지방산, 육색, 지방색 및 조직감으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 형질을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 근내지방도, 등지방두께, 도체중량, 및 불포화지방산의 함량으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 형질을 포함할 수 있다.

상기 SNP 마커인 서열번호 1의 g.3977-325 T>C은 CC 유전자형이 경제형질인 근내지방도 및 도체중량이 가장 높고 등지방두께가 가장 낮으며, 쇠고기의 맛과 육질에 영향을 미치는 올레인산 (C18;1) 및 단일불포화지방산과 같은 불포화지방산의 함량이 높아 가장 우수한 경제형질을 지닌 소로 판단할 수 있으며, CC 유전자형 다음은 CT 유전자형이 우수하고, TT 유전자형이 경제형질 면에서 다른 유전자형에 비해 떨어짐을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명은 경제형질이 우수한 소를 진단하는 다형성 (SNP) 마커로, 상기 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드의 유전자형이 CC인 마커를 제공할 수 있다.

쇠고기의 등급은 육질등급과 육량등급으로 구분하여 판정하는데 육질등급은 고기의 질을 근내지방도, 육색, 지방색, 조직감, 성숙도에 따라 1++, 1+, 1, 2, 3 등급으로 판정하는 것으로 소비자가 고기를 선택하는 기준이 되며, 육량등급은 도체에서 얻을 수 있는 고기량을 도체중량, 등지방두께, 등심단면적의 성적을 종합하여 A, B, C 및 D(등외) 등급으로 판정할 수 있는데, 실시예 3에서 나타난 바와 같이 상기 경제형질은 올레산과 단일불포화지방산과 같은 불포화지방산과의 유의성이 높아, 육질 등급이 높아질수록 불포화지방산의 함량이 높아짐을 확인할 수 있다.

본 발명의 CC 유전자형의 집단에서 고급육인 1⁺등급이상비율이 80.10%를 나타냄을 확인할 수 있어 본 발명의 마커가 경제형질의 판단함에 있어 적절함을 입증하였다. 그러므로 g.3977-325 T>C SNP는 쇠고기의 맛을 결정할 수 있는 요인인 불포화지방산 및 근내지방산 등의 경제형질에 관련된 척도로 활용될 수 있다.

상기 경제형질의 진단방법은, 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인한 후, 이를 통해 근내지방도, 등지방두께, 도체중량, 또는 불포화지방산의 함량과 같은 소의 경제형질을 미리 예측함으로 진단할 수 있다.

본 발명의 소 경제형질의 진단방법은,

(1) 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계; 및

(2) 상기 상기 (1)단계로부터 수득한 DNA을 주형으로 하여, 서열번호 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머를 포함하여 PCR을 수행하고, 상기 PCR결과물로부터 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 DNA 샘플을 수득하는 부위는 특별히 한정된 것은 아니며, 일례로, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 일례로, 출발물질이 gDNA인 경우 gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며 (참조: Rogers & Bendich (1994)), 출발물질이 mRNA인 경우에는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성될 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 프라이머는 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머로 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니며, 일례로 서열번호 2 (Foward sequence : TTTCCCTCCATCATTGTAATCACTT), 서열번호 3 (Reverse sequence : CACATTCCTAGGCACAAAAGCA) 및 서열번호 4 (Extension sequence : CTTGAGGCCAAGTCTTGTAT)를 포함할 수 있다.

PCR은 당업계에서 통상적인 방식에 따라 PCR 증폭에 필요한 시약, 일례로, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermisflavus , Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), 및/또는 dNTPs 등을 포함하여 수행될 수 있다.

상기 유전자 형을 확인하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시할 수 있으며, 일례로, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석 (SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 제한효소 절편길이 다양성 (Restriction fragment length polymorphism,RFLP) 분석, 이형접합자 분석 (heteroduplex analysis), 단일 나선의 구조적 다형성 (single strand conformational polymorphism, SSCP), 테크맨 프로브법 (Taqman probe method) 또는 PCR을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일례로, SNP 위치를 이용한 PCR-RFLP의 방법에 의하면, 상기 선택된 SNP 부위를 포함하는 특정 염기서열, 예를들어 상기 SNP를 포함하는 3~6개의 뉴클레오타이드를 포함하는 염기서열을 특이적으로 인지하는 제한효소를 처리함으로써 이때 얻어지는 결과물로부터 유전자형을 결정할 수 있고 이를 근거로 소의 경제형질을 구분하는 것이 가능할 수 있다. 제한효소는 특정 염기서열 부위를 특이적으로 인지하는 1종 이상을 선택하여 사용할 수 있고, 특정한 종류로 한정되지 않으며 또한, 사용 가능한 구체적인 제한효소의 종류는 여러 회사 제품이 시판되고 있으며 이에 대한 정보도 공개되어 있다.

본 발명에 있어서, 상기 경제형질은 소가 가지고 있는 수많은 형질 중에서 경제적 가치가 있는 근내지방도, 등지방두께, 도체중량, 불포화지방산, 육색, 지방색 및 조직감으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 형질을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 근내지방도, 등지방두께, 도체중량, 및 불포화지방산의 함량으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 형질을 포함할 수 있다.

상기 소의 경제형질 진단은 유전자형을 확인하여 근내지방도, 등지방두께, 도체중량, 또는 불포화지방산의 함량을 예측하는 방법으로 진단할 수 있는데, 구체적인 진단방법은 하기와 같다.

표 3에서 나타난 바와 같이, 도체중량, 근내지방산 및 불포화지방산 (올레산, 단일 불포화지방산)은 CC 유전자형을 가진 개체들이 가장 높게 나타나 가장 우수하였고, CT 유전자형 및 TT 유전자형 순으로 감소하였고, 등지방 두께는 CC 유전자형을 가진 개체들이 가장 낮게 형성되고 CT 유전자형 및 TT 유전자형 순으로 증가함을 확인할 수 있다.

따라서 본 발명에서의 상기 소 경제형질은 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드의 유전자형이 TT 유전자형 < CT 유전자형 < CC 유전자형 순으로 경제형질이 우수한 소로 진단할 수 있다.

본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 일례로, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermisflavus , Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소) 및/또는 dNTPs를 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 프라이머는 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머로 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니며, 일례로 서열번호 2 (Foward sequence : TTTCCCTCCATCATTGTAATCACTT), 서열번호 3 (Reverse sequence : CACATTCCTAGGCACAAAAGCA) 및 서열번호 4 (Extension sequence : CTTGAGGCCAAGTCTTGTAT)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> FABP4유전자내의 쇠고기 맛과 연관된 SNP 선정

지방산 분석은 한우 513두로부터 등심 조직 약 500g을 채취하여 각각 잘게 분쇄한 뒤 4~5g씩 사용하여 Folch법 (Folch 등, 1957)으로 클로로폼 (chloroform) : 메탄올 (methanol) (2:1)을 5ml 넣고, homogenizer (Polytron PT-MR-2100, Switzerland)를 이용하여 11,000rpm에서 2~3분 동안 분쇄하여 추출한 후 water bath (40℃)에서 여과지 (filter paper)를 이용하여 여과하였다. 여과액을 증류수와 혼합한 후 메탄올과 물층을 제거하고 클로로포름과 지질 층을 질소가스를 이용하여 제거한 후 BF3-meathanol (14%)를 처리하여 65℃에서 transmethylation시켜 분석하였다. 총 지방산조성 분석은 가스 크로마토그래피 (gas-chromatography; Perkin-Elmer CO, USA)를 이용하였다. 본 연구에서 SNP genotyping은 SBE (single-based extension, Vreeland 등, 2002)방식을 이용하는 ABI PRISM SNaPshot^TMMultiplexKit (AppliedBiosystems,FosterCity,CA)를 사용하였다.

이후, Genomic DNA 추출은 항응고제 (0.5M EDTA)가 들어있는 진공 주사기 (Becton dickinson, USA)를 이용하여 약 5 ~ 10㎖정도의 혈액을 채취하였다. 채취되어진 혈액은 50㎖ 팰콘 튜브 (falcon tube)에 옮겨서 0.2% NaCl용액을 약 40㎖정도 첨가하여 용혈 시킨 후 백혈구 추출을 위해 2,000rpm에서 10분간 원심분리시키고 원심분리된 용액 중 백혈구가 침전된 약 15㎖을 남기고 제거하였다. 0.16M NaCl/1mM EDTA 1,000㎕를 넣어 세포막을 파괴시키고, 계면활성제 (0.5% N-lauroylsarconsine sodium salt, 10mM Tris-HCl pH8.0, 10mM EDTA)용액을 15㎖ 넣어서 핵 내의 DNA를 용출시켰다. 막 단백질과 DNA내에 있는 단백질을 제거하기 위해 단백질 분해효소인 단백질분해효소 K (Proteinase K; 10㎎/㎖, Promega Co. USA)를 총 부피 (total volume)의 1/100배인 150㎕를 넣어 37℃에서 12시간 동안 배양시켰다. 배양이 끝나면 단백질 침전을 위해 동일량의 TE (Tri-EDTA) : 페놀 (1:1)을 넣고 2시간 동안 20분 간격으로 천천히 흔든 후 3,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 DNA 수용액 층을 채취하고 다시 동일 량의 페놀 (Phenol) : 클로로폼 (Chloroform) : 아이소-아밀알콜 (Iso-amylalchol) (25:24:1)을 넣고 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 재차 DNA 수용액 층을 채취하였다. 에틸 에테르 (Ethyl ether) 2 volume을 넣어 백색의 DNA 수용액 층이 투명해질 때까지 흔든 후 3,000rpm에서 5분간 원심분리하고 에틸 에테르 (ethyl ether)를 휘발시켜 제거하였다. 3M 아세트산나트륨 (sodium acetate, pH5.2)를 총부피 (total volume)의 1/10배를 첨가하고, 100% 에탄올을 넣어 DNA를 응축시키고 70% 에탄올을 20㎖정도 넣고 DNA를 세정하였다. 그리고 완전히 에탄올을 제거한 후, TE (10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA)를 약 1 ~ 2㎖정도 넣어 DNA를 용해시켜 4℃에 보관하였다.

SBE (Single base extension) 반응을 위해 ABI PRISM SNaPshot^TM MultiplexKit (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하였고, 그 조건은 다음과 같다. 1st PCR 반응은 20ng genomic DNA, 0.25U Taq 폴리머라아제 (Solgent Co., Ltd, south korea), 1x 버퍼, 0.2mM dNTP, 5pmol 프라이머 (forward/reverse)를 첨가하여 전체 15㎕가 되도록 하고 혼합한 후 94℃ 5분에서 1 사이클, 94℃에서 30초, 합성온도에서 30초, 72℃에서 3분의 조건으로 35 사이클, 72℃ 3분에서 1 사이클을 반응시켰다. 생성된 PCR 산물에서 1 ㎕를 전기 영동하여 생성물을 확인하였다. 그리고 PCR 산물에 5U SAP (Shrimp alkaline phosphatase)와 2U Exo Ⅰ (Exonuclease Ⅰ, E. coli)를 첨가하여 잘 혼합한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 75℃에서 15분간 불활성 시켰다. 최종적으로 준비된 PCR product 1㎕를 GeneScan-120 LIZ size standard (Applied Biosystems, Foster City, CA) 0.25㎕와 Hi-Di formamide 9.5 ㎕ (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 첨가하여 잘 섞어준 다음 95℃에서 5분간 변성시킨 후 ABI PRISM 3130xL Genetic Analyzer에 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 PCR 산물은 GeneMapper v4.0 소프트웨어 (Applied Biosystems, Foster City, CA)에 데이터를 입력하여 자동분석을 실시하였다.

이와 같은 방법을 통하여 3개의 SNP에 대해서 다형성을 확인한 결과, 1개의 SNP에서만 다형성을 확인하였고 각 SNP에 대한 정보는 하기 표 1에 나타내었다.

SNP	Gene	BTA	Sequences		TM	Product
						size
g.2213+1439 G>A	NC_007312.4	14	F¹	AGGAGGAAAGCCATTCCATT	60	285
			R²	TGGAATAGCATCATAGGGGTTT
			E³	TAGAGAACTTTTAAAAGAGT
g.3318+334 G>C	NC_007312.4	14	F	TTGATGCCTAAGCCCTCTTT	60	352
			R	GAGAGCAGCCAGCTTCATTT
			E	ATTATGAAAAGCCAAGAAAA
g.3977-325 T>C	NC_007312.4	14	F	TTTCCCTCCATCATTGTAATCACTT	60	567
			R	CACATTCCTAGGCACAAAAGCA
			E	CTTGAGGCCAAGTCTTGTAT

¹Forward primer sequence, ²Reverse primer sequence, ³Extension primer sequence

g.3977-325 T>C SNP의 유전자형 빈도는 Mendel의 분리법칙 이론치에 근접하는 분리양상으로 0.480 이라는 이형접합체의 추정치에서도 다형성을 확인할 수 있었으며, 또한 minor allele frequency 의 수치가 0.264로 0.100 보다 높게 나타나 분석의 정확도를 높일 수 있었다.

SNP	Region	Genotype (No. of head)				H¹	MAF²	HWE³
		Frequency
g.2213+1439 G>A	Intron	AA (0)	AG (0)	GG (44)	N⁴(44)	0.000	0.000	0.000
		0.000	0.000	1.000	1
g.3318+334 G>C	Intron	CC (44)	CG (0)	GG (0)	N (44)	0.000	0.000	0.000
		1.000	0.000	0.000	1
g.3977-325 T>C	Intron	CC (18)	CT (18)	TT (9)	N (44)	0.480	0.404	0.264
		0.400	0.400	0.200	1

¹Heterozygosity, ²Minor allele Frequency,³P value for deviation of genotype distribution from Hardy-Weinberg equilibrium, ⁴Total number

< 실시예 2> FABP4 단일 유전자형과 한우 쇠고기 맛 및 경제형질 연관분석

본 발명에 있어 쓰인 실험동물은 경북 지역의 14곳의 시·군 단위에서 사육 되어진 거세우로, ㈜참품한우 사양관리 지침에 따라 26~33개월에서 출하하는 513두의 genomic DNA 샘플과 능력자료 및 각 개체에 대한 지방산 조성을 사용하였다. 또한 한우의 등심조직은 흉추 제 13, 요추 제 1마디 38번 최장근 부분에서 절개하여 채취하였으며, 각 조직은 근외지방을 제거한 뒤 - 80℃에서 보관하였다.

한우의 경제형질 및 지방산 조성과 후보 SNPs들 간의 상관관계 분석을 위해서 각 개체들의 경제형질인 근내지방도 (marbling score)와 등지방 두께 (backfat thickness), 도체중량 (carcass weight)의 형질을 대상으로 분석하였다. 근내지방도는 등급판정부위에서 배최장근단면에 나타난 지방분포정도를 근내지방도 기준과 비교하여 판정하였고, 등지방두께는 배최장근단면의 오른쪽면을 따라 복부쪽으로 3분의 2 들어간 지점의 등지방을 ㎜ 단위로 측정하였다. 또한 지방산 조성은 이중결합이 형성되지 않으며 포화지방산의 종류인 미리스트산 (C14:0), 팔미트산 (C16:0) 및 스테아르산 (C18:0)을 대상으로 측정하였으며 이중결합이 한 개 형성되는 단일불포화지방산 (mono-unsaturated fatty acid)의 종류인 미리스트올레산 (C14:1), 팔미톨레신 (C16:1) 및 올레인산 (C18:1)과 오메가-6 지방산의 한 종류인 리놀레익산 (C18:2n6)과 오메가-3 지방산의 한 종류인 리놀렌산 (C18:3n3)을 대상으로 측정하였다.

또한, SNP 마커의 효율성을 검증하고 후보 SNPs를 사용하여 우리나라의 전체 한우에 적용하였을 때 어느 정도 신뢰할 수 있는지 알아보기 위하여 각 형질 별 최소자승평균값을 구하였고, SPSS v19.0을 사용하여 다음과 같은 통계모형으로 공분산분석과 유의성 검정을 실시하였다.

Yijk =μ+Pi + SNP_j +βage_k +e_ijk

(Where, Yijl = 표현형 수치 (경제형질 및 지방산 함량), μ= 각각의 개체, P_i= 경상북도 지역의 고정효과, SNP_j = SNP 마커의 고정효과, βage_k = 도축일령, eijk = 무작위 오차)

이후, (주)참품한우에서 관리하는 일반농가 513두에 적용한 결과를 바탕으로 각 형질 별로 SNP 유형과 아비정보, 일령, 장소 등의 환경적인 요인을 고려한 최소자승평균 (least squares means)을 구하여 유의성이 인정된 결과를 표 3에 나타내었다.

Trait	g.3977-325 T>C
	CC	CT	TT	Total
	(N=80)	(N=265)	(N=168)	(N=513)
	LSmean±SE	LSmean±SE	LSmean±SE	LSmean±SE
Carcass weight(kg)	432.59±4.33	426.42±2.62	426.01±3.46	427.25±1.91	ns
Backfat thickness(cm)	12.06±0.51^a	13.06±0.31^ab	14.01±0.41^b	13.22±0.22	*
MS(marbling score)	6.43±0.17^c	5.43±0.11^b	4.95±0.15^a	5.43±0.08	***
Fatty acid composition (%)
C14:0	3.16±0.08^a	3.70±0.03^b	3.76±0.04^b	3.63±0.02	***
C16:0	24.35±0.23^a	25.87±0.11^b	25.93±0.14^b	25.65±0.08	***
C18:0	10.21±0.16	10.59±0.08	10.45±0.10	10.48±0.06	ns
C14:1	1.29±0.04	1.23±0.02	1.24±0.03	1.24±0.01	ns
C16:1	6.59±0.11	6.56±0.06	6.70±0.07	6.61±0.04	ns
C18:1	47.06±0.29^b	43.99±0.14^a	43.47±0.18^a	44.30±0.11	***
C18:2n6	2.59±0.09^a	3.06±0.04^b	3.16±0.05^b	3.02±0.03	***
C18:3n3	0.48±0.02^b	0.33±0.01^a	0.32±0.01^a	0.35±0.01	***
SFA¹	38.33±0.33^a	41.04±0.16^b	41.00±0.19^b	40.60±0.12	***
MUFA²	56.50±0.34^b	53.09±0.16^a	52.74±0.19^a	53.50±0.13	***
M/S³	1.49±0.02^b	1.30±0.01^a	1.29±0.01^a	1.33±0.01	***
C14 index⁴	29.10±0.85^b	24.71±0.36^a	24.64±0.44^a	25.37±0.28	***
C16 index⁵	21.31±0.34^b	20.23±0.16^a	20.52±0.20^a	20.50±0.12	**
C18 index⁶	82.17±0.28^b	80.61±0.14^a	80.63±0.18^a	80.85±0.10	***

SFA¹ Saturated fatty acid, MUFA² Monounsaturated fatty acid, M/S³ Monounsaturated fatty acid/Saturated fatty acid, C14 index⁴ [C14:1/(C14:0+C14:1)]*100, C16 index⁵ [C16:1/(C16:0+C16:1)]*100, C18 index⁶ [C18:1/(C18:0+C18:1)]*100, MS=Marbling score(1-9), ^{a, b, c, d, e} Means with different superscripts within the same column are significantly different(P<0.05), * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. ns = non-significant.

지방산 중 스테아르산 (C18:0) 및 미리스트올레산 (C14:1)는 FABP4 유전자 내 SNP와 연관된 결과를 볼 수 없었으며, 포화지방산 중 높은 비중을 차지하고 있는 미리스트산 (14:0) 및 팔미트산 (C16:0)의 경우 TT 유전자형이 가장 높게 나타났다. 포화지방산의 전체함량의 경우 또한 CT, TT 유전자형의 개체에서 41.04% 및 41.00%로써 가장 높게 나타난 점을 볼 수 있었다.

반면 불포화지방산인 올레인산 (C18:1) 및 단일불포화지방산의 경우 포화지방산의 전체함량과 반대로 CC 유전자형의 개체가 47.06%로써 CT, TT 유전자형의 개체보다 유의적으로 높은 (p<0.05) 불포화지방산의 함량을 가지고 있으며, 이러한 결과는 앞서 본 포화지방산의 경향수치와 반대의 결과였다. 또한 불포화지방산인 올레인산 (C18:1) 함량은 일반적으로 불포화지방산 전체 함량의 대부분 (80% 이상)을 차지하고 있어 SNP 유전자형별 올레인산 (C18:1)은 단일불포화지방산함량과 동일한 경향치를 보여주고 있었다.

단일불포화지방산 비율을 나타내는 M/S에서 나타나는 수치와 미리스트올레산 (C14:1) 및 올레인산 (C18:1)의 불포화 지방산 비율을 나타내는 C14 index 와 C18 index의 수치도 CC 유전자형이 불포화지방산 함량이 높게 형성된 된 점을 볼 때 앞선 올레인산 (C18:1)와 단일불포화지방산의 경향과 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

또한, 경제형질과 유전자와의 관계를 분석해 본 결과, 근내지방도 및 등지방 두께와는 높은 연관성을 가진 결과를 볼 수 있었다. 지방산에서 나타난 결과와 마찬가지로 CC 유전자형을 가지는 개체들은 다른 유전자형 그룹보다 근내지방도 성적이 유의적으로 우수한 결과가 나타났으며, 등지방 두께에서도 낮은 지방을 형성하는 점을 볼 수 있었다.

< 실시예 3> g.3977-325 T>C SNP 에서의 등급분포표

한우에서 쇠고기 등급과 불포화지방산과의 연관성을 규명하는 분석을 실시하였다.

표 4에서 나타난 바와 같이, 올레인산 (C18:1) 및 단일불포화지방산 함량 모두 한우의 육질등급이 높을수록 유의적으로 높아지고 있어 한우 쇠고기의 불포화지방산 함량은 근내지방도 성적과 높은 유의적인 연관성을 보여주고 있다.

	Beef grade
Fatty acid	1⁺⁺	1⁺	1	2
	LSMEAN±SE	LSMEAN±SE	LSMEAN±SE	LSMEAN±SE
Oleic acid	45.90±0.31^d	44.60±0.17^c	43.89±0.19^b	42.89±0.26^a
MUFA*	55.17±0.34^d	53.97±0.19^c	52.99±0.22^b	51.82±0.27^a

SNP	Genotype	Beef grade
SNP	Genotype	1⁺⁺	1⁺	1	2	1⁺above
g.3977-325 T>C 유전자형 CC	마리수 비율	21	43	12	4	64
g.3977-325 T>C 유전자형 CC	마리수 비율	26.30%	53.80%	15.00%	5.00%	80.10%

상기 표 4 및 표 5에 따른 등급별 분포를 확인해 본 결과, CC 유전자형의 집단에서 고급육인 1⁺등급이상비율이 80.10%를 나타냄을 확인할 수 있었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 소 경제형질 진단용 다형성(SNP) 마커.
제 1항에 있어서, 상기 경제형질은 근내지방도, 등지방두께, 도체중량, 및 불포화지방산의 함량으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 형질인, 다형성(SNP) 마커.
제 1항에 있어서, 상기 소는 한우인, 다형성(SNP) 마커.
제 1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드의 유전자형이 CC인, 다형성(SNP) 마커.
서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는 소 경제형질의 진단방법.
제 5항에 있어서,
(1) 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계; 및
(2) 상기 (1)단계로부터 수득한 DNA을 주형으로 하여, 서열번호 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머를 포함하여 PCR을 수행하고, 상기 PCR결과물로부터 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계;
를 포함하는 소 경제형질의 진단방법.
제 5 또는 제 6항에 있어서,
상기 소 경제형질은 서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드의 유전자형이 TT 유전자형 < CT 유전자형 < CC 유전자형 순으로 경제형질이 우수한 소로 진단하는, 소 경제형질의 진단방법.
서열번호 1의 421번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 포함하는 소 경제형질 진단용 키트.
제 8항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 소 경제형질 진단용 키트.