CN115232882A - 一种中华鳖遗传性别连锁的snp标记及其引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记及其引物和应用，所述SNP标记为SEQ ID NO:1序列自5’端起第311位、第329位和第332位碱基，所述三个标记在雄性中基因型为AA、CC和CC，在雌性中基因型为AG、AC和CT。根据等位基因特异性PCR(allelespecific PCR，AS‑PCR)原理设计引物，三个SNP标记较近因此设计在同一条引物上，可以极大确保引物与模板地特异性结合，避免假阳性的情况。通过这三个SNP标记及所设计的引物，可以不受中华鳖组织特异性和环境影响，快速简单地鉴定各年龄阶段的中华鳖遗传性别，对研究中华鳖性别决定和分化机制、实现其性别控制具有重要意义，对中华鳖单性群体选育提供了极大便利，应用前景广阔。

Description

一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记及其引物和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记及其引物和应用。

背景技术

爬行动物的性别决定研究具有重大的理论意义与生产应用价值，多年来一直属于研究的热点，备受产业和学界的关注。目前来说爬行动物的性别决定可分为基因型性别决定(Genetic sex determination,GSD)和环境型性别决定(Environmental sexdetermination,ESD)。但至今为止还有许多动物的性别决定机制仍不明确，爬行动物中的龟鳖类就是非常典型的一类。

中华鳖(Pelodiscus sinensis)又名甲鱼、水鱼、团鱼、脚鱼等，隶属于爬行纲(Reptilia)、龟鳖目(Tesudines)、鳖科(Trionychidae)、鳖属(Pelodiscus)，是我国重要的名特优水产养殖品种。中华鳖肉质鲜美，特别是其宽厚的裙边，有着丰富的胶原蛋白，含多种氨基酸，口感独特软糯，广受消费者青睐，因此具有较高的经济价值。

而中华鳖作为龟鳖类的主要养殖品种之一，具有性别二态性，但早期胚胎及稚鳖期外部生物学特征没有肉眼可辨的差异，给中华鳖相关研究带来了一定困难，中华鳖雄性个体不论生长速度还是个体大小均优于雌性个体，为提高养殖效益，需要找到一种可靠的雌雄鉴定方法。

发明内容

1.要解决的技术问题

本发明的目的是为了解决现有技术中中华鳖早期胚胎及稚鳖期外部生物学特征没有肉眼可辨的差异的问题，而提出的一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记及其引物和应用。

2.技术方案

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记，包括三个SNP标记，SNP标记所在的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，三个所述SNP标记分别位于SEQ ID NO:1所示序列第第311位、第329位和第332位碱基。

优选地，三个所述SNP标记在雄性中基因型为AA、CC和CC，在雌性中基因型为AG、AC和CT。

本发明还提出了一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记鉴定用引物，所述引物包括正向引物(5953-1F)、反向引物(5953-1R)和SNP标记特异性引物(5953-1FS)，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2-4所示。

本发明还提出了一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记及其引物，在鉴定中华鳖遗传性别中的应用。

本发明还提出了中华鳖遗传性别的鉴定方法，包括以下步骤：提取中华鳖基因组DNA；将待测中华鳖的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行电泳检测，根据PCR扩增条带的数目及大小来确定中华鳖的遗传性别。

优选地，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板1μL；正向引物0.2μL；反向引物0.5μL；SNP标记特异性引物0.8μL；Vazyme 2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL；灭菌水补至25μL。

优选地，所述PCR扩增的反应条件为：95℃3min；95℃20S，69℃20S，72℃20S，5个循环；95℃20S，67℃20S，72℃20S，5个循环；95℃20S，65℃20S，72℃20S，5个循环；95℃20S，63℃20S，72℃20S，15个循环；72℃5min。

优选地，若电泳结果显示单条带则中华鳖为雄性，若双条带则中华鳖为雌性。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的优点在于：

(1)本发明中，提供的SNP标记不受中华鳖组织特异性和环境影响，能快速简单准确的鉴定各年龄阶段的中华鳖遗传性别，对研究中华鳖性别决定和分化机制、实现其性别控制具有重要意义。

(2)本发明中，所设计的引物涉及的3个SNP位点，在雄性中皆为纯合，在雌性中皆为杂合，能够保证引物的特异性结合，鉴定结果精准。

(3)本发明中，基于PCR基础精确设计了反应体系和程序，操作简单快捷，结果显著易读取。

附图说明

图1为用于鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增产物电泳图；其中第1-8泳道为雄性，第9泳道为Transgen DL 2K Marker，第10-18泳道为雌性；

图2为相关中华鳖雌(ZW)雄(ZZ)个体基因组SNP差异的序列比较与引物设计图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1：

一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记，包括三个SNP标记，其特征在于，SNP标记所在的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，三个所述SNP标记分别位于SEQ ID NO:1所示序列第第311位、第329位和第332位碱基。

本发明中，三个所述SNP标记在雄性中基因型为AA、CC和CC，在雌性中基因型为AG、AC和CT。

实施例2：

其具有上述实施例的实施内容，其中，对于上述实施例的具体实施方式可参阅上述描述，此处的实施例不作重复详述；而在本申请实施例中，其与上述实施例的区别在于：

一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记鉴定用引物，所述引物包括正向引物(5953-1F)、反向引物(5953-1R)和SNP标记特异性引物(5953-1FS)，所述引物的核苷酸序列为SEQID NO:2-4所示。

本发明中，SNP标记及其引物，在鉴定中华鳖遗传性别中的应用。

实施例3：

其具有上述实施例的实施内容，其中，对于上述实施例的具体实施方式可参阅上述描述，此处的实施例不作重复详述；而在本申请实施例中，其与上述实施例的区别在于：

本实施例中，一种中华鳖遗传性别连锁SNP标记的确定：

本实施例中，通过12组雌雄中华鳖全基因组重测序数据和已经公布的中华鳖全基因组数据比对分析，结果显示Scaffold_JH207672.1上的LHX5基因的非编码区内存在多处SNP，且这些SNPs在雌性个体中均为杂合型，在雄性个体的对应位置均为纯合型。

本实施例中，为对此进行验证，提取经解剖进行性别鉴定后的雌雄中华鳖的基因组DNA，设计包含SNP位点的引物对(5953-1F和5953-1R)进行扩增并对PCR产物进行Sanger测序。分析测序峰图显示雌性个体在这些位点上均为杂合型，雄性个体在对应的位置上均为纯合型。

本实施例中，由此可以确定这些位点确实是雌性中华鳖特有的SNP位点，因此可以作为鉴别中华鳖遗传性别的分子标记。也据此进一步设计引物5953-1FS，配合5953-1F和5953-1R对性别进行区分。

实施例4：

其具有上述实施例的实施内容，其中，对于上述实施例的具体实施方式可参阅上述描述，此处的实施例不作重复详述；而在本申请实施例中，其与上述实施例的区别在于：

本实施例中，一种中华鳖遗传性别鉴定方法：

步骤1：DNA抽提，取中华鳖的裙边组织，参照Transgen Easy

Genomic DNAKit提取中华鳖基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪对所提DNA进行质量检测。选取质量和完整性均较好的DNA备用；

步骤2：引物设计，根据本发明所公开的基因序列上的SNP位点(参考实施例3)设计正向引物、反向引物和SNP标记特异性引物；

步骤3：PCR扩增，取DNA模板1μL；正向引物0.2μL；反向引物0.5μL；SNP标记特异性引物0.8μL；Vazyme 2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL；灭菌水补至25μL。设置PCR扩增的反应条件为：95℃3min；95℃20S，69℃20S，72℃20S，5个循环；95℃20S，67℃20S，72℃20S，5个循环；95℃20S，65℃20S，72℃20S，5个循环；95℃20S，63℃20S，72℃20S，15个循环；72℃5min；

步骤4：PCR产物电泳及结果图示，将PCR产物进行1.8％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，其中第1-8泳道为雄性，第9泳道为Transgen DL 2K Marker，第10-18泳道为雌性。

本发明中，提供的SNP标记不受中华鳖组织特异性和环境影响，能快速简单准确的鉴定各年龄阶段的中华鳖遗传性别，对研究中华鳖性别决定和分化机制、实现其性别控制具有重要意义。

本发明中，所设计的引物涉及的3个SNP位点，在雄性中皆为纯合，在雌性中皆为杂合，能够保证引物的特异性结合，鉴定结果精准。

本发明中，基于PCR基础精确设计了反应体系和程序，操作简单快捷，结果显著易读取。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记及其引物和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 420

<212> DNA

<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensis)

<400> 1

cgcaaggctg gagccaattt agatatgcta taaattaaga ggttgccatg gccaccgcat 60

tctcattggc cctcggcctc cctacgttct gcgggacgtc accaaatctg aataaggatg 120

cgcgaattac taaactggga gacaaagctg aagatgggaa cagcgtgaaa gtggagaaaa 180

gtcccaacca gccatctgca cggaggaact gggggctccc ggctttgttg aggtggttat 240

tcttgtgttt gattattaag ccttttcgtg gactggctgc ttccacacag gcgctggctg 300

cgcctacact gaaaggtgcc gagaaagtaa ttcctccagg atatctttgc ttcgcttccc 360

ccgactgaac ctgctggaag aggtggggag caggagaaag agaagcatct gcctcggtgg 420

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensis)

<400> 2

cgcaaggctg gagccaattt agat 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensis)

<400> 3

ccaccgaggc agatgcttct ct 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensis)

<400> 4

ctgaaaggcg ccgagaaagt aatt 24

Claims (8)

1.一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记，包括三个SNP标记，其特征在于，SNP标记所在的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，三个所述SNP标记分别位于SEQ ID NO:1所示序列第第311位、第329位和第332位碱基。

2.根据权利要求1所述的一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记，其特征在于，三个所述SNP标记在雄性中基因型为AA、CC和CC，在雌性中基因型为AG、AC和CT。

3.根据权利要求1-2任一所述的一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记鉴定用引物，其特征在于，所述引物包括正向引物(5953-1F)、反向引物(5953-1R)和SNP标记特异性引物(5953-1FS)，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2-4所示。

4.根据权利要求3所述的一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记及其引物，其特征在于，在鉴定中华鳖遗传性别中的应用。

5.根据权利要求4所述的中华鳖遗传性别的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：提取中华鳖基因组DNA；将待测中华鳖的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行电泳检测，根据PCR扩增条带的数目及大小来确定中华鳖的遗传性别。

6.根据权利要求5所述的中华鳖遗传性别的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板1μL；正向引物0.2μL；反向引物0.5μL；SNP标记特异性引物0.8μL；Vazyme2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL；灭菌水补至25μL。

7.根据权利要求5所述的中华鳖遗传性别的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃3min；95℃20S，69℃20S，72℃20S，5个循环；95℃20S，67℃20S，72℃20S，5个循环；95℃20S，65℃20S，72℃20S，5个循环；95℃20S，63℃20S，72℃20S，15个循环；72℃5min。

8.根据权利要求5所述的中华鳖遗传性别的鉴定方法，其特征在于，若电泳结果显示单条带则中华鳖为雄性，若双条带则中华鳖为雌性。

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