JP5891477B2 - フグの雌雄を判別する方法 - Google Patents
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Description
(1) 次の工程を含む、トラフグ属に属するフグの雌雄を判別するための方法
(a)トラフグ属に属する被検フグが有する、amhrII遺伝子領域の多型を検出し、前記多型が、配列番号:1に記載の塩基配列の3798位における一塩基多型である工程
(b)工程(a)で検出した前記多型に基づいて前記被検フグの雌雄を判別する工程、
(2) 以下の(a)〜(f)の工程を含む、(1)に記載の方法
(a)トラフグ属に属する被検フグからDNA試料を調製する工程
(b)amhrII遺伝子領域の前記多型を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有し、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する工程
(c)前記DNA試料に、前記オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程
(d)前記オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズした前記DNA試料を鋳型として、amhrII遺伝子領域の前記多型を含む塩基配列を増幅する工程
(e)前記増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光を検出する工程
(f)工程(e)で検出した前記蛍光を対照と比較する工程、
(3) 以下の(a)〜(d)の工程を含む、(1)に記載の方法
(a)トラフグ属に属する被検フグからDNA試料を調製する工程
(b)DNA二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記DNA試料を鋳型として、amhrII遺伝子領域の前記多型を含む塩基配列を増幅する工程
(c)前記反応系の温度を変化させ、前記インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出する工程
(d)工程(c)で検出した前記温度の変化に伴う前記蛍光の強度の変動を対照と比較する工程、
(4) (1)〜(3)のうちのいずれか一に記載の方法に用いられるための試薬であって、amhrII遺伝子領域の塩基配列に相補的な少なくとも15塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、以下の(a)〜(b)に記載のオリゴヌクレオチドのうちのいずれかである、試薬
(a)amhrII遺伝子領域の前記多型を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマー
(b)amhrII遺伝子領域の前記多型を含む塩基配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
(a)トラフグ属に属する被検フグが有する、amhrII遺伝子領域の多型を検出する工程
(b)工程(a)で検出した前記多型に基づいて前記被検フグの雌雄を判別する工程。
融解曲線解析)法が挙げられる。
トラフグからのDNAの抽出は、DNA抽出キット BuccalQuick(登録商標、TrimGen社製)を用いて行った。すなわち、先ずキット付属のマニュアルに従い、キット中の300μLの溶液と7μLの酵素液とを均一に混ぜてDNA抽出液を調製し、8連PCRチューブ(QSP(登録商標)435440、Quality Scientific Plastics社製)に1チューブあたり25μLずつ分注した。なお、この状態で、室温にて1日保存しても十分に使用に耐え得ることは確認した。
先ず、トラフグから調製した前記DNA試料を用いた雌雄(SNP)判別方法として、いわゆるTaqMan(登録商標)プローブ法を試した。本法に用いたオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブを、表1及び図3に示す。なお、プライマーとプローブの設計および合成は株式会社ニッポンイージーティーに委託した。いずれもHPLC精製標品である。
次に、トラフグから調製した前記DNA試料を用いた雌雄(SNP)判別方法として、いわゆるHRM(high resolution melting、高分解融解曲線解析)法を試した。
トラフグ属に属するフグ:ヒガンフグ、コモンフグ、及びゴマフグに関しても、amhrII遺伝子領域の多型(配列番号:1に記載の塩基配列の3798位)とHRM法によるSNPの検出とを組み合わせて、前述のトラフグの雌雄判別の方法と同様にして、これらフグにおける雌雄の判別を行った。得られた結果を図6〜8に示す。なお、かかるHRM法において、インターカレーターとしてLCGreen Plus(Idaho Tchnology 社製)を用いた。また、図9に示す通り、図に示した範囲においては、ヒガンフグ、コモンフグ、ゴマフグの性染色体上のamhrII遺伝子領域内の配列は、トラフグのその配列と同じである。
<223> 人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号4〜5
<223> 人工的に合成されたプローブの配列
Claims (4)
- 次の工程を含む、トラフグ属に属するフグの雌雄を判別するための方法
(a)トラフグ属に属する被検フグが有する、amhrII遺伝子領域の多型を検出し、前記多型が、配列番号:1に記載の塩基配列の3798位における一塩基多型である工程
(b)工程(a)で検出した前記多型に基づいて前記被検フグの雌雄を判別する工程。 - 以下の(a)〜(f)の工程を含む、請求項1に記載の方法
(a)トラフグ属に属する被検フグからDNA試料を調製する工程
(b)amhrII遺伝子領域の前記多型を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有し、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する工程
(c)前記DNA試料に、前記オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程
(d)前記オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズした前記DNA試料を鋳型として、amhrII遺伝子領域の前記多型を含む塩基配列を増幅する工程
(e)前記増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光を検出する工程
(f)工程(e)で検出した前記蛍光を対照と比較する工程。 - 以下の(a)〜(d)の工程を含む、請求項1に記載の方法
(a)トラフグ属に属する被検フグからDNA試料を調製する工程
(b)DNA二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記DNA試料を鋳型として、amhrII遺伝子領域の前記多型を含む塩基配列を増幅する工程
(c)前記反応系の温度を変化させ、前記インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出する工程
(d)工程(c)で検出した前記温度の変化に伴う前記蛍光の強度の変動を対照と比較する工程。 - 請求項1〜3のうちのいずれか一項に記載の方法に用いられるための試薬であって、amhrII遺伝子領域の塩基配列に相補的な少なくとも15塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、以下の(a)〜(b)に記載のオリゴヌクレオチドのうちのいずれかである、試薬
(a)amhrII遺伝子領域の前記多型を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマー
(b)amhrII遺伝子領域の前記多型を含む塩基配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
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JP2010290463A JP5891477B2 (ja) | 2010-12-27 | 2010-12-27 | フグの雌雄を判別する方法 |
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