KR20070051394A

KR20070051394A - 한우 배최장근 단면적 및 등지방 두께 연관지방산결합단백질 유전자의 분자 마커 개발

Info

Publication number: KR20070051394A
Application number: KR1020050108866A
Authority: KR
Inventors: 정의룡; 신성철; 김기락
Original assignee: 정의룡
Priority date: 2005-11-15
Filing date: 2005-11-15
Publication date: 2007-05-18
Also published as: KR100774849B1

Abstract

본 발명은 한우의 주요 육종개량 대상형질로서 개체의 도체중 및 도체량을 결정하는 육량등급 판정 항목으로 경제적으로 매우 중요한 배최장근 단면적 및 등지방 두께에 대하여 개체별 유전능력 차이를 조기에 식별하기 위한 분자표지 이용 선발법으로서, 세포막으로부터 지방산 산화, 인지질 또는 트리아실글리세롤(triacylglycerol) 합성 장소에 지방산을 수송하는 기능을 갖는 세포내 단백질로서 세포내 지방산 농도와 특별히 지방대사 조절 작용을 하는 지방산 결합 단백질(fatty acid-binding protein, FABP) 유전자의 제한효소단편다형(restriction fragment length polymorphism; RFLP)을 분석하고 한우의 도체형질 가운데 배최장근 단면적 및 등지방 두께와 연관된 RFLP 분자 마커를 개발하여 한우의 유전능력 개량과 도체중 및 도체량이 높은 한우를 조기에 예측하여 선발하는 도구로 활용하기 위한 내용을 포함하고 있다.

본 발명에서 한우 심장 지방산 결합단백질(H-FABP) 유전자의 인트론(Intron) 1번의 특정 영역을 포함하는 primer를 제작하여 PCR로 증폭한 후, 클로닝하고 염기서열 분석을 통하여 유전자 구조를 해석한 결과, 본 영역에서 1개의 단일염기다형(SNP; single nucleotide polymorphism)을 부위를 발견하고, 이들 단일염기다형을 한우의 육질 및 도체 형질들과의 연관성을 분석하였다.

즉, 한우 H-FABP 유전자의 인트론 1번의 특정 영역을 포함하는 총 302bp 크기의 염기서열 중 64번째 염기서열에서 시토신(C)↔티민(T) 염기치환으로 발생한 단일염기다형(SNP) 부위를 발굴하였다. 이 단일염기다형 염기서열 부위를 PCR-RFLP 기법을 이용하여 TspRⅠ제한효소로 절단하고, 3종류의 유전자형(C/C, C/T 및 T/T)을 검출하였다. 이 가운데 C/C 유전자형이 한우의 등지방 두께와 유의적으로 높게 연관되어 있고, T/T 및 C/T 유전자형이 배최장근 단면적과 유의적으로 높게 연관되어 있다는 새로운 사실을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 한우의 등지방 두께(backfat thickness)와 배최장근 단면적(Longgissimus muscle area)에 유의적인 영향을 미치는 heart fatty acid binding protein(H-FABP) 유전자의 배최장근 단면적이 넓고 등지방 두께는 얇은 SNP 유전자형을 이용하여 한우의 연령 및 성별에 관계없이 유전능력 개량과 도체중 및 도체량이 높은 한우를 조기에 예측하여 선발하는 DNA 마커를 개발하는데 있다.

한우, 심장 지방산 결합단백질(H-FABP), 염기서열분석, PCR-RFLP 분석, 배최장근 단면적, 등지방 두께 연관 DNA 표지인자

Description

한우 배최장근 단면적 및 등지방 두께 연관 지방산결합단백질 유전자의 분자 마커 개발{Development of molecular marker of fatty acid-binding protein(FABP) gene associated with longissimus muscle area and backfat thickness in Korean cattle}

도1 : 본 발명에서 한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자의 SNP 부위를 포함하는 염기서열도

도2 : 본 발명에서 한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자의 증폭부위 인트론 1번 영역 내 64번째 단일염기다형(SNP) 부위에 TspRⅠ 제한효소를 이용한 PCR-RFLP 분석 사진

도3 : 본 발명에서 한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자 인트론 1번의 특정 증폭부위 내 64번째 단일염기다형(SNP) 분석 크로마토그램

본 발명은 한우의 주요 육종개량 대상형질로서 개체의 도체중 및 도체량을 결정하는 육량등급 판정 항목으로 경제적으로 매우 중요한 배최장근 단면적 및 등지방 두께에 대하여 개체별 유전능력 차이를 조기에 식별하기 위한 분자표지 이용 선발법으로서, 세포막으로부터 지방산 산화, 인지질 또는 트리아실글리세롤(triacylglycerol) 합성 장소에 지방산을 수송하는 기능을 갖는 세포내 단백질로서 세포내 지방산 농도와 특별히 지방대사 조절 작용을 하는 지방산 결합 단백질(fatty acid-binding protein, FABP) 유전자의 제한효소단편다형(RFLP)을 분석하고 한우의 도체형질 가운데 배최장근 단면적 및 등지방 두께와 연관된 RFLP 분자 마커를 개발하여 한우의 유전능력 개량과 도체중 및 도체량이 높은 한우를 조기에 예측하여 선발하는 도구로 활용하기 위한 것이다.

일반적으로 그동안 한우의 육용화 및 육질 고급화를 위한 능력개량은 양적유전학에 기초한 통계육종학적 접근 방법에 전적으로 의존하여 왔다. 이 같은 종래의 한우 육종방법은 대규모 축군에 대한 능력검정을 필요로 하고 후대검정을 통해서 유전능력이 우수한 개체를 선발함으로서 능력개량에 오랜 기간이 소요됨은 물론 유전과 환경에 의해 지배되는 표현형 측정치에만 의존하여 개체 간 유전능력 차이를 평가하기 때문에 선발의 정확도가 높지 않아 개량 효율성이 크게 감소하는 단점이 있다. 도체 형질 역시 살아 있는 가축에서는 표현형 측정이 어렵고 도축 후 비로소 정확한 측정이 가능하기 때문에 전통적인 육종방법에만 의존하는 도체형질 개량에는 많은 어려움이 있다. 이처럼 기존의 전통적인 한우 선발육종방법은 많은 경비와 시간 그리고 노동력이 소요되어 한마디로 고비용 저효율 육종시스템이라고 할 수 있다. 따라서, 한우의 가장 중요한 개량형질인 도체형질 개량의 효율을 극대화하고 개량성과를 높이기 위해서는 새로운 육종기술 개발과 육종전략을 적극 모색할 필요가 있다.

최근 분자유전학 및 생명공학 기술의 발달은 동물의 유전적 개량에 보다 정확하고 강력한 새로운 육종 모델의 개발 가능성을 제공해 주고 있다. 첨단 분자유전학적 기법을 이용한 접근방법은 육종의 소요기간이나 유전능력 평가의 정확도면에서 기존의 전통적인 육종방법이 안고 있는 문제점을 극복할 수 있는 획기적인 정보를 제공함으로써 육종개량사업에 새로운 전기를 마련하고 있다. 특히, 경제형질 관련 DNA 마커 개발 및 이용에 관한 연구는 DNA의 분자 수준에서 동물 개체간의 유전 능력 차이를 직접 확인할 수 있어 육종가 추정 및 유전능력 평가에 보다 정확한 유전정보의 이용이 가능하게 되었다. DNA 마커는 가축 개량의 기초가 되는 개체식별, 친자감정, 품종식별 및 가계 분석 등에 기본적으로 응용될 수 있지만 가축에서 경제적으로 중요한 형질들과 연관된 DNA 마커로서의 이용이 육종개량 측면에서 더욱 막대한 가치를 지니게 된다. 경제형질 연관 DNA 표지인자를 동물의 육종개량에 이용할 경우 큰 이점은 대부분의 DNA 표지인자가 공우성으로 단순한 멘델의 유전양식을 따르므로 개체의 유전자형을 직접 판정할 수 있고 성과 연령에 전혀 영향을 받지 않아 개체의 유전적 잠재능력을 조기에 예측하고 선발할 수 있다는데 있다. 그동안 DNA 마커 분석 기술의 눈부신 진전에 따라 각종 DNA 표지인자를 개발하고 이들 마커와 주요 경제형질들과의 연관성을 분석하여 양적형질에 영향을 미치는 연관 DNA marker를 검출하고 이를 지표로 하여 목적으로 하는 특정 유전자형을 보유하고 있는 개체를 직접 선발하는 분자표지 이용 선발법(marker-assisted selection, MAS)의 분자 선발육종 방법의 개발은 종래의 표현형가에만 의존하던 전통적인 선발육종 체계에서 유전자형 그 자체에 의한 직접 선발육종이 실현 가능해 짐으로써 동물의 육종개량에 신기원을 이루는 계기가 되었다.

지방산결합단백질(FABP, Fatty Acid-Binding Protein)은 장쇄 지방산(long chain fatty acid) 대사에 관련된 진화적으로 보존된 단백질 그룹의 하나로서( Hirsch 등, 1998) 혈장 막으로부터 β-산화 및 트리아실글리세롤(triacylglycerol) 또는 인지질(phospholipid) 합성장소로 지방산을 운송하는 작은 세포내 단백질이다(Roy 등, 2003). 특히, 지방산 결합 단백질은 세포내 지방산 농도 및 다양한 세포 및 지질 대사를 조절하는 것으로 알려져 있고(Veerkamp 등, 1995) 이 같은 생리적 작용 때문에 포유동물에서 근내지방 함량(intramuscular fat content)의 후보유전자로 주목되고 있다(Nechtelberger 등, 2001). 심장 형(Heart type) 지방산결합 단백질(H-FABP) 유전자는 근세포에 주로 발현되는 반면 지방 형(adipocyte type) 지방산결합단백질(A-FABP)은 거의 전적으로 지방세포에서 발현된다. 특히, 심근과 골격근 또는 비유중인 유선조직에서와 같이 지방산 요구가 높은 여러 조직에 존재하는(Roy 등, 2003) H-FABP 단백질은 돼지의 근내지방 함량, 등지방 두께 및 성장률과 연관성이 있다고 보고된 바 있다(Gerbens 등, 1998, 1999, 2000). 그러나 소의 경우 최근에 Roy 등(2003)이 RH mapping 기술로 2번 염색체상에 H-FABP3 유전자가 위치하고 있음을 보고하였으나 도체형질 및 육질과의 연관성을 밝힌 연구결과는 아직까지 보고된 바 없다.

본 발명은 포유동물의 세포질막내 지방산 수송 및 지방대사 조절의 기능을 갖는 H-FABP 유전자의 제한효소단편다형(RFLP) 분자 마커를 이용하여 개체의 도체중 및 도체량 등 육량을 결정하는 배최장근 단면적은 크고 등지방 두께는 얇은 한우 조기선발에 DNA 분자 마커를 이용하는 첨단 기술을 제공한다.

본 발명은 한우에서 고등동물의 지방산 수송 및 지질대사 조절에 관여하는 심장형 지방산결합단백질(H-FABP) 유전자의 제한효소단편다형(RFLP) 마커를 발굴하고 PCR-RFLP(restriction fragment length Polymorphism) 분석기법을 이용하여 한우의 배최장근 단면적과 등지방 두께에 유의적으로 영향을 미치는 도체형질 관련 RFLP 마커 유전자형을 개발하고 궁극적으로는 도체중 및 도체량이 높은 한우를 조기에 감별하여 선발할 수 있는 DNA 마커를 제공하여 고능력 한우 선발육종 및 개량에 적극 활용하는데 있다.

다음의 실시 예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다.

실시 예 1 : 한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자의 SNP 유전자형 검출

1. 공시재료 및 DNA 분리 정제

본 발명에 사용한 한우는 국가 후대검정사업에 등록하고 후대검정을 통하여 혈통기록과 도체성적을 보유하고 있는 후보 종모우 집단 총 500두를 공시축으로 선정하였다. 각 공시축 혈액으로부터의 genomic DNA의 분리 및 정제는 Miller등 (1988)의 방법을 일부 변경하여 분리 정제하였으며 스펙트로포토메타( spectrometer)를 이용하여 DNA 농도를 측정한 후 TE buffer(10mM Tris-HCl, pH 7.4; 1mM EDTA)에 용해하여 -20℃ 냉동고에 보존하고 공시재료로 사용하였다.

2. PCR-RFLP 기법에 의한 한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP) 유전자의 단일염기다형(SNP) 검출

한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자의 인트론 1 번의 특정 영역을 포함하는 302bp 크기의 단편을 증폭하기 위한 프라이머(primer)는 GenBank(DQ174319)에 등록된 염기서열 정보를 참고로 하여 각각 설계 제작하였으며, 본 발명에 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다<표 1>.

한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머 염기서열

유전자	프라이머 염기서열(5'-3')	증폭 영역	단편의 크기(bp)
H-FABP(3460-3761)	F : AACGTCTTTGAAGGTTCTCA R : CACCTTGACTTTCCTGTCAT	인트론 1	302

한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자의 3460번째 염기부터 3761번째 염기까지 증폭한 인트론 1번 영역 내 64번째 SNP 부위에 TspRⅠ 제한효소 인지부위(5'-NNCASTGNN^▼-3')가 존재하여 PCR-RFLP 기법을 이용한 heart fatty acid binding protein(H-FABP) 유전자의 3종류 SNP 유전자형(C/C, C/T 및 T/T)을 검출하였다<도면2>. 한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자의 PCR-RFLP 분석은 약 5㎕의 PCR증폭산물에 5unit의 TspRⅠ 제한효소를 첨가한 다음 65℃의 incubator에서 3시간이상 반응시켜 절단하였다. PCR 증폭산물을 제한효소로 절단하여 얻어진 DNA 단편은 TBE buffer(90mM tris-borate, 2mM EDTA, pH 8.0)을 이용하여 3% agarose gel로 약 3시간 정도 전기영동 하여 DNA band 양상을 관찰하고 각 검정 개체별 SNP 유전자형을 판정하였다. 먼저 C 대립유전자의 경우 1개의 제한효소 인지부위가 존재하여 각각 68 과 234 bp 크기를 갖는 총 2개의 band가 형성되었고, T 대립유전자는 제한효소 인지부위가 존재하지 않아 원래의 증폭산물 크기인 302bp band가 검출되었다. 또한 C/T 이형접합체형은 이들 3개의 band가 모두 검출되어 68, 234 그리고 302bp의 banding 패턴을 나타내었다. 본 그림에서는 발현량이 미약한 100bp 이하의 68bp band는 나타내지 않았으므로 C/C형은 234bp band만 나타나있고, T/T형은 302bp, 그리고 C/T형은 234bp와 302bp band만 나타나있다<도면2>. 검출된 대립유전자의 출현빈도는 C 대립유전자는 약 28.2%, T 대립유전자는 약 71.8%로 T 대립유전자가 상당히 높은 출현율을 나타났으며, SNP 유전자형의 출현빈도는 C/C형이 약 1.4%, C/T형이 약 53.7%, 그리고 T/T형이 44.9%로 C/T 이형접합체형이 가장 높은 출현빈도를 나타내었다.

실시 예 2 : 한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자의 SNP 유전자형과 도체 및 육질형질 간의 연관성 분석

한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자의 SNP 유전자형이 도체 및 육질형질의 육종가 추정치에 미치는 효과를 규명하기 위하여 MTDFREML computer program(Boldman 등, 1993)을 이용하여 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자의 SNP 유전자형과 각종 도체 및 육질형질 간의 연관성을 통계 분석한 결과 등지방 두께와 배최장근 단면적에 유의적인 영향을 가지고 있는 것이 확인되었다<표 2>.

즉, 본 발명에서 한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자의 인트론 1번 영역 내 C/C 유전자형은 등지방 두께가 1.150으로 C/T 및 T/T 형에 비해 각각 0.526과 0.494 정도 유의적으로 더 높았으며(P<0.05), 등지방 두께의 육종가(breeding value) 값에 있어서도 C/C 형이 0.0792로 C/T 및 T/T 형의 0.135와 -0.048에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았다. 또한, 배최장근 단면적의 육종가 값에 있어서는 C/C SNP 유전자형이 -4.26으로 C/T형의 0.101과 T/T형의 1.213과 비교해 보았을 때, 각각 4.361과 5.473 정도 유의적으로 더 낮게 나타났다(P<0.05).

한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자의 인트론 1번 영역 내 SNP 유전자형이 육질에 미치는 영향

도체 및 육질형질	SNP 유전자형			P-value
도체 및 육질형질	C/C형	C/T형	T/T형	P-value
생체중/㎏	585.000±36.121	540.379±5.747	548.939±6.287	0.3253
도체중/㎏	328.500±23.200	308.531±3.691	315.015±4.038	0.3825
도체율/%	56.200±1.095	57.048±0.174	57.333±0.190	0.3698
등지방두께/㎝	1.150±0.189a	0.624±0.030b	0.656±0.033b	0.0238*
배최장근단면적/㎠	69.000±5.787	74.518±0.920	76.045±1.007	0.3060
근내지방도/1~7	3.000±0.875	2.177±0.139	1.909±0.152	0.2460
도체중(육종가)/㎏	5.705±7.189	2.436±1.143	5.078±1.251	0.2882
배최장근단면적(육종가)/㎠	-4.260±2.405b	0.101±0.382a	1.213±0.418a	0.0215*
등지방두께(육종가)/㎝	0.792±0.401a	0.135±0.063ab	-0.048±0.069b	0.0311*
근내지방도(육종가)/1~7	0.199±0.090	-0.026±0.014	-0.039±0.015	0.0762

^*P<0.05

^a,b통계적 유의차가 인정됨(P<0.05)

따라서, 본 발명의 한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자의 특정한 SNP 유전자형은 한우의 등지방 두께와 배최장근 단면적에 높은 유의적 연관성이 존재하는 것으로 입증되었다. 즉, C/T 및 T/T 유전자형을 가진 개체들은 C/C 유전자형을 가진 개체들에 비해 등지방 두께는 얇고, 배최장근 단면적은 넓은 것으로 판정되어 한우의 유전능력 개량과 도체중 및 도체량이 높은 한우를 조기에 예측하여 선발하는 도구로 활용할 수 있다.

이상에서 상세히 설명한 본 발명의 지방산결합단백질(H-FABP) 유전자의 분자 마커는 국가단위의 고능력 한우의 선발 육종개량 사업과 관련하여 개체의 육량등급을 좌우하는 도체중과 도체량에 직접 영향을 미치는 배최장근 단면적은 넓고 등지방 두께는 얇은 종모우와 종빈우의 종축을 조기에 정확히 식별하여 선발할 수 있어 선발효율의 향상 및 유전적 개량량의 증대 효과를 가져 올 수 있다.

또한, 한우사육 농가단위에서는 도축 후 육량 등급 판정 시 도체중과 도체량이 많이 나갈 수 있는 우량 송아지나 비육 밑소를 조기에 판별하여 선발 사육함으로써 사료비를 크게 줄이고 사양 관리비 및 노동력 등의 경영비를 크게 절감할 수 있어 생산성 향상을 통한 경영 합리화로 농가 경제소득 증대에 큰 효과를 얻을 수 있다.

Claims

도면 1의 염기서열 구조를 갖는 한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자 염기서열 및 신규 단일염기다형(SNP)
한우에서 DNA를 포함하는 시료를 채취하여 DNA를 분리하고, 특이적 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭한 다음 그 염기서열을 분석하고, PCR-RFLP 분석 기법으로 heart fatty acid binding protein(H-FABP)의 신규 단일염기다형(SNP)에 대한 유전자형(C/C, C/T 및 T/T)을 분석하는 방법
한우 heart fatty acid binding protein(H-FABP)유전자의 SNP를 DNA 표지인자로 이용하여 높은 배최장근 단면적과 낮은 등지방 두께를 갖는 한우를 판정하고 선발하는 분자육종 기술