CN107893107A - 一种用于黑色素瘤基因筛查的荧光定量pcr检测系统及其应用 - Google Patents

一种用于黑色素瘤基因筛查的荧光定量pcr检测系统及其应用 Download PDF

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姜萍萍
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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，特别地，涉及一种荧光定量PCR检测试剂盒，并进一步公开其用于检测黑色素的应用。本发明所述荧光定量PCR检测系统，包括对特定位点基因的检测试剂盒，并根据每个位点对黑色素瘤风险的风险值来计算黑色素瘤风险的得分，并根据现有的数据库去进行人群分级，通过个人得分得到个人的黑色素瘤风险级别，从而评估受检者的患病风险，引导高风险者改善生活方式，并避免诱发因素及增加体检频率。与此同时，本发明通过对选定的7个基因多态性位点建立中国人群数据库，为建立中国人群特有的黑色素瘤评估奠定了基础。

Description

一种用于黑色素瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统及其 应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别地，涉及一种荧光定量PCR检测试剂盒，并进一步公开其用于检测黑色素瘤的应用。
背景技术
随着科学研究的不断发展，人类基因组计划完成后，后基因组计划的全面展开，以基因工程为主导的生物技术在体育运动问题领域的应用得到广泛的关注。目前运用遗传学的理论和方法进行运动选材已经有了初步进展。常用的基因检测方法有：直接测序(directsequencing，DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、定量PCR，其中利用DNA分析仪直接测序是金标准，但是上述方法分别存在着成本高、准确率低、操作繁琐和重复性差等问题。实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR DetectingSystem，qPCR)，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，荧光定量PCR(realtime PCR)检测在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，qPCR系统为三代的PCR检测技术，qPCR具有检测灵敏度高，检测线性范围宽，检测精度和重复性好等突出优势，因此被公认为当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术。因此该技术可以高效、准确的用于运动基因检测。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。SNP为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关，SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。这主要是因为SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。SNP 在基因组中分布相当广泛，研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP在基础研究中也发挥了巨大的作用，通过对Y染色体SNP的分析，使得在人类进化、人类种群的演化和迁徙领域取得了一系列重要成果。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。
已有越来越多的文献对荧光定量PCR技术从各方面的应用角度进行阐述，大部分文献公开了多种单一片段通过荧光定量PCR技术进行检测的具体方式方法，但在发明人进行荧光定量PCR检测SNP位点的过程中，发现单一片段的检测不足以满足检测要求，对于具有两个或多个SNP位点的综合性检测，需要重复检测，步骤繁琐且操作时间长。
黑色素瘤是一种高侵袭，易转移，预后极差的恶性肿瘤。它是由于表皮基底层的黑色素细胞发生恶性突变，色素生成和酪氨酸代谢发生异常所致。因此，黑色素瘤多发生于皮肤，亦可见于消化道、生殖系统的黏膜，眼球及脑膜的脉络膜等处。
近年来，全球各地区黑色素瘤的发病率均成增长趋势，澳大利亚的昆士兰地区和美国西南部地区成为全球黑色素瘤的高发区，欧美白种人发病率较高，为21.6/10万，非洲裔为1.0/10万。我国黑色素瘤多原发于皮肤(50％-70％)和黏膜(22.6％)，以肢端黑色素瘤最多见。中国近几年相关的流行病学数据显示，其发病率略低于非洲人群。尽管我国黑色素瘤发病率远低于欧美等西方国家，但其危害却仍不容小觑，发病率逐年增长，估计每年新发病率约2万例，死亡率极高，尤其是转移性黑色素瘤，患者中期生存期仅约6月，5年生存率<5％。
黑色素瘤是由遗传性基因变异和所处环境共同作用导致的。紫外线(UV) 是黑色素瘤的主要致癌因素，包括规律使用防晒霜在内的减少UV暴露能减少原发皮肤黑色素瘤的发生；此外，基因遗传也是黑色素发生的重要因素之一。约有10％的患者可查明有家族史，有家族史发生黑色素瘤的几率是无家族史的 2倍。有研究发现，携带有特定MC1R突变的人患病风险显著增加。现有的黑色素瘤易感基因的研究多数位点是基于欧洲人群大样本量GWAS研究得出的强关联位点，在应用于亚洲人群，尤其是我国人群时，位点关联性较弱，难以通过检测得到较为准确的结果，因此建立中国人群的评估系统是十分有必要的。
发明内容
本发明目提供了一种用于黑色素瘤基因筛查的荧光定量PCR检测试剂盒，并进一步公开其在黑色素瘤基因筛查领域的应用。
为实现上述目的，本发明提出了荧光定量PCR检测系统用于制备黑色素瘤基因筛查系统的用途。
本发明还公开了一种用于黑色素瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统，所述检测系统包括用于待测基因检测的荧光定量PCR检测为试剂盒，以及检测结果对应的对照评价系统；所述检测结果对照评价系统包括位点对应的检测结果处理部分及参考数据库；所述荧光定量PCR检测试剂盒包括对至少两个黑色素瘤相关基因位点检测的荧光定量PCR检测试剂。
所述荧光定量PCR检测的相关位点包括rs401681、rs7023329、rs1847142、rs258322、rs132985、rs10757257和rs7412746位点。
检测所述黑色素瘤基因位点的引物和探针序列结构如下表所示：
所述参考数据库是以千人基因组中的东亚人群基因组数据作为普通人群水平，并将检测结果实时收入数据库内。
所述检测结果对照评价系统是通过将待测基因的荧光定量PCR检测结果对应至风险级别中，其中待测基因的风险值P为多个检测基因位点的乘积，平均风险值为Pa，平均方差为S，并以此判断待测基因的风险级别：
Pa+0.6S≤P为高风险级别；
Pa+0.2S≤P＜Pa+0.6S为略高风险级别；
Pa-0.2S≤P＜Pa+0.2S为一般风险级别；
Pa-0.6S≤P＜Pa-0.2S为略低风险级别；
P＜Pa-0.6S为低风险级别。
更进一步的，所述平均方差S的计算方式如下：
其中，i为待测基因的检测位点数量
平均风险值Pa为通过东亚人群的基因组数据，Pa的计算公式为：
其中，人群总人数为N。
本发明还公开了所述的荧光定量PCR检测系统在黑色素瘤基因筛查领域中的应用。
本发明还公开了一种基于荧光定量PCR法筛查黑色素瘤基因的方法，包括利用所述荧光定量PCR检测系统对黑色素瘤相关基因进行荧光定量PCR检测的步骤，所述荧光定量PCR检测的位点包括rs401681、rs7023329、rs1847142、 rs258322、rs132985、rs10757257和rs7412746位点。
更优的，所述的基于荧光定量PCR法筛查黑色素瘤基因的方法，具体包括如下步骤：
(1)待测样本的扩增：根据待测基因位点的结构，采用单荧光标记探针，设计待测样本的引物及探针序列，进行PCR扩增；
(2)样本检测：通过熔解曲线峰型图检测已扩增的位点，得到对应位点的检测结果；
(3)根据检测结果进行处理，将各位点的风险积点统计后得出该待测基因的风险值，并对应所述参考数据库中的风险级别；
(4)根据检测结果的对应级别，综合得到基因风险及相关处理结果。
本发明具有如下有益效果：
本发明所述荧光定量PCR检测系统，包括对特定位点基因的检测试剂盒，并根据每个位点对黑色素瘤风险的风险值来计算黑色素瘤风险的得分，并根据现有的数据库去进行人群分级，通过个人得分得到个人的黑色素瘤风险级别，从而评价受检者的患病风险，引导高风险者改善生活方式，并避免诱发因素及增加体检频率。与此同时，本发明通过对选定的7个金银多态性位点建立中国人群数据库，为建立中国人群特有的黑色素瘤评估奠定了基础。
本发明所述荧光定量PCR检测系统，可以对受检者的黑色素瘤相关风险进行评估。本发明提供的检测试剂盒，具有特异性强、检出率高，效果高、成本低的优势，能够综合检测与分析受检人群是否携带“黑色素易感基因”，并评估其患黑色素瘤的风险，将易感人群从普通人群中筛选出来，给予个性化指导建议，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。
附图说明 rs401681、rs7023329、rs、rsrs132985、rs10757257和rs7412746
图1为本发明所述的检测样品rs401681的实验结果；
图2为本发明所述的检测样品rs401681的测序结果；
图3为本发明所述的检测样品rs7023329的实验结果；
图4为本发明所述的检测样品rs7023329的测序结果；
图5为本发明所述的检测样品rs1847142的实验结果；
图6为本发明所述的检测样品rs1847142的测序结果；
图7为本发明所述的检测样品rs258322的实验结果；
图8为本发明所述的检测样品rs258322的测序结果；
图9为本发明所述的检测样品rs132985的实验结果；
图10为本发明所述的检测样品rs132985的测序结果；
图11为本发明所述的检测样品rs10757257的实验结果；
图12为本发明所述的检测样品rs10757257的测序结果；
图13为本发明所述的检测样品rs7412746的实验结果；
图14为本发明所述的检测样品rs7412746的测序结果；
图15为本发明根据检测样品实验结果进行评估的流程图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例中采用黑色素瘤荧光定量PCR检测试剂盒进行黑色素瘤相关基因的检测，其中对黑色素瘤相关的7个基因上的7个多态性位点进行检测，包括rs401681、rs7023329、rs1847142、rs258322、rs132985、rs10757257和rs7412746 位点，共计5个位点。利用特异性设计的引物和探针，优化扩增体系和条件，在 4个体系完成七个基因上的七个多态性位点的检测。
本实施例中采用单荧光标记探针，罗氏480平台，最后通过熔解曲线峰型图检测rs401681、rs7023329、rs1847142、rs258322、rs132985、 rs10757257和rs7412746位点。
具体的rs401681、rs7023329、rs1847142、rs258322、rs132985、rs10757257 和rs7412746位点双重荧光定量PCR检测方法中，对于rs401681、rs7023329、 rs1847142、rs258322、rs132985、rs10757257和rs7412746位点的引物及探针设计如下表1所示：
表1引物及探针设计
对于上述rs401681、rs7023329、rs1847142、rs258322、rs132985、rs10757257 和rs7412746位点，分别设计如下表2-5所示的试剂反应体系：
表2位点rs7023329和rs401681双重体系
表3位点rs1847142和rs258322双重体系
表4位点rs132985和rs10757257双重体系
表5位点rs7412746体系
对上述rs401681、rs7023329、rs1847142、rs258322、rs132985、rs10757257 和rs7412746位点进行PCR扩增，并设计PCR反应程序(循环)设置参数如下表6所示。
表6 PCR反应参数设定
按照上述设计的引物、试剂盒PCR参数，对上述rs401681、rs7023329、 rs1847142、rs258322、rs132985、rs10757257和rs7412746位点进行PCR扩增，且对扩增结果进行检测，检测结果分别如图1-14所示。
检测样品位点rs7023329实验结果为AG，
检测样品位点rs7023329测序结果AG，
检测样品位点rs401681实验结果为CT，
检测样品位点rs401681测序结果CT，
检测样品位点rs1847142实验结果为AG，反链为CT，
检测样品位点rs1847142测序结果CT，
检测样品位点rs258322实验结果为AG，
检测样品位点rs258322测序结果AG；
检测样品位点rs132985实验结果为CC，反链为GG，
检测样品位点rs132985测序结果GG，
检测样品位点rs10757257实验结果为GG，
检测样品位点rs10757257测序结果GG，
检测样品位点rs7412746实验结果为CT，
检测样品位点rs7412746测序结果CT。
通过测序进行复检，证明本实验方法具有准确性和可靠性。
实施例2
实施例1中的7个位点均来自发表于国际顶级期刊文章，文章通过GWAS 研究得出了与黑色素瘤直接相关的七个易感位点，并计算出了七个位点的风险等位基因型风险值，即OR值。
多项GWAS研究发现TERT-CLPTM1、CDKN2A、TYR、MC1R、PLA2G6、 MTAP和ARNT基因上的常见遗传变异与黑色素瘤的发病风险密切相关。Marta 等发现TERT-CLPTM1基因座上的rs401681位点的T等位基因和较长的端粒长度可以显著提高黑色素瘤的发病风险；DTBishop等通过两个群体的case- control实验证实CDKN2A基因的rs7023329、MC1R基因上的rs258322和TYP 基因的rs1847142均与黑色素瘤的发病风险显著相关，其中MC1R、TYP作为色素合成的重要基因，之前已被证实与黑色素瘤风险因素如雀斑形成、晒伤等密切相关；以此同时，Falchi等研究发现CDKN2A邻近的MTAP上rs10757257和 PLA2G6上的rs132985也可作为黑色素瘤的易感位点。此后，Macgregor再次证明MC1R、MTAP-CDKN2A与黑色素瘤发病风险相关，他还发现了新的黑色素瘤易感位点(rs7412746)。
评估上述7个位点，计算不同基因型及其风险值(OR)为：
TERT-CLPTM1基因上的rs401681位点的TT-TC-CC基因型的OR值分别为1.54-1.24-1；
CDKN2A基因上的rs7023329位点的GG-GA-AA基因型的OR值分别为0.72-0.85-1；
TYP基因上的rs1847142位点的AA-AG-GG基因型的OR值分别为1.72- 1.31-1；
MC1R基因上的rs258322位点的AA-AG-GG基因型的OR值分别为2.79- 1.67-1；
PLA2G6基因上的rs132985位点的CC-CT-TT基因型的OR值分别为 1.51-1.23-1；
MTAP基因上的rs10757257位点的GG-GA-AA基因型的OR值分别为 1.51-1.23-1；
ARNT基因上的rs7412746位点的TT-TC-CC基因型的OR值分别为 0.76-0.87-1。
由于黑色素瘤的发病率小于10％，所以OR值近似于RR值，即风险值。每个位点的风险值则按照基因型来计算，即纯合风险等位基因型的风险值为OR 值的平方，杂合风险等位基因型的风险值为OR值，纯合非风险等位基因型为1，对于一个受检者，每个SNP位点根据检测得到的基因型，都有一个易感值，我们定义这个分值为S，那么受检者的个人黑色素瘤易感值为P，P值为七项基因型的OR值乘积，即：
根据上述基因检测结果，对个人的黑色素瘤风险进行评估，并建立中国人群的黑色素瘤易感数据库。
以千人基因组中东亚人群的基因组数据为普通人群水平，总人数定义为N。以千人基因组中东亚人群的基因型平均分设定为人群的平均分：
其中，人群总人数为N。
并计算出平均方差，
根据Pa与S，将东亚人群的黑色素瘤风险值进行分级，将受检者的个人黑色素瘤风险值P对应到人群分级中去，人群分级共五级，分别为高-略高-一般- 略低-低五个风险级别，具体为：
Pa+0.6S≤P为高风险级别；
Pa+0.2S≤P＜Pa+0.6S为略高风险级别；
Pa-0.2S≤P＜Pa+0.2SC为一般风险级别；
Pa-0.6S≤P＜Pa-0.2S为略低风险级别；
P＜Pa-0.6S为低风险级别。
基于东亚人群划分的黑色素瘤风险级别，P值≥2.33为高风险级别，2.13≤P 值＜2.33为偏高风险1.93≤P值＜2.13为一般风险，1.72≤P值＜1.93为偏低风险，P值＜1.72为低风险。
如图15所示的根据基因检测样品实验结果进行评估的流程图，根据基因检测结果，将七项OR值相乘得出个人黑色素瘤的易感值，也就是风险值。对应到由分级方法得到个人的黑色素瘤风险级别，根据受检者的P值对应的级别，综合得到受检者的黑色素瘤的风险，从而给出个体健康管理方案。
实施例3
本发明所述方法通过采集受检者的基因样本然后提取DNA，用罗氏 LightCycler480实时定量仪进行检测，得到的结果可参考图1，3，5，7，9，11， 13。
如下一位受检者的基因检测结果如下表7所示。
某个受检者TERT-CLPTM1基因上的rs401681基因型为CT，对应OR值为 1.24；CDKN2A基因上的rs7023329基因型AG，对应OR值为0.85；TYP基因上的rs1847142基因型为AG，对应OR值为1.31；MC1R基因上的rs258322基因型AA，对应OR值为2.79；PLA2G6基因上的rs132985基因型CC，对应OR 值为1.51；MTAP基因上的rs10757257基因型AG，对应OR值为1.23；ARNT 基因上的rs7412746基因型CC，对应OR值为1。上述OR值来自于NCBI的文献研究。
计算该受检者的个人黑色素瘤易感值
＝1.24*0.85*1.31*2.79*1.51*1.23*1＝7.15。
表7受检者的基因检测结果
rs401681 rs7023329 rs1847142 rs258322 rs132985 rs10757257 rs7412746
受检者 CT AG AG AA CC AG CC
HG00403 CT AA GG AA CT GG CT
HG00404 CT GG AG AG CC AA CC
HG00406 CT AG GG AA CC AG CC
千人基因组数据库中有504个东亚人，比如HG00403这个人P＝1.24*1*1 *2.79*1.23*1.51*0.87＝5.59，其余人同样可以计算得出，则东亚人群位点的基因型平均分Pa＝1.237，平均方差＝1.6。
此受检者P>Pa+0.6S＝1.237+0.6*1.6，所以黑色素瘤风险等级为高，所以该检测者的黑色素瘤风险等级高于人群平均风险，但不代表检测者一定会患此类疾病，请您不要有心理负担，因为疾病的发生除了受遗传因素的影响外，还受到生活环境因素的影响。您需注意防晒，夏季户外活动应注意遮阴，不进行暴晒的活动。不人为刺激皮肤色素痣。
以上实施例的先后顺序仅为便于描述，不代表实施例的优劣。
最后应说明的是：以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110> 深圳美因临床检验所有限公司
<120> 一种用于黑色素瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统及其应用
<130> MY17019P
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgaccagtct accatcagag t 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgaggataca acttagagaa gagg 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcctgtgaat ctgtgcctgc 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gccacatcta cgcacagac 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gataaactta ccagccagaa agc 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caacttcaga gtccatcatg gtgt 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aacttcatca ctccatcact g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgactcattg agcctcttct 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cattgtcttc tacgcatatg ctc 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtttggatta tgggcattag ca 22
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctgaaccgca ttggagagg 19
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttatcacaaa cgttgtacca tttct 25
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
caactgacag aacttggtga tt 22
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggcaggcttg cacttgta 18
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cccacttttg aggtacacgg c 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aaggagggtg agtgtaggat 20
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tcagacaatg gcagtgttaa tc 22
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
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<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
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<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ttgagatgag tagcagcact t 21
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tcacaccaca cctcctttct cctac 25

Claims (10)

1.荧光定量PCR检测系统用于制备黑色素瘤基因筛查系统的用途。
2.一种用于黑色素瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于，所述检测系统包括用于待测基因检测的荧光定量PCR检测为试剂盒，以及检测结果对应的对照评价系统；所述检测结果对照评价系统包括位点对应的检测结果处理部分及参考数据库；
所述荧光定量PCR检测试剂盒包括对至少两个黑色素瘤相关基因位点检测的荧光定量PCR检测试剂。
3.根据权利要求2所述的用于黑色素瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于，所述荧光定量PCR检测的相关位点包括rs401681、rs7023329、rs1847142、rs258322、rs132985、rs10757257和rs7412746位点。
4.根据权利要求2所述的用于黑色素瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于，检测所述黑色素瘤基因位点的引物和探针序列结构如下表所示：
5.根据权利要求2-4任一项所述的用于黑色素瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于，所述参考数据库是以千人基因组中的东亚人群基因组数据作为普通人群水平，并将检测结果实时收入数据库内。
6.根据权利要求2-5任一项所述的用于黑色素瘤基因筛查的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测结果对照评价系统是通过将待测基因的荧光定量PCR检测结果对应至风险级别中，其中待测基因的风险值P为多个检测基因位点的乘积，平均风险值为Pa，平均方差为S，并以此判断待测基因的风险级别：
Pa+0.6S≤P为高风险级别；
Pa+0.2S≤P＜Pa+0.6S为略高风险级别；
Pa-0.2S≤P＜Pa+0.2S为一般风险级别；
Pa-0.6S≤P＜Pa-0.2S为略低风险级别；
P＜Pa-0.6S为低风险级别。
7.根据权利要求6所述的用于黑色素瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于：
所述平均方差S的计算方式如下：
<mrow> <mi>S</mi> <mo>=</mo> <msqrt> <mfrac> <mrow> <msubsup> <mi>&amp;Sigma;</mi> <mrow> <mi>i</mi> <mo>=</mo> <mn>1</mn> </mrow> <mi>N</mi> </msubsup> <msup> <mrow> <mo>(</mo> <msub> <mi>P</mi> <mi>i</mi> </msub> <mo>-</mo> <msub> <mi>P</mi> <mi>a</mi> </msub> <mo>)</mo> </mrow> <mn>2</mn> </msup> </mrow> <mi>N</mi> </mfrac> </msqrt> <mo>;</mo> </mrow>
其中，i为待测基因的检测位点数量
平均风险值Pa为通过东亚人群的基因组数据，Pa的计算公式为：
<mrow> <msub> <mi>P</mi> <mi>a</mi> </msub> <mo>=</mo> <mfrac> <mrow> <msubsup> <mo>&amp;Sigma;</mo> <mrow> <mi>i</mi> <mo>=</mo> <mn>1</mn> </mrow> <mi>N</mi> </msubsup> <mrow> <mo>(</mo> <msub> <mi>P</mi> <mi>N</mi> </msub> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mi>s</mi> <mn>401684</mn> <mo>)</mo> </mrow> <mo>*</mo> <msub> <mi>P</mi> <mi>N</mi> </msub> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mi>s</mi> <mn>7023329</mn> <mo>)</mo> </mrow> <mo>*</mo> <msub> <mi>P</mi> <mi>N</mi> </msub> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mi>s</mi> <mn>1847142</mn> <mo>)</mo> </mrow> <mo>*</mo> <msub> <mi>P</mi> <mi>N</mi> </msub> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mi>s</mi> <mn>25322</mn> <mo>)</mo> </mrow> <mo>*</mo> <msub> <mi>P</mi> <mi>N</mi> </msub> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mi>s</mi> <mn>132985</mn> <mo>)</mo> </mrow> <mo>*</mo> <msub> <mi>P</mi> <mi>N</mi> </msub> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mi>s</mi> <mn>10757257</mn> <mo>)</mo> </mrow> <mo>*</mo> <msub> <mi>P</mi> <mi>N</mi> </msub> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mi>s</mi> <mn>7412746</mn> <mo>)</mo> </mrow> <mo>)</mo> </mrow> <mi>N</mi> </mfrac> <mo>;</mo> </mrow>
其中，人群总人数为N。
8.权利要求2-7任一项所述的荧光定量PCR检测系统在黑色素瘤基因筛查领域中的应用。
9.一种基于荧光定量PCR法筛查黑色素瘤基因的方法，其特征在于，包括利用权利要求2-7任一项所述的荧光定量PCR检测系统对黑色素瘤相关基因进行荧光定量PCR检测的步骤，所述荧光定量PCR检测的位点包括rs401681、rs7023329、rs1847142、rs258322、rs132985、rs10757257和rs7412746位点。
10.根据权利要求9所述的基于荧光定量PCR法筛查黑色素瘤基因的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)待测样本的扩增：根据待测基因位点的结构，采用单荧光标记探针，设计待测样本的引物及探针序列，进行PCR扩增；
(2)样本检测：通过熔解曲线峰型图检测已扩增的位点，得到对应位点的检测结果；
(3)根据检测结果进行处理，将各位点的风险积点统计后得出该待测基因的风险值，并对应所述参考数据库中的风险级别；
(4)根据检测结果的对应级别，综合得到基因风险及相关处理结果。
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