CN104372091A - 一种鉴定或辅助鉴定细菌菌门的引物及其应用 - Google Patents

一种鉴定或辅助鉴定细菌菌门的引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定细菌菌种的引物及其应用。本发明的引物是由如SEQ ID No.1中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物、如SEQ ID No.2中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物、如SEQ ID No.3中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物、如SEQ ID No.4中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物、如SEQ ID No.5中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物、如SEQ ID No.6中第59-75位核苷酸分子所示的反向引物和如SEQ ID No.7中第59-75位核苷酸分子所示的反向引物组成。实验结果表明：利用本发明设计的引物，结合普通PCR技术，可以快速、高覆盖的构建细菌高通量Illumina测序文库。

Description

一种鉴定或辅助鉴定细菌菌门的引物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴定或辅助鉴定细菌菌门的引物及其应用。
背景技术
高通量测序作为近年来发展起来的全新的技术手段，在生态系统的研究中起到了非常重要的作用。随着测序技术的逐渐成熟和应用领域的扩大，其重要性日益突出。目前高通量测序已经被广泛应用于环境和人体肠道样本的微生物群落多样性和丰度的检测，主要包括土壤、动物体表和肠道样品等。
尽管高通量测序技术于近年得到广泛应用，但测序文库的构建方法仍没有明显的改进。测序文库的构建主要包括以下步骤：元基因组提取，基因组的片断化，DNA片断末端加A，然后加adaptor。之后利用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片断，最后对构建好的文库进行定量，定量合格的文库即可用于高通量测序。建库过程中涉及多个DNA片断筛选和磁珠纯化的步骤。该方法对于需要了解生态系统中菌群的多样性和丰度要求的样品并不适用，因为测序会产生大量不需要的冗余数据从而增加测序成本，而且以上的建库方法步骤繁琐而耗时。故开发步骤简单而覆盖率高的测序文库构建方法就显得尤为重要。
目前细菌的分子鉴定普遍采用16S rRNA基因作为金标准。菌种鉴定的常规步骤是利用细菌16S rRNA基因通用引物扩增该基因全长，测序后与数据库中的数据比对来鉴定菌种。目前使用高通量测序方法研究生态系统中菌群多样性和丰度的普遍采用的平台是焦磷酸测序(454pyrosequencing)，该方法准确率高但成本也很高，而且通量低。但目前采用Illumina平台构建文库时仅采用单一测序引物，无法覆盖大多数数据库中已知的细菌菌门，从而会丢失一部分没有覆盖到的菌门信息。因此设计高覆盖率的测序引物迫在眉睫。
发明内容
本发明的一个目的是提供一组用于鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门的引物。
本发明所提供的一组用于鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门的引物，由如下(1)-(7)所示引物组成：
(1)如SEQ ID No.1中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
(2)如SEQ ID No.2中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
(3)如SEQ ID No.3中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
(4)如SEQ ID No.4中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
(5)如SEQ ID No.5中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
(6)如SEQ ID No.6中第59-75位核苷酸分子所示的反向引物；
(7)如SEQ ID No.7中第59-75位核苷酸分子所示的反向引物。
上述引物中，所述正向引物序列的5’端连接有adaptor序列。
上述引物中，所述正向引物序列的5’端连接的adaptor序列如SEQ ID No.1中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.2中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.3中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.4中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.5中第1-58位核苷酸分子所示。
上述引物中，所述反向引物序列的5’端连接有adaptor序列。
上述引物中，所述反向引物序列的5’端连接的adaptor序列如SEQ ID No.6中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.7中第1-58位核苷酸分子所示。
上述引物中，所述反向引物中还包括barcode序列。
上述引物中，所述barcode序列加入的位置是反向引物中的adaptor序列的第24-25位核苷酸分子之间，不同的待测样品中加入不同的barcode序列。
本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌种的试剂盒。
上述所述试剂盒中包括上述任一所述的引物。
上述所述的试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门的产品中的应用也是本发明的目的。
本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门的方法。
本发明所提供的一种鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门的方法包括如下步骤：
(1)提取待测样品中细菌基因组DNA；
(2)以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，采用上述所述的引物进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
(3)利用IlluminaHiSeq2000测序平台对扩增产物进行双端150bp测序；
(4)对测序结果进行菌门分类，得到待测样品中存在的细菌菌门。
上述方法中，所述的细菌菌门包括：Actinobacteria，Bacteroidetes，Fusobacteria，Proteobacteria，Firmicutes，Aquificae，Caldiserica，Chlamydiae，Chlorobi，Chloroflexi，Chrysiogenetes，Deferribacteres，Deinococcus-Thermus，Elusimicrobia，Fibrobacteres，Gemmatimonadetes，Lentisphaerae，Marinimicrobia，Nitrospirae，Planctomycetes，Spirochaetes，Synergistetes，Tenericutes，Thermodesulfobacteria，Thermotogae，Parcubacteria，Microgenomates，SR1，Candidatus Saccharibacteria，Latescibacteria，Armatimonadetes，Verrucomicrobia，Omnitrophica，Poribacteria，Hydrogenedentes，Nitrospinae。
上述方法中，所述待测样品为含有细菌的样品；所述具体为人体肠道样本、动植物或环境；更具体为人粪便。
本发明的最后一个目的是提供一种构建细菌高通量Illumina测序文库的方法。
本发明所提供的一种构建细菌高通量Illumina测序文库的方法包括如下步骤：
(1)提取待测样品中细菌基因组DNA；
(2)以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，采用上述所述的引物进行多重PCR扩增，得到的扩增产物即为所述细菌高通量Illumina测序文库；
上述所述的方法在鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门中的应用也是本发明的保护范围。
本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定细菌菌门的引物及其应用。实验表明：利用本发明设计的引物，结合普通PCR技术，可以快速、高覆盖的构建细菌高通量Illumina测序文库。
附图说明
图1为18个粪便样本PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。M:marker；N:阴性对照；1-18:样本号。
图2为人体肠道样本的Illumina和454焦磷酸测序结果在菌门水平上的比对。图2A为18个人体肠道(粪便)样品Illumina测序结果分析；图2B为18个人体肠道(粪便)样品454焦磷酸测序结果分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、引物的设计与合成
本发明使用了5条正向引物(长度为17bp)和2条反向引物(长度为17bp)。5条正向引物分别命名为338F、339F、340F、341F和342F，2条反向引物分别命名为518R和519R，引物序列见表1。在表1中，match％为在核糖体数据库(RDP)中细菌比对的百分比(％)，比对序列为‘Good’quality且序列长度大于1200nt，7条引物可以覆盖核糖体数据库项目中已知的35个菌门。
表1、构建文库使用的16S rRNA基因V3区特异引物序列
35个菌门如下：Actinobacteria(放线菌门)，Bacteroidetes(拟杆菌门)，Fusobacteria(梭杆菌门)，Proteobacteria(变形菌门)，Firmicutes(厚壁菌门)，Aquificae(产水菌门)，Caldiserica(嗜热丝菌门)，Chlamydiae(沙眼衣原体)，Chlorobi(绿菌门)，Chloroflexi(绿弯菌门)，Chrysiogenetes(产金菌门)，Deferribacteres(脱铁杆菌门)，Deinococcus-Thermus(异常球菌-栖热菌门)，Elusimicrobia(迷踪菌门)，Fibrobacteres(纤维杆菌门)，Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)，Lentisphaerae(黏胶球形菌门)，Marinimicrobia(还没有中文名)，Nitrospirae(硝化螺旋菌门)，Planctomycetes(浮霉菌门)，Spirochaetes(螺旋体门)，Synergistetes(互养菌门)，Tenericutes(软壁菌门)，Thermodesulfobacteria(热脱硫杆菌门)，Thermotogae(热袍菌门)，Parcubacteria(还没有中文名)，Microgenomates(还没有中文名)，SR1(还没有中文名)，CandidatusSaccharibacteria(还没有中文名)，Latescibacteria(还没有中文名)，Armatimonadetes(装甲菌门)，Verrucomicrobia(疣微菌门)，Omnitrophica(还没有中文名)，Poribacteria(海维杆菌门)，Hydrogenedentes(还没有中文名)，Nitrospinae(硝化刺菌门)。
除了设计的细菌16S rRNA基因V3区特异引物外，合成引物时在所有正向引物的5'端都加入了如SEQ ID No.1的第1-58位核苷酸所示的adaptor序列，所有反向引物的5'端都加入了如SEQ ID No.6的第1-58位核苷酸所示的adaptor序列，如表2所示。
表2、构建文库使用的16S rRNA基因V3区的引物序列
为了区分不同的样本，在合成引物时还需在反向引物中加入6bp的barcode序列，反向引物中加入的barcode序列的位置是在反向引物的adaptor序列中的第24-25位核苷酸之间，不同的待测样本加入不同的barcode序列。
实施例2、引物的覆盖率检测
1、人体肠道样本的收集和元基因组提取
样本来自于18个志愿者的人体肠道(粪便)。收集到的样本(约500mg)被立刻装入冷冻管并储存于-80℃冰箱中，直到样品元基因组提取时取出。肠道样本中细菌元基因组是利用QIAamp DNA Stool Mini试剂盒提取并略有改进。为了有效的破坏细胞壁，尤其是革兰氏阳性菌的细胞壁，在均质步骤中加入了100mg玻璃珠(直径0.1mm)。同时在裂解步骤中加入了终浓度为20mg/mL溶菌酶。之后混合物被放在95℃水浴锅中孵育5min以增加DNA的提取量。其它步骤与说明书中一致。
2、利用设计的引物通过多重PCR扩增靶序列
分别以上述步骤1中获得的元基因组为模板，采用实施例1中设计的正向引物和反向引物通过多重PCR扩增靶序列。
18个样品的barcode序列如下：CGTGAT，ACATCG，GCCTAA，TGGTCA，CACTGT，ATTGGC，GATCTG，TCAAGT，CTGATC，AAGCTA，GTAGCC，TACAAG，TTGACT，GGAACT，TGACAT，TCGCTT，TGAGGA，ACAACC。
PCR反应总体系50μl：包括模板DNA 1μl；正向和反向引物各0.4μM，其中正向引物为等浓度的5条引物的混合物，反向引物为等浓度的2条引物的混合物；1.5mMMgCl2；1U的Kapa Taq DNA聚合酶(Kapa biosystems,Boston,US)。
PCR反应条件：95℃5min；95℃1min，52℃1min，72℃1min，20个循环；72℃7min。
3、琼脂糖凝胶电泳、目的条带的回收与定量
电泳采用1.5％琼脂糖凝胶电泳，条件为100V，50min，18个样本的PCR产物电泳结果见图1。之后切胶回收目的条带以去除产生的二聚体。然后，利用QIAGEN凝胶回收试剂盒(Cat.no.28604,USA)回收PCR产物。产物经NanoDropND1000spectrophotometer(Thermo Scientific,USA)初步定量后利用ABI 7300real-timePCR精确定量检测。定量检测合格的样本即可用于高通量测序。
4、高通量测序及测序结果的分析
本方法采用的是IlluminaHiSeq2000测序平台进行的双端150bp测序。测序结果经过去冗余和序列比对后进行菌门分类，结果见图2。结果表明：Illumina测序结果与454焦磷酸测序的结果相同，即人肠道(粪便)样本中均检测出共包括30种已知的菌门和其它未知菌门。且丰度与焦磷酸测序的结果基本一致。两种方法检测的结果均为厚壁菌和拟杆菌门为优势菌门(占细菌总量>90％以上)，其它为稀有菌门。
实验结果表明：本发明设计的引物覆盖率高且操作简单，可以应用于人体肠道样本中的细菌多样性和丰度的检测，并且同样适用于其它肠道样本和环境样本的检测。

Claims (10)

1.一组用于鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门的引物，由如下(1)-(7)所示引物组成：
(1)如SEQ ID No.1中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
(2)如SEQ ID No.2中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
(3)如SEQ ID No.3中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
(4)如SEQ ID No.4中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
(5)如SEQ ID No.5中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
(6)如SEQ ID No.6中第59-75位核苷酸分子所示的反向引物；
(7)如SEQ ID No.7中第59-75位核苷酸分子所示的反向引物。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正向引物序列的5’端连接有adaptor序列；
所述正向引物序列的5’端连接的adaptor序列如SEQ ID No.1中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.2中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.3中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.4中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.5中第1-58位核苷酸分子所示。
3.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于，所述反向引物序列的5’端连接有adaptor序列；
所述反向引物序列的5’端连接的adaptor序列如SEQ ID No.6中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.7中第1-58位核苷酸分子所示。
4.根据权利要求1-3任一所述的引物，其特征在于，所述反向引物中还包括barcode序列；
所述barcode序列加入的位置是反向引物中的adaptor序列的第24-25位核苷酸分子之间，不同的待测样品中加入不同的barcode序列。
5.一种用于鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌种的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1-4任一所述的引物。
6.权利要求5所述的试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门的产品中的应用。
7.一种鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品中细菌基因组DNA；
(2)以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，采用权利要求1-4任一所述的引物进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
(3)利用IlluminaHiSeq2000测序平台对扩增产物进行双端150bp测序；
(4)对测序结果进行菌门分类，得到待测样品中存在的细菌菌门。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的细菌菌门包括：Actinobacteria，Bacteroidetes，Fusobacteria，Proteobacteria，Firmicutes，Aquificae，Caldiserica，Chlamydiae，Chlorobi，Chloroflexi，Chrysiogenetes，Deferribacteres，Deinococcus-Thermus，Elusimicrobia，Fibrobacteres，Gemmatimonadetes，Lentisphaerae，Marinimicrobia，Nitrospirae，Planctomycetes，Spirochaetes，Synergistetes，Tenericutes，Thermodesulfobacteria，Thermotogae，Parcubacteria，Microgenomates，SR1，CandidatusSaccharibacteria，Latescibacteria，Armatimonadetes，Verrucomicrobia，Omnitrophica，Poribacteria，Hydrogenedentes，Nitrospinae。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述待测样品为含有细菌的样品；具体为人体肠道样本、动植物或环境；更具体为人粪便。
10.一种构建细菌高通量Illumina测序文库的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品中细菌基因组DNA；
(2)以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，采用权利要求1-4任一所述的引物进行多重PCR扩增，得到的扩增产物即为所述细菌高通量Illumina测序文库；
或，权利要求10所述的方法在鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门中的应用。
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