CN103361413A

CN103361413A - 一种检测普洱茶微生物群落结构的方法

Info

Publication number: CN103361413A
Application number: CN2013100208293A
Authority: CN
Inventors: 林炜铁; 罗剑飞; 杨晓苹
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2013-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明公开了一种检测普洱茶微生物群落结构的方法，该方法用玻璃珠震荡法收集普洱茶茶叶的微生物菌体；然后用液氮冻融、酶法和CTAB法相结合提取微生物总DNA；再分别使用细菌16S rRNA和真菌18S rRNA 可变区域的通用引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增；用DGGE分离PCR产物和染色得到条带图谱，应用Quantity One软件对条带进行相对定量分析；切胶回收条带DNA，对回收的核酸进行PCR扩增，产物连接T载体，挑选阳性克隆进行带GC夹的菌落PCR；DGGE电泳重新比对，选择目的条带对应的PCR产物进行测序鉴定。本发明可用于检测普洱茶发酵过程中微生物群落结构和相对数量的变化。

Description

一种检测普洱茶微生物群落结构的方法

技术领域

本发明涉及到普洱茶微生物群落结构和相对数量的分析检测，特别是涉及应用PCR-DGGE技术和Quantity One软件分析相结合检测普洱茶微生物群落结构和相对数量的方法。

背景技术

普洱茶产于我国云南，是以云南大叶种晒青毛茶为原料，经特殊后发酵过程生产而成的一类茶。普洱茶特殊的风味得以形成，与参与后发酵过程的微生物的酶促作用，以及微生物本身的次生代谢有关。因此，普洱茶中微生物群落结构和多样性的研究，对普洱茶特有品质的高持续稳定特性的实现与强弱等有着非常重要的作用。

目前，基因指纹技术和克隆文库方法等分子生物学技术子在普洱茶真菌群落结构的研究应用中越来越受到重视。国外，Michiharu等(MICHIHARU A，NAOHIRO T，YOSHITO I，et al.Characteristic fungi observed in the fermentation process for Puer tea[J].International Journalof Food Microbiology，2008，124：199-203)应用PCR-DGGE技术发现普洱茶中存在2种优势种群；在国内，张阳等(张阳，赵树欣，梁慧珍，等.普洱茶发酵过程中真菌群落结构的变化分析[J].中国酿造，2012，31(1)：122-125)也利用该技术分析了普洱茶不同发酵阶段的真菌多样性。然而，对普洱茶细菌群落结构的研究微乎其微，普洱茶发酵过程中及成品茶都含有大量细菌，其菌群的组成与变化和普洱茶品质的形成也有着密切的关系，仅研究真菌结构显然不够全面和系统。其次，国内外大多数研究中仅仅通过DGGE图谱分析微生物的群落结构，缺乏对微生物数量的同步量化分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于PCR-DGGE技术和Quantity One软件分析的普洱茶微生物群落结构和相对数量的检测方法。

本发明使用通用引物341F/518R和NS1/Fung分别对细菌16S rRNA V3区和真菌18SrRNA基因5′末端进行PCR扩增，利用DGGE技术获得细菌和真菌群落结构图谱，应用Quantity One软件分析细菌和真菌的相对数量，结合克隆筛选、测序的方法鉴定微生物种类。本方法为分析普洱茶中的微生物群落结构和相对数量提供了有效的检测方法，进而对研究功能微生物的作用和指导普洱茶发酵工艺改进提供了重要的参考依据。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种检测普洱茶微生物群落结构的方法，包括如下步骤：

1)玻璃珠震荡法收集茶叶样品的微生物菌体；

2)用液氮冻融、酶法和CTAB法相结合的方法提取茶叶上的微生物菌体总DNA：600μL细胞裂解液充分悬浮菌体沉淀，在液氮和65℃水浴锅中反复冻融4-6次，37℃水浴10min；加入30μL溶菌酶，37℃水浴30min；加30μL SDS溶液，6μL蛋白酶K，37℃水浴1～2h；于通风橱中加660μL的氯仿/异戊醇的混合液，所述氯仿/异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24∶1；于冰上放置5min，12000rpm离心5min，将上清液转移到新的无菌离心管中，直至上清液清澈透明，最后将上清液转入1.5mLEP管中；加入异丙醇和乙酸钠溶液，按体积比计算，所述的异丙醇和乙酸钠溶液体积分别为为上清液体积的0.6～0.8倍和0.1倍；轻轻混匀，于-20℃沉淀30min以上；12000rpm，离心5min，弃上清，加入1mL预冷的70％乙醇，12000rpm，离心5min，弃上清；自然风干沉淀，加入20～40μLTE溶液，使DNA溶解；

3)细菌16S rRNA和真菌18S rRNA的PCR扩增：分别使用16S rRNA V3区和对大多数真菌18S rRNA基因5′末端具有特异性的带GC发夹的通用引物对总DNA模板进行PCR扩增；PCR扩增体系为：DNA 1μL 20ng，25μL r Taq PCR Mix；每种引物各0.5μL；双蒸水补足50μL；细菌16S rRNA PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃45sec，65℃30sec，72℃1min，之后每一循环降0.5℃，20cycles；94℃45sec，55℃30sec，72℃1min，10cycles；72℃延伸10min；真菌18S rRNA PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃30sec，47℃45sec，72℃1min，循环30次，72℃延伸10min；

所述的细菌16S rRNA V3区通用引物为：SEQ ID NO 1；SEQ ID NO 3；对大多数真菌18S rRNA基因5′末端具有特异性的通用引物为：SEQ ID NO 4；SEQ ID NO 5；

4)DGGE分离、染色、扫描和软件分析：将步骤3)得到的PCR产物通过DGGE进行分离，其中丙烯酰胺凝胶质量浓度为8％，细菌和真菌的变性梯度范围分别为40％-60％、20％-40％；电泳条件为电压130～150V，60℃下电泳300～240min；采用银染法对胶片进行染色，显色后，将DGGE胶片通过扫描得到电子图谱；应用Quantity one软件打开DGGE电子图谱，利用compare lanes功能，选择图谱上的各个泳道，自动生成条带的信号强度分布图，对条带进行相对定量分析；

5)切胶回收条带DNA：用无菌小刀切割条带放入无菌离心管中，用50μL无菌去离子水清洗后，加入20μL TE溶液并于4℃静置过夜以释放条带中的DNA片段；对回收的DNA进行PCR扩增，细菌引物为：SEQ ID NO 2；SEQ ID NO 3；真菌引物为：SEQ ID NO 4；SEQ ID NO 6；产物按照DNA回收纯化试剂盒进行纯化后连接T载体，转入大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑选多个阳性克隆子进行菌落PCR扩增，细菌引物为：SEQ IDNO 1；SEQ ID NO 3；真菌引物为：SEQ ID NO 4；SEQ ID NO 5；

6)将步骤5)得到的菌落PCR扩增产物与步骤3)的PCR产物按照步骤4)同时进行DGGE分离和染色，通过对比图谱上的条带，步骤5)的PCR产物电泳条带与目的条带处于同一位置的则为目的条带PCR产物；目的条带PCR产物进行PCR扩增，细菌引物为：SEQ IDNO 2；SEQ ID NO 3；真菌引物为：SEQ ID NO 4；SEQ ID NO 6；产物送测序，将所得序列与GenBank中已知序列进行比对，确定条带对应的微生物的属分类。

相对于现有技术，本发明具有如下优点：

1)利用液氮冻融、酶法和CTAB法相结合的方法，可以同时提取普洱茶中细菌和真菌的总DNA，更加方便高效；

2)利用PCR-DGGE技术同时分析普洱茶细菌和真菌的群落结构，更加全面和系统地分析普洱茶的微生物结构；

3)本发明中同时对普洱茶的细菌和真菌群落结构进行PCR-DGGE分析，应用QuantityOne软件的compare lanes功能对DGGE电子图谱进行处理，自动生成各泳道条带的信号强度分布图，对条带对应的微生物进行相对定量分析，直观地表示普洱茶中不同微生物之间的数量对比和不同样品中同一微生物的数量变化，对进一步了解微生物的作用机理及其对普洱茶特有品质的高持续稳定特性的实现与控制等有着非常重要的意义。

附图说明

图1为实施例1普洱茶样品中细菌群落结构的DGGE图谱。

图2为实施例1应用Quantity One软件分析得到的普洱茶样品中细菌条带的信号强度分布图。

图3为实施例1普洱茶样品中细真菌群落结构的DGGE图谱。

图4为实施例1应用Quantity One软件分析得到的普洱茶样品中真菌条带的信号强度分布图。

图5为实施例2普洱茶发酵过程4个阶段细菌群落结构的DGGE图谱。

图6为实施例2应用Quantity One软件分析得到的普洱茶发酵过程4个阶段细菌条带的信号强度分布图。

图7为实施例2普洱茶发酵过程4个阶段真菌群落结构的DGGE图谱。

图8为实施例2应用Quantity One软件分析得到的普洱茶发酵过程4个阶段真菌条带的信号强度分布图。

图9为实施例3甲乙丙三种不同产地普洱茶细菌群落结构的DGGE图谱。

图10为实施例3应用Quantity One软件分析得到的甲乙丙三种不同产地普洱茶细菌条带的信号强度分布图。

图11为实施例3甲乙丙三种不同产地普洱茶真菌群落结构的DGGE图谱。

图12为实施例3应用Quantity One软件分析得到的甲乙丙三种不同产地普洱茶真菌条带的信号强度分布图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的保护范围并不局限于实施例的范围。

实施例1

一种检测普洱茶微生物群落结构和相对数量的方法，包括如下步骤：

1、以日常饮用的一款普洱茶产品为样品；

2、玻璃珠震荡法收集茶叶样品的微生物菌体：称取5g茶叶样品置于装有酸洗玻璃珠的45mL无菌磷酸盐缓冲液中，室温条件下，200rpm震荡2h；茶汤用无菌双层纱布过滤，滤液转入2ml EP管中，12000rpm离心3min，去上清液，用1mL无菌去离子水洗涤沉淀，12000rpm离心3min，得到的沉淀即茶叶上的微生物菌体；

3、微生物总DNA的提取：用液氮冻融+酶法和CTAB法相结合，600μL细胞裂解液充分悬浮菌体沉淀，在液氮和65℃水浴锅中反复冻融6次，37℃水浴10min；加入30μL溶菌酶，37℃水浴30min；加30μL SDS溶液，6μL蛋白酶K，37℃水浴1h；于通风橱中加等体积(660μL)的氯仿/异戊醇(V_氯仿∶V_异戊醇＝24∶1)的混合液，于冰上放置5min，12000rpm离心5min，将上清液转移到新的无菌离心管中，直至上清液清澈透明，最后将上清液转入1.5mL EP管中；加入0.6倍体积的异丙醇，1/10体积的乙酸钠，轻轻混匀，于-20℃沉淀30min以上；12000rpm，离心5min，弃上清，加入1mL预冷的70％乙醇，12000rpm，离心5min，弃上清；自然风干沉淀，加入30μLTE溶液，使DNA溶解。

4、细菌16S rRNA和真菌18S rRNA的PCR扩增：带GC发夹的细菌16S rRNA V3区通用引物GC-341F(CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCTACGGGAGGCAGCAG)，518R(ATTACCGCGGCTGCTGG)；带GC发夹的真菌18S rRNA基因5′末端通用引物NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)，GC-Fung(CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG)总DNA模板进行PCR扩增。PCR扩增体系为：DNA 1μL(约20ng)，25μL r Taq PCR Mix(Takara公司)；每种引物(20μM)各0.5μL；双蒸水补足50μL。细菌16S rRNA PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃45sec，65℃30sec，72℃1min，之后每一循环降0.5℃，20cycles；94℃45sec，55℃30sec，72℃1min，10cycles；72℃延伸10min；真菌18S rRNA PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃30sec，47℃45sec，72℃1min，循环30次，72℃延伸10min。

5、DGGE分离、染色、扫描和软件分析：将步骤4得到的PCR产物分别加入不同泳道通过DGGE电泳进行分离，电泳仪器为Bio-rad公司的Dcode基因突变检测系统；丙烯酰胺凝胶浓度为8％，细菌和真菌的变性梯度范围分别为40％-60％、20％-40％；电泳条件为电压130V，60℃下电泳300min；电泳结束后采用银染法对胶片进行染色，先加入固定液(10％乙醇，0.5％冰醋酸)，放置15min；倒掉固定液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入银染液(0.2％AgNO3，用之前加入200μl甲醛)中，放置在脱色摇床上振荡，染色15min；倒掉银染液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入显色液(1.5％NaOH，0.5％甲醛)显色。凝胶的颜色由透明变成浅黄色，条带开始逐渐出现，再变成茶色时，大部分条带都显现且清晰即可取出，用去离子水冲洗。对凝胶进行扫描保存为电子图谱。获得DGGE图谱，见附图1和3。应用Quantity one软件打开DGGE电子图谱，选择compare lanes功能，点击图谱上的各个泳道，自动生成条带的信号强度分布图，对条带进行相对定量分析；见附图2和4。

6、切胶回收条带DNA：用无菌小刀切割条带放入无菌离心管中，用50μL无菌去离子水清洗后，加入20μL TE溶液并于4℃静置过夜以释放条带中的DNA片段。对回收条带的DNA进行PCR扩增，细菌的引物为341F(CTACGGGAGGCAGCAG)，518R(ATTACCGCGGCTGCTGG)；真菌引物为NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)，Fung(ATTCCCCGTTACCCGTTG)。扩增体系和条件同步骤4。产物按照DNA回收纯化试剂盒进行纯化后连接T载体，转入大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑选多个阳性克隆子进行菌落PCR扩增，引物和扩增体系如步骤4，扩增条件中预变性延长为10min。

7、将步骤6得到的菌落PCR扩增产物与步骤4的PCR产物按照步骤5同时进行DGGE分离和染色，通过对比图谱上的条带，步骤6的PCR产物条带与目的条带处于同一位置的则为单纯的目的条带DNA。单纯的目的条带DNA进行PCR扩增，细菌的引物为341F(CTACGGGAGGCAGCAG)，518R(ATTACCGCGGCTGCTGG)；真菌引物为NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)，Fung(ATTCCCCGTTACCCGTTG)。产物送测序，将所得序列与GenBank中已知序列进行比对，获得条带对应的微生物的属分类，确定这款普洱茶细菌和真菌的种类。

附图1和3分别为实施例1普洱茶样品中细菌和真菌群落结构的DGGE图谱，结合步骤7测序结果可知，本方法检测到该普洱茶中有Staphylococcus kloosii，Lysinibacillus，Escherichia hermannii，Pseudomonas putida，Bacillus thermoamylovorans，Bacillus和Virgibacillus等7种细菌，还有Candida allociferrii，Aspergillus niger和Aspergillus clavatus 3种真菌。附图2和4是应用Quantity one软件中的compare lanes对细菌和真菌DGGE条带进行相对定量分析，这种分析利用条带的信号强度表示相对的微生物数量，但不能直接代表菌的数量。横坐标为条带相对位置，纵坐标为条带相对信号强度，曲线上的峰对应DGGE图谱中上的条带。由图2可知，该普洱茶细菌中，Staphylococcus kloosii和Virgibacillus数量最多，其次分别为Bacillus，Lysinibacillus，Pseudomonas putid，a Bacillus thermoamylovorans，Escherichia hermannii。同理，真菌数量由多到少依次为：Aspergillus clavatus，Aspergillusniger，Candida allociferrii。

实施例2

一种检测普洱茶发酵过程中微生物群落结构和相对数量的方法，包括如下步骤：

1、使用5点取样法对云南某普洱茶加工工厂发酵过程中的普洱茶进行采样，在普洱茶发酵翻堆前取表层和里层茶叶各10g，并在无菌封口袋中充分混匀，每6天翻堆一次，共采样4次。

2、玻璃珠震荡法收集发酵各阶段茶叶样品的微生物菌体：称取10g茶叶样品置于装有酸洗玻璃珠的40mL无菌磷酸盐缓冲液中，室温条件下，200rpm震荡1.5h；茶汤用无菌双层纱布过滤，滤液转入2ml EP管中，12000rpm离心3min，去上清液，用1mL无菌去离子水洗涤沉淀，12000rpm离心3min，得到的沉淀即茶叶上的微生物菌体；

3、微生物总DNA的提取：用液氮冻融+酶法和CTAB法相结合，600μL细胞裂解液充分悬浮菌体沉淀，在液氮和65℃水浴锅中反复冻融5次，37℃水浴10min；加入30μL溶菌酶，37℃水浴30min；加30μL SDS溶液，6μL蛋白酶K，37℃水浴1h；于通风橱中加等体积(660μL)的氯仿/异戊醇(V_氯仿∶V_异戊醇＝24∶1)的混合液，于冰上放置5min，12000rpm离心5min，将上清液转移到新的无菌离心管中，直至上清液清澈透明，最后将上清液转入1.5mL EP管中；加入0.8倍体积的异丙醇，1/10体积的乙酸钠，轻轻混匀，于-20℃沉淀30min以上；12000rpm，离心5min，弃上清，加入1mL预冷的70％乙醇，12000rpm，离心5min，弃上清；自然风干沉淀，加入20μLTE溶液，使DNA溶解。

4、细菌16S rRNA和真菌18S rRNA的PCR扩增：带GC发夹的细菌16S rRNA V3区通用引物GC-341F(CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCTACGGGAGGCAGCAG)，518R(ATTACCGCGGCTGCTGG)；带GC发夹的真菌18S rRNA基因5′末端通用引物NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)，GC-Fung(CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG)总DNA模板进行PCR扩增。PCR扩增体系为：DNA 1μL(约20ng)，25μL r Taq PCR Mix(Taka ra公司)；每种引物(20μM)各0.5μL；双蒸水补足50μL。细菌16S rRNA PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃45sec，65℃30sec，72℃1min，之后每一循环降0.5℃，20cycles；94℃45sec，55℃30sec，72℃1min，10cycles；72℃延伸10min；真菌18S rRNA PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃30sec，47℃45sec，72℃1min，循环30次，72℃延伸10min。

5、DGGE分离、染色、扫描和软件分析：将步骤4得到的PCR产物分别加入不同泳道通过DGGE电泳进行分离，电泳仪器为Bio-rad公司的Dcode基因突变检测系统；丙烯酰胺凝胶浓度为8％，细菌和真菌的变性梯度范围分别为40％-60％、20％-40％；电泳条件为电压150V，60℃下电泳240min；电泳结束后采用银染法对胶片进行染色，先加入固定液(10％乙醇，0.5％冰醋酸)，放置15min；倒掉固定液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入银染液(0.2％AgNO₃，用之前加入200μl甲醛)中，放置在脱色摇床上振荡，染色15min；倒掉银染液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入显色液(1.5％NaOH，0.5％甲醛)显色。凝胶的颜色由透明变成浅黄色，条带开始逐渐出现，再变成茶色时，大部分条带都显现且清晰即可取出，用去离子水冲洗。对凝胶进行扫描保存为电子图谱。获得DGGE图谱，见附图5和7。应用Quantity one软件打开DGGE电子图谱，选择compare lanes功能，点击图谱上的各个泳道，自动生成条带的信号强度分布图，对条带进行相对定量分析；见附图6和8。

6、切胶回收条带DNA：用无菌小刀将图谱上不同水平位置的条带切下放入无菌离心管中，用50μL无菌去离子水清洗后，加入20μL TE溶液并于4℃静置过夜以释放条带中的DNA片段。对回收条带的DNA进行PCR扩增，细菌的引物为341F(CTACGGGAGGCAGCAG)，518R(ATTACCGCGGCTGCTGG)；真菌引物为NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)，Fung(ATTCCCCGTTACCCGTTG)。扩增体系和条件同步骤4。产物按照DNA回收纯化试剂盒进行纯化后连接T载体，转入大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑选多个阳性克隆子进行菌落PCR扩增，引物和扩增体系如步骤4，扩增条件中预变性延长为10min。

7、将步骤6得到的菌落PCR扩增产物与步骤4的PCR产物按照步骤5同时进行DGGE分离和染色，通过对比图谱上的条带，步骤6的PCR产物条带与目的条带处于同一位置的则为单纯的目的条带DNA。单纯的目的条带DNA进行PCR扩增，细菌的引物为341F(CTACGGGAGGCAGCAG)，518R(ATTACCGCGGCTGCTGG)；真菌引物为NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)，Fung(ATTCCCCGTTACCCGTTG)，产物送测序，将所得序列与GenBank中已知序列进行比对，获得条带对应的微生物的属分类，确定普洱茶发酵过程中细菌和真菌的种类。

附图5和7分别为实施例2普洱茶样品发酵过程中细菌和真菌群落信息的DGGE图谱，其中，1、2、3、4分别代表一翻、二翻、三翻、四翻4个不同阶段的普洱茶微生物样品，由图可知各阶段细菌和真菌的群落结构不同，两者均在二翻时发生明显改变，各种菌的数量也随着发酵时间而变化。结合步骤7测序结果可知，本方法检测到该普洱茶发酵过程中有Staphylococcus kloosii，Lysinibacillus，Escherichia hermannii，Pseudomonas putida，Oceanobacillus sojae，Bacillus thermoamylovorans，Enterobacter，Bacillus，Pantoea rodasii，Virgibacillus和Bordetella 11种细菌，还有Arxula adeninivorans，Aspergillus niger和Aspergillusfumigatus 3种真菌。附图6和8是应用Quantity one软件中的compare lanes对细菌和真菌DGGE条带进行相对定量分析，这种分析利用条带的信号强度表示相对的微生物数量，但不能直接代表菌的数量。一翻、二翻、三翻和四翻4个阶段的泳道分别用1、2、3、4四条曲线表示，横坐标为条带相对位置，纵坐标为条带相对信号强度，曲线上的峰对应DGGE图谱中上的条带。由图6可知，该普洱茶的发酵前期，主要优势细菌为Staphylococcus kloosii，Lysinibacillus，Escherichia hermannii，Pseudomonas putida和Enterobacter，后期的主要优势细菌为Staphylococcus kloosii，Bacillus，Pantoea rodasii，Virgibacillus和Bordetella。Aspergillus niger和Arxula adeninivorans分别为发酵前期和后期的优势真菌。

实施例1相比，本实施例采用发酵过程不同阶段的普洱茶样品作为检测和分析对象，可以检测到发酵过程中细菌和真菌的群落结构和相对数量变化。

实施例3

一种检测不同产地普洱茶微生物群落结构和相对数量的方法，包括如下步骤：

1、从市面上选择三种甲、乙、丙不同产地的普洱茶产品为样品；

2、玻璃珠震荡法收集茶叶样品的微生物菌体：称取8g茶叶样品置于装有酸洗玻璃珠的42mL无菌磷酸盐缓冲液中，室温条件下，200rpm震荡1h；茶汤用无菌双层纱布过滤，滤液转入2ml EP管中，12000rpm离心3min，去上清液，用1mL无菌去离子水洗涤沉淀，12000rpm离心3min，得到的沉淀即茶叶上的微生物菌体；

3、微生物总DNA的提取：用液氮冻融+酶法和CTAB法相结合，600μL细胞裂解液充分悬浮菌体沉淀，在液氮和65℃水浴锅中反复冻融4次，37℃水浴10min；加入30μL溶菌酶，37℃水浴30min；加30μL SDS溶液，6μL蛋白酶K，37℃水浴1h；于通风橱中加等体积(660μL)的氯仿/异戊醇(V_氯仿∶V_异戊醇＝24∶1)的混合液，于冰上放置5min，12000rpm离心5min，将上清液转移到新的无菌离心管中，直至上清液清澈透明，最后将上清液转入1.5mL EP管中；加入0.7倍体积的异丙醇，1/10体积的乙酸钠，轻轻混匀，于-20℃沉淀30min以上；12000rpm，离心5min，弃上清，加入1mL预冷的70％乙醇，12000rpm，离心5min，弃上清；自然风干沉淀，加入20μLTE溶液，使DNA溶解。

5、DGGE分离、染色、扫描和软件分析：将步骤4得到的PCR产物分别加入不同泳道通过DGGE电泳进行分离，电泳仪器为Bio-rad公司的Dcode基因突变检测系统；丙烯酰胺凝胶浓度为8％，细菌和真菌的变性梯度范围分别为40％-60％、20％-40％；电泳条件为电压140V，60℃下电泳280min；电泳结束后采用银染法对胶片进行染色，先加入固定液(10％乙醇，0.5％冰醋酸)，放置15min；倒掉固定液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入银染液(0.2％AgNO₃，用之前加入200μl甲醛)中，放置在脱色摇床上振荡，染色15min；倒掉银染液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入显色液(1.5％NaOH，0.5％甲醛)显色。凝胶的颜色由透明变成浅黄色，条带开始逐渐出现，再变成茶色时，大部分条带都显现且清晰即可取出，用去离子水冲洗。对凝胶进行扫描保存为电子图谱。获得DGGE图谱，见附图9和11。应用Quantity one软件打开DGGE电子图谱，利用compare lanes功能，选择图谱上的各个泳道，自动生成条带的信号强度分布图，对条带进行相对定量分析；见附图10和12。

附图9和11分别为实施例3甲、乙、丙三种不同产地普洱茶样品细菌和真菌群落信息的DGGE图谱，由图可知三种普洱茶的微生物群落结构不尽相同，有共同的细菌和真菌种类，也有各自不同的种类。结合步骤7测序结果可知，本方法在甲乙丙三种普洱茶均检测到的细菌有Bacillus，甲、丙共有的细菌有Bacillus thermoamylovorans和Enterobacter，除此之外，Lysinibacillus、Pantoea rodasii和Pseudomonas putida为甲独有，Escherichia hermannii为乙独有，Staphylococcus kloosii，Virgibacillus和Bordetella为丙独有。本方法在甲、乙、丙三种普洱茶均检测到的真菌有Blastobotrys adeninivorans和Aspergillus niger，而乙还检测到Candida blankii，丙还检测到Aspergillus flavus。附图10和12是应用Quantity one软件中的compare lanes对细菌和真菌DGGE条带进行相对定量分析，这种分析利用条带的信号强度表示相对的微生物数量，但不能直接代表菌的数量。甲乙丙三个泳道的曲线如图所示，横坐标为条带相对位置，纵坐标为条带相对信号强度，曲线上的峰对应DGGE图谱中上的条带。由此可知，甲普洱茶的优势细菌为：Enterobacter和Bacillus；乙普洱茶的优势细菌为：Bacillus；丙普洱茶的优势细菌为：Staphylococcus kloosii，Bacillus thermoamylovorans，Bacillus和Bordetella。三种普洱茶的优势真菌均为Blastobotrys adeninivorans和Aspergillus niger。

实施例1和2相比，本实施例采用不同产地的普洱茶产品作为检测和分析对象，可以检测到不同产品中细菌和真菌的群落结构及差异和相对数量。

Claims

1.一种检测普洱茶微生物群落结构的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)玻璃珠震荡法收集茶叶样品的微生物菌体；

2.根据权利要求1所述的检测普洱茶微生物群落结构的方法，其特征在于，所述玻璃珠震荡法收集茶叶样品的微生物菌体的方法为：称取5～10g茶叶样品置于装有酸洗玻璃珠的45～40mL无菌磷酸盐缓冲液中，室温条件下，200rpm震荡1～2h；茶汤用无菌双层纱布过滤，滤液转入2ml EP管中，12000rpm离心3min，去上清液，用1mL无菌去离子水洗涤沉淀，12000rpm离心3min，得到的沉淀即茶叶上的微生物菌体。

3.根据权利要求1所述的检测普洱茶微生物群落结构的方法，其特征在于所述的细胞裂解液配方为：CTAB 30g/L、NaCl 1.0mol/L、EDTA 50mmol/L、Tris 250mmol/L，用稀盐酸调节pH至8.0；溶菌酶浓度为50mg/mL，SDS溶液浓度为10％，蛋白酶K浓度为20mg/mL，乙酸钠溶液浓度为3mol/L。

4.根据权利要求1所述的检测普洱茶微生物群落结构的方法，其特征在于，所述TE溶液的配方为：Tris-HCl 10mmol/L、EDTA 0.1mmol/L；用稀盐酸调节pH至8.0。

5.根据权利要求1所述的检测普洱茶微生物群落结构的方法，其特征在于，银染法的具体步骤如下：先加入固定液，按体积百分比计，所述固定液包括10％的乙醇，0.5％的冰醋酸，余量为水，放置15min；倒掉固定液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入银染液，按质量体积百分比计，所述银染液包括0.2％的AgNO₃，余量为水，用之前加入200μl 甲醛，放置在脱色摇床上振荡，染色15min；倒掉银染液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入显色液进行显色，按质量百分比计，所述的显色液包括1.5％的NaOH，0.5％甲醛，余量为水。