JP4252812B2 - 歯周病菌の定量方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定疾患の検出方法、さらに具体的には、歯肉炎、歯周炎等の、歯周疾患の検出方法に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
歯周疾患は、歯を支えているまわりの組織である、歯肉や歯槽骨等の病気であり、虫歯と異なり、ほとんど痛みがなく、気づかないうちに進行することが多い。しかしながら、放置すると、症状は進行し、やがて歯が抜けることとなる。
【０００３】
特に、近年の日本においては、食生活の欧米化が進み、比較的柔らかな食品を好む傾向や、精神的ストレスの増加等により、歯周疾患が起きる度合いが高まっている。
【０００４】
歯周疾患の対策としては、正しい歯磨きや、定期健診によるプラークコントロール、食生活の改善等の予防行為が挙げられるが、現実的には、進行しつつある歯周疾患をいかに的確に発見し、その症状に適した治療を行うか、というところが非常に重要なポイントとなっている。
【０００５】
歯周疾患の診断法としては、例えば、エックス線写真検査、プラーク付着検査、ポケット測定検査等が挙げられるが、特に、歯肉にのみ炎症が生じている、初期の歯肉炎の段階での発見は、担当した歯科医師の技量に依るところが大きいことは否定できない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
歯周疾患は、歯肉炎の段階であれば、正しい歯磨きや、歯石の除去により改善することが知られている。仮に、この初期段階の歯周疾患を、簡便、かつ、正確に検出し得る手段が提供されれば、歯周炎等の深刻な歯周疾患に罹患する危険性を低下させることが可能なはずである。
【０００７】
よって、本発明が解決すべき課題は、このような、被検者の負担が少なく、簡便、かつ、正確に、歯周疾患を検出する手段を提供することにあるが、特に、様々な歯周疾患の検出手段の中から、簡便に行うことができる唾液検査に的を絞り、従来よりも正確に、歯周疾患を検出することが可能な指標を見いだすことを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決するために、唾液検査における、歯周疾患検出のための適切な指標について検討したところ、唾液中の乳酸脱水素酵素（以下、ＬＤＨともいう）活性、唾液中の全菌数に対するPorphyromonas gingivalis（以下、Ｐ．ｇ．ともいう）の菌数の割合、および、同Bacteroides forsythus（以下、Ｂ．ｆ．ともいう）の菌数の割合、を指標とすることにより、歯周疾患を、簡便、かつ、正確に検出可能であることを見いだし、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、唾液中のＬＤＨ活性、唾液中の全菌数に対するＰ．ｇ．の菌数の割合、および、同Ｂ．ｆ．の菌数の割合、を指標として、歯周疾患を検出する、歯周疾患の検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。さらに本発明は、唾液中におけるＰ．ｇ．及び／又はＢ．ｆ．の菌体数を検出する方法において、これらの菌の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子をターゲット遺伝子として、リアルタイムＰＣＲ定量法を用いて当該菌体数の検出を行う歯周病菌の菌体数の検出方法であって、Ｐ．ｇ．の菌体数を検出するための遺伝子増幅用プライマーの一方の塩基配列を配列番号１で表される塩基配列とし、他方を配列番号２で表される塩基配列とすること、並びに、Ｂ．ｆ．の菌体数を検出するための遺伝子増幅用プライマーの一方を配列番号３で表される塩基配列とし、他方を配列番号４で表される塩基配列とすることを特徴とする、歯周病菌の菌体数の検出方法を提供する発明である。
【００１０】
なお、本発明において、「歯肉炎」とは、上述したように、歯肉にのみ炎症が生じたもので、歯根膜や歯槽骨までは冒されていない状態の歯周疾患のことを意味するものとする。また、「歯周炎」とは、歯槽骨が溶けはじめている状態以上に進行した歯周疾患を意味するものとする。臨床上は、これらの区別を、歯肉に形成されるポケットの程度（大きさと数）により判断することが多い。
【００１１】
【発明の実施の形態】
（１）本検出方法における検出指標であるＬＤＨは、歯周疾患が進行すると、歯肉細胞の破壊が起こり、唾液中のＬＤＨ濃度が上昇するために、歯周疾患の検出指標として有用であると考えられる。
【００１２】
唾液中のＬＤＨの検出方法は、既に知られている方法を用いることが可能であり、特に限定されないが、好適な方法として、比色法、酵素反応速度測定法等が挙げられる。
【００１３】
（２）また、本検出方法における検出指標である、唾液中の全菌数に対するＰ．ｇ．の菌数の割合（以下、Ｐ．ｇ．／Ｔｂともいう）が、歯周疾患の検出に有用であることは、未だに知られていない。
【００１４】
Ｐ．ｇ．自体は、進行した成人性歯周炎（慢性歯周炎）の病巣から、分離されることが知られている菌種である。
まず、唾液中の全菌数の算出は、例えば、計数法、抗体による発色法（例えば、特開昭６３−１５９７６２号公報等）、ＰＣＲ法を用いること等によって求めることが可能であるが、リアルタイムＰＣＲ定量法を用いることが、簡便、かつ、正確である。
【００１５】
すなわち、例えば、細菌類に広く共通する塩基配列を有する遺伝子の、この共通する塩基配列を増幅のターゲットとして、これを増幅するための増幅用プライマーを用いて、当該増幅ターゲット配列を増幅し、これにより得られる遺伝子増幅産物の量を基に、唾液中の全菌数を算出することができる。上記の共通する塩基配列としては、例えば、細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列を挙げることができる。この全菌数のＰＣＲ法による算出については、例えば、「Lyons,S.R.et al.,Journal of Clinical Microbiology38(6):2362-2365,2000」等を参照して行うことができる。
【００１６】
また、唾液中のＰ．ｇ．の菌数は、リアルタイムＰＣＲ定量法を用いて算出することが好適である。
すなわち、Ｐ．ｇ．に関して特徴的な遺伝子の塩基配列を増幅のターゲットとして、これを増幅するための増幅用プライマーを用いて、当該増幅ターゲット配列を増幅し、これにより得られる遺伝子増幅産物の量を基に、唾液中のＰ．ｇ．の菌数を算出することができる。
【００１７】
例えば、ターゲット遺伝子を、Ｐ．ｇ．の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（５７８〜６４５）６８ｂｐとして、
増幅用プライマーの一方を、
5'-GCGCTCAACGTTCAGCCT-3'（配列番号１）として、
他方を、
5'-CACGAATTCCGCCTGCC-3'（配列番号２）とすることで、所望のターゲット遺伝子を増幅することができる。
【００１８】
このようにして得られる、唾液中のＰ．ｇ．の菌数を、唾液中の全菌数で除して、本検出方法の指標の一つであるＰ．ｇ．／Ｔｂが得られる。
【００１９】
（３）また、本検出方法における検出指標である、唾液中の全菌数に対するＢ．ｆ．の菌数の割合（以下、Ｂ．ｆ．／Ｔｂともいう）が、歯周疾患の検出に有用であることは、未だに知られていない。
【００２０】
Ｂ．ｆ．は、歯周組織破壊の激しい部位で、高率に検出される菌種であり、深在性で活動性の歯周病の病巣で多く検出されることが知られている。
唾液中の全菌数の算出と、唾液中のＢ．ｆ．の菌数の算出は、上記のＰ．ｇ．の場合に準じて行うことができる。
【００２１】
例えば、増幅のターゲット遺伝子を、Ｂ．ｆ．の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（５６３〜７２４）１６２ｂｐとして、
増幅用プライマーの一方を、
5'-TGAAAGTTTGTCGCTTAACGATAAAA-3'（配列番号３）として、
他方を、
5'-TCGTGCTTCAGTGTCAGTTATACCT-3'（配列番号４）とすることで、所望のターゲット遺伝子を増幅することができる。
【００２２】
このようにして得られる、唾液中のＢ．ｆ．の菌数を、唾液中の全菌数で除して、本検出方法の指標の一つであるＢ．ｆ．／Ｔｂが得られる。
以上のようにして、被検者の唾液から得られる、本検出方法の検出指標である、（１）ＬＤＨ活性、（２）Ｐ．ｇ．／Ｔｂ、（３）Ｂ．ｆ．／Ｔｂを、被検者の歯周疾患の進行度に関連づけて、被検者の歯周疾患を検出することができる。
【００２３】
この関連付けの方法は、特に限定されず、あらゆる手法を用いることができる。
例えば、ロジスティック回帰分析の予測式による処理値を指標にして、この関連付けを行うことが好適である。
【００２４】
ロジスティック回帰分析の予測式とは、一般的には、式（１）
【００２５】
【数２】
［式中、Ｃは、定数を表し、ｘは、線形式を表す］
で表される、自然現象の解析に用いられる予測式である。
【００２６】
線形式ｘは、一般に、
ｘ＝ａ1ｔ1＋ａ2ｔ2＋・・・＋ａ0ｔ0
で表され、本発明におけるａ1〜ａ0は、各検出要素ｔ1〜ｔ0についてのオッズ比である。
【００２７】
この線形式に適用する検出要素がいかなる組み合わせが、歯周疾患の検出において有用であるかを検討したところ、本発明者は、（１）ＬＤＨ活性、（２）Ｐ．ｇ．／Ｔｂ、（３）Ｂ．ｆ．／Ｔｂの組み合わせが、その正確性と簡便性から最適であることを見いだした。なお、これ以外の要素を勘案することも可能であるが、１要素加わることは、診療費が嵩むことになり、この費用の増加に見合った正確性の向上を見込むことが困難な傾向がある。
【００２８】
具体的なオッズ比ａ1〜ａ0は、現実のモデル診断を行うことにより導き出すことができる。
このようにして、ロジスティック回帰分析の予測式により導き出される値であるｙを指標にして、「異常なし」、「歯肉炎」、「歯周炎」、さらには、「歯周炎」の程度（軽度、中等度、重度等）を検出することができる。
【００２９】
ただし、本検出方法を、医療現場で行う場合、口腔内の視診で、一見して判別することに熟練を要する、「歯肉炎」と「歯周炎」の区別を行い、初期の歯周炎に罹患している検出対象者を見逃さないことを目的として行われることが想定される。この意味で、本検出方法により検出される結果としては、検出対象者を、「異常なし」若しくは「歯肉炎」であるか、または、「歯周炎」であるか、を分類することができることが、最も本質的である。
【００３０】
本検出方法は、これを行う行程をアルゴリズムとして含むソフトウエアにより行うことが好適である。
この本検出方法を行うためのソフトウエアには、具体的なオッズ比ａ1〜ａ0が確定している、ロジスティック回帰分析の予測式（１）を、ＬＤＨ活性、Ｐ．ｇ．／Ｔｂ、および、Ｂ．ｆ．／Ｔｂの値に対して実行する行程と、その計算値ｙに応じた、歯周疾患の程度、例えば、「異常なし」若しくは「歯肉炎」であるか、または、「歯周炎」であるか、を導き出す行程が含まれていることが好適である。
【００３１】
かかるアルゴリズムは、適切なプログラム言語、例えば、機械語、アセンブラ言語等の低水準言語；Fortran、COBOL、BASIC、Ｃ等の手続型言語；RＰ．ｇ．、Prolog、LISP、APL、Smalltalk、Ｃ＋＋、JAVA（登録商標）等の非手続型言語等に従い、ソフトウエア化され、コンピュータ端末等のハードウエアに組み込まれて実行されることで、本発明を行うことができる。
【００３２】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を記載する。
モデルの内容
埼玉県内において、歯周疾患に関する集団検診を行い、この検診結果を、ロジスティック回帰分析の予測式により処理し、歯周疾患について伝統的な視診による確定診断を、習熟した歯科医師に従って行い、その結果に対し、この予測式により処理した結果が、どの程度の信頼性があるかを検討した。
【００３３】
１）検診の対象と内容：１３４名の成人男女に対して、ａ）飲食・歯磨きの習慣、ｂ）口腔内の様子、ｃ）生活習慣、ｄ）喫煙の状況、ｅ）その他、についての問診を行った上で、口腔内の検診を行った。この口腔内の検診において、歯肉に、４mm以上のポケットが認められる場合には、歯周炎と判断した。なお、ポケットが４mm未満である場合で、歯周に炎症が認められる場合には、歯肉炎と判断し、歯周に炎症が認められない場合には、異常なしと判断した。
【００３４】
さらに、その際、被検者の唾液を採取し、この唾液を検体として、所定の項目の検査を行った。
唾液検体に対する検査項目は、
ａ）ＧＯＴ（グルタミック・オキサロアセチック・トランスアミナーゼ）活性、ｂ）ＬＤＨ（ＬＤＨ１〜ＬＤＨ５の総活性和）活性、ｃ）ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）活性、ｄ）遊離ヘモグロビン、ｅ）総菌数、ｆ）ミュータンスレンサ球菌数、ｇ）Ｐ．ｇ．数、ｈ）Ｂ．ｆ．数、とした。各項目の検査は、ｂ）については、酵素反応速度測定法を用いた検査用キット（Ｌタイプワコー ＬＤＨ・Ｊ：和光純薬社製）で行い、ｅ）〜ｈ）については、上述したＰＣＲ法を用いた方法で行い、それ以外は、各方法を行うための市販の検査キットを用いて行った。
【００３５】
２）結果
各検査項目について、各検体の平均値を求め、さらに、常法により、ＲＯＣ曲線（縦軸：感度、横軸：１−特異度）を描き、感度と特異度のカットオフポイントを求めた。結果を、第１表に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
さらに、このカットオフポイントを基に、各々の検体の検査値を、陽性または陰性に区分けした。
これらの項目の中から、ＬＤＨ、Ｐ．ｇ．／Ｔｂ、および、Ｂ．ｆ．／Ｔｂの３因子を選択して、これらの３因子のオッズ数［Ｅｘｐ（Ｂ）］と、ロジスティック回帰分析の予測式の定数（Ｃ）を求めた。結果を、第２表に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】
この結果の小数点３位以下を四捨五入して、その値を、ロジスティック回帰分析の予測式（１）にあてはめると。
【００４０】
【数３】
［式中、Ｃは、定数を表し、ｘは、線形式を表す］において、線形式ｘが、
ｘ＝２．８３Ｐ．ｇ．＋０．５７Ｂ．ｆ．＋９．９９ＬＤＨ
［式中、Ｐ．ｇ．は、唾液中の全菌に対するPorphyromonas gingivalisの割合を表し、Ｂ．ｆ．は、唾液中の全菌に対するBacteroides forsythusの割合を表し、ＬＤＨは、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を表す］であり、かつ、定数Ｃが０．１０である］
と結論付けられる（なお、さらに、正確度を増すために、各要素のオッズ比の小数点以下の桁を増やすことも可能である）。
【００４１】
次に、計算値ｙについての、検出対象者を、「異常なし」若しくは「歯肉炎」であるか、または、「歯周炎」であるか、を分類することについてのカットオフポイントを算出すると、ｙ＝０．８６（オッズ比の小数点以下の桁を増やした場合は、０．８５９８５となる）となった。
【００４２】
よって、この具体的な、ロジスティック回帰分析式において、処理値ｙが、０．８６以上の場合は、「歯周炎」であるとして、同０．８６未満の場合には、「異常なし」若しくは「歯肉炎」であるとすることができることが明らかとなった。
【００４３】
なお、この最終的な計算式から、被験者からの唾液から得られる判定結果と、具体的な視診による判定結果を比較すると、驚くべきことに、８７．３％の確率で、歯周炎であるか否かの判定を行うことができることが判明した。
【００４４】
このように、本検出方法は、歯周疾患を検出する上で、極めて有用であることが明らかになった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、簡便、かつ、正確な、被験者の唾液検体を用いた、歯周疾患の判定方法が提供される。
【００４６】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定疾患の検出方法、さらに具体的には、歯肉炎、歯周炎等の、歯周疾患の検出方法に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
歯周疾患は、歯を支えているまわりの組織である、歯肉や歯槽骨等の病気であり、虫歯と異なり、ほとんど痛みがなく、気づかないうちに進行することが多い。しかしながら、放置すると、症状は進行し、やがて歯が抜けることとなる。
【０００３】
特に、近年の日本においては、食生活の欧米化が進み、比較的柔らかな食品を好む傾向や、精神的ストレスの増加等により、歯周疾患が起きる度合いが高まっている。
【０００４】
歯周疾患の対策としては、正しい歯磨きや、定期健診によるプラークコントロール、食生活の改善等の予防行為が挙げられるが、現実的には、進行しつつある歯周疾患をいかに的確に発見し、その症状に適した治療を行うか、というところが非常に重要なポイントとなっている。
【０００５】
歯周疾患の診断法としては、例えば、エックス線写真検査、プラーク付着検査、ポケット測定検査等が挙げられるが、特に、歯肉にのみ炎症が生じている、初期の歯肉炎の段階での発見は、担当した歯科医師の技量に依るところが大きいことは否定できない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
歯周疾患は、歯肉炎の段階であれば、正しい歯磨きや、歯石の除去により改善することが知られている。仮に、この初期段階の歯周疾患を、簡便、かつ、正確に検出し得る手段が提供されれば、歯周炎等の深刻な歯周疾患に罹患する危険性を低下させることが可能なはずである。
【０００７】
よって、本発明が解決すべき課題は、このような、被検者の負担が少なく、簡便、かつ、正確に、歯周疾患を検出する手段を提供することにあるが、特に、様々な歯周疾患の検出手段の中から、簡便に行うことができる唾液検査に的を絞り、従来よりも正確に、歯周疾患を検出することが可能な指標を見いだすことを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決するために、唾液検査における、歯周疾患検出のための適切な指標について検討したところ、唾液中の乳酸脱水素酵素（以下、ＬＤＨともいう）活性、唾液中の全菌数に対するPorphyromonas gingivalis（以下、Ｐ．ｇ．ともいう）の菌数の割合、および、同Bacteroides forsythus（以下、Ｂ．ｆ．ともいう）の菌数の割合、を指標とすることにより、歯周疾患を、簡便、かつ、正確に検出可能であることを見いだし、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、唾液中のＬＤＨ活性、唾液中の全菌数に対するＰ．ｇ．の菌数の割合、および、同Ｂ．ｆ．の菌数の割合、を指標として、歯周疾患を検出する、歯周疾患の検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。さらに本発明は、唾液中におけるＰ．ｇ．及び／又はＢ．ｆ．の菌体数を検出する方法において、これらの菌の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子をターゲット遺伝子として、リアルタイムＰＣＲ定量法を用いて当該菌体数の検出を行う歯周病菌の菌体数の検出方法であって、Ｐ．ｇ．の菌体数を検出するための遺伝子増幅用プライマーの一方の塩基配列を配列番号１で表される塩基配列とし、他方を配列番号２で表される塩基配列とすること、並びに、Ｂ．ｆ．の菌体数を検出するための遺伝子増幅用プライマーの一方を配列番号３で表される塩基配列とし、他方を配列番号４で表される塩基配列とすることを特徴とする、歯周病菌の菌体数の検出方法を提供する発明である。
【００１０】
なお、本発明において、「歯肉炎」とは、上述したように、歯肉にのみ炎症が生じたもので、歯根膜や歯槽骨までは冒されていない状態の歯周疾患のことを意味するものとする。また、「歯周炎」とは、歯槽骨が溶けはじめている状態以上に進行した歯周疾患を意味するものとする。臨床上は、これらの区別を、歯肉に形成されるポケットの程度（大きさと数）により判断することが多い。
【００１１】
【発明の実施の形態】
（１）本検出方法における検出指標であるＬＤＨは、歯周疾患が進行すると、歯肉細胞の破壊が起こり、唾液中のＬＤＨ濃度が上昇するために、歯周疾患の検出指標として有用であると考えられる。
【００１２】
唾液中のＬＤＨの検出方法は、既に知られている方法を用いることが可能であり、特に限定されないが、好適な方法として、比色法、酵素反応速度測定法等が挙げられる。
【００１３】
（２）また、本検出方法における検出指標である、唾液中の全菌数に対するＰ．ｇ．の菌数の割合（以下、Ｐ．ｇ．／Ｔｂともいう）が、歯周疾患の検出に有用であることは、未だに知られていない。
【００１４】
Ｐ．ｇ．自体は、進行した成人性歯周炎（慢性歯周炎）の病巣から、分離されることが知られている菌種である。
まず、唾液中の全菌数の算出は、例えば、計数法、抗体による発色法（例えば、特開昭６３−１５９７６２号公報等）、ＰＣＲ法を用いること等によって求めることが可能であるが、リアルタイムＰＣＲ定量法を用いることが、簡便、かつ、正確である。
【００１５】
すなわち、例えば、細菌類に広く共通する塩基配列を有する遺伝子の、この共通する塩基配列を増幅のターゲットとして、これを増幅するための増幅用プライマーを用いて、当該増幅ターゲット配列を増幅し、これにより得られる遺伝子増幅産物の量を基に、唾液中の全菌数を算出することができる。上記の共通する塩基配列としては、例えば、細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列を挙げることができる。この全菌数のＰＣＲ法による算出については、例えば、「Lyons,S.R.et al.,Journal of Clinical Microbiology38(6):2362-2365,2000」等を参照して行うことができる。
【００１６】
また、唾液中のＰ．ｇ．の菌数は、リアルタイムＰＣＲ定量法を用いて算出することが好適である。
すなわち、Ｐ．ｇ．に関して特徴的な遺伝子の塩基配列を増幅のターゲットとして、これを増幅するための増幅用プライマーを用いて、当該増幅ターゲット配列を増幅し、これにより得られる遺伝子増幅産物の量を基に、唾液中のＰ．ｇ．の菌数を算出することができる。
【００１７】
例えば、ターゲット遺伝子を、Ｐ．ｇ．の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（５７８〜６４５）６８ｂｐとして、
増幅用プライマーの一方を、
5'-GCGCTCAACGTTCAGCCT-3'（配列番号１）として、
他方を、
5'-CACGAATTCCGCCTGCC-3'（配列番号２）とすることで、所望のターゲット遺伝子を増幅することができる。
【００１８】
このようにして得られる、唾液中のＰ．ｇ．の菌数を、唾液中の全菌数で除して、本検出方法の指標の一つであるＰ．ｇ．／Ｔｂが得られる。
【００１９】
（３）また、本検出方法における検出指標である、唾液中の全菌数に対するＢ．ｆ．の菌数の割合（以下、Ｂ．ｆ．／Ｔｂともいう）が、歯周疾患の検出に有用であることは、未だに知られていない。
【００２０】
Ｂ．ｆ．は、歯周組織破壊の激しい部位で、高率に検出される菌種であり、深在性で活動性の歯周病の病巣で多く検出されることが知られている。
唾液中の全菌数の算出と、唾液中のＢ．ｆ．の菌数の算出は、上記のＰ．ｇ．の場合に準じて行うことができる。
【００２１】
例えば、増幅のターゲット遺伝子を、Ｂ．ｆ．の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（５６３〜７２４）１６２ｂｐとして、
増幅用プライマーの一方を、
5'-TGAAAGTTTGTCGCTTAACGATAAAA-3'（配列番号３）として、
他方を、
5'-TCGTGCTTCAGTGTCAGTTATACCT-3'（配列番号４）とすることで、所望のターゲット遺伝子を増幅することができる。
【００２２】
このようにして得られる、唾液中のＢ．ｆ．の菌数を、唾液中の全菌数で除して、本検出方法の指標の一つであるＢ．ｆ．／Ｔｂが得られる。
以上のようにして、被検者の唾液から得られる、本検出方法の検出指標である、（１）ＬＤＨ活性、（２）Ｐ．ｇ．／Ｔｂ、（３）Ｂ．ｆ．／Ｔｂを、被検者の歯周疾患の進行度に関連づけて、被検者の歯周疾患を検出することができる。
【００２３】
この関連付けの方法は、特に限定されず、あらゆる手法を用いることができる。
例えば、ロジスティック回帰分析の予測式による処理値を指標にして、この関連付けを行うことが好適である。
【００２４】
ロジスティック回帰分析の予測式とは、一般的には、式（１）
【００２５】
【数２】
で表される、自然現象の解析に用いられる予測式である。
【００２６】
線形式ｘは、一般に、
ｘ＝ａ1ｔ1＋ａ2ｔ2＋・・・＋ａ0ｔ0
で表され、本発明におけるａ1〜ａ0は、各検出要素ｔ1〜ｔ0についてのオッズ比である。
【００２７】
この線形式に適用する検出要素がいかなる組み合わせが、歯周疾患の検出において有用であるかを検討したところ、本発明者は、（１）ＬＤＨ活性、（２）Ｐ．ｇ．／Ｔｂ、（３）Ｂ．ｆ．／Ｔｂの組み合わせが、その正確性と簡便性から最適であることを見いだした。なお、これ以外の要素を勘案することも可能であるが、１要素加わることは、診療費が嵩むことになり、この費用の増加に見合った正確性の向上を見込むことが困難な傾向がある。
【００２８】
具体的なオッズ比ａ1〜ａ0は、現実のモデル診断を行うことにより導き出すことができる。
このようにして、ロジスティック回帰分析の予測式により導き出される値であるｙを指標にして、「異常なし」、「歯肉炎」、「歯周炎」、さらには、「歯周炎」の程度（軽度、中等度、重度等）を検出することができる。
【００２９】
ただし、本検出方法を、医療現場で行う場合、口腔内の視診で、一見して判別することに熟練を要する、「歯肉炎」と「歯周炎」の区別を行い、初期の歯周炎に罹患している検出対象者を見逃さないことを目的として行われることが想定される。この意味で、本検出方法により検出される結果としては、検出対象者を、「異常なし」若しくは「歯肉炎」であるか、または、「歯周炎」であるか、を分類することができることが、最も本質的である。
【００３０】
本検出方法は、これを行う行程をアルゴリズムとして含むソフトウエアにより行うことが好適である。
この本検出方法を行うためのソフトウエアには、具体的なオッズ比ａ1〜ａ0が確定している、ロジスティック回帰分析の予測式（１）を、ＬＤＨ活性、Ｐ．ｇ．／Ｔｂ、および、Ｂ．ｆ．／Ｔｂの値に対して実行する行程と、その計算値ｙに応じた、歯周疾患の程度、例えば、「異常なし」若しくは「歯肉炎」であるか、または、「歯周炎」であるか、を導き出す行程が含まれていることが好適である。
【００３１】
かかるアルゴリズムは、適切なプログラム言語、例えば、機械語、アセンブラ言語等の低水準言語；Fortran、COBOL、BASIC、Ｃ等の手続型言語；RＰ．ｇ．、Prolog、LISP、APL、Smalltalk、Ｃ＋＋、JAVA（登録商標）等の非手続型言語等に従い、ソフトウエア化され、コンピュータ端末等のハードウエアに組み込まれて実行されることで、本発明を行うことができる。
【００３２】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を記載する。
モデルの内容
埼玉県内において、歯周疾患に関する集団検診を行い、この検診結果を、ロジスティック回帰分析の予測式により処理し、歯周疾患について伝統的な視診による確定診断を、習熟した歯科医師に従って行い、その結果に対し、この予測式により処理した結果が、どの程度の信頼性があるかを検討した。
【００３３】
１）検診の対象と内容：１３４名の成人男女に対して、ａ）飲食・歯磨きの習慣、ｂ）口腔内の様子、ｃ）生活習慣、ｄ）喫煙の状況、ｅ）その他、についての問診を行った上で、口腔内の検診を行った。この口腔内の検診において、歯肉に、４mm以上のポケットが認められる場合には、歯周炎と判断した。なお、ポケットが４mm未満である場合で、歯周に炎症が認められる場合には、歯肉炎と判断し、歯周に炎症が認められない場合には、異常なしと判断した。
【００３４】
さらに、その際、被検者の唾液を採取し、この唾液を検体として、所定の項目の検査を行った。
唾液検体に対する検査項目は、
ａ）ＧＯＴ（グルタミック・オキサロアセチック・トランスアミナーゼ）活性、ｂ）ＬＤＨ（ＬＤＨ１〜ＬＤＨ５の総活性和）活性、ｃ）ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）活性、ｄ）遊離ヘモグロビン、ｅ）総菌数、ｆ）ミュータンスレンサ球菌数、ｇ）Ｐ．ｇ．数、ｈ）Ｂ．ｆ．数、とした。各項目の検査は、ｂ）については、酵素反応速度測定法を用いた検査用キット（Ｌタイプワコー ＬＤＨ・Ｊ：和光純薬社製）で行い、ｅ）〜ｈ）については、上述したＰＣＲ法を用いた方法で行い、それ以外は、各方法を行うための市販の検査キットを用いて行った。
【００３５】
２）結果
各検査項目について、各検体の平均値を求め、さらに、常法により、ＲＯＣ曲線（縦軸：感度、横軸：１−特異度）を描き、感度と特異度のカットオフポイントを求めた。結果を、第１表に示す。
【００３６】
【表１】
さらに、このカットオフポイントを基に、各々の検体の検査値を、陽性または陰性に区分けした。
これらの項目の中から、ＬＤＨ、Ｐ．ｇ．／Ｔｂ、および、Ｂ．ｆ．／Ｔｂの３因子を選択して、これらの３因子のオッズ数［Ｅｘｐ（Ｂ）］と、ロジスティック回帰分析の予測式の定数（Ｃ）を求めた。結果を、第２表に示す。
【００３８】
【表２】
この結果の小数点３位以下を四捨五入して、その値を、ロジスティック回帰分析の予測式（１）にあてはめると。
【００４０】
【数３】
ｘ＝２．８３Ｐ．ｇ．＋０．５７Ｂ．ｆ．＋９．９９ＬＤＨ
［式中、Ｐ．ｇ．は、唾液中の全菌に対するPorphyromonas gingivalisの割合を表し、Ｂ．ｆ．は、唾液中の全菌に対するBacteroides forsythusの割合を表し、ＬＤＨは、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を表す］であり、かつ、定数Ｃが０．１０である］
と結論付けられる（なお、さらに、正確度を増すために、各要素のオッズ比の小数点以下の桁を増やすことも可能である）。
【００４１】
次に、計算値ｙについての、検出対象者を、「異常なし」若しくは「歯肉炎」であるか、または、「歯周炎」であるか、を分類することについてのカットオフポイントを算出すると、ｙ＝０．８６（オッズ比の小数点以下の桁を増やした場合は、０．８５９８５となる）となった。
【００４２】
よって、この具体的な、ロジスティック回帰分析式において、処理値ｙが、０．８６以上の場合は、「歯周炎」であるとして、同０．８６未満の場合には、「異常なし」若しくは「歯肉炎」であるとすることができることが明らかとなった。
【００４３】
なお、この最終的な計算式から、被験者からの唾液から得られる判定結果と、具体的な視診による判定結果を比較すると、驚くべきことに、８７．３％の確率で、歯周炎であるか否かの判定を行うことができることが判明した。
【００４４】
このように、本検出方法は、歯周疾患を検出する上で、極めて有用であることが明らかになった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、簡便、かつ、正確な、被験者の唾液検体を用いた、歯周疾患の判定方法が提供される。
【００４６】
【配列表】
Claims (1)
- 唾液中におけるPorphyromonas gingivalis及び／又は Bacteroides forsythusの菌体数を検出する方法において、これらの菌の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子をターゲット遺伝子として、リアルタイムＰＣＲ定量法を用いて当該菌体数の検出を行う歯周病菌の菌体数の検出方法であって、 Porphyromonas gingivalis の菌体数を検出するための遺伝子増幅用プライマーの一方の塩基配列を配列番号１で表される塩基配列とし、他方を配列番号２で表される塩基配列とすること、並びに、 Bacteroides forsythus の菌体数を検出するための遺伝子増幅用プライマーの一方を配列番号３で表される塩基配列とし、他方を配列番号４で表される塩基配列とすることを特徴とする、歯周病菌の菌体数の検出方法。
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