KR20130044217A - 녹농균 혈청형 분석법 및 키트 및 상기 방법 및 키트에 유용한 올리고뉴클레오타이드 서열들 - Google Patents

녹농균 혈청형 분석법 및 키트 및 상기 방법 및 키트에 유용한 올리고뉴클레오타이드 서열들 Download PDF

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미카엘 루돌프
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켄타 바이오테크 아게
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Abstract

본 발명은 종 및 혈청형 특이적으로 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 민감하고 믿을 수 있으며 빠른 검출을 위하여 녹농균 분석법을 위한 올리고뉴클에오타이드, 키트 및 분석법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 녹농균의 혈청형 특이적 분석법, 녹농균의 혈청형 특이적 검출용 키트 및 상기 분석법 또는 키트에 이용되는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 추가적으로 상기 분석법 및 키트분석 법 및 키트를 이용하여 특이적 녹농균 혈청형이 검출된 환자에서 녹농균 혈청형 특이적 치료를 위한 녹농균 혈청형 특이적 항체에 관한 것이다.

Description

녹농균 혈청형 분석법 및 키트 및 상기 방법 및 키트에 유용한 올리고뉴클레오타이드 서열들{Assays and kits for serotyping Pseudomonas aeruginosa and oligonucleotide sequences useful in such methods and kits}
본 발명은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 혈청형 특이적 검출 분석법, 녹농균 혈청형 특이적 검출 키트 및 상기 분석법 또는 키트 유용한 올리고뉴크레오타이드(oligonucleotides)서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 녹농균 혈청형으로 유발된 질환으로부터 고통받는 환자에 있어서 녹농균 감염의 혈청형 특이적 치료를 위한 녹농균 혈청형 특이적 항체에 용도에 관한 것이다.
녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 신선한 토양과 물속에서 흔하게 발견되는 그람 음성 환경 박테리아다. 이것은 항체를 이용한 항원특이적 결합작용과 포식작용에 의해서 병원체를 제거하는 면역 능력이 있는 숙주에는 위협적이지 않은 전통적인 기회감염성(opportunistic)의 병원체이다. 그러나 낭포성섬유증(cystic fibrosis) 환자들과 화상 피해자, 공개기도를 유지하기 위해 중점관리 기구를 삽관한 환자들, 암 환자, 후천성면역결핍증(AIDS) 환자들을 포함하는 면역이 결핍된 사람들과 장기 이식한 환자들에게는 녹농균 감염과 같은 병원 혹은 기인성 감염이 높은 위험성을 갖는다. 이러한 환자들의 급성 감염은 녹농균에 의한 폐렴(ventilator-associated pneumonia;(VAP))으로 기인한 사망률이 30-50%로 급속하게 치명적인 예후를 보인다. 심지어 더욱 중요한 것은 항생제 내성을 지닌 녹농균의 저항성은 의미있게 증가하고 있다. 제3세대 광범위 항생제 세팔로포린인 계열(ceftazidime)에 내성을 지닌 녹농균의 분리율이 1995년 12%에서 2001년 29%로 증가했다. 1975년에는 하루에 1000명의 환자 가운데 7.2명에서 1995년에는 하루에 1000명당 9.8명으로 증가하는 모든 기인성 감염의 34%가 메스실린 내성 황색 포도상 구균(methicillin - resistant S. aureus;(MRSA)), 반코마이신 내성 락트산 세균(vancomycin - resistant enterococci;(VRE)) 및 녹농균이 원인이다. 대단히 자주 관찰되는 기인성 감염의 형태가 혈액감염과 폐렴이다.
항생제 내성의 증가에 있어서, 녹농균 감염에 대응하는 수동적인 면역치료를 위한 인간 단일 항체의 이용은 새로운 유력한 접근방식이다. 이것은 녹농균에 의해 유발되는 감염을 대항하는 특이적 대응에 중요한 매개체로 작용하는 그람 음성 박테리아의 표면에 있는 중요한 요소인 O-항원 특이적 탄수화물을 표적으로 하는 항체다. 외부 탄수화물 층(O-항원)이 혈청형마다 다른 것처럼 몇 가지의 혈청형 특이적 항체는 녹농균의 감염에 대항하는 광범위한 대응을 제공하는 것이 필요하다.
녹농균의 혈청형의 각기 다른 형태를 구별하는 수 많은 방법들이 있다. 일반적으로 O-항원 특이적 지질 당쇄(lipopolysaccharide-(LPS-))와 연관된 탄수화물의 혈청학적 특성에 근거하는 국제 항원 구별 방법(International Antigenic Typing Scheme;(IATS))이 있고 적어도 20개의 각기 다른 O-항원 혈청형으로 구분되는 방법이 있다. 기인성 녹농균 감염의 대다수는 어떤 혈청형과 연관된 것으로 보인다. 비록 다양한 국가들에서 혈청형들의 발병률에 관한 역학적 조사들에서 녹농균 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 IATS-02, IATS-05, IATS-016를 포함하는 혈청군 2가 유행하고 있지만 임상적인 녹농균 분리율이 70%이상을 차지한다.
O-항원형 특이적, 및 혈청 특이적 항체로 녹농균 감염으로부터 고통받는 환자들을 치료하기 위하여, 항체 치료 전에 감염되는 녹농균 균주의 혈청형을 결정하는 것이 기본적으로 필요하다. 녹농균 감염의 검출을 위해서 전통적인 녹농균 배양법으로 검출하기 위해서는 2일 이상 걸린다. 불행하게도 혈청형의 구분은 세균 군집의 모양, 크기 그리고 형태로 구분할 수 없다. 혈청학적 방법은 혈청형의 애매한 구분으로 인한 유의적인 실폐율을 가진다. 예를 들면, 슬라이드 응집에 기초한 혈청형 판단은 실험자의 이해 정도와 경험에 강하게 의존하는 방법들이어서 결과를 도출하기 위해서는 시간이 필요한 방법이며 더욱이 녹농균 균주들의 자가 응집(self-agglutinating) 또는 비응집(non-agglutinating)으로 인한 제한이 있다.
검출 키트 시장의 대부분의 관련된 혈청형 검출 키트는 녹농균 균주들이 자가 응집 또는 비응집 균주이기 때문에, 비정형으로 분류되어 거의 30%의 실폐율이 있다. 표준 미생물 분석법과 같은 방법은 녹농균의 구분에 있어서 다소 제한된 방법이고 세부 혈청형에 있어서 적절한 시간이 필요한 방법이다. 항생제 내성을 지닌 녹농균 균주들에 의해 유발된 감염으로 고통받는 환자들에 있어서, 혈청형 구분을 위한 시간은 매우 중요하다. 감염의 지속은 사망률을 현저히 증가시키기 때문이다.
그 결과, 빠른 혈청형 결정의 방법은 진단과 혈청형 항체 치료 사이의 시간을 줄이기 위하여 고도의 치료에 필요하다.
최근에, 바이오칩과 같은 분자적 검출, 마이크로어레이 또는 PCR을 이용한 방법들이 빠른 녹농균과 기인성 감염에 원인이 되는 다른 박테리아 종들의 구별을 위한 일반적인 방법이다. 이러한 특정 유전자들을 포함하는 방법들의 규정들은 종 특이적인 고유 서열들을 사용한다. 현재까지 많은 PCR을 기초한 방법들은 예를 들어 16S rRNA 또는 23S rRNA와 같은 지역에 특이적으로 어닐링되는 올리고 뉴클레오타이드를 이용한 계통학적 그리고 기능적인 유전자들과 연관된 방법이다. 그러나 이러한 종 특이적인 분석법을 가지고 어떤 혈청형은 구별할 수 없다.
US20080026370은 올리고뉴클레오타이드 탐지자들은 바이오칩 또는 마이크로어레이 혼성화 분석법에서 녹농균의 유전형 그리고 병원성형(pathotyping)에 유용항을 개시하고 있다. 혈청형 분석 방법은 개시되어 있지 않다.
W09741234은 녹농균의 LPS O-항원 유전자 군집에 속한 다양한 유전자들의 특성화를 개시하고 있다. PsbM (WbpM)또는 PsbN (WbpN)을 코드화하는 뉴클레오타이드 서열들로 포함하는 핵산 분자들의 증폭이 가능한 프라이머를 표본에 처리하는 단계를 포함하는 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 혈청형들 O1 내지 O20을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 다양한 녹농균 혈청형의 믿을 수 있는 식별에 사용되는 특이적 올리고뉴클레어타이드 서열들은 개시되어 있지 않다.
이에, 특정한 녹농균 혈청형을 구별하는 기술로 알려진 방법들에서 하기와 같은 많은 결점을 나타낸다:
녹농균 혈청형의 미생물학적 분석은 시간이 필요하고 자가 응집 또는 비응집하는 녹농균 균주들에 의해서 제한받는다. 일반적으로 박테리아 균주들에 유전형과 혈청형을 위한 알려진 분자적 방법들은 믿을 수 있는 구별과 박테리아 종들을 구별하는 것에 사용할 수 없다. 비록 몇몇 유전자들은 라이보좀 유전자들(16S rDNA, 23S rDNA)과 같은 다양한 종간 공통부분을 공유하지만 하나의 박테리아 종에 있어서 믿을 수 있는 구별과 혈청형 구별을 위한 유전자를 대표하는 보존된 올리고뉴클래오타이드 서열로는 사용할 수 없다.
그래서, 박테리아 종과 가장 일반적인 녹농균 혈청형에 특이적인 녹농균 혈청형의 빠르고 믿을 수 있는 검출법이 의료에 고도로 요구되고 있다. 박테리아 군집화(103-6 cfu/ml)와 녹농균 박테리아 감염(106 cfu/ml) 사이의 구별은 적어도 절대치 6 단계의 범위 이상으로 정해져야 한다. 주형 농도의 폭 넓은 범위 이상의 녹농균 혈청형의 믿을 수 있는 검출 분석법의 필요가 조금 더 요구되기 때문이다.
각각의 분석법의 프라이머 및 탐지자 쌍은 서로 영향을 미치기 때문에 종종 임상적인 불확실한 검출 제한을 수반하므로 한 번의 반응으로 몇 가지의 녹농균 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 혈청군 2의 동시 검출이 기술적으로 요구된다.
놀랍게도, 본 발명은 혈청형 특이적인 프라이머들을 사용해서 녹농균 종의 믿을 수 있고 빠르게 구별할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 이용한 분석법 및 키트 및 상기 올리고뉴클레오타이드를 확인하였다.
도 1은 LightCycler를 바탕으로 이용한 융해점 커브 분석에 의한 양성 혈청형 검출후에 4가(4-valent)의 녹농균 혈청형 시험 결과 분석을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 검출한 융해 정점(Tm) 값의 재현성을 나타낸 도면이다.
도 3은 비 기능적인 프라이머와 탐지자의 조합들의 전형적인 융해 정점(Tm) 값을 나타낸 도면이다.
따라서, 본 발명은 기술적 문제에 있어서 빠르고 정확한 감도가 좋고 믿을 수 있는 임상적으로 많이 유행하고 있는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 혈청형의 특이적 결정을 위한 방법을 제공한다.
상기의 기술적 문제는 하기와 같이 정의된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 분석법 및 키트 및 올리고뉴클레오타이드를 제공하여 해결한다:
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 샘플에서 녹농균의 혈청형 특이적 검출 분석법을 제공한다:
a) 하기의 적어도 한쌍의 녹농균 혈청형 프라이머들로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 프라이머를 이용한 샘플에서 표적 염기 서열에 대한 적어도 한쌍의 녹농균 혈청형 프라이머들의 어닐링(anneling, 풀림)단계.
(i) 서열번호 1로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 이루어진 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 2로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 이루어진 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머,
(ii) 서열번호 3으로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 이루어진 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 4로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 이루어진 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머,
(iii) 서열번호 5로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 이루어진 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 이루어진 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머,
(iv) 서열번호 7로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 이루어진 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 8로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 이루어진 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 및
b) 표적 핵산을 증폭하는 단계, 및
c) 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계.
본 발명에서 "녹농균 혈청형(Pseudomonas aeruginosa serotype)"이라는 용어는 혈청형의 특이성의 원인이 되는 녹농균 외부 탄수화물 지질 당쇄(LPS)의 구성요소인 특정 O-항원의 표현을 의미하는 것으로 사용한다. 이들 박테리아에서 달리 분리된 녹농균의 특정 O-항원이 있는 상기 외부의 탄수화물층은 주목할 만큼 다양하다. O-항원의 차이로 기초한 혈청형이 적어도 20개의 다른 혈청형이 존재한다(Rivera et al., 1992). 많이 유행되는 녹농균의 혈청형은 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 혈청군 2(IATS-02, IATS-05, IATS-016)이다.
본 발명에서 "혈청형 특이적인 검출(serotype-specific detection)"이라는 용어는 상기에 정의된 가장 일반적인 녹농균 혈청형의 하나 또는 그 이상에서 구별과 검출을 의미하는 것으로 사용한다. 본 발명에 있어서, 검출은 샘플에서 목표물을 증폭하는 기술들에 의한 분석을 수행한다. 상기와 같이 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction(PCR)) 또는 접합효소연쇄반응(ligase chain reaction(LCR)) 기초 기술을 포함하는 수많은 증폭 기술은 선행 기술에 개시되어있다. 상기 어떠한 증폭기술의 사용은 당업자에게 통상적인 작업이고 상기 기술들은 적절한 증폭 기술 중에서 적합한 예시로 제시한다. 바람직한 유전자 증폭 기술은 PCR이고, 좀더 바람직하게는 실시간 PCR(real-time PCR)이고, 가장 바람직하게는 다중 실시간 PCR(multiplex real-time PCR) 또는 LightCycler에 기초한 실시간 다중 PCR(LightCycler-based real-time (multiplex) PCR )이다.
본 발명에서 "프라이머(primer)", "올리고뉴클레오타이드 프라이머(oligonucleotide primer)" 또는 "프라이머 쌍(primer pair)"이란 용어는 상기에 언급된 증폭 기술에 있어서 DNA 표적 서열에 증폭에 사용되는 짧은 뉴클레오타이드일반적으로는 10-50bp, 바람직하게 15-35bp들을 의미하는 것으로 사용한다. 상기 프라이머들에 있어서 본 발명은 서열번호 1 내지 8의 어떤 뉴클레오타이드에서 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35 연속적인 뉴클레오타이드들을 포함하는 분자들이다. 상기 프라이머들 또는 올리고뉴클레오타이드 프라이머들을 예를 들면 포스포트리에스테르 그리고 포스포디에스터 방법(phosphotriester and phosphodiester methods)(Gait et al., 1980) 또는 자동화 기술(automated techniques)(Conolly, 1987)과 같이 공지된 기술을 사용해서 생산된 것을 의미한다.
본 발명에서 "녹농균 혈청형 특이적 프라이머(Pseudomonas aeruginosa serotype-specific primer)"용어는 예를 들면 O-항원 부위같은 혈청형 특이적인 표적 DNA 부위에 연관되거나 상보적인 핵산 서열에 요구되는 증폭 조건 하에서 합성 개시점으로 작용 가능한 프라이머들을 의미한다. 뉴클레오타이드 기질들의 존재하에서 상기의 프라이머의 합성 산물에 필요한 조건은 DNA 중합효소 그리고 적합한 온도와 산도(pH)와 같은 중합화 단계에 필요한 반응물들이다. 바람직하게, 상기 프라이머들은 상기 프라이머의 복제물에 염기 쌍을 이루지 않고 머리 핀과 같은 구조형성을 하지 않는 핵산 서열들이다. 상기 프라이머의 길이는 대략 10-50 뉴클레오타이드 사이고, 바람직하게는 약 15-35 뉴클레오타이드 길이다.
본 발명은 상기 검출하는 단계에 적어도 한 쌍의 녹농균 혈청형 특이적 혼성화 탐지자를 상기 단계 a)의 결합하는 단계를 수행하기 위해 선별된 적어도 한 쌍의 녹농균 혈청형 특이적 프라이머 쌍에 결합되는 내부 서열에 혼성화하는 단계를 추가적으로 포함하는 분석법을 제공한다. 혼성화 기술들은 하기 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.가 집필한 분자적 클로닝, 실험실 메뉴얼(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989 (Nolan C, Ed.), 뉴욕)에 보기로 설명되어있고, 당 업계에 잘 알려진 기술이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 단계 a)의 결합하는 단계를 수행하기 위해 선별되는 적어도 하나의 녹농균 혈청형 특이적 프라이머 쌍과 결합하는 서열 내부에 혼성화하는 적어도 한 쌍의 녹농균 혈청형 특이적 혼성화 탐지자는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
(1) 서열번호 9로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 10으로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자,
(2) 서열번호 11로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 12로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자,
(3) 서열번호 13으로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 14로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자, 및
(4) 서열번호 15로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 16으로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자.
본 발명에서 "탐지자(probe)", "올리고뉴클레오타이드 탐지자(oligonucleotide probe)", "혼성화 탐지자(hybridization probe)"라는 용어는 적어도 혼성화에 의해서 증폭된 표적 뉴클레오타이드 서열을 검출 할 수 있는 어떤 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명에서 상기와 같은 탐지자는 짧은 뉴클레오타이드 일반적으로 10-50 bp, 바람직하게는 15-35 bp들을 말한다. 본 발명에서 탐지자는 서열번호 9에서 16로 기재된 어떤 핵산 서열의 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35의 연속적인 뉴클레오타이드들로 포함하는 분자이다.상기의 탐지자 또는 올리고뉴클레오타이드 탐지자는 공지된 기술들을 사용해서 합성된 것을 말한다. 상기의 탐지자는 적어도 증폭된 산물들을 검출이 가능한 하나의 검출 할 수 있는 표지로 연결되 바람직하게는 공유적으로 연결된 것을 말한다. 올리고뉴클레오타이드 탐지자는 첫번째 프라이머 쌍이 결합하는 서열 내부에 혼성화되고 혈청형 특이적인 적절한 혼성화 탐지자를 의미한다.
본 발명에서 "검출 가능한 표지(detectable label)"라는 용어는 특별한 제한이 없이 사용한다. 상기의 검출 가능한 방사성 표지자들은 발광 표지자들,형광 염새제들, 효소 활성을 지닌 화합물들, 자화된 표지자들, 항원들 및 높은 결합 능을 가진 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 형광 염색제들은 실시간 PCR에서 검출 표지로써 사용되는 탐지자와 연결된다. 적합한 방사성 마커들은 P-32, S-35, 1-125, 또는 H-3이고, 적합한 발광 마커들은 화학적 발광물 화합물, 바람직하게 루미놀(luminol)이며, 적합한 형광 마커들은 바람직하게 댄실 염화물(dansyl chloride), FITC 이성질체(fluorcein-5-isothiocyanate), 그리고 형광 NBD (4-fluor-7-nitrobenz-2-aza-1,3 diazole)이고, 적합한 효소 마커들은 고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 알파-갈락토시다아제(α-galactosidase), 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase), 또는 바이오틴(biotin) 이다.
실시간 PCR(Real-time PCR)은 자동 설정 및 데이터 분석을 따르는 단일 단계 밀폐된 튜브 방법을 의미한다. 본 발명의 상기에서 앞선 바람직한 실시예에 있어서, LightCycler를 기초로 한 실시간 PCR 방법을 사용했다. 실시간 PCR을 기초한 과정에는 일차적인 진단 및 표적 정량을 동반한 가능법이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 증폭 단계("올리고뉴클레오타이드 프라이머들")에서 사용된 올리고뉴클레오타이드 서열의 특별한 조합은 특별한 올리고뉴클에오타이드 서열들 조합("올리고뉴클레오타이드 탐지자들")과 특이성을 조금더 증가하기 위해서 결합한다. 가장 바람직한 실시예로서,상기 프라이머 및 탐지자 쌍은 하기 올리고뉴클에오타이드 및 탐지자 서열들 쌍의 하나 또는 그 이상으로부터 선택된다:
(i) 서열번호 1 및 2로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머들, 및 서열번호 9 및 10으로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 탐지자들,
(ii) 서열번호 3 및 4로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머들, 및 서열번호 11 및 12로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 탐지자들,
(iii) 서열번호 5 및 6으로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머들, 및 서열번호 13 및 14로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 탐지자들, 및
(iv) 서열번호 7 및 8로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머들, 및 서열번호 15 및 16으로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 탐지자들.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 녹농균 혈청형 검출 단계는 하기의 단계를 거쳐 검출된다:
● 알려진 박테리아의 농도의 표준 곡선과 비교해서 결정을 할 수 있는 박테리아 양을 포함하는 정량 분석;
● 단일 밀도 증가로 관찰 가능한 PCR 산물의 충분한 증폭을 포함하는 증폭 곡선의 모니터링;및/또는
● 개별적인 융해 온도를 가지는 산물의 함성에서 PCR 증폭 결과들은 포함하는 융해 곡선 분석.
본 발명의 혼성화 탐지자들은 최고 수준의 특이성 a) 표준곡선과 비교를 통한 박테리아 양 정량, b) 혈청형 특이적 증폭 온라인 관찰, 또는 c) 융해 곡선 분석을 통한 혈청형 결정을 제공한다
본 발명의 분석법은 수많은 실질적인 적용들을 제공한다. 예를 들면, 상기 발명의 분석법은 어떤 의료 행위, 수의사(veterinarian), 복제수가 광범위한 녹농균을 포함하리라 의심되는 환경 샘플에서 개별적으로 또는 동시에 많이 유행하고 있는 녹농균 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 혈청군 2(IATS-02, IATS-05, IATS-016) 검출에 사용한다. 샘플에서 한 혈청형의 특이적 검출을 위해서 올리고뉴클레오타이드 서열들의 2개 프라이머들(앞쪽=fwd 및 뒤쪽=rev) 및 2개 탐지자들로 구성된 흥미있는 2개의 조합을 사용한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 분석법은 다가(multi-valent) 또는 다중(multiplex)분석으로 언급된 동시에 둘 또는 그 이상의 녹농균의 검출방법을 제공한다. 예를 들면 4개의 유행하고 있는 녹농균 혈청형 특이적 검출을 위해서 한 분석(4-valent assay)에서 상기에서 언급한 4x2개 프라이머, 및 4x2개의 탐지자를 사용한다. 바람직하게, 녹농균 혈청형은 많이 유행하고 있는 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 IATS-02, IATS-05 및 IATS-016 혈청형을 포함하는 혈청군 2를 검출한다. 프라이머들(앞쪽=fwd 및 뒤쪽=rev) 및 탐지자들은 동시에 한 단계 또는 연속적으로 두 개 분리된 단계에 사용한다.
본 발명에서 올리고뉴클레오타이드 서열들의 사용은 4가 LightCycler 분석법이 가장 바람직하다. 본 발명에 있어서 "4가 LightCycler 분석법(4-valent LightCycler assay)"이란 용어는 동시에 4개의 녹농균 혈청형, 동시에 4개의 많이 유행하는 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 혈청군 2의 녹농균을 검출 가능한 분석법을 의미한다. 상기의 분석법은 단일 반응에 있어서 매우 높은 특이성 및 감도를 보인다. 그러나, 비정형 균주의 양은 4가 분석법으로 감소할 수 있다. 그리고 4가 LightCycler 분석법은 임상적인 기관지-폐포 세척(broncho-alveolar lavage (BAL)) 샘플들에서 직접적인 측정을 성공적으로 확인한다. 밀폐된 유리 모세관들에서 일어나는 LightCycler를 기초로 하는 실시간 PCR, 증폭 및 검출은 증폭물의 상호 오염을 방지한다.
LightCycler는 가열 블락 전도보다는 공냉을 통해 고속 온도 순환을 수행한다. 4가의 녹농균 혈청형 시험법의 결과는 한 시간 안에 얻을 수 있다.
본 발명에서 녹농균의 검출은, 특히 상기에서 설명된 4가 혈청형 시험법은 분리된 박테리아 DNA, 또는 일반적으로 초 순수 물에 희석한 객담, 기관지 폐포 세척액 또는 기관지 흡입과 같은 임상적인 샘플들에서 수행한다.
상기의 언급된 샘플들은 직접적으로 폐질환을 앓고 있는 환자와 같은 사람의 폐 세척액을 포함한다. 임상 샘플들은 혈액, 소변, 조직 및 그와 같은 체액성 물질들을 포함한다. 일반적으로 상기 샘플들은 사람 또는 포유류의 상처부위, 화상부위, 폐, 및 소변 통로 감염에서 얻어진다. 녹농균의 혈청형은 음식, 토양, 물 샘플들에서 또한 검출된다.
녹농균이 감염된 폐렴 환자들에서 10 cfu/ml 이상에서 109 cfu/ml의 범위의 박테리아 양이 일상적으로 발견된다. 호흡적 분비(예를 들면 기관지 폐포 세척액, 기관 내관 가검물 등)를 포함하는 방법에 의존하는 것은 녹농균의 군집의 한계점을 해석하기 어렵거나 급성감염은 임상적으로 매일 통상적인 것으로 정한다. 상기의 한계점은 박테리아 군집은 10 cfu/ml부터이고 폐렴과 같은 감염은 106 cfu/ml 이다. 그 결과 박테리아 양은 적어도 6단계의 범위 이상으로 결정하는 것이 필요하다. 그래서 상기에 나타난 원형의 농도의 넓은 범위 이상의 녹농균 혈청형을 결정하는 믿을 수 있는 바람직한 진단법을 제공한다.
놀랍게도, 본 발명에 있어서, 녹농균 혈청형의 검출에 있어서 샘플의 원형의 농도의 넓은 범위에서 수행될 수 있다. 본 발명에 있어서 한가지 실시예에서 샘플에서 박테리아 양은 10 cfu/ml 에서 109 cfu/ml, 또는 102 cfu/ml 이상 108 cfu/ml 범위, 또는 103 cfu/ml 이상 108 cfu/ml, 또는 104 cfu/ml 이상 108 cfu/ml의 범위로 검출가능하다.
본 발명의 추가적인 실시예에 있어서 본 발명의 분석법은 종 특이적인 분석법이다. 만일 달리 지시된 것을 제외하면, 본 발명에서 "종 특이적(species-specific)"이라는 용어는 상기 녹농균의 종 특이성을 의미하는 것으로 사용한다. 특히, "종 특이적 검출(species-specific detection)"은 녹농균이외에 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 클라미디아 뉴모니아(Chlamydophila pneumoniae), 엔테로박터 에로지네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아스(Enterobacter cloacae), 대장균(Escherichia coli), 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 세라티아 마르센세스(Serratia marcescens), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 아에로모나스 하이드로필리아(Aeromonas hydrophilia), 박테리오테스 프라질리스(Bacterioides fragilis), 바르토넬라 핸셀라에(Bartonella henselae), 보르데텔라 페루투시스(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 부르콜데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 캠필로박터균(Campylobacter jejuni), 카디오박테리움 호미니스(Cardiobacterium hominis), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 리지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 리스테리아균(Listeria monocytogenes), 모라셀라 카탈리스(Moraxella catarrhalis), 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii), 수막구균(Neisseria meningitidis), 판토에아 아굴로메란스(Pantoea agglomerans), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 텐티콜라(Prevotella denticola), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 여시니아균(Yersinia enterocolitica), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus), 표피포도구뷴(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 헤모필리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 폐구균(Streptococcus pneumoniae), 연쇄상구균(Streptococcus agalactiae), 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus),클로스트리디움 페르프린제네스 (Clostridium perfringens), 코리네박테리움 제이케이움(Corynebacterium jeikeium), 제멜라 헤몰리산스(Gemella haemolysans), 히스토플라스마 캡술라툼(Histoplasma capsulatum), 마이코박테리움 포튜이툼(Mycobacterium fortuitum), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 마이코플라즈마 폐렴균(Mycoplasma pneumoniae), 페토스트렙토코커스 마그너스(Peptostreptococcus magnus), 여드름균(Propionibacterium acnes), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 크루제(Candida krusei), 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아데노바이러스(Adenoviruses), 헤르페스바이러스 (Herpesviruses), 오르소믹스바이러스(Orthomyxoviruses), 파라믹소바이러스(Paramycxoviruses), 및 빈번하게 발생하는 미생물(박테리아, 곰팡이, 또는 바이러스)을 의미하고 본 발명의 키트 또는 올리고뉴클레오타이드를 이용한 분석법을 이용한 검출을 의미하고 피코로나바이러스(Picornaviruses)는 검출 할 수 없다.
본 발명에 있어서 상기에 정의한 IATS 01, 혈청군 2(IATS-02, IATS-05, IATS-016), IATS 06, 및 IATS 011 군으로 선택된 것을 특징으로 하는 하나 또는 그 이상의 녹농균 혈청형 결정 가능한 올리고뉴클레오타이드 한 쌍을 제공하고, 상기 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14 또는 15 및 16으로 기재된 첫번째 및 두번째 올리고뉴클레오타이드 쌍은 적어도 연속적인 서열 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35 뉴클레오타이드 서열로 구성하는 것을 특징으로 한다. 특히, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택된 올리고뉴클에오타이드 한 쌍을 제공한다:
a) 서열번호 1로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 2로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드,
b) 서열번호 3으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 4로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드,
c) 서열번호 5로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 6으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드,
d) 서열번호 7로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 8로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드,
e) 서열번호 9로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 10으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드,
f) 서열번호 11로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 12로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드,
g) 서열번호 13으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 14로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드, 및
h) 서열번호 15로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 16로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드들은 하기의 [표 1]에 기재된 기술적 특징을 가진다:
Figure pct00001
본 발명에 있어서 올리고뉴클레오타이드 서열은 특별하게 녹농균 혈청형 IATS 01, 혈청군 2(IATS-02, IATS-05, IATS-016), IATS 06, IATS 011을 특이적 결정할 수 있다. 본 발명에 있어서, 사용되는 바람직한 올리고뉴클레오타이드는 하기 표 2로 기재된 프라이머 및 탐지자이다.
올리고뉴클레오타이드 서열/ 종류 국제 항원 분석법 혈청형 이름 표지 5' - 3' 서열 서열번호
프라이머 O1 O1-fwd - TAC GCC GTG AAG ATA GAA TTG 1
O1-rev - TCT CCT CTA AGC GCC TTG 2
S2 S2-fwd - TTC ATG GGT GAT GCG GG 3
S2-rev - TCC GGC GGA TCA GAG TA 4
O6 O6-fwd - TGT ACT GGC TTG GAG GTT T 5
O6-rev ATC GGA ACC TAC ACC ACT GA 6
O11 O11-fwd - TAG TGC AGC CTT GGT CT 7
O11-rev - CGA TCC CAT CCA TGA AGT TAT 8
탐지자 O1 O1-Fluo Fluo TGG GCA GGT ATC TGA GCA GC 9
O1-Red640 Red640 TCG GCT ATC ATG AAC GGT AGC TTG ATG TAT ATG C 10
S2 S2-Fluo Fluo CCC TCG CTG TTC TGG 11
S2-Red610 Red610 GTT GAT ATT GCT GGG AGT GTT CAT CGT TGA TGC AA 12
O6 O6-Fluo Fluo CAG CGT TGA GGC TGT G 13
O6-Red705 Red705 TGT GTG CGT TGG CGC T 14
O11 O11-Fluo Fluo TTG GTG TCA CTT GGG ACC TGG 15
O11-Red670 Red670 TGG TTC GGA GGA CTT CTC TTT GCT TTC TAT 16
IC IC-Red610 Red610 AGC CGA TAG TAC TTG CCA TCG AAC TAC ATA TAC G 17
본 발명에서 프라이머의 결합 활성은 연관된 혼성화 탐지자에 의한 순차적인 또는 동시에 혈청형 특이적 검출을 위한 적합한 표적 유전자의 혈청형 특이적 증폭을 할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기의 표적 유전자는 wzz 및 GtGr4로 불리는 녹농균 LPS-O-항원 유전자 군집에 속한 혈청형 특이적 프라이머 탐지자 쌍의 디자인과 일치하는 것을 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 서열목록의 서열번호 18에서 20으로 기재된 서열은 녹농균 혈청형 IATS 01, 혈청군 2(IATS-02, IATS-05, IATS-016), IATS 06, IATS 011 wzz 및 GtGr4의 표적 유전자의 서열이다.
서열번호 18로 기재된 녹농균 혈청형 IATS-01의 표적 유전자는 NCBI Accession AF498400에서 찾을 수 있는; Version AF498400.1 ; ORF_4; 지역 :1284에서 2321; ORF_4; wzz;로 사슬 길이 결정 단백질과 비슷하다.
서열번호 19로 기재된 녹농균 혈청형 혈청군 2(IATS-02, IATS-05, 및 IATS-016)에서 모든 세 개의 혈청형의 각각의 서열의 표적 유전자는 NCBI Accession AF498412에서 찾을 수 있는; Version AF498412.1 ; ORF_19; 지역: 18769 에서 19788; ORF_T9; GtGr4; 글리코실 전위효소 군 4 ;잠재적인 다중 막 스패닝 도메인이다 .
서열번호 20으로 기재된 녹농균 혈청형 IATS-06의 표적 유전자는 NCBI Accession AF498417에서 찾을 수 있는; Version AF498417.1 ; ORF_14; 지역 12654에서 13694, ORF_14; GtGr4; 글리코실 전위효소 군 4 ;잠재적인 다중 막 스패닝 도메인이다 .
서열번호 21로 기재된 녹농균 혈청형 IATS-011의 표적 유전자 는NCBI Accession AF498402에서 찾을 수 있는 ; Version AF498402.1 ; ORF_13; Region: 1 1073-12098, ORF_13; GtGr4; 글리코실 전위효소 군 4 ;잠재적인 다중 막 스패닝 도메인이다 .
상기의 LPS-O-항원 군집은 높은 유전적 다양성을 갖는 지역처럼 정의하고, DNA 서열을 기초한 PCR법은 녹농균 혈청형 사이의 차이를 결정하고 정의해서 구별하는 방법을 개발하는 기회를 제공한다(Raymond et al., 2002). 20개의 녹농균 혈청형에서 Raymond 그리고 coauthors가 O-항원 유전자 군집의 모든 11개의 군들을 정의했다. 비록 상기 연구자들은 DNA 서열 수준에서 다른 하나로부터 다양하게 갈라지는 각 유전자 군집들을 주장했다. 본 발명자는 혈청형 특이적 디자인에 요구되는 매우 작은 상기 표적 유전자들의 대다수의 DNA에서 차이를 경험했다. 좀더, 혈청형 특이성의 결여, 충분하지 못한 감도 또는 적용하는 원형체의 농도에 따른 강한 신호의 다양함에 사용할 수 없는 디자인 한 대부분의 올리고뉴클레오타이드는 심지어 높은 유전적 다형성을 가진 몇몇의 유전자들에서 실패했다.
본 발명의 분석법에 적용하는 적합한 반응물은 적합한 보관함에 포장되어 필수 재료들로 구성된 편리한 키트 내에 포함할 수 있다.
상기 키트는 본 발명에서 상기 설명된 방법으로 녹농균 혈청형, 바람직하게 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 혈청군 2(IATS-02, IATS-05, IATS-016)를 검출하는데 필요한 모든 반응물은 추가적으로 본 발명을 수행하는 적합한 제공물을 포함하며, 바람직하게 본 발명에 있어서 키트는 적합한 양성 및/또는 내부 대조군 표적 핵산 서열뿐만 아니라 물을 사용한 음성 대조군을 포함한다.
본 발명에 있어서 분석법과 키트는 많은 실제적인 적용을 갖는다. 예를 들면 본 발명의 방법과 키트는 녹농균을 포함하고 있다고 추측되는 어떤 임상, 수의학적 또는 환경 샘플에서 녹농균 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 혈청군 2(IATS-02, IATS-05, IATS-016)를 동시에 검출할 수 있다.
상기의 키트는 추가적으로 위험성과 내성 마커를 위한 대조군과 반응물을 제공한다.
상기 추가적으로 바람직한 실시예에서, 본 발명은 미리 정의된 녹농균의 혈청형 특이적 검출을 위한 분석법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 하기 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 개의 녹농균 혈청형 특이적 프라이머 쌍을 포함한다:
i. 서열번호 1로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 2로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머,
ii. 서열번호 3으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 4로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머,
iii. 서열번호 5로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 및
iv. 서열번호 7로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 8로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및
어닐링에 필요한 반응물, 및 증폭을 위한 반응물 및/또는 녹농균의 혈청형 특이적 검출을 위한 설명서.
상기 키트에 사용한 반응물은 효소의 재오염을 포함하는 효소 용액, Mg2+를 포함하는 완충 용액, dNTP 혼합물 및/또는 프라이머 및 혼성화 탐지자 혼합물, 적절한 양성 및/또는 내부 대조군뿐만 아니라 핵산 서열 또는 음성 대조군으로 사용한 물을 포함하는 DNA 또는 RNA 증폭 효소를 포함하는 효소 용액이다.
본 발명에 바람직한 실시예에서, 상기 키트는 추가적으로 적어도 하나의 혈청형 특이적 프라이머 쌍이 어닐링하는 서열에 있는 내부 서열에 혼성화하는 적어도 한 쌍의 혼성화하는 녹농균 혈청형 특이적 혼성화 탐지자를 포함한다.
바람직하게, 상기 적어도 한 쌍의 녹농균 혈청형 특이적인 혼성화 탐지자는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다:
(i) 서열번호 9로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 10으로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자,
(ii) 서열번호 11로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 12로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자,
(iii) 서열번호 13로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 14로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자, 및
(iv) 서열번호 15로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 16으로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자.
보다 바람직하게, 본 발명의 키트는 하기의 올리고뉴클레오타이드 서열의 쌍으로부터 선택된 하나 또는 그 이상 프라이머 및 탐지자 쌍을 포함한다:
(i) 서열번호 1 및 2로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 9 및 10으로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 탐지자,
(ii) 서열번호 3 및 4로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 11 및 12로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 탐지자,
(iii) 서열번호 5 및 6으로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 13 및 14로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 탐지자, 및
(iv) 서열번호 7 및 8로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 15 및 16으로 기재된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 탐지자,
본 발명에 있어서 키트는 추가적으로 증폭된 핵산 분자 또는 중합 효소 연쇄반응에 있어서 미리 결정된 단편을 생산하기 위해 요구되는 반응물 및 증폭된 서열을 분석하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 키트에 있어서, 혈청형 특이적 탐지자는 검출 가능한 마커로 표지된다. 바람직하게, 상기 검출 가능한 마커는 하기로 구성된 군에서 선택된다: 발광 마커, 형광 마커, 방사성 마커 및 효소 마커.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 상기에서 정의된 것처럼 혈청형 특이적 프라이머 쌍, 바람직하게 하기 구성된 군으로부터 선택된는 프라이머 쌍을 포함하는 녹농균 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 혈청군 2(IATS-02, IATS-05 및 IATS-016)를 동시 검출하기 위한 키트를 제공한다:
a. 서열번호 1로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 2로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머,
b. 서열번호 3으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 4로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머,
c. 서열번호 5로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 및
d. 서열번호 7로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 8로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
본 발명의 구체적 실시예에서, 본 발명의 키트는 녹농균 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 IATS-02, IATS-05 및 IATS-016로 구성된 혈청군 2를 동시에 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서 특이적 녹농균 혈청형으로 진단된 환자군에 녹농균 감염에 대한 좀더 효과적 치료를 위한 혈청형 특이적 항체 사용에 직접적으로 사용된다.
본 발명은 녹농균 감염의 치료를 위한 약제 제조에 있어서, 하나 또는 그 이상의 녹농균 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 IATS-02, IATS-05 및 IATS-016로 구성된 혈청군 2를 위한 특이적 항체의 용도를 제공한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명으로 검출된 분석법에 의에서 특이적 녹농균 혈청형을 갖는 환자에 있어서 녹농균의 치료를 위한 약제 제조를 위한 하나 또는 그 이상의 녹농균 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 IATS-02, IATS-05 및 IATS-016로 구성된 혈청군 2를 위한 특이적 항체 용도를 제공한다.
추가적인 실시예에서, 본 발명은 녹농균 감염 치료에 있어서 사용을 위한 하나 또는 그 이상의 녹농균 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 IATS-02, IATS-05 및 IATS-016로 구성된 혈청군 2 특이적 항체를 제공한다.
보다 바람직한 실시예에서, 본 발명은 본 발명으로 검출된 분석법에 의해서 상기 특이적 녹농균 혈청형을 갖는 환자에 있어서 녹농균의 치료의 사용을 위한 하나 또는 그 이상의 녹농균 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 IATS-02, IATS-05 및 IATS-016로 구성된 혈청군 2를 위한 특이적 항체를 제공한다.
본 발명에 있어서 상기에 녹농균 혈청형 특이적 검출에 있어서 올리고뉴클레오타이드 또는 탐지자의 용도를 추가적으로 제공한다.
이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하나. 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 추가적인 실시예는 본 명세서를 검토하는 당업자 및 일반 상식을 가진자를 위하여 명확히 나타내었다.
실시예
재료 및 방법들
LightCycler 에 기초한 4가 녹농균(4- valent Pseudomonas aeruginosa ) 혈청형 시험법
4가 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 혈청형 시험법은 융해점 곡선 분석으로 불리는 기능을 통해 증폭된 산물의 혈청형 특이적 서열의 확인을 제공할 수 있다. 각 PCR 실행의 말단에 온도 챔버(thermal chamber)에 온도는 느리게 상승한다. 이 단계를 지나는 동안 각 모세관의 형광을 빈도 간격을 측정하였다. 이러한 융해 증폭된 DNA의 상태가 매우 가깝게 모니터 되었음을 나타낸다. 온도가 상승 되자마자 탐지자가 방출될 때 FRET(fluorescence resonance energy transfer)의 중단의 결과처럼 형광은 감소할 것이다. 융해점 곡선의 분석의 이해를 위해 샘플 형광의 첫번째 음성 파생물(negative derivative)을 온도에 대비하여 나타내었고 각 샘플의 융해점 최고점을 표시하였다. 상기의 온도는 탐지자들의 대체에 있어서 서열에 의존적으로 매우 광범위할 수 있고, 길이 그리고 GC 분포 그리고 심지어 단일 뉴클레오타이드의 차이는 융해점을 바꿀 수 있다.
그래서, 융해점 목록은 특정 DNA산물을 정의하는데 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 4가 녹농균 혈청형 시험에 프라이머와 탐지자의 사용 수행 후에 융해점 곡선 분석을 통해 우리가 알지 못하는 임상적 샘플으로부터 PCR 산물의 녹농균 혈청형은 상기 산물의 융해점과 양성 대조군의 증폭에 의한 산물의 융해점(Tm)과 비교해서 결정할 수 있다. 표 1에 기재된 바와같이, 녹농균 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 혈청군 2의 혈청형 특이적 Tm 값들은 전형적인 검출 채널에 표기하였다.
본질적으로, PCR은 광범위한 멀티플렉스(multiplexing) 및 다중반응에 요구되는 유전자 표적을 검토하는 것을 처리할 수 없다. LightCycler에 기초한 실시간 PCR에서 상기 장애물은 동시에 분리된 채널에서 형광을 측정할 수 있는 광학적 기구에 의해서 해소되었다. 그 때문에 단일 샘플에서 하나의 표적 유전자 그 이상의 분석이 가능하다. 단일 반응에서 몇몇 녹농균 혈청형 바람직하게 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 혈청형 군2를 동시에 검출 가능한 것은 개별 색깔로 표지한 다중 탐지자 및 4가 녹농균 혈청형 시험법에 사용된 다중 프라이머이다.
상기와 같은 반응물은 복잡성에 있어서 대단히 높은 정도를 제공하고 이것은 특이적이고 신뢰할 수 있는 결과에서 기인한 적합한 반응 조건 결정한다. 그러나 상기와 같은 다중 분석은 만일 반응 지표들을 신중하게 선택했다면 오직 특이적이고 민감하다. 분석 설계를 위한 기준은 하기와 같다:
● 프라이머의 설계,
● (혼성화)탐지자의 설계,
● 표적의 농도,
● 샘플에서 비 특이적 잔기성 DNA 분석(오염으로 인한)
● 각기 다른 생물학적 세포 간질들(예를 들면 기관지-폐포 세척액)로부터 샘플 준비.
표적 유전자 정의
표적 유전자를 정의하기 위해서 각기 다른 녹농균 혈청형의 O-항원 유전자 위치를 구성하는 ORF(open reading frames)를 유전자 은행에서 다운로드 했고, 정렬법과 같은 군집화에 의해서 비교하였다(Chenna et al., 2003). 첫번째 선별 단계에 있어서, 혈청형 문제의 O-항원 부위가 존재하지 않거나 다수 존재하는 ORF를 제외하였다. 두번째 단계에 있어서, 불충분한 서열 다형성을 가진 ORF 및 프라이머/탐지자 기초분석법의 설계에 있어서 너무 작은 ORF는 배제하였다. 이러한 선별기준에 적용에 있어서 단지 프라이머/탐지자 설계에 단지 28개의 ORF중 단지 4개가 적합한 듯했다. 슈도모나스(Pseudomonas) O-항원 유전자 군집의 유전자 은행(gene bank) 데이터를 기초로 남겨진 ORF 아스파라진 합성 및 산화환원효소 계 NAD-결합 도스만 폴드(Asparagine synthase and Oxidoreductase family NAD-binding Rossmann fold)에서 2는 단지 혈청형의 제한된 수로 존재하고 있을 것으로 생각된다. 그러나, 프라이머/탐지자를 설계한 후, 두 유전로부터 혈청형 독립적 PCR 증폭이 관찰되는 것을 확인하였다. 상기 결과처럼 상기 유전자들의 각각의 혈청형의 O-항원 유전자 부위 외부에 찾을 수 있고, 상기 유전자들은 혈청형 구별에 있어서 적합하지 않다.
프라이머 /탐지자 설계
녹농균의 혈청형 특이적 검출을 위해서 특이적 프라이머/탐지자 올리고뉴클레오타이드 분리가 필요하다. 상기 필요한 서열의 설계를 위해서 LightCycler 탐지자 설계 소프트웨어 2.0(Roche Applied Science)를 사용했다. 첫번째, 두 개의 남겨진 표적 유전자들(사슬 길이 결정 단백질과 유사한 wzz 및 글리코실전환효소 군4와 유사한 GtGr4)을 자동 분석법과 고안된 지표들을 선택에 의해서 프라이머/탐지자 서열의 점수 결과에 의해서 소프트웨어에서 추출하였다. 본 발명에서 기재된 프라이머/탐지자 쌍은 하기와 같이 몇몇의 사전 설정 설계로 적용했다: 정량 PCR을 위한 프라이머/탐지자 조합, 융해 곡선 분석을 위한 프라이머/탐지자 조합, 및 다중 PCR 검출을 위한 프라이머/탐지자 조합. 다음 단계로 제안된 프라이머/탐지자 쌍을 NCBI 웹사이트에 직접 제출을 통해 잠재적이고 교차상호성을 테스트를 수행하였다..
상기의 설계단계를 완료 후에, 뉴클레오타이드 서열을 단지 매우 제한된 수의 박테라아 분리체에서 처음에 시험하였다. 선택된 프라이머/탐지자 쌍의 첫번째 평가를 위해 가장 의미 있는 실험에서 각기 희석율에 있는 특별한 녹농균 참고 균주의 측정을 실시하였다. 이러한 조건하에서 설계된 분석법의 절대 다수가 믿을 수 있는 혈청형 검출 신호를 생산하거나 충분한 감도를 가진 검출을 하지 못하였다. 그러나, 원형체의 농도의 광범위 이상 믿을 수 있고 안정적인 혈청형 검출은 높은 임상 연관성 및 진단 분석법의 성공적인 설계를 위해서 필수 선행 조건이다. 결과적으로, 이러한 요구들과 접하지 않은 프라이머/탐지자 쌍은 즉시 제거된다.
소프트웨어 기반 프라이머/탐지자 설계 과정을 요약할 때, 일반적으로 좋은 프라이머 및 탐지자 설계에 요구(예를 들면, 내부 분자 상동성 없음, 주형에 단일 어닐링 부위, 증폭 크기, 원하는 융해 온도, 등)를 충족하는 많은 올리고뉴클레오타이드 서열을 제한했다. 그럼에도 불구하고, 검출 신호에 있어서 너무 많은 다양성, 혈청형 특이성 오류, 충분하지 못한 감도 때문에 수 많은 제안된 프라이머/탐지자 쌍은 믿을 수 있는 혈청형 결정에 있어서 사용할 수 없다.
4개의 녹농균 혈청형의 동시 검출을 위하여, 다중 분석법을 제공하는 목적으로 결정 반응 조건, 혈청형 및 종 특이성뿐만 아니라 분석 빈감성에 관해 요구되는 것을 모두 만족하는 4개의 분리된 혈청형 테스트 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 혈청군 2의 프라이커/탐지자 상은 하나의 반응에 결합하였다. 이 단계에 있는 몇몇의 프라이머/탐지자 쌍은 소프트웨어 기반 설계하에 상세하게 설명한다. (예를 들면, 혈청군 2 특이적 탐지자는 단축으로 상세히 설명한 IATS-011 특이적 탐지자를 포함하는 신호 강도 상승시키는 탐지자 파트너들과 각기 다른 검출 채널 사이에서 신호 교차를 방지하는 탐지자 중 하나의 불안정 사이의 간격을 위해서 최적화했다.)
녹농균 혈청형 분석의 4가 형식의 최종 계산 후에 10 내지 107(102 에서 109 ml 당 유전자 복제수/㎖)의 반응당 특이적 복제수의 재현 가능한 검출이 가능하다. 특이적 혈청형 결정과 같이 또한 연관성 없는 녹농균 혈청형 또는 다른 종으로부터 유래된 DNA(예를 들면, 박테리아, 곰팡이 및 바이러스)에서 106 이상 반응 당 유전자 복제수(108 ml 당 유전자 복제수와 관련있는)의 존재가 관찰되었다.
이것은 비 상보성 서열을 포함하는 샘플 분석 또는 증폭된 그것에 관한 올리고뉴틀레오타이드 단편에 핵산 분자에 상보적인 서열을 포함하는 프라이머/탐지자의 충분한 양을 제공하는 프라이머/탐지자로 평가될 것이다. 제한된 부위 연결자는 증폭된 산물의 적절한 제한효소를 가지고 손쉬운 클로닝을 위한 절단이 가능한 프라이머 및 증폭된 산물의 서열화 프라이머와 연관된다.
실시간(real-time) PCR을 위한 반응 조건은 일반적으로 프라이머의 길이와 구성, 주형의 농도, 증폭된 DNA 조각의 길이, 내열성 DNA중합효소, 및 마그네슘(Mg2 +) 농도에 의존적이다. 상기 지표의 각각은 정통적인 기준을 따르는 기술에 있는 보통의 방법중 하나에 의해서 쉽게 결정된다
대부분의 실례에 있어서, 증폭된 DNA 아가로스 또는 아크릴아마이드 젤 전기영동으로 EtBr(ethidium bromide)에 염색하고 UV 조사해서 검출한다. PCR의 감도 증가 또는 빠른 결과를 제공하기 위해서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 탐지자 하나 또는 둘은 중합화를 진행하는 동안 증폭한 DNA에 삽입할 수 있는 상기에서 설명한 것처럼 표지될 수 있다. 표지된 DNA 산물은 증폭되는 동안 온라인으로 분석하기 때문에 결과 해석을 위한 전기영동의 필요는 제거된다.
실시예 1 : 미생물학적 샘플
4가 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)혈청형 시험의 개발을 위해 16개 참고 균주들과 94개의 임상 분리체들을 사용했다. 참고 균주들은 파스퇴르연구소(파리, 프랑스) 또는 벨기에 박테리아 컬렉션BCCM(겐트, 벨기에)에서 수득하였다. 임상 분리체들은 쮜리히, 베른, 바실 대학병원(스위스) 또는 제나(독일)및 낭포성 섬유종 다국적 임상연구에서 수득하였다.
개발된 4가 녹농균 혈청형 시험의 비교를 위해 미국, 독일, 그리스 및 벨기에에 있는 거의 20여개의 병원에서 수집된 호흡기 녹농균 분리체들 500개를 가지고 일반적으로 가능한 응집 시험법(바이오라드)을 수행하였다.
실시예 2 : 샘플 준비
2.1 분리된 박테라아 DNA 측정
각 각의 참고 균주들 및 임상적 분리체들은 밤새 37℃에서 5ml의 BHI 배지(BD Bioscience)에서 배양되었다. 박테리아의 DNA는 박테리아 세포 침전체로부터 고순도 PCR 주형 준비 키트(Roche Diagnostics)를 이용해서 분리했다. PCR 증폭 전에, 모든 DNA 샘플들의 DNA 저장 용액은 20 ㎍/㎕에서 표준화했다. DNA 저장 용액에서 초순도 물(Roche Diagnostics)로 1:10의 비율로 연속적으로 조사 용액으로 희석했다. 각 각의 DNA 조사 용액의 5㎕ 주형 용액으로 적용되었다.
2.2. 박테리아 배양에서 측정
참고 균주 및 임상 분지체들은 BHI 아가 플레이트(BD Bioscience)에 도말했다. 밤새 37℃에서 배양한 후 박테리아 한 개의 접종 루프 초순도 물(Roche Diagnostics) 500㎕에 재용해되었다. 각 각의 박테리아 희석액 8㎕는 주형 용액으로 적용되었다.
2.3.기관지-폐포 세척액( broncho - alveolar lavage ; BAL ) 샘플의 측정
분리된 박테리아 DNA는 반응당 103 및 106 유전자 복제수의 농도에서 처리된 기관지 폐포 세척액(BAL) 샘플들에 탔다. 기관지 폐포 세척액은 베른 대학 병원에서 수득하였다. PCR에서 증폭 전에, 스푸타졸(Sputasol(Oxoid))에 1:3으로 희석된 기관지 폐포 세척액 샘플들은 36℃에서 30분간 배양해서 수용화했다. 희석하고 수용화된 기관지 폐포 세척액 샘플들은 최종적으로 초순도 물에 1:100으로 희석되었다. 각 각의 처리된 기관지 폐포 세척액 샘플들의 희석액 8㎕는 주형 용액으로 적용되었다.
실시예 3 : 프라이머 및 분석법 설계
3.1. 표적 유전자들의 선별
혈청형 특이적 프라이머/탐지자 쌍의 설계에 사용된 표적유전자들.
분석법 IATS 혈청형 표적 유전자 및 위치 결정 참고 서열 프라이머 /탐지자 서열번호
O1 O1 Wzz는 길이 결정 단백질과 비슷하다.
NCBI accession AF498400;
ORF_4; region 1284-2321		 IATS O1 참고 균주, ATCC 33348 O1-fwd / O1-rev
O1-Fluo / O1-Red640
18
S2 S2 GtGr4는 글리코실전환효소 군4와 비슷하다.
NCBI accession AF498412;
ORF_19; region 18769-19788		 IATS O2 참고 균주, ATCC 33356 S2-fwd / S2-rev
S2-Fluo / S2-Red610
19
O6 O6 GtGr4는 글리코실전환효소 군4 와 비슷하다.
NCBI accession AF498417;
ORF_14; region 12654-13694		 IATS O6 참고 균주, ATCC 33354 O6-fwd / O6-rev
O6-Fluo / O6-Red705
20
O11 O11 GtGr4는 글리코실전환효소 군4와 비슷하다.
NCBI accession AF498402;
ORF_13; region 11073-12098		 IATS O11 참고 균주, ATCC 33358 O11-fwd / O11-rev
O11-Fluo / O11-Red670
21
3.2. 프라이머 및 탐지자 서열의 설계
LightCycler 탐지자 설계 소프트웨어 2.0을 이용해서 프라이머/탐지자 올리고뉴클레오타이드를 설계했다. 소프트웨어 기초한 설계 외에 혈청군 2 특이적 탐지자는 탐지자 파트너 사이 간격을 위해 최적화했고 혈청형 011 특이적 탐지자는 단축과 센서의 불안정에 의해서 정제했다.
Figure pct00002
실시예 4 : PCR 조건, 시험법 구성 및 시험법 대조군
Figure pct00003

Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 5 :
발명에 있어서 프라이머 및 탐지자는 임상적으로 유행하는 녹농균 혈청형 IATS-01, IATS -06, IATS -011 및 혈청군 2( IATS -02, IATS -05 및 IATS -016)의 특이적 검출에 적합하다.
녹농균 혈청형 시험법
IATS 혈청형 샘플 ID 소스 감도 1 [%] 정확도 2 [%]
O11 1) LMG 14079 BCCM, 참고 균주 ATCC 33358 100 100
2) PEG4 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
3) PEG16 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
4) PEG19 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
5) PEG32 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
6) PEG35 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
7) PEG36 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
8) VA1014 제나(Jena) 임상 분리체 100 100
9) VA26642/1 제나(Jena) 임상 분리체 100 100
10) VA26794/4 제나(Jena) 임상 분리체 100 100
11) VA26831 제나(Jena) 임상 분리체 100 100
12) VA26939 제나(Jena) 임상 분리체 100 100
13) VA2813 제나(Jena) 임상 분리체 100 100
14) VA3805 제나(Jena) 임상 분리체 100 100
15) VA3881 제나(Jena) 임상 분리체 100 100
16) VA695 제나(Jena) 임상 분리체 100 100
17) VA843 제나(Jena) 임상 분리체 100 100
18) 2309.36 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
19) 2310.49 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
20) 2311.35 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
O6 21) CIP 59.39 파스퇴르 연구소, 참고 균주 33354 100 100
22) PEG6 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
23) PEG20 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
24) PEG21 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
25) PEG22 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
26) PEG30 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
27) PEG33 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
28) 2311.11 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
29) 2310.15 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
30) 2312.18 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
31) 402/T512 001 연구 임상 분리체 100 100
32) 473/T323 001 연구 임상 분리체 100 100
33) 483/T406 001 연구 임상 분리체 100 100
34) 486/T429 001 연구 임상 분리체 100 100
35) 499/T338 001 연구 임상 분리체 100 100
36) 618/T348 001 연구 임상 분리체 100 100
O6 37) 599/T478 001 연구 임상 분리체 100 100
38) 575/T014 001 연구 임상 분리체 100 100
39) 581/T291 001 연구 임상 분리체 100 100
S2 - o2 40) LMG 14072 BCCM, 참고 균주 o2 - ATCC 33356 100 100
S2 - o5 41) LMG 14075 BCCM, 참고 균주 o5 - ATCC 33352 100 100
S2 - o16 42) LMG 14083 BCCM, 참고 균주 o16 - ATCC 33363 100 100
S2 - o5 43) PEG2 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
S2 - o5 44) PEG11 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
S2 - o16 45) PEG24 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
S2 - o16 46) PEG27 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
S2 - o5 47) PEG39 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
S2 - o2 48) PEG40 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
S2 - o2 49) UR538 Clinical isolate Jena 100 100
S2 - o5 50) 2308.57 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
S2 - o16 51) 2310.27 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
S2 - o5 52) 2310.31 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
S2 - o5 53) 2312.58 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
S2 - o2 54) 348/T133 001 연구 임상 분리체 100 100
S2 - o2 55) 420/T358 001 연구 임상 분리체 100 100
S2 - o2 56) 421/T355 001 연구 임상 분리체 100 100
S2 - o2 57) 488/T183 001 연구 임상 분리체 100 100
S2 - o16 58) VA26925 제나(Jena) 임상 분리체 100 100
S2 - o5 59) Vo56635 쮜리히(Zurich) 임상 분리체 100 100
O1 60) LMG 14071 BCCM, 참고 균주 ATCC 33348 100 100
61) PEG3 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
62) PEG7 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
63) PEG9 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
64) PEG12 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
65) PEG37 바젤(Basel) 임상 분리체 100 100
66) 2309.07 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
67) 2309.24 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
68) 2310.28 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
69) 2310.37 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
70) 2311.07 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
71) 2311.34 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
72) 2311.42 베르네(Berne) 임상 분리체 100 100
73) 417/T537 001 연구 임상 분리체 100 100
74) 448/T76 001 연구 임상 분리체 100 100
75) 471/T369 001 연구 임상 분리체 100 100
76) 485/T631 001 연구 임상 분리체 100 100
77) 487/T421 001 연구 임상 분리체 100 100
78) 615/T341 001 연구 임상 분리체 100 100
Total Target Organisms 78 / 78 100 % 100 %
1 : 감도: 검출된 분리체 수 / 시험된 분리체 수
2: 정확도: 정확하게 검출된 분리체 수 / 시험된 분리체 수
각각의 4 특이 녹농균 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 혈청군 2(IATS-02, IATS-05 및 IATS-016)의 100% 감도 및 정확도를 갖는 4가 녹농균 혈청형 시험법으로 검출된 6개의 참고 균주 및 72개의 임상 분리체를 나타냈다. 4가 녹농균 혈청형 시험법에 기초한 검출 가능한 혈청형에 하나에 속한 균주 결정은 하나의 특이적(양성) 검출 신호에 항상 결과를 나타냈다. 그러나 다른 혈청형 시험법을 위한 세 개의 음성 신호는 다중 4가 분석법을 포함된다. 어떤 음성 혈청형 분석법을 위해서, 내부 대조군은 양성 및 PCR 방법의 실폐와 같이 제외할 수 있는 것으로 검출되었다. 모든 78개의 DNA 샘플은 거의 반응당 106 복제수로 시험했다.
실시예 6 :
본 발명의 프라이머 / 탐지자는 다른 녹농균의 균주들과 상호교차반응은 보이지 않는다.
표 8: 녹농균 혈청형 시험법
녹농균 혈청형 시험법은 참고 균주 및 10개의 부가적 혈청형 IATS-03, IATS- 04, IATS-07, IATS-08, IATS-09, IATS-O10, IATS-012, IATS-013, IATS-014, 및 IATS-015의 임상 분리체들과 교차 반응성은 보이지 않는다. 모든 DNA 샘플들은 거의 반응당 106 복제수로 시험했다. 샘플에 존재하는 잠재적 PCR 억제제 때문에 음성 혈청형 결과 가능성을 제외하면서 얻었다. 상기에 수행한 반응들 각각에 내부 대조군을 첨가했다. 내부 대조군에서 성공적으로 검출함에 따라 모든 32개의 조사된 혈청형 샘플 PCR 억제 제외할 수 있다.
Figure pct00006
실시예 7 :
본 발명에 있어서 프라이머는 종 특이적이다.
녹농균 혈청형 시험법
미생물 종 # 양성/ # 시험 [%]
그람 음성 박테리아 1) 아시네토박터 마우마니( Acinetobacter baumannii ) 0
2) 엔테로박터 에로지네스( Enterobacter aerogenes )
3) 엔테로박터 글로아스( Enterobacter cloacae )
4) 대장균( Escherichia coli )
5) 클레브시엘라 옥시토카( Klebsiella oxytoca )
6) 클레브시엘라 뉴모니아에( Klebsiella pneumoniae )
7) 프로테우스 미라빌리스( Proteus mirabilis )
8) 세라티아 마르센세스( Serratia marcescens )
9) 스테노트로모나스 말토필리아( Stenotrophomonas maltophilia )
10) 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄
( Actinobacillus actinomycetemcomitans )
11) 아에로모나스 하이드로필리아( Aeromonas hydrophilia )
12) 박테리오테스 프라질리스( Bacterioides fragilis )
13) 바르토넬라 한셀라에( Bartonella henselae )
14) 보르데텔라 페루투시스( Bordetella pertussis )
15) 보렐리아 부르그도르페리( Borrelia burgdorferi )
16) 부르콜데리아 세파시아( Burkholderia cepacia )
17) 캠필로박터균( Campylobacter jejuni )
18) 카디오박테리움 호미니스( Cardiobacterium hominis )
19) 헤모필러스 인플루엔자( Haemophilus influenza )
20) 리지오넬라 뉴모필라( Legionella pneumophila )
21) 리스테리아균( Listeria monocytogenes )
22) 모라셀라 카탈리스( Moraxella catarrhalis )
23) 모르가넬라 모르가니( Morganella morganii )
24) 수막구균( Neisseria meningitidis )
25) 파토에아 아굴로메란스( Pantoea agglomerans )
26) 포르피로모나스 진지발리스( Porphyromonas gingivalis )
27) 프레보텔라 텐티콜라( Prevotella denticola )
28) 프로테우스 불가리스( Proteus vulgaris )
29) 여시나아균( Yersinia enterocolitica )
그람 양성 박테리아 30) 엔테로코커스 파에칼리스( Enterococcus faecalis ) 0
31) 엔테로코커스 파에시움( Enterococcus faecium )
32) 황색 포도상구균( Staphylococcus aureus )
33) 표피 포도구균( Staphylococcus epidermidis )
34) 스타필로코커스 헤모필리티쿠스
( Staphylococcus haemolyticus )
35) 폐구균( Streptococcus pneumoniae )
그람 양성 박테리아 36) 연쇄상구균( Streptococcus agalactiae ) 0
37) 황농성 연쇄상구뷴( Streptococcus pyogenes )
38) 스트렘토코커스 미티스( Streptococcus mitis )
39) 바실러스 세레우스( Bacillus cereus )
40) 글로스트리디움 페르프린제네스( Clostridium perfringens )
41) 코리네박테리움 제이케이움( Corynebacterium jeikeium )
42) 제멜라 헤몰리산스( Gemella haemolysans )
43) 히스토플라스마 캡슐라툼( Histoplasma capsulatum )
44) 마이코박테리움 포튜이툼( Mycobacterium fortuitum )
45) 결핵균( Mycobacterium tuberculosis )
46) 마이코플라즈마 폐렴균( Mycoplasma pneumoniae )
47) 페스트렙토코커스 마그너스( Peptostreptococcus magnus )
48) 여드름균( Propionibacterium acnes )
곰팡이 49) 아르스페르길루스 푸미가투스( Aspergillus fumigatus ) 0
50) 칸디다 알비칸스( Candida albicans )
51) 칸디다 글라브라타( Candida glabrata )
52) 칸디다 클루제( Candida krusei )
53) 칸디다 파랍실로시스( Candida parapsilosis )
54) 칸디다 트로피칼리스( Candida tropicalis )
55) 크립토코커스 네오포르만스( Cryptococcus neoformans )
바이러스 56) 1형 허피스 바이러스( Herpes simplex virus , Type 1)
( HHV -1/ HSV -1) 		0
57) 2형 허피스 바이러스( Herpes simplex virus , Type 2)
( HHV -2/ HSV -2)
바이러스 58) 1형 사이토메갈로바이러스 ( Cytomegalovirus , Type 1)
( HHV -5/ CMV ) 		0
총 표적 개체 비특이적 검출 0%
녹농균 혈청형 시험법의 종 특이성을 58개의 박테리아, 곰팡이 및 바이러스성 미생물의 측정을 통해서 증명했다. 미생물학적 샘플은 미국 형태 배양 컬렉션 (American Type Culture Collection;(ATCC)),독일 삼룩 미생물 및 세포배양(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen;(DSMZ)) 및 벨기에 미생물 조합 컬렉션(Belgian Co-ordinated collections of Microorganisms;(BCCM))에서 얻었다. 모든 DNA 샘플은 상호 교차성을 보이지 않은 4가 녹농균 형청형 시험법으로 평가했다. 모든 DNA 샘플은 거의 반응당 106 복제수로 시험했다. 샘플에 존재할 수 있는 잠재적 PCR 억제제 때문에 얻어지는 음성 혈청형 결과의 가능성을 제외하기 위해서, 각각의 수행한 반응에 내부 대조군 용액을 첨가했다. 내부 대조군에서 성공적으로 검출함에 따라 모든 58개의 조사된 혈청형 샘플 PCR 억제 제외할 수 있다.
실시예 8 :
방법의 재현성/견고성
다른 실험적 설정에 있어서 혈청형 검출의 높은 재현성이 혈청형 IATS-06이 전형적으로 나타냈다. 고유의 Tm 값은 도 2에 기재된 것으로부터 얻었다.
(A) 참고 균주 및 19개의 분리체의 측정으로부터,
(B) 적용한 주형 농도(반응당 102에서 107 유전체)의 독립
(C) 또는 30개의 임상적 샘플(기관지-폐포 세척액)의 측정 후.
실시예 9 :
분석적 감도
녹농균 혈청형 시험법의 분석 감도는 7개의 표적 양성 샘플의 8배로 복제한 정제된 DNA를 이용하여 녹농균 ATS-01, IATS-06, IATS-011 및 혈청군 2(IATS-02, IATS-05 및 IATS-016)의 참고 균주 적중률 분석에 의해서 결정했다. 95% 제한 값으로 시험한 각 미생물의 DNA는 프로빗(Probit) 분석을 사용한 낮은 검출 제한(lower limit of detection (LOD))을 결정하기위해 계산했다. 4가 혈청형 시험법의 다중 형식은 4개 시험법 각각의 LOD에 영향이 있다. 이것은 각 4개의 분석법을 분리해서 시험할 때 낮은 LOD를 갖는 것으로 예상된다.
4가 녹농균 혈청형 시험법-분석적 감도
IATS O1 참고 균주, ATCC 33348
농도
(유전자 복제수 / PCR ) 		300 150 75 50 12.5 3.125 1.56 0
Hit rate 8 / 8 8 / 8 7 / 8 6 / 8 4 / 8 0 / 8 0 / 8 0 / 8
검출 한계,
계산한 LOD95 값 		101.55
IATS S2 ( O2 ) 참고 균주, ATCC 33356
농도
(유전자 복제수 / PCR ) 		300 150 75 50 12.5 3.125 1.56 0
적중률 8 / 8 8 / 8 8 / 8 6 / 8 3 / 8 0 / 8 1 / 8 0 / 8
검출 한계,
계산한 LOD95 값 		101.53
IATS O6 참고 균주, ATCC 33354
농도
(유전자 복제수 / PCR ) 		300 150 75 50 12.5 3.125 1.56 0
적중률 8 / 8 8 / 8 8 / 8 8 / 8 3 / 8 2 / 8 1 / 8 0 / 8
검출 한계,
계산한 LOD95 값 		56.16
IATS O11 참고 균주, ATCC 33358
농도
(유전자 복제수 / PCR ) 		300 150 75 50 12.5 3.125 1.56 0
적중률 8 / 8 8 / 8 7 / 8 5 / 8 2 / 8 0 / 8 0 / 8 0 / 8
검출 한계,
계산한 LOD95 값 		121.36
실시예 10 :
비교: 슬라이드 응집 및 4가 혈청형 시험법에 의한 임상적 분리체들의 혈청형
호흡기관 녹농균 분리체들은 미국, 독일, 그리스 및 벨기에에 있는 거의 20개 병원에서 수집했다. 박테리아 균주들은 37℃에서 BHI 아가 평판배지(BD Bioscience) 위에서 밤새 배양 후 측정을 수행하였다. 각 균주의 하나의 도말 고리는 응집반응뿐만 아니라 순차적인 LightCycler 분석에 필요한 초순도 물에 희석을 위해서 사용했다.
상기 두 개의 혈청형 방법으로부터 얻은 결과를 비교할 때, 이것은 4가 녹농균 혈청형 시험법의 적용에 의해서 급격하게 증가할 수 있는 믿을 수 있게 정의된 임상적 분리체 개수가 분명하다. 관찰된 개선 절대치는 500개의 조사된 박테리아의 균주의 15%(53.4%에서 69.2%로 혈청형 결정의 향상)에 해당한다. 상기 실시예에 있어서 혈청형 특이적 항체 치료에 적합한 75명 잠재적 환자들과 15%의 차이와 일치했다.
IATS 혈청형 분리체 수집 장소 합계
미국 독일 그리스 벨기에
시험에 사용한 분리체 수 94186100119 499
혈청형 분포 [%] 평균
[%]
슬라이드 응집법에 의한 혈청형
O1 10.6 8.6 2.0 6.7 7
S2 6.4 4.3 9.0 6.7 6.6
O6 19.1 20.4 8.0 19.3 16.7
O11 20.2 16.7 38.0 21.0 24
슬라이드 응집법에 의한 혈청형 O1 , S2 , O6 , 및 O11 의 합계 56.3 50.0 57.0 53.7 54.3
비 혈청형 분리체 25.5 23.7 26 23.5 24.7
4-가 PCR 분석법에 의한 혈청형
O1 14.9 13.4 4.0 7.6 10.0
S2 7.4 7.5 12.0 11.8 9.7
O6 25.5 24.2 11.0 24.4 21.3
O11 25.5 17.2 30.0 30.3 25.8
4-가 PCR 혈청형 시험법에 의한 혈청형 O1 , S2, O6 , 및 O11 의 합계 73.3 62.3 67.0 74.1 69.2
혈청형 O1, S2, O6, 및 O11으로부터 혈청형 차이 26.7 37.7 33.0 25,9 30.8
실시예 11 :
4가 녹농균 혈청형 시험법- 비 기능적인 프라이머 /탐지자 쌍.
녹농균 혈청형 특이적 검출을 위하여 특이적 프라이머/탐지자 분리가 필요하다. 상기와 같은 서열의 설계를 위해서 LightCycler 탐지자 설계 소프트웨어 2.0(Roche Applied Science)를 사용했다. 상기 소프트웨어가 좋은 프라이머 및 탐지자의 일반적 요구(예를 들면 분자 내부 서열 비 상동성, 주형 위에 있는 단일 어닐링 부위, 복제물의 크기, 원하는 융해 온도 등)를 충족하는 많은 올리고뉴클레오타이드 서열을 보유하고 있음에도 불구하고, 상기 소프트웨어가 보유하고 있는 수많은 프라이머/탐지자 쌍은 열거된 예외 조항 기준 때문에 믿을 수 있는 혈청형 결정에 사용할 수 없었다.
LightCycler 탐지자 설계 소프트웨어 2.0 (Roche Applied Science)를 사용해서 설계된 25개 프라이머/탐지자 올리고뉴클레오타이드 프라이머/탐지자를 나타내었다. 광범위한 주형 농도 이상의 믿을만한 혈청형 특이적 검출 신호를 발생시키는 프라이머/탐지자를 사용될 수 없다.
순번 프라이머 이름/ 탐지자 쌍 IATS 혈청형 검출 표적 유전자 프라이머 / 탐지자 서열 5'-3' 예외 조항
1 Wzz_O1_hk1
O1_wzz_P1/2		 O1 Wzz는 사슬 길이 결정 단백질과 비슷하다; NCBI accession AF498400;
ORF_4;
지역 1284-2321		 for: GTGGCGGTGAAATTGATCTC
rev: GCAACACGGCGATACTG
P1: TTATCCTGGTCGTAGCTCTTATATTTGGCATTG
P2: GCTGCTATATATGCCTATACAAGTAAGCCGGTT		 혈청형 특이적 검출 신호의 원하지 않는 변이 및 낮은 신호 감도
2 Wzz_O1_hk7
O1_wzz_P3/4		 for: CCTGGTCGTAGCTCTTATATT
rev: CTGAAGACCCGACTCCT
P3: GCCAGTATCGCCGTGTTGC
P4: CCCTCGCTGAGCAATGTTGCCG		 혈청형 특이적 검출 신호의 원하지 않는 변이 및 낮은 신호 감도
3 Wzz_O1_hk10
O1_wzz_P5/6		 for: ATCAGTATTACTCTGCCAGACA
rev: GTGCGCATTCTTAACCATTTC
P5: TGAGCTGGCCGCTGAGTG
P6: TCCGTCGCTATCTTGCCGATACGG 		혈청형 특이적 검출 신호의 원하지 않는 변이
4 Wzz_O1_hk11
O1_wzz_P7/8		 for: CGGTGAAATTGATCTCGTAAGAC
rev: GGCAACATTGCTCAGCG
P7: TAGCTCTTATATTTGGCATTGTTGCTGCTA
P8: TATGCCTATACAAGTAAGCCGGTTTATGAAGCCAG		 혈청형 특이적 검출 신호의 원하지 않는 변이 및 낮은 신호 감도
5 Wzz_O1_hk4
O1_wzz_P9/10		 for: CGCGATAGTCTCTATAGGGTATTTA
rev: CCATTTCTTGGACGGAATGT
P9: ACAGTAGAACAGGAAGATCCTGAGC
P10: GCCGCTGAGTGGATCCGTCG		 혈청형 특이적 검출 신호의 원하지 않는 변이
6 Wzz_S2_hk4
S2_wzz_P3/4		 S2 Wzz는 사슬 길이 결정 단백질과 비슷하다; NCBI accession
AF498412;
ORF_4;
지역 1288-2334		 for: CTTCAAGGTCCAGGATGTG
rev: GGCAAACTAATACTTATCTGATCAGTG
P3: TTTCAATGAGACCTATTTGCCTTCTTTGGA
P4: AAGAGCTTCGTTCGGTTTCGCG		 혈청형 특이적 검출 신호의 원하지 않는 변이
7 Wzz_S2_hk6
S2_wzz_P7/8		 for: ACTGATCAGATAAGTATTAGTTTGCC
rev: GCATTGTTCAACATTTCCTGAATAGA
P7: GGAGCGTGCGGCGAG
P8: GGGTTCGTCGGTATATAGCTGATGCGG		 혈청형 특이적 검출 신호의 원하지 않는 변이
8 GtGr4_S2_hk9
S2_GtGr4_P5/6		 GtGr4는 글리코실전환효소 군 4와 비슷하다; NCBI accession
AF498412;
ORF_19;
지역 18769-19788		 for: CTGCTCGGCCATTTCTC
rev: ACACTGGCAATACCATCAA
P5: GTTTCCCGCCGCTGGAT
P6: GGTTGGGCATGCTGTCGACTTAGG		 불충분한 감도
9 GtGr4_S2_hk18
S2_GtGr4_P7/8		 for: GGCATGCTGTCGACTTAG
rev: CATGCCCTGTAAGCCAGTA
P7: ACTTCATGGATGGCATTGATGGTATTG
P8: AGTGTCGAGGCCATTGGTGTCTG		 혈청형 특이적 검출 신호의 원하지 않는 변이
10 GtGr4_S2_hk24
S2_GtGr4_P9/10		 for: CAGTGTCGAGGCCATTG
rev: CGCATCA
P9: TATCCCTCTGTTGCTGGCGTGCCCATGAAGATT
P10: CGGTCGCCGGCTTCCTGA		 불충분한 감도
11 Ored_O2_hk1 S2 산화환원효소계는 NAD 결합 로소만 폴드와 비슷하다; NCBI accession
AF498412;
ORF_6;
지역 4525-5475		 for: TAAGCGCCTCTACAACATTCT
rev: TGGATCTCCCTTCCAGC		 혈청형 특이성 없음
12 Ored_O2_hk3 for: AGCGTAATGTTGTGCACTTCA
rev: ACGGTAATCGAACGATAGG		 혈청형 특이성 없음
13 Ored_O2_hk4 for: GTCCGCATAAGTACGAGG
rev: GCAGCTTGCCAAAGATGA		 혈청형 특이성 없음
14 Asp_O6_hk1 O6 아스파라진합성효소와 비슷하다; NCBI accession AF498417;
ORF_10;
지역 7493-9376		 for: TCCGATGTTCCTTTGGGAG
rev: CAACCGCCTTTGCGTAA		 혈청형 특이성 없음
15 Asp_O6_hk2 for: GCAGTTGATCTTCTGGAAAGT
rev: CAACCGCCTTTGCGTAA		 혈청형 특이성 없음
16 Asp_O6_hk3 for: CCGAGGCAGTTGATCTTC
rev: CAGGCTCATCAAAGCCAAT		 혈청형 특이성 없음
17 Asp_O6_hk4 for: AGCATATCGGATCAGATGG
rev: CGTAAACAGCCTCATCATACC		 혈청형 특이성 없음
18 Asp_O6_hk5 for: TCCGATGTTCCTTTGGGAG
rev: GTACCGATATGTTCTGCAACC		 혈청형 특이성 없음
19 GtGr4_O11_hk41
O11_GtGr4_P1/2		 O11 GtGr4는 글리코실전환효소 군 4와 비슷하다; NCBI accession
AF498402;
ORF_13;
지역 11073-12098		 for: ATGGATGGAATCGATGGAATTG
rev: GCAGGAGGGAAATTCCAGA
P1: TGTGTTGGCGGGGCATTATTATACTG
P2: TGAATGGCCAACTGACGCAGGC		 혈청형 특이적 검출 신호의 원하지 않는 변이
20 GtGr4_O11_hk1
O11_GtGr4_P3/4		 for: TAGTGCAGCCTTGGTCT
rev: CGATCCCATCCATGAAGTTAT
P3: TGTTGGTGTCAGTTGGGACCTG
P4: GTGGTTCGGAGGACTTCTCTTTGCTTT		 낮은 신호 강도
21 GtGr4_O11_hk3
O11_GtGr4_P9/10		 CCATTTCAGATTGTTGGTGTCA
ATGCCCTAATTCAGCCAGTATAA
P9: TGTGGTTGCTGAATCTCTATAACTTCATGG
P10: GGGATCGATGGACTTGCCAGCC		 불충분한 감도
22 GtGr4_O11_hk4
O11_GtGr4_P11/12		 for: GCAGCCTTGGTCTCATTGTA
rev: ATGCCCTAATTCAGCCAGTATAA
P11: TCTATCTCGTGTGGTTGCTGAATCTCTA
P12: ACTTCATGGATGGGATCGATGGACTTG		 불충분한 감도
23 Wzz_O11_hk1
O11_wzz_P1/2		 Wzz는 사슬 길이 결정 단백질과 비슷하다; NCBI accession AF498402;
ORF_4
지역 919-1956		 for: TGCAGAGCCGCATAACC
rev: TCCATGATCGAGGAAAGTTGT
P1: GCTGATTGCGGAGTCGC
P2: AAGATAGATGGCCCGCCATTAATAGAAGGG		 혈청형 특이적 검출 신호의 원하지 않는 변이
24 Wzz_O11_hk16
O11_wzz_P3/4		 for: TCCTGCTAACAAGCCAGATG
rev: CTGGAAATCTCTACCTGCACTA
P3: GCGAGAGGTTCTTGCTACATGG
P4: ACAAGCTTTCGTGCGTTTGGCTG		 혈청형 특이적 검출 신호의 원하지 않는 변이
25 Wzz_O11_hk30
O11_wzz_P7/8		 for: GAGCGGAAAGCGAAGATGA
rev: AAAGCTTGTGCCCATGT
P7: TAACAAGCCAGATGCAGACCG
P8: ATACGGTAATTGTGGAGGGCACGAAG		 혈청형 특이적 검출 신호의 원하지 않는 변이
도 3에 기재된 세 개의 비 기능적 프라이머/탐지자 조합들은 LightCycler 탐지자 설계 소프트웨어로 활성화되었다.
증폭 특이적 Tm 값의 강한 표준편차의 경우에 있어서 관련된 프라이머/탐지자 쌍은 믿을 수 있는 혈청형 결정에 사용할 수 없다. 도 3에 적용된 주형 농도의 의존도에 있어서 강한 Tm 변이를 갖는 세 가지 예시를 기재하였다. 모든 세 가지 실험에 있어서 반응 당 10e6에서 10e2 유전체를 참고 균주 IATS-011(A), IATS-02(B), 및 IATS-01(C)에 사용해서 측정했다. 샘플들은 표 12에 기재된 프라이머/탐지자 조합번호 19(A), 9(B), 및 1(C)로 나타내었다.
참조문헌:
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Claims (20)

  1. 하기 단계를 포함하는 샘플에서 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 혈청형 특이적 검출분석법:
    a) 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한쌍의 녹농균 혈청형 특이적프라이머를 샘플에서 표적 핵산과 어닐링(anneling, 풀림)하는 단계:
    i) 서열번호 1로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 2로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머,
    ii) 서열번호 3으로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 4로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머,
    iii) 서열번호 5로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 6로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 및
    iv)서열번호 7로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 8로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머;
    b) 표적 핵산을 증폭하는 단계, 및
    c) 표적 핵산이 증폭된 슈도모나스(Pseudomonas)를 검출 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 검출하는 단계는 적어도 한 쌍의 녹농균 혈청형 특이적 혼성화 탐지자를 제 1항에서 선택된 적어도 한 쌍의 녹농균 혈청형 특이적 프라이머 쌍이 결합되는 내부에 있는 서열과 혼성화 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 적어도 한산의 녹농균 혈청형 특이적 혼성화 탐지자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 특징으로 하는 분석법:
    (i) 서열번호 9로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 10으로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자,
    (ii) 서열번호 11로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 12로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자,
    (iii) 서열번호 13으로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 14로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자, 및
    (iv) 서열번호 15로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 16으로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자.
  4. 제 2항 또는 3항에 있어서, 상기 녹농균 혈청형 특이적 혼성화 탐지자는 검출 마커로 표지된 것을 특징으로 하는 분석법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 검출 탐지자는 발광 탐지자, 형광 탐지자, 방사성 탐지자 및 효소 탐지자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분석법.
  6. 제 2항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹농균 혈청형은 정량, 증폭 커브 또는 융해 커브 분석방법으로 검출하는 것으로 특징으로 하는 분석법.
  7. 제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹농균 혈청형 두 개 또는 그 이상을 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 분석법.
  8. 제 7항에 있어서, 검출된 혈청형은 IATS-01 , IATS-06, IATS-011 및 IATS-02, IATS-05 및 IATS-016를 포함하는 녹농균 혈청형군 2인 것을 특징으로 하는 분석법.
  9. 제 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 객담과 같은 체액, 기관치 폐포 세척, 기관지 흡입, 혈액, 소변, 조직 및 세균배양으로부터 분리된 DNA로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 분석법.
  10. 제 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 음식, 토양 및 물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석법.
  11. 제 1항 내지 10항 어느 한 항에 있어서, 10 cfu/ml 에서 109 cfu/ml의 범위의 세균을 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 세균량.
  12. 제 1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석법은 종 특이적인것을 분석할 수 있는 것을 특징으로 하는 분석법.
  13. 하기로 구성되는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 쌍:
    a. 서열번호 1로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 2로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드,
    b. 서열번호 3으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 4로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드,
    c. 서열번호 5로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 6으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드,
    d. 서열번호 7로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 8로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드,
    e. 서열번호 9로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 10으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드,
    f. 서열번호 11로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 12로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드,
    g. 서열번호 13으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 14로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드, 및
    h. 서열번호 15로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 16으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드.
  14. 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 녹농균 혈청형 특이적 프라이머 쌍을 포함하는 녹농균의 혈청형 특이적 검출용 키트:
    a. 서열번호 1로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 2로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머,
    b. 서열번호 3으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 4로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머,
    c. 서열번호 5로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머,
    d. 서열번호 7로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 8로 기재된 서열로 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 및
    어닐링을 위한 반응물, 증폭을 위한 선택적인 반응물 및 녹농균 혈청형 특이적 검출을 위한 설명서.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 키트는 적어도 한 쌍의 혈청형 특이적 혼성화 탐지자를 제14항으로부터 선택되 적어도 하나의 혈청형 특이적 프라이머 쌍이 결합된 서열 내부에 있는 서열과 혼성화 하는 것을 추가적으로 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 적어도 한 쌍의 녹농균 혈청형 특이적인 혼성화 탐지자는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 키트:
    a. 서열번호 9로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 10으로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자,
    b. 서열번호 11로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 12로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자,
    c. 서열번호 13으로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 14로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자, 및
    d. 서열번호 15로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 탐지자들로 구성된 첫번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자 및 서열번호 16으로 기재된 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드들로 구성된 두번째 올리고뉴클레오타이드 탐지자.
  17. 제 15항 또는 16항에 있어서, 상기 녹농균 혈청형 특이적 탐지자는 검출이 용이한 마커로 표지된 것을 특징으로 하는 키트.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 검출 마커는 발광 마커, 형광 마커, 방사성 마커 및 효소 마로 구성에서 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 키트.
  19. 제 14항의 a 내지 d의 혈청형 특이적 프라이머를 포함하는, 녹농균 혈청형 IATS-01, IATS-06, IATS-011 및 IATS-02, IATS-05 및 IATS-016를 포함하는 녹농균 혈청형군 2을 동시 검출하는 키트.
  20. 녹농균 혈청형 특이적 검출을 위한 제 1항 또는 제 3항의 올리고 뉴클레오타이드 프라이머 또는 탐지자의 용도.
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