CN115927684A - 一种同时检测三种引起龋齿的病原体多重rt-pcr方法及试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测三种引起龋齿的病原体多重RT‑PCR方法及试剂盒和应用，该实时荧光定量PCR检测试剂盒包括PCR引物探针，PCR引物探针包括分别针对变形链球菌、远缘链球菌、干酪乳杆菌的正向PCR扩增引物、反向PCR扩增引物及检测探针；其序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9所示，本发明能够同时对引起龋齿的病原体进行快速检测和筛查，且具有较高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测三种引起龋齿的病原体的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒和应用。
背景技术
龋齿俗称虫牙、蛀牙，是细菌性疾病，因此它可以继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症，如不及时治疗，病变继续发展，形成龋洞，终至牙冠完全破坏消失，未经治疗的龋洞是不会自行愈合的，其发展的最终结果是牙齿丧失，龋齿是一种由口腔中多种因素复合作用所导致的牙齿硬组织进行性病损，表现为无机质脱矿和有机质的分解，随病程发展而从色泽改变到形成实质性病损的演变过程。其特点是发病率高，分布广。是口腔主要的常见病，也是人类最普遍的疾病之一，世界卫生组织已将其与癌肿和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。
龋齿主要由以下方面引起：1、普遍原因：蛀牙产生细菌，细菌产酸进而腐蚀掉牙齿表面的矿物质或釉质，使牙齿逐渐缺损、变黑，形成龋齿；2、细菌在生长代谢时分泌有毒或有害物质，导致牙齿矿物质的脱矿，为龋齿产生的原因，可造成牙齿硬组织的缺损，牙齿变黑。导致龋病的主要细菌应该是变形链球菌、轻链球菌、血链球菌，这些都是有可能导致龋病的一些主要细菌。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。因此，相比于传统的检测手段荧光定量PCR技术具有灵敏性高，特异性高的优点。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种同时检测三种引起龋齿的病原体多重RT-PCR方法及试剂盒和应用，其能够同时对三种引起龋齿的病原体进行快速检测和筛查，且具有较高的灵敏度。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种同时检测三种引起龋齿的病原体多重RT-PCR方法及试剂盒和应用，包括试剂盒和PCR引物探针组，所述试剂盒包括上游引物、下游引物、探针、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶，所述PCR引物探针组包括分别针对变形链球菌、远缘链球菌、干酪乳杆菌的正向PCR扩增引物、反向PCR扩增引物及检测探针。
进一步地，所述变形链球菌的所述正向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.2所示，检测探针序列如SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.1：5’-GATCCTTTATTGACGCAGATTC- 3’ ；
SEQ ID NO.2：5’-GATCCATGTTTTCCGACTCTA- 3’ ；
SEQ ID NO.3：5’-ACCAGCTTCTGACCGTCCATTACAATACC- 3’ ；
所述远缘链球菌正向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.5所示，检测探针序列如SEQ ID NO.6所示：
SEQ ID NO.4：5’-TCTGGAGGAAAGATGCGATTAGATAAGTA- 3’ ；
SEQ ID NO.5：5’-GCCAAGATACCGTTGACCTTAATCC- 3’ ；
SEQ ID NO.6：5’-CCACTTCCTTGGCGACTGGACGGCGT- 3’ ；
所述干酪乳杆菌正向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.8所示，检测探针序列如SEQ ID NO.9所示：
SEQ ID NO.7：5’-GCCGAAGAGAAGAAAGAAGAG- 3’ ；
SEQ ID NO.8：5’-CTGCTTGTGGAGCCAATATAC- 3’ ；
SEQ ID NO.9：5’-CGCTTCCGAACCGCTTCCAGACC- 3’ ；
进一步地，所述PCR引物探针组还包括针对人DNA内参的正向PCR扩增引物、反向PCR扩增引物及检测探针，所述人DNA内参的正向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.10所示，反向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.11所示，检测探针的序列如SEQ ID NO.12所示：
SEQ ID NO.10：5’-TCTGGCACCACACCTTCTACAA-3’ ；
SEQ ID NO.11：5’-GGATAGCACAGCCTGGATAGCA-3’ ；
SEQ ID NO.12：5’-AGGAGCACCCCGTGCTGCTGAC- 3’ ；
采用人DNA完整性的对照内参，确保在检测过程中对样品质量的判断，避免假阴性。
进一步地，所述变形链球菌的所述检测探针序列5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2 ；所述远缘链球菌的检测探针序列5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1 ；所述干酪乳杆菌的所述检测探针序列5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。
进一步地，所述人DNA内参的检测探针序列5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
进一步地，所述检测方法包括采集样本并提取核酸和以提取的核酸为模板进行PCR反应并采集荧光，具体步骤如下：
步骤(1) ：将样品提取模板、无RNase水、阳性质控品各7μL分别加入不同的PCR反应管中，并向各管中加入RT-PCR buffer 20μL、Hot Start Taq酶1μL和引物探针混合液2μL，配成体系，盖好管盖，放入荧光定量PCR仪中进行荧光PCR检测；
步骤（2）：设置仪器中PCR扩增反应条件为50℃2分钟（3.1℃/s）；95℃2秒钟（3.1℃/s）；95℃1秒钟（3.1℃/s），60℃10秒钟（2.38℃/s）并采集荧光，循环40次；
步骤（3）：步骤（2）反应完成后，基线设定为自动调整，根据扩增曲线图和Ct值对检测结果进行分析；
步骤(4)有效性判定：无RNase水检测出的Ct值为Undet或40，且阳性质控品检测出的Ct值≤38，否则实验视为无效；
步骤(5)结果判读：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，判定待测样品阳性或阴性。
进一步地，所述步骤(5)中待测样品阳性或阴性的的判定标准为：
阴性：样本检测孔Ct值为Undet或40；
阳性：样本检测孔Ct值≤38；
复测；样本DNA/RNA提取失败、待测样本中不含DNA/RNA或含量低于检测限；样本检测孔Ct值为38-40，需要复检一次，如果Ct值仍为38-40则为阴性。
进一步地，本发明还提供一种同时检测三种引起龋齿的病原体多重RT-PCR方法及试剂盒在制备检测龋齿试剂中的应用。
进一步地，本发明还提供一种同时检测三种引起龋齿的病原体多重RT-PCR方法及试剂盒在检测唾液样本和牙菌斑样本中的应用。
本发明的有益效果为：
发明的检测方法及试剂盒，同时针对三种引起龋齿的病原体变形链球菌、远缘链球菌、干酪乳杆菌进行检测，具有较高的灵敏度，较高的特异性，并缩短检测时间，提高检测效率；将为医院及其它医疗机构提供一种灵敏、准确、快速且低成本的检测方案。
附图说明
图1为本发明检测限实验的QPCR扩增曲线图；
图2为本发明重复性实验的QPCR扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明所述序列具体参见表1。
表1
实施例1 检测限验证
取酶混合液1.5μL，反应液13 μL，所示的各引物和探针的PCR引物溶液0.5μL，样本模板取5μL并采用如下的PCR反应的条件：50℃2分钟（3.1℃/s）；95℃2秒钟（3.1℃/s）；95℃1秒钟（3.1℃/s），60℃10秒钟（2.38℃/s）并采集荧光，循环40次，针对试剂盒进行检测限检测，用试剂盒进行检测每种病原菌的培养物，按照100000copies /mL、10000copies /mL、1000copies /mL的浓度梯度分别对每种菌进行上述PCR检测。荧光检测结果具体如图1所示，具体Ct值见表2。
表2
由图1可知，本实施例的检测方法及试剂盒的扩增效率好，使用拷贝数样本可达到1000copies /mL，具有非常高的灵敏度。
实施例2 重复性验证
取酶混合液1.5μL，反应液13 μL，所示的各引物和探针的PCR引物溶液0.5μL，样本模板取5μL并采用如下的PCR反应的条件：50℃2分钟（3.1℃/s）；95℃2秒钟（3.1℃/s）；95℃1秒钟（3.1℃/s），60℃10秒钟（2.38℃/s）并采集荧光，循环40次，针对试剂盒进行检测限检测，用试剂盒进行检测每种病原菌的培养物， 使用3种高浓度的病原菌培养物（100000copies /mL左右）进行3次重复实验，用3种中浓度的病原菌培养物（10000copies /mL左右）进行3次重复实验，进行上述PCR检测，荧光检测结果具体如图2所示。
具体Ct值见表3。
表3
由表3可知本试剂盒具有非常好的重复性。
需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种同时检测三种引起龋齿的病原体多重RT-PCR方法及试剂盒，其特征在于，包括试剂盒和PCR引物探针组，所述试剂盒包括上游引物、下游引物、探针、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶，所述PCR引物探针组包括分别变形链球菌、远缘链球菌、干酪乳杆菌的正向PCR扩增引物、反向PCR扩增引物及检测探针和人DNA内参的正向PCR扩增引物、反向PCR扩增引物及检测探针。
2.如权利要求1所述的一种同时检测三种引起龋齿的病原体多重RT-PCR方法及试剂盒，其特征在于，所述变形链球菌正向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.2所示，检测探针序列如SEQ ID NO.3所示；所述远缘链球菌的正向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.5所示，检测探针序列如SEQ ID NO.6所示；所述干酪乳杆菌的正向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.8所示，检测探针序列如SEQ ID NO.9所示，所述人DNA内参的正向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.10所示，反向PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.11所示，检测探针的序列如SEQ ID NO.12所示。
3.如权利要求1所述的一种同时检测三种引起龋齿的病原体多重RT-PCR方法及试剂盒，其特征在于，所述变形链球菌检测探针序列5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；所述远缘链球菌检测探针序列5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述干酪乳杆菌检测探针序列5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。
4.如权利要求1所述的一种同时检测三种引起龋齿的病原体多重RT-PCR方法及试剂盒，其特征在于，所述人DNA内参的检测探针序列5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
5.如权利要求1所述的一种同时检测三种引起龋齿的病原体多重RT-PCR方法及试剂盒，其特征在于，所述检测方法包括采集样本并提取核酸和以提取的核酸为模板进行PCR反应并采集荧光，具体步骤如下：
步骤(1) ：将样品提取模板、无RNase水、阳性质控品各7μL分别加入不同的PCR反应管中，并向各管中加入RT-PCR buffer 20μL、Hot Start Taq酶1μL和引物探针混合液2μL，配成体系，盖好管盖，放入荧光定量PCR仪中进行荧光PCR检测；
步骤(2) ：设置仪器中的PCR扩增反应条件为50℃2分钟-3.1℃/s；95℃2秒钟-3.1℃/s；95℃1秒钟-3.1℃/s，60℃10秒钟-2.38℃/s，并采集荧光，循环40次；
步骤(3)：步骤（2）反应完成后，基线设定为自动调整，根据扩增曲线图和Ct值对检测结果进行分析；
步骤(4)有效性判定：无RNase水检测出的Ct值为Undet或40，且阳性质控品检测出的Ct值≤38，否则实验视为无效；
步骤(5)结果判读：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，判定待测样品阳性或阴性。
6.如权利要求5所述的一种同时检测三种引起龋齿的病原体多重RT-PCR方法及试剂盒，其特征在于，所述步骤(5)中待测样品阳性或阴性的的判定标准为：
阴性：样本检测孔Ct值为Undet或40；
阳性：样本检测孔Ct值≤38；
复测；样本DNA/RNA提取失败、待测样本中不含DNA/RNA或含量低于检测限；样本检测孔Ct值为38-40，需要复检一次，如果Ct值仍为38-40则为阴性。
7.如权利要求1-6任一项所述的一种同时检测三种引起龋齿的病原体多重RT-PCR方法及试剂盒在制备检测龋齿试剂中的应用。
8.如权利要求1-6任一项所述的一种同时检测三种引起龋齿的病原体多重RT-PCR方法及试剂盒在检测唾液样本和牙菌斑样本中的应用。
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| JP2000300271A (ja) * | 1999-04-21 | 2000-10-31 | Tokuyama Corp | 齲蝕原因菌の検出方法 |
| KR101562491B1 (ko) * | 2014-10-31 | 2015-10-23 | 김성현 | 충치(치아우식) 원인균 동시 탐지를 위한 Multiplex real-time PCR 용 프라이머와 프로브 및 이의 용도 |
| CN105483215A (zh) * | 2015-11-25 | 2016-04-13 | 重庆医科大学附属口腔医院 | 致龋菌的定量检测方法 |
| KR101706070B1 (ko) * | 2016-06-28 | 2017-02-13 | (주) 와이디생명과학 | 멀티플렉스 실시간 pcr을 이용한 다수의 구강질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법 |
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2022
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| JP2000300271A (ja) * | 1999-04-21 | 2000-10-31 | Tokuyama Corp | 齲蝕原因菌の検出方法 |
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