CN114657257B - 用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合及其应用、鉴别方法 - Google Patents

用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合及其应用、鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组合，其包括引物一和引物二，其中，引物一为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子，引物二为核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子。本发明还公开了上述引物组合的应用，以及基于该引物组合的鉴别方法。实施本发明，可有效鉴别乌梢蛇药材、标准汤剂以及中药配方颗粒。

Description

用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组 合及其应用、鉴别方法
技术领域
本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组合及其应用、鉴别方法。
背景技术
我国蛇类物种约有两百余种，其中有20余种为常见蛇类，包括蕲蛇Agkistrodonacutus、乌梢蛇Zaocys dhumnades、金钱白花蛇Bungarus multicinctus、金环蛇Bungarusfasciatus、滑鼠蛇Ptyas mucosus、圆斑蝰Daboia russelii、眼镜蛇Naja naja、赤链蛇Lycodon rufozonatus、王锦蛇Elaphe carinata、灰鼠蛇Ptyas korros、短尾蝮蛇Gloydiusbrevicaudus、黑眉锦蛇Elaphe taeniura、百花锦蛇Elaphe moellendorffi等，其多数不具有临床药效。由于多种蛇类形态近似，药材鉴别困难，特别是加工处理时剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上的花纹特征、颜色几近消失，难以辨认，尤其是经过水提取制成标准汤剂，进一步加工成中药配方颗粒后，在失去药材性状后，更难以进行有效的鉴别。
一些研究指出，可采用PCR法(聚合酶链式反应法)对乌梢蛇药材进行鉴定。然而，对于乌梢蛇标准汤剂、中药配方颗粒而言，一者其往往含有一定比例的辅料，导致现有方法DNA提取效率不高；二者标准汤剂、中药配方颗粒在制备过程中，往往需要加热提取，导致DNA降解，难以存留超过200bp的DNA片段，导致现有方法检测精度低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组合，其专属性良好，可有效解决DNA失去形态后难以鉴别的问题。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种上述引物组合在鉴别乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂、或乌梢蛇中药配方颗粒中的应用。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种上述引物组合在鉴别乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂、或乌梢蛇中药配方颗粒的试剂盒中的应用。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种基于上述的用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组合的鉴别方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组合，其包括引物一和引物二，所述引物一为核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示的DNA分子；所述引物二为核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子。
相应的，本发明还公开了上述的用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组合在鉴别乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂、或乌梢蛇中药配方颗粒中的应用。
相应的，本发明还公开了上述的用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组合在鉴别乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂、或乌梢蛇中药配方颗粒的试剂盒中的应用。
相应的，本发明还公开了一种基于上述的用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组合的鉴别方法，其包括：
提取待检测样品的基因组DNA；
以所述基因组DNA为DNA模板，采用上述的用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组合进行PCR扩增，若扩增产物中含有135bp的DNA片段，则待检测样品为乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂或乌梢蛇中药配方颗粒。
作为上述技术方案的改进，提取待检测样品的基因组DNA的方法如下：
取待检测样品，加入CTAB沉淀液、蛋白酶K沉淀提取2～3次；取沉淀物加入CTAB提取液、β-巯基乙醇提取，然后加入氯仿-异戊醇萃取2～3次，取萃取后上清液，加入异丙醇或异丙醇-乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用水溶解，即得待检测样品的基因组DNA。
作为上述技术方案的改进，提取待检测样品的基因组DNA的方法如下：
取待检测样品0.3～0.8g，研磨成粉末，置离心管中，加入1～1.8mL的CTAB沉淀液、15～25μL蛋白酶K，混合均匀，在60～70℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；加入800～1000μL CTAB沉淀液，15～25μL蛋白酶K，混合均匀，在60～70℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；取沉淀加入800～1000μL CTAB提取液，5～15μLβ-巯基乙醇，混合均匀，在60～70℃下加热100～150min，离心，冷却至室温，取提取后上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡混匀后离心，取上清液700～800μL，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡混匀后离心，取上清液400～500μL，加入等体积的异丙醇或异丙醇-乙酸钠混合液，于-30～-20℃静置30～60min，离心后弃去上清液，再用乙醇洗涤沉淀2～4次，弃去上清液，沉淀于35～38℃孵育20～40min，待乙醇挥发后，加入30～50μL灭菌水溶解，即得到待检测样品的基因组DNA。
作为上述技术方案的改进，所述CTAB沉淀液包括CTAB、Tris-HCl、EDTA和水；其中，CTAB的浓度为1～3％(w/v)，Tris-HCl的浓度为80～120mmol/L，EDTA的浓度为10～30mmol/L；
所述CTAB提取液包括CTAB、Tris-HCl、EDTA、NaCl、PVP40和水；其中，CTAB的浓度为1～3％(w/v)，Tris-HCl的浓度为80～120mmol/L，EDTA的浓度为10～30mmol/L，NaCl的浓度为1～3mol/L，PVP40的浓度为10～30％(w/v)。
作为上述技术方案的改进，将DNA模板、引物组合、PCR缓冲液、dNTP、rTaq、水混合均匀，得到PCR扩增体系；
将所述PCR扩增体系按照预设扩增程序进行扩增，得到扩增产物；
将所述扩增产物进行电泳分析，记录其电泳图谱，若图谱中含有135bp的DNA片段，则待检测样品为乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂或乌梢蛇中药配方颗粒。
作为上述技术方案的改进，所述PCR扩增体系由下述物质组成：
10×PCR BufferⅠ(Mg2+pulse)2.5μL，dNTP Mixture 0.6μL，引物一0.3μL，引物二0.3μL，rTaq 0.3μL，DNA模板1μL，去离子水20μL。
作为上述技术方案的改进，所述PCR扩增程序为：
将所述扩增体系在90～95℃预变性3～7min，然后在预设程序下循环30～40次，最后在70～75℃延伸3～7min；
其中，所述预设程序为：将扩增体系在90～95℃变性25～32s，然后在59～61℃退火25～32s，再在70～73℃延伸28～35s。
作为上述技术方案的改进，所述PCR扩增程序为：
将所述扩增体系在95℃预变性5min，然后在预设程序下循环35次，最后在72℃延伸5min；
其中，所述预设程序为：将扩增体系在95℃变性30s，然后在59～61℃退火30s，再在72℃延伸30s。
作为上述技术方案的改进，所述电泳分析方法为：将所述扩增产物稀释后点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于115～125V电压条件下电泳45～60min，经Gelred显色，得到电泳图谱。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明设计了针对乌梢蛇药材、标准汤剂、中药配方颗粒的引物组合，并采用特定的PCR扩增方法，实现了乌梢蛇药材、标准汤剂和中药配方颗粒的快速鉴别。本发明中的引物组合、鉴别方法，可有效克服DNA提取过程中辅料干扰的问题，且可解决标准汤剂、中药配方颗粒在失去形态后难以鉴别的难题。
附图说明
图1是实施例3中各种蛇类样品进行PCR扩增后电泳检测结果图；其中，M为DNA分子量标准，1-6为乌梢蛇药材，7-9为乌梢蛇标准汤剂(冻干粉)，10-12为乌梢蛇中药配方颗粒，13-14为金钱白花蛇药材，15-16为蕲蛇药材，17-18为百花锦蛇药材，19-20为赤链蛇药材，21-22为短尾蝮蛇药材，23-24为黑眉锦蛇药材，25-26为灰鼠蛇药材，27-28为滑鼠蛇药材，29-30为金环蛇药材，31-32为王锦蛇药材，33-34为圆斑蝰蛇药材，35-36为眼镜蛇药材，37-38为竹叶青蛇药材，N为空白对照(ddH2O)；
图2是实施例4中灵敏度试验结果图；其中，M为DNA分子量标准，1-8为乌梢蛇中药配方颗粒(广东省佛山市)，其DNA模板量为300ng；9-10为乌梢蛇中药配方颗粒(江苏省江阴市)，其DNA模板量为100ng；11-12为乌梢蛇中药配方颗粒(四川省成都市)，其DNA模板量为80ng；13-14：11-12为乌梢蛇中药配方颗粒(广东省深圳市)，其DNA模板量为400ng；N：空白对照(ddH2O)；
图3是实施例5中各种蛇类样品进行PCR扩增后电泳检测结果图；其中，M为DNA分子量标准，1-2为乌梢蛇药材，3-4为乌梢蛇中药配方颗粒，5为王锦蛇药材，6为滑鼠蛇药材，7为圆斑蝰蛇药材，8为空白对照(ddH2O)；
图4是实施例6中各种蛇类样品进行PCR扩增后电泳检测结果图；其中，M为DNA分子量标准，1-2为乌梢蛇药材，3-4为乌梢蛇中药配方颗粒，5为王锦蛇药材，6为滑鼠蛇药材，7为圆斑蝰蛇药材，8为空白对照(ddH2O)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
本发明提供一种用于检测乌梢蛇药材、标准汤剂、中药配方颗粒的引物组合，具体的，其包括：引物一(正向引物)和引物二(反向引物)，其中，引物一为如下核苷酸序列如SEQID NO：1所示的DNA分子；引物二为核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子。
通过对常见蛇类物种的Cytochrome Oxidase I序列的同源比对分析，确定乌梢蛇的SNP位点，再根据含有该SNP位点的碱基序列设计引物，并综合考虑高温提取对DNA碱基序列的破坏作用、产物条带、引物评分等信息，得到上述引物组合。根据上述引物组合对乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂、乌梢蛇中药配方颗粒进行PCR扩增，可获得135bp大小的特异性片段。
本发明还提供了上述引物组合在鉴别乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂、或乌梢蛇中药配方颗粒中的应用。需要说明的是，本发明中的引物组合可用于鉴定含有乌梢蛇的各种物质，如药材、标准汤剂、中药配方颗粒、饮片、含乌梢蛇的中药复方(如风湿祛痛胶囊)等。
本发明还提供了上述引物组合鉴别乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂、或乌梢蛇中药配方颗粒的试剂盒中的应用。具体的，该试剂盒包括上述的引物组合，还包括PCR缓冲液、dNTP、rTaq和水。
本发明还公开了一种基于上述用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组合的鉴别方法，其包括：
(1)提取待检测样品的基因组DNA；
其中，待检测样品以固态形式提供，标准汤剂以冻干粉的形式提供(即将标准汤剂冷冻干燥后得到冻干粉)。
具体的，提取方法如下：
A、取待检测样品，加入CTAB沉淀液、蛋白酶K沉淀提取2～3次，得到沉淀物；
具体的，取待检测样品0.3～0.8g，研磨成粉末，置离心管中，加入1～1.8mL在65℃预热的CTAB沉淀液、15～25μL蛋白酶K，混合均匀，在60～70℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；加入800～1000μL CTAB沉淀液，15～25μL蛋白酶K，混合均匀，在60～70℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液，即得；
其中，CTAB沉淀液的组成为2％(w/v)CTAB，100mmol/L Tris-HCl(pH＝8.0)，20mmol/L EDTA(pH＝8.0)。
B、取沉淀物加入CTAB提取液、β-巯基乙醇提取，然后加入氯仿-异戊醇萃取2～3次，得萃取后上清液；
具体的，在沉淀物中加入800～1000μL CTAB提取液，5～15μLβ-巯基乙醇，混合均匀，在60～70℃下加热100～150min，离心，冷却至室温，取提取后上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，震荡混匀后离心，取上清液700～800μL，再加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，震荡混匀后离心，取上清液400～500μL，即得。
需要说明的是，在本步骤中，在采用CTAB提取液、β-巯基乙醇提取结束后，可直接加入氯仿-异戊醇，也可取提取后所得上清液再加入氯仿-异戊醇，取上清液再加入氯仿-异戊醇可提升提取准确度。
其中，CTAB提取液：1～3％(w/v)CTAB，80～120mmol/L Tris-HCl(pH＝8.0)，10～30mmol/L EDTA(pH＝8.0)，1～3mol/LNaCl，10～30％(w/v)PVP40。
C、取提取液加入异丙醇或异丙醇-乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用水溶解，即得待检测样品的基因组DNA。
具体的，取提取液，加入等体积的异丙醇或异丙醇-3mol/L乙酸钠混合液，于-30～-20℃静置30～60min，离心后弃去上清液，再用乙醇洗涤沉淀2～4次，弃去上清液，沉淀于35～38℃孵育20～40min，待乙醇挥发后，加入30～50μL灭菌水溶解，即得到待检测样品的基因组DNA，作为DNA模板。
需要说明的是，申请人在面临乌梢蛇标准汤剂、乌梢蛇中药配方颗粒中基因组DNA提取时，尝试了传统的CTAB法、螯合树脂法、曲拉通-100法、SDS法、碱式裂解法、DNeasyBlood&Tissue Kit法、磁珠法，但均得到了不溶性沉淀。故，本发明人在传统CTAB法的基础上，对CTAB沉淀液、CTAB提取液以及提取程序加以改进，得到了上述提取方法。上述提取方法尽量多地保留乌梢蛇标准汤剂、乌梢蛇中药配方颗粒中的基因组DNA信息，同时可克服辅料干扰的问题。
(2)形成PCR扩增体系，并进行扩增，得到扩增产物；
具体的，将DNA模板、引物组合、PCR缓冲液、dNTP、rTaq、水混合均匀，得到PCR扩增体系；
更具体的，PCR扩增体系的总体积为25μL，其包括：10×PCR BufferⅠ(Mg2+pulse)2.5μL，dNTP Mixture 0.6μL，引物一0.3μL，引物二0.3μL，rTaq 0.3μL，DNA模板1μL，去离子水20μL。
扩增程序为：90～95℃预变性3～7min；90～95℃变性25～32s，59～61℃退火25～32s，70～73℃延伸28～35s，循环30～40次；最后在70～75℃延伸3～7min。
优选的，扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，59～61℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后在72℃延伸5min。
(3)将扩增产物进行分析；
具体的，可采用电泳法或荧光染色法对扩增产物进行分析，但不限于此。
优选的，采用电泳法对扩增产物进行分析，具体如下：
取扩增产物，加入5μL 6×loading buffer，混匀，取混合产物5～10μL点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于115～125V电压条件下电泳45～60min，经Gelred显色，得到电泳图谱。若电泳图谱中含有135bp的DNA片段，则待检测样品为乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂或乌梢蛇中药配方颗粒。
下面以具体实施例对本发明进行说明。
实施例1引物设计
以中国药典2020年版乌梢蛇及常见蛇类NADH；Cytochrome Oxidase I；12SrRNA；16S rRNA；Cytochrome b序列分析为基础，利用BioEdit软件对GeneBank数据库中常见蛇类物种的Cytochrome Oxidase I序列进行同源比对，校对后分析乌梢蛇的特异性SNP位点，将包含SNP位点的碱基序列导入到Primer Premier 5软件中，进行引物设计。
经序列对比发现，乌梢蛇特异性位点为T而其他为A或C，确定该SNP位点后，使SNP位点接近正向引物3’端，通过移动上游引物位置，调节引物得分及GC含量，并借助PrimerPremier 5软件，进一步调节反向引物位置，通过最终引物评分、产物条带得分以确定最佳组合。在设计过程中，还需考虑到经高温提取后，对DNA碱基序列的破坏作用。综合以上因素，获得的引物组合如下：
引物一：5’-CCCCTAATAATCGGAGCG-3；
引物二：5’-TACTGTTCACCCAGTGCC-3’。
实施例2鉴定方法建立
(1)DNA提取及浓度调节
取干燥的样品0.5g，研磨成粉末，置2mL离心管中，加入1.5mL在65℃预热的CTAB沉淀液、20μL蛋白酶K，混匀，65℃水浴加热60min，冷却至室温后，以10000r/min离心5min，弃上清液，再加入900μL CTAB沉淀液、20μL蛋白酶K，同法操作。向该离心管中依次加入900μLCTAB提取液、10μLβ-巯基乙醇，混匀，65℃水浴加热120min，离心，待冷却至室温后取上清液；加入等体积的氯仿-异戊醇(24﹕1)，震荡3min，混匀；再以12000r/min，4℃离心10min，取上清液750μL加入新的2mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24﹕1)，震荡3min，混匀；再以12000r/min，4℃离心10min；再取上清液450μL于1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，于-20℃静置30～60min。取出该离心管以12000r/min离心5min，弃上清液，再分别用75％乙醇、无水乙醇洗涤沉淀两次，弃上清液，沉淀于37℃孵育30min，待乙醇挥发后，加灭菌水30μL使溶解。
其中，CTAB沉淀液组成如下：2％(w/v)CTAB(上海源叶生物科技有限公司)，100mMTris-HCl(pH＝8.0)(Beijing Solarbio)，20mM EDTA(pH＝8.0)(Shanghai Yu Bo BiotechCo.,Ltd)。
CTAB提取液组成如下：2％(w/v)CTAB(上海源叶生物科技有限公司)，100mM Tris-HCl(pH＝8.0)(Beijing Solarbio)，20mM EDTA(pH＝8.0)(Shanghai Yu Bo Biotech Co.,Ltd)，2.5mol/LNaCl(西陇科学股份有限公司)，20％PVP40(上海源叶生物科技有限公司)。
取上述DNA样品，采用BioSpec-nano微量紫外分光光度计测定DNA浓度，同时记录OD260/OD230，OD260/OD280，并调整浓度到50ng/μL，得到DNA模板。
(2)设计引物组合
引物组合的序列为：引物一(正向引物)如SEQ ID NO：1所示；引物二(反向引物)如SEQ ID NO：2所示。
(3)PCR扩增
PCR扩增体系：10×PCR Buffer I(Mg2+pluse)2.5μL，2.5mmol/L的dNTP Mixture0.6μL，10μmol/L的引物一0.3μL，10μmol/L的引物二0.3μL，5U/μL的rTaq聚合酶0.3μL，50ng/μL的DNA模板1μL，去离子水20μL。上述液体震荡混匀，瞬时离心，即得PCR扩增体系。
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；61℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。
(4)电泳检测
取扩增产物，加入6×loading buffer 5μL，混匀，取混合产物8μL点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于120V电压的条件下电泳50min，经Gelred显色，最后于凝胶成像仪观察记录结果。
如果电泳图谱中含有135bp的DNA片段，则待检测样品为乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂或乌梢蛇中药配方颗粒。
实施例3鉴定方法验证
选取14个已知物种的蛇类样品(具体如表1所示)。
采用实施例2建立的鉴别方法对样品进行鉴定。其中，PCR体系中，DNA模板量为50ng。
表1样品表
鉴定结果如图1所示，从图中可以看出，乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂(冻干粉)、乌梢蛇中药配方颗粒均存在135bp的条带；而其他样品均未得到该条带。该结果表明，本发明中的鉴别方法准确率达到100％。
实施例4灵敏度试验
分别取不同厂家生产的乌梢蛇中药配方颗粒(表1中样品4～6)。提取待检测样品的基因组DNA，并采用ddH2O对基因组DNA进行稀释，然后采用实施例2中步骤3～4的方法进行测试。
其中，乌梢蛇中药配方颗粒(广东省佛山市)相关样品测试的PCR扩增体系中，DNA模板的含量为300ng；
乌梢蛇中药配方颗粒(江苏省江阴市)相关样品测试的PCR扩增体系中，DNA模板的含量为100ng；
乌梢蛇中药配方颗粒(四川省成都市)相关样品测试的PCR扩增体系中，DNA模板的含量为80ng；
乌梢蛇中药配方颗粒(广东省深圳市)相关样品测试的PCR扩增体系中，DNA模板的含量为400ng；
测试结果如图2所示，从图中可以看出，各厂家生产的乌梢蛇中药配方颗粒均存在135bp的条带；可见本发明的方法对于80～400ng的DNA模板量均具有良好的适用性。
实施例5方法学验证-退火温度
(1)取表1中编号为1～2、4～5的乌梢蛇样品，编号为17的王锦蛇，编号为15的滑鼠蛇，编号为18的圆斑蝰蛇作为样品；
(2)采用实施例2所建立的方法对样品进行鉴定；其中，鉴定过程中，分别采用57℃、59℃、61℃和63℃的退火温度。
测试结果如图3所示，从图中可以看出，当退火温度分别为57℃、59℃、61℃、63℃时，PCR扩增条带差异较小且均空白对照无假阳性出现。当退火温度达到63℃时，条带有减弱趋势，但空白对照无假阳性出现；当退火温度为57℃时，条带较弱。因此，退火温度为59～61℃。
实施例6方法学验证-PCR扩增体系
(1)取表1中编号为1～2、4～5的乌梢蛇样品，编号为17的王锦蛇，编号为15的滑鼠蛇，编号为18的圆斑蝰蛇作为样品；
(2)采用实施例2所建立的方法对样品进行鉴定；其中，鉴定过程中，其中，鉴定过程中，分别采用0.3μL的浓度为5U/μL的rTaq酶、ExTaq酶、SpeedSTAR酶、MightyAMP酶与10×PCR Buffer I(Mg2+pluse)2.5μL，2.5mmol/L的dNTP Mixture 0.6μL，10μmol/L的引物一0.3μL，10μmol/L的引物二0.3μL，50ng/μL的DNA模板1μL，去离子水20μL组成扩增体系。
测试结果如图4所示，从图中可以看出，rTaq酶和SpeedSTAR酶均获得PCR扩增条带，为保证条带的亮度，故选DNA聚合酶为rTaq酶。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东一方制药有限公司
<120> 用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组合及其应用、
鉴别方法
<130> Zaocys dhumnades
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cccctaataa tcggagcg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tactgttcac ccagtgcc 18

Claims (3)

1.一种乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂及乌梢蛇中药配方颗粒的PCR鉴别方法，其特征在于，包括：
取待检测样品0.3～0.8g，研磨成粉末，置离心管中，加入1～1.8mL的CTAB沉淀液、15～25μL蛋白酶K，混合均匀，在60～70℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；加入800～1000μL CTAB沉淀液，15～25μL蛋白酶K，混合均匀，在60～70℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；取沉淀加入800～1000μL CTAB提取液，5～15μLβ-巯基乙醇，混合均匀，在60～70℃下加热100～150min，离心，冷却至室温；取提取后上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡混匀后离心，取上清液700～800μL，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡混匀后离心，取上清液400～500μL，加入等体积的异丙醇或异丙醇-乙酸钠混合液，于-30～-20℃静置30～60min，离心后弃去上清液，再用乙醇洗涤沉淀2～4次，弃去上清液，沉淀于35～38℃孵育20～40min，待乙醇挥发后，加入30～50μL灭菌水溶解，即得到待检测样品的基因组DNA；其中，所述CTAB沉淀液的组成为：2％(w/v)CTAB，100mmol/LTris-HCl，20mmol/LEDTA；所述CTAB提取液的组成为：2％(w/v)CTAB，100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，2.5mol/L NaCl，20％(w/v)PVP40；其中，Tris-HCl、EDTA的pH均为8.0；
以所述基因组DNA为DNA模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的引物一、核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的引物二进行PCR扩增，若扩增产物中含有135bp的DNA片段，则待检测样品为乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂或乌梢蛇中药配方颗粒；
其中，PCR扩增体系由下述物质组成：
10×PCR BufferⅠMg2+plus 2.5μL，dNTP Mixture 0.6μL，引物一0.3μL，引物二0.3μL，rTaq 0.3μL，DNA模板1μL，去离子水20μL；
PCR扩增程序为：
将所述扩增体系在95℃预变性5min，然后在预设程序下循环35次，最后在72℃延伸5min；
其中，所述预设程序为：将扩增体系在95℃变性30s，然后在59～61℃退火30s，再在72℃延伸30s。
2.如权利要求1所述的PCR鉴别方法，其特征在于，将所述扩增产物进行电泳分析，记录其电泳图谱，若图谱中含有135bp的DNA片段，则待检测样品为乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂或乌梢蛇中药配方颗粒。
3.如权利要求2所述的PCR鉴别方法，其特征在于，所述电泳分析方法为：将所述扩增产物稀释后点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于115～125V电压条件下电泳45～60min，经Gelred显色，得到电泳图谱。
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乌梢蛇实时荧光定量PCR法的建立及与普通PCR鉴别方法的比较研究;杨宝等;药学研究(第11期);摘要，正文第637页左栏第2段至640页左栏第2段 *
杨宝等.乌梢蛇实时荧光定量PCR法的建立及与普通PCR鉴别方法的比较研究.药学研究.2020,(第11期),摘要，正文第637页左栏第2段至640页左栏第2段. *

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