KR101925827B1 - 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균 검출용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 게놈 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머와 프로브; 상기 프라이머와 프로브를 포함하는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균 검출용 조성물; 및 이를 이용하여 상기 균을 특이적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 치주질환 원인균인 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 특이적으로 검출할 수 있어 유용하다. 특히, 본 발명에 의하면 멀티플랙스로 다른 유해 세균 존재 하에서도 해당 균을 특이적으로 검출할 수 있어 시간적, 원가비용적 절감이 된다는 장점이 있다.
본 발명에 의하면, 치주질환 원인균인 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 특이적으로 검출할 수 있어 유용하다. 특히, 본 발명에 의하면 멀티플랙스로 다른 유해 세균 존재 하에서도 해당 균을 특이적으로 검출할 수 있어 시간적, 원가비용적 절감이 된다는 장점이 있다.
Description
본 발명은 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균 검출용 조성물에 관한 발명으로, 보다 상세하게는 본 발명에 따른 프라이머와 프로브를 포함하는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균 검출용 조성물 및 이를 이용하여 상기 균을 검출하는 방법에 관한 것이다.
인간의 구강 내에는 약 700여 세균 종이 있다고 알려져 있으며, 수많은 세균이 덩어리를 이룬 채로 서식하여 치면 세균막을 이루고 있다. 치아와 치아 사이나 치아와 잇몸사이에 생긴 치면세균막은 칫솔질에 의해서도 제거되지 않고 잔류하며, 이러한 부위에 남아있는 치면세균막 내에서 세균들이 증식하면서 치은조직에 직접 작용하여 면역반응을 유발시키거나 세포 독성물질을 방출하여 치은조직에 염증을 일으킨다. 이러한 염증은 치조골까지 진행되면서 치주염을 일으키게 된다.
치주 질환(Periodontal Disease)은 위에서 기술한 것과 같이 치면세균막에 존재하는 세균에 의해 치아의 지지조직(백악질, 치은, 치조골, 치주인대)에 염증이 발생하는 질환이다. 치주 질환은 크게 임상적으로 치조골 파괴가 동반되지 않고 치은 조직에만 염증이 존재하는 치은염(gingivitis)과, 치조골 파과까지 동반된 치주염(periodontitis)으로 분류할 수 있다. 이처럼, 치주질환의 초기단계인 치은염은 연한 잇몸조직에만 침범한 것으로 이 단계에서는 치면세균막과 치석의 제거만으로도 회복이 가능하다. 하지만, 치료를 받지 않으면 치조골이 파괴되는 치주염으로 진행되고, 잇몸 수술 등의 치료를 받지 않을 경우 결국 치아를 잃게 된다.
현재까지의 연구 결과에 의하면, 흡연 여부, 당뇨병 등의 전신 질환 및 면역 결핍을 동반하는 질병 등이 치주 질환으로의 발병에 영향을 주지만, 치은연하 치면세균막에 존재하는 그람-음성 세균 종들이 치주 질환을 일으키는 주요한 병인으로 알려져 있다. 여러 연구자들의 역학연구들에 의해, 치주질환의 주요한 원인균종으로 트리포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 테너넬라 포사이시아(Tannernella forsythia), 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 프리보텔라 인터미디어(Prevotella intermedia), 캠파일로박터 렉터스(Campylobacter rectus), 퓨조박테리움 뉴클레아텀(Fusobacterium nucleatum) 등이라고 알려져 있다.
한편, 현재까지 치주 질환은 임상 및 방사선학적 결과를 토대로, 환자 연령에 따른 치주 조직의 변화, 예를 들어 치조골의 소실 정도, 동요도, 염증 양상 등을 종합하여 진단한다. 하지만, 치주 질환과 관련해서는 대부분 치조골 소실량이 50% 이상 진행된 상태에서 병원을 찾게 되므로 지속적인 처치를 요하게 된다.
그러나 지금까지 치주 질환과 관련하여 그 원인균에 의한 감염 여부 또는 원인균의 존재 여부를 조기에 탐지 및 검색하기에는 한계점이 있었다. 그나마 지금까지 이와 관련한 치주질환에 관련된 병원성 세균 종을 찾기 위한 분자역학적 연구는 주로 16S rRNA gene(16S rDNA)을 표적으로 하여 PCR법을 이용하여 정성 분석한 것이 대부분이었다. 그러나 상기의 기존의 방법으로는 수많은 치주질환 병원성 세균 종을 종-특이적으로 검출해 낼 수 있는 PCR 프라이머 설계 및 개발이 불가능했으며, 치주질환 원인균의 분자역학적 연구를 위해 정성 및 정량 데이터를 동시에 얻을 수 있는 세균 종 검출기법의 개발에도 한계가 존재하였다.
따라서, 치주질환의 예방, 발병가능성 및 치료 후 예후 판정을 위해 세균감염성 구강질환의 원인균종을 효율적이면서도 민감도가 높은 방법으로 검출할 수 있는 시스템 개발의 필요성이 제기되고 있는 실정이다.
Aberg, C., Kelk, P. and Johansson, A. (2014). Aggregatibacter actinomycetemcomitans : Virulence of its leukotoxin and association with aggressive periodontitis. Virulence, 6(3), pp.188-195.
Braga, R., Carvalho, M., Bruna-Romero, O., Teixeira, R., Costa, J., Mendes, E., Farias, L. and Magalhaes, P. (2010). Quantification of five putative periodontal pathogens in female patients with and without chronic periodontitis by real-time polymerase chain reaction. Anaerobe, 16(3), pp.234-239.
Brown, A., Boesze-Battaglia, K., Du, Y., Stefano, F., Kieba, I., Epand, R., Kakalis, L., Yeagle, P., Epand, R. and Lally, E. (2012). Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin cytotoxicity occurs through bilayer destabilization. Cellular Microbiology, 14(6), pp.869-881.
Gaetti-Jardim, E., Marcelino, S., Feitosa, A., Romito, G. and Avila-Campos, M. (2009). Quantitative detection of periodontopathic bacteria in atherosclerotic plaques from coronary arteries. Journal of Medical Microbiology, 58(12), pp.1568-1575.
Kuboniwa, M., Amano, A., Kimura, K., Sekine, S., Kato, S., Yamamoto, Y., Okahashi, N., Iida, T. and Shizukuishi, S. (2004). Quantitative detection of periodontal pathogens using real-time polymerase chain reaction with TaqMan probes. Oral Microbiology and Immunology, 19(3), pp.168-176.
Morillo, J., Lau, L., Sanz, M., Herrera, D., Martin, C. and Silva, A. (2004). Quantitative real-time polymerase chain reaction based on single copy gene sequence for detection of periodontal pathogens. Journal of Clinical Periodontology, 31(12), pp.1054-1060.
Nonnenmacher, C., Dalpke, A., Mutters, R. and Heeg, K. (2004). Quantitative detection of periodontopathogens by real-time PCR. Journal of Microbiological Methods, 59(1), pp.117-125.
Sanchez, G., Acquier, A., De Couto, A., Busch, L. and Mendez, C. (2015). Association between Aggregatibacter actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis in subgingival plaque and clinical parameters, in Argentine patients with aggressive periodontitis. Microbial Pathogenesis, 82, pp.31-36.
Walters, M., Brown, A., Edrington, T., Baranwal, S., Du, Y., Lally, E. and Boesze-Battaglia, K. (2013). Membrane association and destabilization by Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin requires changes in secondary structures. Mol oral Microbiol, 28(5), pp.342-353.
이에 본 발명자들은 구강 세균감염성질환을 일으키는 병원성 세균 중에서도 유해세균으로 알려져 있는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머와 프로브를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 LtA 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머와 프로브를 제작하였고, 상기 프라이머와 프로브를 이용하면 다양한 시료에서 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 특이적이고 간단하게 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 1), 서열번호 5 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 7) 및 서열번호 5 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 8) 중에서 선택된 프라이머 세트와, 서열번호 16 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 프로브를 포함하는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 a)분석 대상의 시료에서 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 gDNA를 검출하는 단계; b)상기 핵산을 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 1), 서열번호 5 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 7) 및 서열번호 5 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 8) 중에서 선택된 프라이머 세트 및 서열번호 16 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 프로브를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭 산물을 생성하는 단계;를 포함하는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 검출 또는 정량하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 1), 서열번호 5 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 7) 및 서열번호 5 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 8) 중에서 선택된 프라이머 세트와, 서열번호 16 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 프로브를 포함하는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 검출 또는 정량용 키트를 제공하는 데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 1), 서열번호 5 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 7) 및 서열번호 5 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 8) 중에서 선택된 프라이머 세트 및 서열번호 16 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 프로브를 포함하는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 1), 서열번호 5 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 7) 및 서열번호 5 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 8) 중에서 선택된 프라이머 세트 및 서열번호 16 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 프로브를 포함하는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 검출 또는 정량용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 a)분석 대상의 시료에서 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 gDNA를 검출하는 단계; b)상기 핵산을 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 1), 서열번호 5 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 7) 및 서열번호 5 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 8) 중에서 선택된 프라이머 세트 및 서열번호 16 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 프로브를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭 산물을 생성하는 단계;를 포함하는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 특이적으로 검출할 수 있도록 제작된 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 조성물을 이용함으로써 분석 대상시료에서 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 매우 간단하고 효과적으로 검출 또는 멀티플랙스 분석을 할 수 있다.
또한, 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 정량 분석을 통해 질환의 진행 정도를 진단할 수 있으며, 치주질환 치료 전후의 세균 검출 결과 비교분석을 통해 세균학적 예후평가를 규명하는 도구로도 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1의 a)는 본 발명의 프라이머 세트와 프로브에 의하여 증폭되는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 LtA 유전자의 gDNA 일부를 나타낸 것이다.
도 1의 b) 본 발명의 9개의 프라이머 세트 후보군에 의하여 증폭되는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 LtA 유전자의 gDNA 일부를 나타낸 것이다.
도 2a는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 전체 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 1 (AaLtF11+R11)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 2 (AaLtF11+R13)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2d는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 3 (AaLtF11+R14)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2e는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 4 (AaLtF13+R11)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2f는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 5 (AaLtF13+R13)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2g는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 6 (AaLtF13+R14)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2h는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 7 (AaLtF14+R11)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2i는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 8 (AaLtF14+R13)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2j는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 9 (AaLtF14+R14)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2k는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트의 A.a균의 gDNA를 주형으로 이용하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 2l는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트의 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 이용하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 2m는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트의 음성대조군으로 증류수 (D.W)를 주형으로 이용하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 1 (AaLtF11+R11)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 2 (AaLtF11+R13)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3c는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 3 (AaLtF11+R14)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3d는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 4 (AaLtF13+R11)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3e는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 5 (AaLtF13+R13)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3f는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 6 (AaLtF13+R14)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3g는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 7 (AaLtF14+R11)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3h는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 8 (AaLtF14+R13)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3i는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 9 (AaLtF14+R14)의 결과를 나타낸 것이다.
도 4a)는 상기 선정된 3개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 프로브 (AaLtP13-FAM, 서열번호 18)를 이용하여 A.a균의 gDNA와 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA와 실제 환자 샘플의 gDNA와 음성 대조군인 증류수 (D.W)를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 전체 결과를 나타낸 것이다.
도 4b)는 상기 선정된 3개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 프로브 (AaLtP13-FAM, 서열번호 18)를 이용하여 A.a균의 gDNA와 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA와 실제 환자 샘플의 gDNA와 음성 대조군인 증류수 (D.W)를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과 중 A.a균의 gDNA를 주형으로 하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 4c)는 상기 선정된 3개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 프로브 (AaLtP13-FAM, 서열번호 18)를 이용하여 A.a균의 gDNA와 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA와 실제 환자 샘플의 gDNA와 음성 대조군인 증류수 (D.W)를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과 중 클론 DNA를 주형으로 하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 4d)는 상기 선정된 3개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 프로브 (AaLtP13-FAM, 서열번호 18)를 이용하여 A.a균의 gDNA와 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA와 실제 환자 샘플의 gDNA와 음성 대조군인 증류수 (D.W)를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과 중 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 4e)는 상기 선정된 3개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 프로브 (AaLtP13-FAM, 서열번호 18)를 이용하여 A.a균의 gDNA와 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA와 실제 환자 샘플의 gDNA와 음성 대조군인 증류수 (D.W)를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과 중 음성 대조군인 증류수 (D.W)를 주형으로 하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 실제 환자 샘플 (1019KimJ)의 gDNA를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 실제 환자 샘플 (1023HuhS)의 gDNA를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5c는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 실제 환자 샘플 (1105LimJ)의 gDNA를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5d는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 실제 환자 샘플 (1111KimI)의 gDNA를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5e는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 A.a 균의 클론 DNA (10^-6)를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5f는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 클론 DNA (10^-6)들의 혼합 시료를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5g는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 음성대조군인 증류수를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Taq man Probe Real-time PCR의 검출 민감도와 정량 분석의 신뢰성을 확인하기 위해 상기 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA의 10배씩 serial dilution된 시료를 대상으로 형광 증폭 곡선을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 상기 선정된 프라이머 세트 7 (AaLtF14+R11)의 실제 멀티플랙스로 다른 유해 세균인 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis, P.g)균과 타네렐라 포르시시아 (Tannerella forsythia, T.f)균과 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola, T.d)균의 제작된 각각의 프라이머 세트와 각각 다른 형광 물질을 붙여서 합성된 프로브들을 함께 혼합하여 환자 샘플을 분석함에 있어서 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균에 대한 검출능을 확인하기 위하여 강남리플랜트치과에서 수집된 40명의 치주질환 환자들의 gDNA를 주형으로 상기 4개의 균의 gDNA르 바탕으로 클로닝된 클론의 DNA의 혼합물의 10배씩 희석된 시료들(10^-2~10^-6)을 바탕으로 한 Standard Curve를 이용하여 정량하는 다중 실시간 중합효소연쇄반응 (Multiplex Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 1의 b) 본 발명의 9개의 프라이머 세트 후보군에 의하여 증폭되는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 LtA 유전자의 gDNA 일부를 나타낸 것이다.
도 2a는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 전체 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 1 (AaLtF11+R11)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 2 (AaLtF11+R13)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2d는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 3 (AaLtF11+R14)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2e는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 4 (AaLtF13+R11)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2f는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 5 (AaLtF13+R13)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2g는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 6 (AaLtF13+R14)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2h는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 7 (AaLtF14+R11)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2i는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 8 (AaLtF14+R13)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2j는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 9 (AaLtF14+R14)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2k는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트의 A.a균의 gDNA를 주형으로 이용하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 2l는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트의 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 이용하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 2m는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트의 음성대조군으로 증류수 (D.W)를 주형으로 이용하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 1 (AaLtF11+R11)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 2 (AaLtF11+R13)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3c는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 3 (AaLtF11+R14)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3d는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 4 (AaLtF13+R11)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3e는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 5 (AaLtF13+R13)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3f는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 6 (AaLtF13+R14)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3g는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 7 (AaLtF14+R11)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3h는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 8 (AaLtF14+R13)의 결과를 나타낸 것이다.
도 3i는 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과 중 프라이머 세트 9 (AaLtF14+R14)의 결과를 나타낸 것이다.
도 4a)는 상기 선정된 3개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 프로브 (AaLtP13-FAM, 서열번호 18)를 이용하여 A.a균의 gDNA와 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA와 실제 환자 샘플의 gDNA와 음성 대조군인 증류수 (D.W)를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 전체 결과를 나타낸 것이다.
도 4b)는 상기 선정된 3개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 프로브 (AaLtP13-FAM, 서열번호 18)를 이용하여 A.a균의 gDNA와 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA와 실제 환자 샘플의 gDNA와 음성 대조군인 증류수 (D.W)를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과 중 A.a균의 gDNA를 주형으로 하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 4c)는 상기 선정된 3개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 프로브 (AaLtP13-FAM, 서열번호 18)를 이용하여 A.a균의 gDNA와 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA와 실제 환자 샘플의 gDNA와 음성 대조군인 증류수 (D.W)를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과 중 클론 DNA를 주형으로 하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 4d)는 상기 선정된 3개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 프로브 (AaLtP13-FAM, 서열번호 18)를 이용하여 A.a균의 gDNA와 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA와 실제 환자 샘플의 gDNA와 음성 대조군인 증류수 (D.W)를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과 중 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 4e)는 상기 선정된 3개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 프로브 (AaLtP13-FAM, 서열번호 18)를 이용하여 A.a균의 gDNA와 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA와 실제 환자 샘플의 gDNA와 음성 대조군인 증류수 (D.W)를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과 중 음성 대조군인 증류수 (D.W)를 주형으로 하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 실제 환자 샘플 (1019KimJ)의 gDNA를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 실제 환자 샘플 (1023HuhS)의 gDNA를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5c는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 실제 환자 샘플 (1105LimJ)의 gDNA를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5d는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 실제 환자 샘플 (1111KimI)의 gDNA를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5e는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 A.a 균의 클론 DNA (10^-6)를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5f는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 클론 DNA (10^-6)들의 혼합 시료를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5g는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 음성대조군인 증류수를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Taq man Probe Real-time PCR의 검출 민감도와 정량 분석의 신뢰성을 확인하기 위해 상기 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA의 10배씩 serial dilution된 시료를 대상으로 형광 증폭 곡선을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 상기 선정된 프라이머 세트 7 (AaLtF14+R11)의 실제 멀티플랙스로 다른 유해 세균인 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis, P.g)균과 타네렐라 포르시시아 (Tannerella forsythia, T.f)균과 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola, T.d)균의 제작된 각각의 프라이머 세트와 각각 다른 형광 물질을 붙여서 합성된 프로브들을 함께 혼합하여 환자 샘플을 분석함에 있어서 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균에 대한 검출능을 확인하기 위하여 강남리플랜트치과에서 수집된 40명의 치주질환 환자들의 gDNA를 주형으로 상기 4개의 균의 gDNA르 바탕으로 클로닝된 클론의 DNA의 혼합물의 10배씩 희석된 시료들(10^-2~10^-6)을 바탕으로 한 Standard Curve를 이용하여 정량하는 다중 실시간 중합효소연쇄반응 (Multiplex Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시형태들을 설명한다. 다만, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시형태는 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
*
본 발명자들은 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 동정 및 검출하기 위한 표적 유전자로 LtA 유전자에 주목하였는데, LtA 유전자는 치주질환 원인균 A.a 균의 대표적 질환 유발 기작이 있는 단백질의 유전자이다.
본 발명자들은 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 LtA 유전자가 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 제외한 다른 세균으로부터 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 구별할 수 있는 특이 유전자임을 확인하고 해당 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트와 프로브는 하기와 같이 설계하였다.
[프라이머 세트와 프로브의 조합 1]
(AaLtF14 + AaLtR11 +AaLtP11)
정방향 (forward) 프라이머: 5'-GGTGGAGAAGGAAATGATATTTATG-3' (서열번호5)
역방향 (reverse) 프라이머: 5'-ATTGCCGTTACGCTCAAATG-3' (서열번호 2)
가수분해 프로브: 5‘-(FAM) TGGGCACCACACTATTACGGAA (BHQ1)-3’ (서열번호 16)
앰플리콘(amplicaon): 5'-GGTGGAGAAGGAAATGATATTTATGTTTACCGTAA
GGAATATGGCCACCACACTATTACGGAACATAGCGGTGATAAAGATAAATTATCATTAGCAAATATCAACCTCAAAGAGGTGTCATTTGAGCGTAACGGCAAT-3' (서열번호 13)
[프라이머 세트와 프로브의 조합 2]
(AaLtF14 + AaLtR11 +AaLtP12)
정방향 (forward) 프라이머: 5'-GGTGGAGAAGGAAATGATATTTATG-3' (서열번호5)
역방향 (reverse) 프라이머: 5'-ATTGCCGTTACGCTCAAATG-3' (서열번호 2)
가수분해 프로브: 5‘-(FAM) TGGCCACCACACTATTACGGAACA (BHQ1)-3’ (서열번호 17)
앰플리콘(amplicaon): 5'-GGTGGAGAAGGAAATGATATTTATGTTTACCGTAA
GGAATATGGCCACCACACTATTACGGAACATAGCGGTGATAAAGATAAATTATCATTAGCAAATATCAACCTCAAAGAGGTGTCATTTGAGCGTAACGGCAAT-3' (서열번호 13)
[프라이머 세트와 프로브의 조합 3]
(AaLtF14 + AaLtR11 +AaLtP13)
정방향 (forward) 프라이머: 5'-GGTGGAGAAGGAAATGATATTTATG-3' (서열번호5)
역방향 (reverse) 프라이머: 5'-ATTGCCGTTACGCTCAAATG-3' (서열번호 2)
가수분해 프로브: 5‘-(FAM) CCACACTATTACGGAACATAGCGGTG (BHQ1)-3’ (서열번호 18)
앰플리콘(amplicaon): 5'-GGTGGAGAAGGAAATGATATTTATGTTTACCGTAA
GGAATATGGCCACCACACTATTACGGAACATAGCGGTGATAAAGATAAATTATCATTAGCAAATATCAACCTCAAAGAGGTGTCATTTGAGCGTAACGGCAAT-3' (서열번호 13)
구체적으로, LtA 유전자의 서열번호 3148 번 내지 3277 번의 영역을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 1), 서열번호 5 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 7) 및 서열번호 5 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 8) 중에서 선택된 프라이머 세트로, 프라이머 세트 1의 정방향 프라이머(forward primer)가 서열번호 1, 역방향 프라이머(reverse primer)가 서열번호 2이고, 프라이머 세트 7의 정방향 프라이머(forward primer)가 서열번호 5, 역방향 프라이머(reverse primer)가 서열번호 2이고, 프라이머 세트 8의 정방향 프라이머(forward primer)가 서열번호 5, 역방향 프라이머(reverse primer)가 서열번호 4이고, 프로브는 서열번호 16 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택하였다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 1), 서열번호 5 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 7) 및 서열번호 5 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 8) 중에서 선택된 프라이머 세트 및 서열번호 16 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 프로브를 포함하는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 게놈 유전자는 gDNA 유전자일 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트 중, 프라이머 세트 1의 정방향 프라이머(forward primer)는 서열번호 1, 역방향 프라이머(reverse primer)는 서열번호 2이고, 프라이머 세트 7의 정방향 프라이머(forward primer)는 서열번호 5, 역방향 프라이머(reverse primer)는 서열번호 2이고, 프라이머 세트 8의 정방향 프라이머(forward primer)는 서열번호 5, 역방향 프라이머(reverse primer)가 서열번호 4이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명자들은 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 세균의 LtA 유전자 서열을 기초로 프라이머 세트와 프로브를 설계하였다(도 1, 표 1, 표 2). 먼저, 해당 9개의 프라이머 세트가 모두 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 유전자만을 특이적으로 검출할 수 있는지를 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time RCR)을 수행하여 확인하였다.(도 2, 실시예 1 참조), 그 중에서 증폭결과로 Ct나 RFU값이 A.a 균의 gDNA와 실제 환자 샘플의 gDNA 두 주형에서 모두 좋거나 한곳에서 월등히 좋은 프라이머 세트인, 프라이머 세트 1, 프라이머 세트 7, 프라이머 세트 8의 프라이머 세트를 선별하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 프라이머 세트와 혼용하여 사용할 우수한 프로브를 선별하기 위하여 순차적으로 3 개 (서열번호 16, 17, 18)의 프로브를 설계 및 제작하여 실험해본 결과를 바탕으로 서열번호 16 내지 서열번호 18을 선별하여 상기 프라이머 세트와 혼용하여 멀티플렉스 분석을 위해 가장 우수한 조합을 선별하였다(실시예 2, 도 4 내지 도 8 참조).
구체적으로, 선별한 프라이머 세트와 서열번호 16내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(Taq man Probe Real-time PCR)을 수행하여 각각의 조합이 모두 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 더욱 효울적으로 검출이 가능함을 확인하였다. 그리고 그 중에서, 프라이머 세트 7과 서열번호 18의 프로브(AaLtP13)를 조합하여 사용하는 경우 검출 효과가 가장 우수한 것을 확인하였다.
다만, 본 발명의 프라이머 세트는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예: 부가, 결실, 치환)될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 “프라이머”란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 (DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP (deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA합성을 개시할 수 있다.
본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에서 “프로브”란 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 핵산단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 핵산 존재여부를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소등으로 표지될 수 있다.
본 발명의 프로브는 바람직하게는 5'-말단 및 3'-말단에 각각 형광물질이 표지될 수 있다. 또한, 더욱 바람직하게는 상기 5'-말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5 (Cy5)으로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 3'-말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA) 또는 black holequencher-1,2,3 (BHQ-1,2,3)일 수 있으며, 이에 한정 되는 것은 아니다.
프로브의 5'-말단 및 3'-말단에 표지된 각각의 형광물질은 상호 간섭 현상을 나타내는 것 일 수 있다. 이에 따라, 프로브가 시료에 존재하는 표적 염기서열에 결합된 상태에서는 3'-말단의 형광물질 에너지에 의해 5'-말단의 형광물질이 억제되어 발색이 제한되고, 중합효소 연쇄반응의 수행시 프로브가 분해되면서 5'-말단의 형광물질이 유리되면서 3'-말단의 형광물질에 의한 억제가 해제되어 형광물질이 발색 반응을 하게 된다.
본 발명에 의한 프라이머 및 프로브는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 LtA 유전자 부위에만 특이적인 특징이 있기 때문에 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 효율적으로 검출할 수 있으며, 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 gDNA 유전자를 주형으로 하여, 상기 유전자의 LtA 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머와 프로브를 이용함으로써 PCR을 수행할 수 있다.
상기 PCR을 수행하여 수득되는 증폭 산물은 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 기법을 통해 검출하여 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 정성 및 정량 검출이 가능하다.
따라서, 본 발명은 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 검출 또는 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 타액 등의 a)분석 대상의 시료에서 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 gDNA를 검출하는 단계; b)상기 핵산을 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 1), 서열번호 5 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 7) 및 서열번호 5 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 8) 중에서 선택된 프라이머 세트 및 서열번호 16 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 프로브를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭 산물을 생성하는 단계;를 포함하는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 검출 또는 정량하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 PCR을 수행하여 수득되는 증폭 산물은 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 기법을 통해 검출하여 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 정성 및 정량 검출이 가능하다.
따라서, 상기 방법은 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출하여 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 검출하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출하여 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 검출하는 단계는 상기 증폭 산물을 마이크로 플레이트 웰 내에 부착된 프로브와 혼성화(Hybridization)하는 과정을 포함할 수 있다.
또한, 상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출하여 치주질환 원인균을 정성 및 정량 검출하는 단계는 상기 증폭 산물과 상기 프로브가 혼성화(Hybridization)된 반응물을 효소가 표지된 항체와 결합시키는 과정을 포함할 수 있다.
상기 혼성화(Hybridization)된 반응물과 상기 항체가 결합 후 효소 작용에 의해 나타난 흡광도를 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) reader로 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
표준 시약으로 상기 단계를 수행하여 나온 결과와 상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출한 결과와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 검출 또는 정량용 키트를 제공한다.
상기 검출용 또는 정량용 키트는 본 발명에 따라 제작된 프라이머 세트와 프로브를 구성으로 포함한다. 또한, 본 발명의 상기 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 검출용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 구강 세균감염성질환 원인균 검출용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하도록 한다.
이들 실시 예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
세균 및 genomic DNA (gDNA)
본 발명에서 이용된 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균은 ATCC 29522이며 한국미생물 보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)으로부터 구입하였고 발명된 프라이머 세트 7 (정방향 프라이머인 AaLtF14와 역방향 프라이머인 AaLtR11)의 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균 특이성을 비교 실험하기 위한 대조군으로 사용된 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis, P.g)균과 테너렐라 포르시시아 (Tannerella forsythia, T.f)균과 트리포네마 덴티콜라 (Treponema denticola, T.d)균은 각각 ATCC 33277, ATCC 43037, ATCC 35405이며 동결 건조된 앰플상태로 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)으로부터 구입하였으며 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis, P.g) ATCC 33277균의 genomic DNA는 추출된 gDNA상태로 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)으로부터 구입하였다.
포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis, P.g)균을 제외한 각 균주들은 배양 시 돌연변이 등 서열의 변화 가능성을 고려하여 구입하여 전달받은 앰플에서 바로 genomic DNA를 분리하였다.
타액 샘플 채취
치주질환이 의심되는 환자들의 동의를 얻은 후 검사 희망자들에게 시중에서 판매되는 가글용액을 이용하여 20초간 가글링을 하게 한 후 가글링된 시료를 준비된 샘플 용기에 수거하였다.
게놈 DNA (genomic DNA, gDNA) 분리
모든 gDNA는 컬럼 방식의 Exgene Cell SV DNA 분리 Kit(Exgene Cell SV, GeneAll)을 이용하였고 분리 방법은 GeneAll에서 제공한 방법대로 하였다. 전처리 과정 또한 GeneAll에서 제공한 방법대로 시행하였다. 각 균주 앰플은 판매 기관에서 추천한 방법대로 앰플커터를 이용하여 앰플을 제거한 뒤 미리 준비해 놓은 180 ㎕의 라이소자임 버퍼 용액에 동결 건조된 균주를 넣어 잘 현탁하고 37℃에서 30분간 반응시켰다.
치주질환이 의심되는 환자들로부터 수거된 샘플용액을 Voltexer를 이용하여 1분간 잘 섞은 후 1.5 ㎖을 1.7 ㎖ 마이크로튜브에 옮긴 후 17,000 rpm에서 1분간 원심 분리하여 가글링된 부유물을 침전시켰다. 침전된 부유물은 180 ㎕의 라이소자임 버퍼 용액을 가하여 잘 현탁하고, 37℃에서 30분간 반응시켰다.
상기 반응시킨 시료들에 상기 분리 Kit에서 제공된 20 ㎕의 프로테아제 K(20 ㎎/㎖)와 200 ㎕의 BL 버퍼를 가하여 56 ℃에서 30분간 반응시켰다. 상기 반응시킨 시료는 다시 95℃에서 15분간 반응하고 상온에서 식혔다. 여기에 200 ㎕의 100% 에탄올을 가하여 간헐적인 진동으로 혼합하여 제공된 SV 컬럼으로 옮긴 후 14,000 rpm에서 1분간 원심 분리하였다. 원심 분리된 컬럼을 제공된 새 컬럼용 튜브에 삽입시킨 후 컬럼에 600 ㎕의 BW 버퍼를 넣은 후 10,000 rpm에서 1분간 원심 분리하고 다시 컬럼을 제공된 새 컬럼용 튜브에 삽입시킨 후 700 ㎕의 TW 버퍼를 넣은 후 10,000 rpm에서 1분간 원심 분리하였다. 튜브 내의 여과된 용액을 제거 한 후 컬럼을 다시 삽입하여 14,000 rpm에서 1분간 원심 분리하였다. 원심 분리된 컬럼을 새 1.7 ㎖ 마이크로튜브에 옮긴 후 컬럼에 100 ㎕의 AE 버퍼를 넣고 1분간 상온에서 반응시킨 후 14,000 rpm에서 1분간 원심 분리하였다.
상기 정제된 gDNA는 NanoDrop 1000 (Thermo Fisher, U.S.A)를 사용하여 260nm에서 정량하고 -20℃에 보존하면서 하기 실험에 사용하였다.
A.a
균의 LtA 유전자의 클론 제작
정량분석 시 필요한 표준곡선을 그리기위해 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균의 특이적 유전자 검출을 위하여 GenBank 데이터베이스로부터 얻어진 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 세균의 LtA 유전자 서열을 기초로 (주)코스모진텍 (Seoul, Korea)에 의뢰하여 A.a균의 LtA 유전자의 일부분을 상기 두 후보군 중 증폭 산물의 크기가 가장 큰 프라이머 세트 1을 이용하여 PCR 한 뒤 pMD20-T 벡터에 클로닝을 수행하였다.
아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 균 특이적 프라이머 세트의 제작
아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 특이적 유전자 검출을 위하여 GenBank 데이터베이스로부터 얻어진 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 세균의 LtA 유전자 서열을 기초로 프라이머 세트와 프로브를 설계 및 조합하였다(도 1, 표 1, 표 2). 설계된 프라이머는 (주)코스모진텍 (Seoul, Korea)에 의뢰하여 100 pM 스케일(scale)로 합성하고 OPC로 정제하였다. 합성한 프라이머는 10 pM 농도로 희석하고 -20℃에 보관하면서 본 실험에 사용하였다.
| 프라이머 세트 번호 | 서열번호 | 염기서열 | 증폭서열 |
| 1 (AaLtF11 + AaLtR11) |
1 | 5'-CCGGTGGAGAAGGAAATGAT-3' | 서열번호 7 |
| 2 | 5'-ATTGCCGTTACGCTCAAATG-3' | ||
| 2 (AaLtF11 + AaLtR13) |
1 | 5'-CCGGTGGAGAAGGAAATGAT-3' | 서열번호 8 |
| 4 | 5'-CACATCCTTTGAGATTGATATTTGCT-3' | ||
| 3 (AaLtF11 + AaLtR14) |
1 | 5'-CCGGTGGAGAAGGAAATGAT-3' | 서열번호 9 |
| 6 | 5'-TTGAGATTGATATTTGCTAATGATAATTTATC-3' | ||
| 4 (AaLtF13 + AaLtR11) |
3 | 5'-GAGAAGGAAATGATATTTATGTTTACCGTAA-3' | 서열번호 10 |
| 2 | 5'-ATTGCCGTTACGCTCAAATG-3' | ||
| 5 (AaLtF13 + AaLtR13) |
3 | 5'-GAGAAGGAAATGATATTTATGTTTACCGTAA-3' | 서열번호 11 |
| 4 | 5'-CACATCCTTTGAGATTGATATTTGCT-3' | ||
| 6 (AaLtF13 + AaLtR14) |
3 | 5'-GAGAAGGAAATGATATTTATGTTTACCGTAA-3' | 서열번호 12 |
| 6 | 5'-TTGAGATTGATATTTGCTAATGATAATTTATC-3' | ||
| 7 (AaLtF14 + AaLtR11) |
5 | 5'-GGTGGAGAAGGAAATGATATTTATG-3' | 서열번호 13 |
| 2 | 5'-ATTGCCGTTACGCTCAAATG-3' | ||
| 8 (AaLtF14 + AaLtR13) |
5 | 5'-GGTGGAGAAGGAAATGATATTTATG-3' | 서열번호 14 |
| 4 | 5'-CACATCCTTTGAGATTGATATTTGCT-3' | ||
| 9 (AaLtF14 + AaLtR14) |
5 | 5'-GGTGGAGAAGGAAATGATATTTATG-3' | 서열번호 15 |
| 6 | 5'-TTGAGATTGATATTTGCTAATGATAATTTATC-3' |
아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 특이적 프로브의 제작
아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균의 특이적 유전자 검출을 위하여 GenBank 데이터베이스로부터 얻어진 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 세균의 LtA 유전자 서열을 기초로 제작된 클론 DNA의 서열을 바탕으로 프로브를 설계하였다(표 2). 설계된 프로브는 (주)코스모진텍 (Seoul, Korea)에 의뢰하여 100 pM 스케일(scale)로 합성하고 HPLC로 정제하였다. 합성한 프라이머는 10 pM 농도로 희석하고 -20℃에 보관하면서 본 실험에 사용하였다.
| 5‘-(FAM) TGGGCACCACACTATTACGGAA (BHQ1)-3’ | 서열번호 16 |
| 5‘-(FAM) TGGCCACCACACTATTACGGAACA (BHQ1)-3’ | 서열번호 17 |
| 5‘-(FAM) CCACACTATTACGGAACATAGCGGTG (BHQ1)-3 | 서열번호 18 |
제작된 프라이머 세트의 확인
상기 9개의 프라이머 세트를 A.a 균의 gDNA와 실제 A.a 균의 존재가 의심되는 환자의 타액 샘플의 gDNA와 음성 대조군인 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis, P.g)균과 테너렐라 포르시시아 (Tannerella forsythia, T.f)균과 트리포네마 덴티콜라 (Treponema denticola, T.d)균의 gDNA와 증류수를 주형으로 각 주형 1 ㎕ (20 ng 이나 30 ng)에 2 X iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Inc., U.S.A) 10 ㎕, D.W 7 ㎕, 10 uM 정방향 프라이머 1 ㎕, 10 uM 역방향 프라이머 1 ㎕를 가한 다음 CFX96-IVD real-time PCR detection system (BIO-RAD, U.S.A)에서 95℃ 5분 1회, 95℃ 30초, 60℃ 40초, 72℃ 30초간의 반응을 41회 반복하여 증폭하고 실제 PCR 산물들이 A.a균의 LtA 유전자의 일부분의 PCR산물과 일치하는지 확인하기 위한 반응 (Melting Curve)으로 95℃ 10초, 60℃ 5초, 95℃ 30분 반응으로 Real-time PCR을 실시하였다.
실시예 1. 프라이머의 특이도 확인
실시예 1에서 9개의 프라이머 세트가 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 유전자만을 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 합성된 프라이머 세트들을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행하였다.
우선, 상기 [표 1]에 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 A.a 균의 gDNA와 실제 A.a 균의 존재가 의심되는 환자의 타액 샘플의 gDNA와 음성 대조군인 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis, P.g)균과 테너렐라 포르시시아 (Tannerella forsythia, T.f)균과 트리포네마 덴티콜라 (Treponema denticola, T.d)균의 gDNA와 증류수를 주형으로 각 주형 1 ㎕ (20 ng 이나 30 ng)에 2 X iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Inc., U.S.A) 10 ㎕, D.W 7 ㎕, 10 uM 정방향 프라이머 1 ㎕, 10 uM 역방향 프라이머 1 ㎕를 가한 다음 CFX96-IVD real-time PCR detection system (BIO-RAD, U.S.A)에서 95℃ 5분 1회, 95℃ 30초, 60℃ 40초, 72℃ 30초간의 반응을 41회 반복하여 증폭하고 실제 PCR 산물들이 A.a균의 LtA 유전자의 일부분의 PCR산물과 일치하는지 확인하기 위한 반응 (Melting Curve)으로 95℃ 10초, 60℃ 5초, 95℃ 30분 반응으로 Real-time PCR을 실시하고, 그 결과를 도 2와 3에 나타내었다.
도 2a에서 보는 바와 같이, 이용된 음성 대조군 균들의 gDNA를 주형으로 각각의 대조군 균들의 증폭을 위해 제작된 프라이머 세트에 의해서만 증폭되었고 이용된 9개의 프라이머 세트가 모두 전체적으로 유의 수준에서 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균 특이적 증폭을 하였음을 알 수 있다.
도 2b는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 1 (AaLtF11+R11)의 결과를 나타낸 것이다. 도 2b에서 보는 바와 같이, 프라이머 세트 1을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행하였을 때는 모든 음성 대조군에서는 증폭된 산물이 생산되지 않았으며 A.a균의 gDNA와 실제 환자 샘플의 gDNA에서만 증폭된 것을 알 수 있다.
도 2c는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 2 (AaLtF11+R13)의 결과를 나타낸 것이다. 도 2b에서 보는 바와 같이, 프라이머 세트 2를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행하였을 때는 모든 음성 대조군에서는 약간의 증폭된 산물이 생산되었지만 증류수 (D.W)를 주형으로 넣은 값보다 작기에 프라이머 다이머인 것으로 사료되며 A.a균의 gDNA와 실제 환자 샘플의 gDNA에서는 정확하게 증폭된 것을 알 수 있다.
도 2d는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 3 (AaLtF11+R14)의 결과를 나타낸 것이다. 도 2d에서 보는 바와 같이, 프라이머 세트 3을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행하였을 때는 모든 음성 대조군에서는 약간의 증폭된 산물이 생산되었지만 증류수 (D.W)를 주형으로 넣은 값보다 작기에 프라이머 다이머인 것으로 사료되며 A.a균의 gDNA와 실제 환자 샘플의 gDNA에서는 정확하게 증폭된 것을 알 수 있다.
도 2c와 d)의 결과를 보면 서열번호 1 (AaLtF11)은 서열번호 4 (AaLtR13)나 서열번호 6 (AaLtR14)와 조합될 때는 약간 특이적 증폭 효율이 감소됨을 알 수 있다.
도 2e는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 4 (AaLtF13+R11)의 결과를 나타낸 것이다. 도 2e에서 보는 바와 같이, 프라이머 세트 4를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행하였을 때는 모든 음성 대조군에서는 증폭된 산물이 생산되지 않았으며 A.a균의 gDNA와 실제 환자 샘플의 gDNA에서만 증폭된 것을 알 수 있다.
도 2f는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 5 (AaLtF13+R13)의 결과를 나타낸 것이다. 도 2b에서 보는 바와 같이, 프라이머 세트 5를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행하였을 때는 음성 대조군 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis, P.g)균에서 약간의 증폭된 산물이 생산되었지만 유의 수준 이하인 것으로 사료되며 A.a균의 gDNA와 실제 환자 샘플의 gDNA에서는 정확하게 증폭된 것을 알 수 있다.
도 2g는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 6 (AaLtF13+R14)의 결과를 나타낸 것이다. 도 2e에서 보는 바와 같이, 프라이머 세트 6을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행하였을 때는 모든 음성 대조군에서는 증폭된 산물이 생산되지 않았으며 A.a균의 gDNA와 실제 환자 샘플의 gDNA에서만 증폭된 것을 알 수 있다.
도 2h는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 7 (AaLtF14+R11)의 결과를 나타낸 것이다. 도 2e에서 보는 바와 같이, 프라이머 세트 7을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행하였을 때는 모든 음성 대조군에서는 증폭된 산물이 생산되지 않았으며 A.a균의 gDNA와 실제 환자 샘플의 gDNA에서만 증폭되었으며 특히, RFU값이 다른 세트의 결과물들보다 높은 것을 알 수 있다.
도 2i는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 8 (AaLtF14+R13)의 결과를 나타낸 것이다. 도 2b에서 보는 바와 같이, 프라이머 세트 8을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행하였을 때는 음성 대조군 트리포네마 덴티콜라 (Treponema denticola, T.d)균에서 약간의 증폭된 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행하였을 때는 음성 대조군 트리포네마 덴티콜라 (Treponema denticola, T.d)균에서 약간의 증폭된 산물이 생산되었지만 유의 수준 이하인 것으로 사료되며 A.a균의 gDNA와 실제 환자 샘플의 gDNA에서는 정확하게 증폭되고 특히, 두 결과의 RFU값이 다른 세트의 결과물들보다 약간 높은 것을 알 수 있다.
도 2k는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트의 A.a균의 gDNA를 주형으로 이용하였을 때의 결과를 나타낸 것이다. 도 2k에서 보는 바와 같이, A.a균의 gDNA를 주형으로 이용하였을 경우 프라이머 세트 7, 8, 9, 4, 6 순으로 Ct값과 RFU값이 좋은 것을 알 수 있었다.
도 2l는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트의 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 이용하였을 때의 결과를 나타낸 것이다. 도 2l에서 보는 바와 같이, 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 이용하였을 경우 프라이머 세트 4, 1, 7, 5, 2, 8 순으로 Ct값과 RFU값이 좋은 것을 알 수 있었다.
도 2m는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)가 수행된 9개의 프라이머 세트의 음성대조군으로 증류수 (D.W)를 주형으로 이용하였을 때의 결과를 나타낸 것이다. 도 2m에서 보는 바와 같이, 증류수 (D.W)를 주형으로 이용하였을 경우 프라이머 세트 3과 2를 제외하고는 모두 증폭된 산물을 확일 할 수 없었다.
도 2를 전체적으로 종합해보면, 서열번호 4 (AaLtR13)나 서열번호 6 (AaLtR14)이 정방향 프라이머들과 조합될 때는 약간 특이적 증폭 효율이 감소됨을 알 수 있었지만, 서열번호 1 (AaLtF11)과 3 (AaLtF13)이 조합될 때는 실제 환자 샘플의 gDNA와 A.a균의 gDNA의 RFU값이 차이를 보이며 환자 샘플의 gDNA의 RFU값만 높은 반면 서열번호 5 (AaLtF14)와 조합될 때에는 두 값이 비슷하며 높은 것을 알 수 있었다. 특히, 서열번호 5 (AaLtF14)는 서열번호 2 (AaLtR11)과 조합되었을 때 가장 효율이 좋은 것을 알 수 있었다.
도 3은 상기 개시된 9개의 프라이머 세트를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균과 음성 대조 균주들의 gDNA와 증류수 (D.W) 와 실제 환자 샘플의 gDNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 수행한 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 수행한 Mult Curve와 Mult Peak의 결과를 나타낸 것으로, 해당 결과로부터 9개의 프라이머 세트 모두 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균 특이적 증폭을 하였음을 알 수 있었다.
상기와 같이, 9개의 프라이머 세트 모두 유의 수준에서 음성 대조군인 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis, P.g)균과 테너렐라 포르시시아 (Tannerella forsythia, T.f)균과 트리포네마 덴티콜라 (Treponema denticola, T.d)균의 gDNA와 증류수에서가 아닌 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 균에서만 9개의 프라이머 세트에 의해 증폭된 유전자 산물을 특이적으로 얻을 수 있음을 확인하였다. 이에, 본 발명에 의해 제작된 프라이머 세트 1 내지 9 모두 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 균을 특이적으로 검출함을 확인할 수 있다.
그 중에서도, 프라이머 세트 1, 프라이머 세트 7, 프라이머 세트 8은 A.a균의 gDNA와 실제 환자 샘플의 gDNA에서의 증폭결과가 Ct나 RFU값이 두 주형에서 모두 좋거나 한 곳이라도 월등히 좋으며 음성대조군에서 결과가 좋은 세트인바, 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 균의 증폭하고자 하는 LtA 유전자에 대한 특이적 검출능이 다른 프라이머 세트에 비하여 상대적으로 더욱 우수함을 확인할 수 있었다. 이에, 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 균의 검출을 위하여 프라이머 세트 1, 프라이머 세트 7, 프라이머 세트 8을 서열번호 16 내지 서열번호 18과의 프로브와 혼용하여 그 효율을 확인하였다 (실시예 2).
실시예 2. 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 프로브와의 혼용 효율 평가
실시예 2에서 특히 효과가 우수하다고 판단된 3개의 프라이머 세트(프라이머 세트 1, 프라이머 세트 7, 프라이머 세트 8)를, A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 프로브를 이용하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행하였다.
우선, 3개의 프라이머 세트 각 1 세트와 본 발명자가 제작한 프로브 (AaLtP13-FAM, 서열번호 18)를 이용하여 상기 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균의 gDNA와 (주)코스모진텍 (Seoul, Korea)에 의뢰하여 A.a균의 LtA 유전자의 일부분을 PCR 산물의 크기가 가장 큰 상기 프라이머 세트 1을 이용하여 PCR 한 뒤 pMD20-T 벡터에 클로닝 해 놓은 클론 DNA와 실제 환자 샘플의 gDNA와 음성 대조군인 증류수 (D.W) 각 1 ㎕ (20 ng 이나 30 ng)에 반응액 10 X Han taq Buffer (Genenmed, Korea) 2 ㎕, 2.5 mM dNTPs 1 ㎕, D.W. 13.2 ㎕, 10 uM 정방향 프라이머 1 ㎕, 10 uM 역방향 프라이머 1 ㎕, 10 uM 프로브 (AaLtP13-FAM) 0.5 ㎕와 Han taq 중합효소 (Genenmed, Korea) 0.3 ㎕씩 가한 다음 CFX96-IVD real-time PCR detection system (Bio-Rad Inc., U.S.A)에서 95℃ 5분 1회, 95℃ 30초, 60℃ 40초, 72℃ 30초간의 반응을 41회 반복하여 반응시켰다. 상기 PCR 산물들의 실시간으로 그래프화된 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, A.a균의 gDNA와 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA와 실제 환자 샘플의 gDNA와 음성 대조군인 증류수 (D.W)에서의 결과의 Ct 및 RFU 값을 전체적으로 비교하여 3개의 프라이머 세트 중 프라이머 세트 1 (서열번호 1와 2의 조합), AaLtF11와 AaLtR11 조합 세트가 A.a균의 gDNA을 주형으로 증폭되었을 때는 우수하지만 실제 정량의 표준그래프 작성에 사용되는 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA를 주형으로 증폭되었을 때 우수한 프라이머 세트 7 (서열번호 5와 2의 조합), AaLtF14와 AaLtR11 조합 세트가 가장 우수한 것으로 판단되었다. 이에, 프라이머 세트 7을 이용할 경우, A.a균을 종 특이적이면서 프로브 (AaLtP13-FAM)를 혼용하여 다른 세균과 함께 멀티플랙스 분석을 하기 위해 가장 우수한 결과를 얻을 수 있을 것이라 사료된다.
| 서열번호 | 염기서열 | 증폭서열 | |
| 프라이머 (AaLtF14 + AaLtR11) |
5 | 5'-GGTGGAGAAGGAAATGATATTTATG-3' | 서열번호 13 |
| 2 | 5'-ATTGCCGTTACGCTCAAATG-3' | ||
| 프로브 (AaLtP11) |
16 | 5'(FAM)-TGGGCACCACACTATTACGGAA(BHQ1)-3' |
| 서열번호 | 염기서열 | 증폭서열 | |
| 프라이머 (AaLtF14 + AaLtR11) |
5 | 5'-GGTGGAGAAGGAAATGATATTTATG-3' | 서열번호 13 |
| 2 | 5'-ATTGCCGTTACGCTCAAATG-3' | ||
| 프로브 (AaLtP12) |
17 | 5'(FAM)-TGGCCACCACACTATTACGGAACA(BHQ1)-3' |
| 서열번호 | 염기서열 | 증폭서열 | |
| 프라이머 (AaLtF14 + AaLtR11) |
5 | 5'-GGTGGAGAAGGAAATGATATTTATG-3' | 서열번호 13 |
| 2 | 5'-ATTGCCGTTACGCTCAAATG-3' | ||
| 프로브 (AaLtP13) |
18 | 5'(FAM)-CCACACTATTACGGAACATAGCGGTG(BHQ1)-3' |
| 서열번호 | 염기서열 | 증폭서열 | |
| 프라이머 (AaLtF11 + AaLtR11) | 1 | 5'-CCGGTGGAGAAGGAAATGAT-3' | 서열번호 7 |
| 2 | 5'-ATTGCCGTTACGCTCAAATG-3' | ||
| 프로브 (AaLtP11) |
16 | 5'(FAM)-TGGGCACCACACTATTACGGAA(BHQ1)-3' |
| 서열번호 | 염기서열 | 증폭서열 | |
| 프라이머 (AaLtF11 + AaLtR11) | 1 | 5'-CCGGTGGAGAAGGAAATGAT-3' | 서열번호 7 |
| 2 | 5'-ATTGCCGTTACGCTCAAATG-3' | ||
| 프로브 (AaLtP12) |
17 | 5'(FAM)-TGGCCACCACACTATTACGGAACA(BHQ1)-3' |
| 서열번호 | 염기서열 | 증폭서열 | |
| 프라이머 (AaLtF11 + AaLtR11) | 1 | 5'-CCGGTGGAGAAGGAAATGAT-3' | 서열번호 7 |
| 2 | 5'-ATTGCCGTTACGCTCAAATG-3' | ||
| 프로브 (AaLtP13) |
18 | 5'(FAM)-CCACACTATTACGGAACATAGCGGTG(BHQ1)-3' |
이에, 상기 도 4의 결과를 토대로 프로브 및 프라이머의 혼용 효율을 좀 더 알아보기 위하여, 상기 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM, AaLtP12-FAM, AaLtP13-FAM)와 상기 2개의 프라이머 세트 후보군인 프라이머 세트 1, 프라이머 세트 7 (표 3, 4, 5, 6, 7, 8)를 이용하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응(Taq mamn Probe Real-time PCR)을 수행하였다 (도 5 참조).
실시예 1에서 분리 정제한 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균의 gDNA와 제 A.a 균의 존재가 의심되는 4 명의 환자들의 타액 샘플의 gDNA와 상기 정량을 위해 제작된 AaLt 유전자의 클론과 다중 정량 시 A.a균의 검출 특이도를 확인하기 위한 음성 대조군인 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis, P.g)균과 테너렐라 포르시시아 (Tannerella forsythia, T.f)균과 트리포네마 덴티콜라 (Treponema denticola, T.d)균의 gDNA에서 각 특이 유전자를 바탕으로 제작된 클론들과 AaLt 유전자의 클론을 동량씩 혼합한 혼합물과 또 다른 음성 대조군인 증류수(D.W)를 주형으로 각 주형 4㎕에 반응액 10 X Han taq Buffer (Genenmed, Korea) 2 ㎕, 2.5 mM dNTPs 1 ㎕, D.W. 10 ㎕, 10 uM 각 정방향 프라이머 1 ㎕, 10 uM 각 역방향 프라이머 1 ㎕, 10 uM 각 프로브 (AaLtP13-FAM) 0.5 ㎕와 Han taq 중합효소 (Genenmed, Korea) 0.5 ㎕씩 가한 다음 CFX96-IVD real-time PCR detection system (Bio-Rad Inc., U.S.A)에서 95℃ 5분 1회, 95℃ 30초, 60℃ 40초, 72℃ 30초간의 반응을 41회 반복하여 반응시켰다. 상기 PCR 산물들의 실시간으로 그래프화된 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5a는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군(프라이머 세트 1, 프라이머 세트7)과 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 실제 환자 샘플 (1019KimJ)의 gDNA를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이며, 조합 1 (프라이머 세트 7과 프로브 서열번호 16 프로브)과 조합 3 (프라이머 세트 7과 프로브 서열번호 18 프로브)이 가장 우수한 결과를 보여준 것을 확인하였다.
도 5b는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 실제 환자 샘플 (1023HuhS)의 gDNA를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이며, 역시 조합 1 (프라이머 세트 7과 프로브 서열번호 16 프로브)과 조합 3 (프라이머 세트 7과 프로브 서열번호 18 프로브)이 가장 우수한 결과를 보여준 것을 확인하였다.
도 5c는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 실제 환자 샘플 (1105LimJ)의 gDNA를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이며, 역시 조합 1 (프라이머 세트 7과 프로브 서열번호 16 프로브)과 조합 3 (프라이머 세트 7과 프로브 서열번호 18 프로브)이 가장 우수한 결과를 보여준 것을 확인하였다.
도 5d는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 실제 환자 샘플 (1111KimI)의 gDNA를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이며, 역시 조합 1 (프라이머 세트 7과 프로브 서열번호 16 프로브)과 조합 3 (프라이머 세트 7과 프로브 서열번호 18 프로브)이 가장 우수한 결과를 보여준 것을 확인하였다.
도 5e는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 A.a 균의 클론 DNA (10^-6)를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이며, 역시 조합 1 (프라이머 세트 7과 프로브 서열번호 16 프로브)과 조합 3 (프라이머 세트 7과 프로브 서열번호 18 프로브)이 가장 우수한 결과를 보여준 것을 확인하였다.
도 5f는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 클론 DNA (10^-6)들의 혼합 시료를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이며, 역시 조합 1 (프라이머 세트 7과 프로브 서열번호 16 프로브)과 조합 3 (프라이머 세트 7과 프로브 서열번호 18 프로브)이 가장 우수한 결과를 보여준 것을 확인하였다.
도 5g는 상기 선정된 2개의 프라이머 세트 2차 후보군과 A.a균을 다른 세균들과 함께 멀티플랙스 분석을 위해 제작된 3개의 프로브 (AaLtP11-FAM_서열번호 16, AaLtP12-FAM_서열번호 17, AaLtP13-FAM_서열번호 18)를 이용하여 음성대조군인 증류수를 주형으로 하여 프로브 실시간 중합효소연쇄반응 (Taq man Probe Real-time PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이며, 모든 조합이 주형을 넣지 않은 음성대조군에서는 증폭 산물이 없는 결과를 보여준 것을 확인하였다.
전체적인 도 5의 결과를 바탕으로 조합 1 (프라이머 세트 7과 프로브 서열번호 16 프로브)과 조합 3 (프라이머 세트 7과 프로브 서열번호 18 프로브)이 가장 우수한 것을 확인하였고 특히 조합 3의 결과가 전체적으로 조합 1의 결과보다 증폭 속도의 효율성을 나타내는 Ct 값이 더 좋음을 확인하였다.
상기 결과들을 토대로, 프라이머 세트 7과 서열번호 18의 프로브(AaLt13)을 조합하여 사용하는 경우 검출 효과가 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 표준그래프(standard curve)의 작성 및 검출 민감도 평가
Taq man Probe Real-time PCR의 검출 민감도와 정량 분석의 신뢰성을 확인하기 위해 상기 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 균의 LtA 유전자의 클론 DNA을 정량한 후, 10배씩 serial dilution한 시료를 대상으로 형광 증폭 곡선을 확인하였다(도 6). 클론 DNA의 크기는 (주)코스모진텍 (Seoul, Korea)에서 염기서열 분석을 통하여 확인하였으며, Avogadro의 수 (6.02 × 1023 molecules per mole)를 기반으로 하여 각각의 희석 용액 당 들어있는 각 균주에 대한 유전체 DNA copy number를 계산하였으며, 표준그래프를 그리기 위한 log값으로 환산하여 하기 표 6과 같이 작성하였다.
Taq man Probe Real-time PCR의 반응용액은 1 ㎕(37 ng/㎕)의 각 10배씩 serial dilution된 template DNA, A.a균의 특이적 프라이머 세트 중 가장 우수한 프라이머 세트로 선정한 프라이머 세트 7의 각 1 ㎕(10 pmol/㎕)씩의 서열번호 5 (AaLtF14)와 2 (AaLtR11)의 프라이머, 0.5 ㎕ (10 pmol/㎕)의 서열번호 18의 프로브 (AaLtP13-FAM), 2 ㎕의 10 X Han taq Buffer (Genenmed, Korea), 1 ㎕의 2.5 mM dNTPs, 13.2 ㎕의 D.W., 0.3 ㎕의 Han taq 중합효소 (Genenmed, Korea)를 가한 다음 CFX96-IVD real-time PCR detection system (Bio-Rad Inc., U.S.A)에서 95℃ 5분 1회, 95℃ 30초, 60℃ 40초, 72℃ 30초간의 반응을 41회 반복하여 반응시켰으며, 데이터 분석은 Bio-Rad CFX Manager IVD Edition 1.6 (Bio-Rad Inc., USA)을 이용하였다. Cycle threshold(Ct)는 알려진 숫자의 DNA 농도의 대수증폭기로 시작하여 균주에 대한 표준곡선에 의해서 시료당 세균수를 측정하였다. 상기 PCR 산물들의 실시간으로 그래프화된 결과를 도 6과 표 6에 나타내었다.
도 6과 표 9에 나타난 바와 같이, 10배씩 serial dilution (10^-1 ~ 10^-5)된 A.a균의 LtA 유전자의 클론 DNA가 10^-5로 희석된 것까지 검출되며 각 시료의 Ct값과 양이 희석 배율만큼 일정하게 감소되는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명으로 설계된 프라이머 세트에 의해 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 균의 DNA를 3.7 pg/㎕ 까지 종 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 상기 결과로부터 AaLtF14 + AaLtR11와 AaLtP13-FAM이 가장 효율이 좋은 프라이머 세트와 프로브임을 확인할 수 있었다.
| 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a) ATCC 29522 | ||||||
| DNA 농도 | 37 ng/㎕ | 3.7 ng/㎕ | 370 pg/㎕ | 37 pg/㎕ | 3.7 pg/㎕ | 0 pg/㎕ |
| Ct 값 | 7.46 | 11.07 | 14.72 | 18.20 | 21.68 | N/A |
| Log | 10.967 | 9.967 | 8.967 | 7.967 | 6.967 | 0 |
| Copy 수 | 9.26E+10 | 9.26E+09 | 9.26E+08 | 9.26E+07 | 9.26E+06 | 0 |
실시예 4. 치주질환 환자 시료에서 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 균의 확인
선정된 프라이머 세트 7 (AaLtF14+R11)과 프로브 (서열번호 18, AaLtP13-FAM)의 조합 3의 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 균 검출능을 확인하기 위하여, 강남리플랜트치과에서 수집된 하기 표 7에 표기한 40명의 치주질환 환자들을 대상으로 타액 시료를 채취한 후, 상기 게놈 DNA (genomic DNA, gDNA) 분리방법으로 genomic DNA를 분리하고 상기 실시예 2에서와 같이 제작되 고 정량하여 Copy 수가 계산된 클론의 DNA들 (A.a균, P.g균, T.f균, T.d균의 클론 DNA)의 혼합물(10^-2)을 10배씩 희석하여 희석된 시료들 (10^-2 ~ 10^-6)을 Standard Curve를 그리는데 사용하였다.
희석된 클론 DNA들과 환자 샘플들의 gDNA 각 4 ㎕에 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis, P.g)균과 타네렐라 포르시시아 (Tannerella forsythia, T.f)균과 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola, T.d)균의 제작된 각각의 프라이머 세트 1 ㎕(10 pmol/㎕)씩의 정방향과 역방향 프라이머를 각각 다른 형광 물질을 붙여서 합성한 프로브들 (PghaP11B-HEX, TfKpP11-Texas red, TdopP01-Cy5) 0.5 ㎕ (10 pmol/㎕)를 함께 혼합하여 1 ㎕(10 pmol/㎕)씩의 서열번호 5 (AaLtF14)와 2 (AaLtR11)의 프라이머, 0.5 ㎕ (10 pmol/㎕)의 서열번호 18의 프로브 (AaLtP13-FAM), 2 ㎕의 10 X Han taq Buffer (Genenmed, Korea), 1 ㎕의 2.5 mM dNTPs, 4.4 ㎕의 D.W., 0.6 ㎕의 Han taq 중합효소 (Genenmed, Korea)를 가한 다음 CFX96-IVD real-time PCR detection system (Bio-Rad Inc., U.S.A)에서 95℃ 5분 1회, 95℃ 30초, 60℃ 40초, 72℃ 30초간의 반응을 41회 반복하여 반응시켰으며, 데이터 분석은 Bio-Rad CFX Manager IVD Edition 1.6 (Bio-Rad Inc., USA)을 이용하였다. Cycle threshold(Ct)는 알려진 숫자의 DNA 농도의 대수증폭기로 시작하여 균주에 대한 표준곡선에 의해서 시료당 세균수가 측정되었다. 상기 다중 실시간 중합효소연쇄반응 (Multiplex Real-time PCR)을 수행하여 정량 분석하고 그 결과를 도 7과 표 10, 11에 나타내었다.
도 7과 하기의 표 10에 나타난 바와 같이, 다른 세균의 검출을 목적으로 제작된 프라이머 세트들과 프로브들과의 혼합 반응에서도 40명의 환자 시료 중 6명의 환자 시료에서 본 발명의 프라이머 세트에 의해 증폭된 유전자 산물이 본 발명의 프로브로 확인되었으며, 이는 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 균이 존재함을 의미하며 본 발명의 프라이머 세트와 프로브 조합이 다중으로 다른 세균들과 같이 겁출 및 정량에 있어서 적합함을 나타낸다.
상기 유전자 산물이 확인되지 않은 환자들에 대해서는 질환의 정도 및/또는 감염의 정도에 따른 결과로 사료되며 특히, 이미 보고에서 알려진 것처럼 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 균은 급성치주염에 관련이 있는 균으로 치주질환이 만성으로 진행될 때나 질환의 진행이 후반기일 때는 잘 검출되지 않는 것으로 사료된다.
| No. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 1 | 151201LimJ | 151218ChoY | 151219KimE | 151222KangE | 151222KimJJ |
| 2 | 160107KimSH | 160109SaJB | 160111ChoGH | 160112ShinDSn | 160112ShinDSg |
| 3 | 160113ChoHJ | 160113JungK | 160114JangYS | 160115YunTH | 160115KimJJ |
| 4 | 160116HanSJ | 160116YuHG | 160120LeeHY | 160120JeonSJ | 160120KimSK |
| 5 | 160120YunKH | 160120KangME | 160120ShimGH | 160120ChoiJD | 160120BaeKS |
| 6 | 160122LeeJT | 160122ChoHG | 160125SungSJ | 160125JungSK | 160125LeeKJ |
| 7 | 160125ParkYK | 160126WeYM | 160126YounJW | 160127ChoiYW | 160127JangSJ |
| 8 | 160128ChoiKE | 160129AnHD | 160129LeeLS | 160129WangHS | 160130LeeKA |
| No. | Sample I.D | Ct 값 | Copy 수 |
| 1 | 160120JeonSJ | 32.29 | 2.06E+04 |
| 2 | 160120ChoiJD | 30.89 | 5.03E+04 |
| 3 | 160120BaeKS | 31.12 | 4.34E+04 |
| 4 | 160122LeeJT | 28.06 | 3.09E+05 |
| 5 | 160127JangSJ | 31.38 | 3.67E+04 |
| 6 | 160129WangHS | 33.52 | 9.30E+03 |
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
<110> LEE, Jung Tae
<120> COMPOSITION FOR DETECTING AGGREGATIBACTERACTINOMYCETEMCOMITANS
AND USES THEREOF
<130> P20160607
<160> 18
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer (AaLtF11)
<400> 1
ccggtggaga aggaaatgat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer (AaLtR11)
<400> 2
attgccgtta cgctcaaatg 20
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer (AaLtF13)
<400> 3
gagaaggaaa tgatatttat gtttaccgta a 31
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer (AaLtR13)
<400> 4
cacatccttt gagattgata tttgct 26
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer (AaLtF14)
<400> 5
ggtggagaag gaaatgatat ttatg 25
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer (AaLtR14)
<400> 6
ttgagattga tatttgctaa tgataattta tc 32
<210> 7
<211> 140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amplicon
<400> 7
ccggtggaga aggaaatgat atttatgttt accgtaagga atatggccac cacactatta 60
cggaacatag cggtgataaa gataaattat cattagcaaa tatcaacctc aaagaggtgt 120
catttgagcg taacggcaat 140
<210> 8
<211> 119
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amplicon
<400> 8
ccggtggaga aggaaatgat atttatgttt accgtaagga atatggccac cacactatta 60
cggaacatag cggtgataaa gataaattat cattagcaaa tatcaatctc aaagatgtg 119
<210> 9
<211> 112
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amplicon
<400> 9
ccggtggaga aggaaatgat atttatgttt accgtaagga atatggccac cacactatta 60
cggaacatag cggtgataaa gataaattat cattagcaaa tatcaatctc aa 112
<210> 10
<211> 134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amplicon
<400> 10
gagaaggaaa tgatatttat gtttaccgta aggaatatgg ccaccacact attacggaac 60
atagcggtga taaagataaa ttatcattag caaatatcaa cctcaaagag gtgtcatttg 120
agcgtaacgg caat 134
<210> 11
<211> 113
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amplicon
<400> 11
gagaaggaaa tgatatttat gtttaccgta aggaatatgg ccaccacact attacggaac 60
atagcggtga taaagataaa ttatcattag caaatatcaa tctcaaagat gtg 113
<210> 12
<211> 106
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amplicon
<400> 12
gagaaggaaa tgatatttat gtttaccgta aggaatatgg ccaccacact attacggaac 60
atagcggtga taaagataaa ttatcattag caaatatcaa tctcaa 106
<210> 13
<211> 138
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amplicon
<400> 13
ggtggagaag gaaatgatat ttatgtttac cgtaaggaat atggccacca cactattacg 60
gaacatagcg gtgataaaga taaattatca ttagcaaata tcaacctcaa agaggtgtca 120
tttgagcgta acggcaat 138
<210> 14
<211> 117
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amplicon
<400> 14
ggtggagaag gaaatgatat ttatgtttac cgtaaggaat atggccacca cactattacg 60
gaacatagcg gtgataaaga taaattatca ttagcaaata tcaatctcaa agatgtg 117
<210> 15
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amplicon
<400> 15
ggtggagaag gaaatgatat ttatgtttac cgtaaggaat atggccacca cactattacg 60
gaacatagcg gtgataaaga taaattatca ttagcaaata tcaatctcaa 110
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 16
tgggcaccac actattacgg aa 22
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 17
tggccaccac actattacgg aaca 24
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 18
ccggtggaga aggaaatgat 20
Claims (11)
- 정방향 프라이머(forward primer) 서열번호 5와 역방향 프라이머(reverse primer) 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 7); 및
서열번호 18 프로브;로 이루어지고,
구강 세균감염성질환을 일으키는 병원성 유해세균인 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 LtA 유전자와 특이적으로 결합하고,
게놈 유전자는 gDNA 유전자이고,
실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time PCR)을 수행하여 수득되는 증폭 산물을 검출하고,
상기 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 gDNA를 3.7 pg/㎕ 이상의 농도를 종 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 구강 세균감염성질환을 일으키는 병원성 세균인 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 검출 및 정량용 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 정방향 프라이머(forward primer) 서열번호 5와 역방향 프라이머(reverse primer) 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 7); 및
서열번호 18 프로브;로 이루어지고,
구강 세균감염성질환을 일으키는 병원성 유해세균인 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 LtA 유전자와 특이적으로 결합하고,
게놈 유전자는 gDNA 유전자이고,
실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time PCR)을 수행하여 수득되는 증폭 산물을 검출하고,
상기 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 gDNA를 3.7 pg/㎕ 이상의 농도를 종 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 구강 세균감염성질환을 일으키는 병원성 세균인 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 검출 및 정량용 키트. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- a)분석 대상의 시료에서 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 gDNA를 수득하는 단계; 및
b)상기 핵산을 정방향 프라이머(forward primer) 서열번호 5와 역방향 프라이머(reverse primer) 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트(프라이머 세트 7);와 서열번호 18 프로브;를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time PCR)을 수행하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출하여 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 검출하는 단계;
상기 ELISA를 통해 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스균을 검출하는 단계는,
상기 증폭 산물을 마이크로 플레이트 웰 내에 부착된 프로브와 혼성화(Hybridization)하는 과정과,
상기 증폭 산물과 상기 프로브가 혼성화(Hybridization)된 반응물을 효소가 표지된 항체와 결합시키는 과정과,
상기 혼성화(Hybridization)된 반응물과 상기 항체가 결합 후 효소 작용에 의해 나타난 흡광도를 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 리더 (reader)로 측정하는 과정과,
표준 시약으로 각 과정을 수행하여 나온 결과와 상기 증폭 산물을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 검출한 결과와 비교하는 과정을 포함하고,
상기 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균의 gDNA를 3.7 pg/㎕ 이상의 농도를 종 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 구강 세균감염성질환을 일으키는 병원성 세균인 아그레가티박티 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.a)균을 검출 및 정량하는 방법. - 삭제
- 삭제
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101925827B1 (ko) |
-
2018
- 2018-01-23 KR KR1020180008354A patent/KR101925827B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GenBank Accession No. M27399.1.* |
| kihiro Yoshida Yoshida et al. BMC Infectious Diseases 2012, 12:253 |
| Maria P. Isaza et al. INFECTION AND IMMUNITY, Aug. 2008, Vol. 76, No. 8, p.3561-3568.* |
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| KR20180011475A (ko) | 2018-02-01 |
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