KR20190031395A - 구강 질환 관련 세균의 실시간 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 리얼타임 pcr 방법 - Google Patents

구강 질환 관련 세균의 실시간 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 리얼타임 pcr 방법 Download PDF

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Abstract

본원은, 구강 질환 관련 세균의 다중 실시간 검출용 프라이머 및 프로브, 이를 포함한 리얼타임 PCR 조성물 및 이를 이용한 리얼타임 PCR 방법에 관한 것이다.

Description

구강 질환 관련 세균의 실시간 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 리얼타임 PCR 방법{PRIMER AND PROBE FOR REAL TIME DETECTING MICROORGANISM ASSOCIATED WITH ORAL DISEASE AND REAL TIME PCR METHOD USING THE SAME}
본원은, 구강 질환 관련 세균의 실시간 검출용 프라이머 및 프로브, 이를 포함한 리얼타임 PCR 조성물 및 이를 이용한 리얼타임 PCR 방법에 관한 것이다.
치주염은 다양한 복합 구강 세균이 구강 내에 감염되어 치자 뿌리를 둘러싸고 있는, 치조골이 흡수되는 만성질환으로서, 전 세계의 성인 2/3 이상이 이환되어 있을 뿐만 아니라 성인의 치아 발치의 가장 주요한 원인이 되는 심각한 글로벌 질환이다. 또한, 복합 세균이나 여기서 유발된 독성 물질들이 혈류를 통해 심각한 전신 질환을 야기하거나 심화되는 과정에 있어 결정적인 영향을 미친다.
고령화 사회로 접어들게 됨에 따라, 이러한 치주 질환자들 중 노인 환자들의 수가 상승하고 있으며, 만성 소모성 질환을 가진 치주 환자들도 급격히 증가하여 다양한 전신성 질환(예를 들어, 심혈관질환, 당뇨병, 저체중조산, 류마티스관절염, 만성 신장질환, 상기도 폐질환, 암, 기억력 감퇴 등)에 영향을 미친다는 연구 결과가 나오고 있다.
치주 질환의 주요한 원인균종으로는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포필로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 타네렐라 포시티아 (Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 푸소박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 파비모나스 마이크라 (Parvimonas micra), 캄필로박터 렉터스 (Campylobacter rectus) 등이 알려져 있고, 또 다른 원인균종을 밝히기 위한 연구들이 계속 진행 중이다. 또한, 거주 지역에 따라 치주 질환에 연관된 세균 종이 다르다는 연구도 있다. 그러므로, 치주질환의 원인균을 밝히기 위해서는 전 인류를 대상으로 하는 대단위 역학 연구가 필요하고, 이때 모든 연구자들이 공동적으로 사용할 수 있으면서 민감도와 특이도가 우수한 검출법이 필요한 실정이다.
치주 질환을 진단하는 기존 방법은 환자에게 상당한 고통을 수반하는 치주 탐침자를 이용하고 있는 바, 단순한 검체 채취로 이러한 고통을 줄여주면서도, 치주 질환의 원인이 되는 치주 질환 유발 미생물의 양을 정밀한 유전자 정량 분석 방법을 통해 진단함으로써, 질병의 원인을 규명하고, 근본적인 치료가 가능하도록 하고, 치료 중이나 후의 치주 질환의 개선 여부를 확인할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
또한, 현재 치과 내에서 많이 행하여지는 기존의 미생물 검사 방법은 미생물의 종류와 수를 제대로 구분하지 못하며, 시각적 근거자료에 의하여 의사가 병원성 위험요인에 대한 정확한 판단과 치료에 어려움을 겪고 있다.
현재까지 치주 질환 관련 원인균종을 찾기 위한 분자역학연구는 주로 16s rDNA의 염기서열을 바탕으로 프라이머를 제작한 PCR법을 이용하여 정성분석을 한 것이 대부분이었다[G. Conrads et al. "The use of a 16S rDNA directed PCR for the detection of endodontopathogenic bacteria." Journal of Endodontics 23.7 (1997): 433-438]. 16s rDNA 염기서열은 수많은 연구가 진행된 위치이며 변이가 적어 양성률이 높은 장점이 있으나, 여러 미생물 종들과 유사한 염기서열 구조를 가지고 있어 PCR 조건 및 반응 용액 조건의 최적화가 필요하며, 실험상의 작은 변화가 일어나면 유사한 미생물에 대한 비특이적 증폭반응이 일어날 가능성이 높다.
본원은, 구강 질환 관련 세균의 실시간 검출용 프라이머 및 프로브, 이를 포함한 리얼타임 PCR 조성물 및 이를 이용한 리얼타임 PCR 방법을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 서열번호 1 및 2의 염기 서열을 포함하는, 프레보텔라 인터미디아 검출용 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4의 염기 서열을 포함하는, 포필로모나스 진지발리스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 염기 서열을 포함하는, 캄필로박터 렉터스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8의 염기 서열을 포함하는, 트레포네마 덴티콜라 검출용 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 염기 서열을 포함하는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 염기 서열을 포함하는, 푸소박테리움 뉴클레아툼 검출용 프라이머쌍 서열번호 13 및 14의 염기 서열을 포함하는, 파비모나스 마이크라 검출용 프라이머쌍; 및 서열번호 15 및 16의 염기 서열을 포함하는, 타네렐라 포시티아 검출용 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 2 쌍 이상의 프라이머쌍을 포함하는, 구강 질환 관련 세균의 다중 실시간 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본원의 제 2 측면은, 서열번호 17의 염기서열을 포함하는, 프레보텔라 인터미디아 검출용 프로브; 서열번호 18의 염기서열을 포함하는, 포필로모나스 진지발리스 검출용 프로브; 서열번호 19의 염기서열을 포함하는, 캄필로박터 렉터스 검출용 프로브; 서열번호 20의 염기서열을 포함하는, 트레포네마 덴티콜라 검출용 프로브; 서열번호 21의 염기서열을 포함하는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프로브; 서열번호 22의 염기서열을 포함하는, 푸소박테리움 뉴클레아툼 검출용 프로브; 서열번호 23의 염기 서열을 포함하는, 파비모나스 마이크라 검출용 프로브; 및 서열번호 24의 염기 서열을 포함하는, 타네렐라 포시티아 검출용 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 2 개 이상의 프로브를 포함하는, 구강 질환 관련 세균의 다중 실시간 검출용 프로브 세트를 제공한다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 프라이머 세트 및 제 2 측면에 따른 프로브 세트를 포함하는, 구강 질환 관련 세균 검출용 리얼타임 PCR 조성물을 제공한다.
본원의 제 4 측면은, 본원의 제 3 측면에 따른 리얼타임 PCR 조성물을 이용하여 환자의 구강으로부터 수득한 시료에서 구강 질환 관련 세균을 다중 검출하기 위한, 리얼타임 PCR 방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따른 프라이머 세트 및 프로브 세트는, 구강 세균 감염성 질환을 일으키는 병원성 세균을 동정 및 검출하기 위한 것으로서, 계통분류학적으로 잘 보존이 되어 있으며, 세균 종간의 구분이 비교적 용이하고, 일반적으로 연구하는 16S rDNA보다는 각 균주가 가지고 있는 기능적 유전자와 다른 균주와 구별될 수 있는 16S rDNA를 바탕으로 구성됨에 따라, 여러 미생물종들과 유사한 염기서열 구조를 가지고 있어 PCR 조건 및 반응용액 조건의 최적화가 필요한 종래의 16S rDNA 기저 프라이머 또는 프로브에 비해 효과적으로 구강 질환(치주질환 원인균 8종)을 다중 실시간 검출할 수 있는 종특이적 PCR 검출을 가능하게 할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따른 구강 질환 관련 세균 검출용 프라이머 세트 및 프로브 세트는, 민감도 및 특이도가 높으며, 교차 오염을 줄일 수 있어, 구강 내 다양한 세균 중 치주질환 고위험 원인균에 대해 신속하고 간단하게 검출 및 분석할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 구강 질환의 원인균인 미생물의 존재 여부와 농도의 확인을 위해 유전자 분석 기술을 이용하는 것은 방법의 정확성과 기법이 확립되어 있으며, 기존의 배양을 통해 확인하는 방법에 비해 빠르고 정확하며, 배양이 되지 않는 균들에 대한 확인도 가능하여 비용 절감과 임상적인 효과가 뛰어나다. 또한, 정확한 균종 및 양의 확인이 가능하며 치과 병원 내에서 구강 질환 원인 미생물에 적합한 치료 가이드 [항생제 및 SRP(scailing and root planing)]를 제시할 수 있으며, 치료 전 후 반복 검사를 통해 치료성과를 모니터링 함으로써 효율적인 치료를 가능하게 할 수 있다. 또한 환자는 원인 미생물의 조기 분석으로 인하여 구강질환 원인 미생물에 대한 경각심 고조 및 구강 관리에 집중을 할 수 있게 한다.
도 1a 및 도 1b는, 본원의 일 실시예에 따른 A-세트의 싱글플렉스(singleplex) 리얼타임 PCR의 프레보텔라 인터미디아 (a) 민감도와 (b) 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는, 본원의 일 실시예에 따른 A-세트의 싱글플렉스(singleplex) 리얼타임 PCR의 포필로모나스 진지발리스 (a) 민감도와 (b) 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b는, 본원의 일 실시예에 따른 A-세트의 싱글플렉스(singleplex) 리얼타임 PCR의 캄필로박터 렉터스 (a) 민감도와 (b) 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는, 본원의 일 실시예에 따른 A-세트의 싱글플렉스(singleplex) 리얼타임 PCR의 트레포네마 덴티콜라 (a) 민감도와 (b) 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 5a 및 도 5b는, 본원의 일 실시예에 따른 B-세트의 싱글플렉스(singleplex) 리얼타임 PCR의 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 (a) 민감도와 (b) 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 6a 및 도 6b는, 본원의 일 실시예에 따른 B-세트의 싱글플렉스(singleplex) 리얼타임 PCR의 푸소박테리움 뉴클레아툼 (a) 민감도와 (b) 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 7a 및 도 7b는, 본원의 일 실시예에 따른 B-세트의 싱글플렉스(singleplex) 리얼타임 PCR의 파비모나스 마이크라 (a) 민감도와 (b) 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 8a 및 도 8b는, 본원의 일 실시예에 따른 B-세트의 싱글플렉스(singleplex) 리얼타임 PCR의 타네렐라 포시티아 (a) 민감도와 (b) 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 9a 및 도 9b는, 본원의 일 실시예에 따른 A와 B세트의 멀티플렉스(Multiplex) 리얼타임 PCR의 결과를 나타낸 것으로 각 피크에 대한 검출 예시를 나타낸 것이다.
도 10은, 본원의 일 실시예에 따른 A. 악티노마이세템코미탄스의 Aa02F/Aa02R 프라이머의 음성 대조군 균주에 대한 특이도를 나타낸 것이다(M:marker; Aa:A. 악티노마이세템코미탄스; No 1: A. 오돈토리티쿠스; No 2: C. 콘시수스; No 3: C. 오차라세아; No 4: E. coli; No 5: E. 코로덴스; No 6: S. 파우씨모빌리스; No 7: S. 고도니; No 8: S. 미티스; 및 No 9: V. 파불라).
도 11은, 본원의 일 실시예에 따른 T. 포시티아의 Tf02F/Tf02R 프라이머의 음성 대조군 균주에 대한 특이도를 나타낸 것이다(M:marker; Tf: T. 포시티아; No 1: A. 오돈토리티쿠스; No 2: C. 콘시수스; No 3: C. 오차라세아; No 4: E. coli; No 5: E. 코로덴스; No 6: S. 파우씨모빌리스; No 7: S. 고도니; No 8: S. 미티스; 및 No 9: V. 파불라).
도 12는, 본원의 일 실시예에 따른 T. 덴티콜라 의 Td02F/Td02R 프라이머의 음성 대조군 균주에 대한 특이도를 나타낸 것이다(M:marker; Td: T. 덴티콜라; No 1: A. 오돈토리티쿠스; No 2: C. 콘시수스; No 3: C. 오차라세아; No 4: E. coli; No 5: E. 코로덴스; No 6: S. 파우씨모빌리스; No 7: S. 고도니; No 8: S. 미티스; 및 No 9: V. 파불라).
도 13은, 본원의 일 실시예에 따른 P. 인터미디아 의 Pi93F/Pi01R 프라이머의 음성 대조군 균주에 대한 특이도를 나타낸 것이다(M:marker; Pi: P. 인터미디아; No 1: A. 오돈토리티쿠스; No 2: C. 콘시수스; No 3: C. 오차라세아; No 4: E. coli; No 5: E. 코로덴스; No 6: S. 파우씨모빌리스; No 7: S. 고도니; No 8: S. 미티스; 및 No 9: V. 파불라).
도 14는, 본원의 일 실시예에 따른 F. 뉴클레아툼 의 Fn1601F/Fn1601R 프라이머의 음성 대조군 균주에 대한 특이도를 나타낸 것이다(M:marker; Fn: F. 뉴클레아툼; No 1: A. 오돈토리티쿠스; No 2: C. 콘시수스; No 3: C. 오차라세아; No 4: E. coli; No 5: E. 코로덴스; No 6: S. 파우씨모빌리스; No 7: S. 고도니; No 8: S. 미티스; 및 No 9: V. 파불라).
도 15는, 본원의 일 실시예에 따른 P. 마이크라의 Pm1601F/Pm1601R 프라이머의 음성 대조군 균주에 대한 특이도를 나타낸 것이다(M:marker; Pm: P. 마이크라; No 1: A. 오돈토리티쿠스; No 2: C. 콘시수스; No 3: C. 오차라세아; No 4: E. coli; No 5: E. 코로덴스; No 6: S. 파우씨모빌리스; No 7: S. 고도니; No 8: S. 미티스; 및 No 9: V. 파불라).
도 16은, 본원의 일 실시예에 따른 C. 렉터스의 Cr156F/Cr390R 프라이머의 음성 대조군 균주에 대한 특이도를 나타낸 것이다(M:marker; Cr: C. 렉터스; No 1: A. 오돈토리티쿠스; No 2: C. 콘시수스; No 3: C. 오차라세아; No 4: E. coli; No 5: E. 코로덴스; No 6: S. 파우씨모빌리스; No 7: S. 고도니; No 8: S. 미티스; 및 No 9: V. 파불라).
도 17은, 본원의 일 실시예에 따른 P. 진지발리스의 Pg01F/Pg01R 프라이머의 음성 대조군 균주에 대한 특이도를 나타낸 것이다(M:marker; Pg: P. 진지발리스; No 1: A. 오돈토리티쿠스; No 2: C. 콘시수스; No 3: C. 오차라세아; No 4: E. coli; No 5: E. 코로덴스; No 6: S. 파우씨모빌리스; No 7: S. 고도니; No 8: S. 미티스; 및 No 9: V. 파불라).
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 “연결”되어 있다고 할 때, 이는 “직접적으로 연결”되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 “전기적으로 연결”되어 있는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.
본원의 명세서 전체에서, "환자"는 구강 질환을 진단하고자 하는 대상을 의미하며, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 마우스(mouse), 랫(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본원 명세서 전체에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
이하, 본원의 구현예를 상세히 설명하였으나, 본원이 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 1 측면은, 서열번호 1 및 2의 염기 서열을 포함하는, 프레보텔라 인터미디아 검출용 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4의 염기 서열을 포함하는, 포필로모나스 진지발리스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 염기 서열을 포함하는, 캄필로박터 렉터스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8의 염기 서열을 포함하는, 트레포네마 덴티콜라 검출용 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 염기 서열을 포함하는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 염기 서열을 포함하는, 푸소박테리움 뉴클레아툼 검출용 프라이머쌍 서열번호 13 및 14의 염기 서열을 포함하는, 파비모나스 마이크라 검출용 프라이머쌍; 및 서열번호 15 및 16의 염기 서열을 포함하는, 타네렐라 포시티아 검출용 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 2 쌍 이상의 프라이머쌍을 포함하는, 구강 질환 관련 세균의 다중 실시간 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 종래의 리얼타임 PCR 방법에서는, 주로 16S rDNA의 염기서열을 바탕으로 프라이머를 제작하여 정성분석을 하였다. 그러나 16S rDNA 염기서열은 수많은 연구가 진행된 위치이며 변이가 적어 양성률이 높은 장점이 있으나, 여러 미생물 종들과 유사한 염기서열 구조를 가지고 있어 PCR 조건 및 반응용액 조건의 최적화가 필요하며, 실험상의 작은 변화가 일어나면 유사한 미생물에 대한 비특이적 증폭반응이 일어날 가능성이 높다. 이에 반하여, 본원의 프라이머 세트는 다른 균주와 구별될 수 있는 16S rDNA와 각 균주가 가지고 있는 기능적 유전자를 바탕으로 하여 제조된 것으로서, 민감도 및 특이도가 높으며, 교차 오염을 줄일 수 있어, 구강 내 다양한 세균 중 치주 질환 고위험 원인균을 정확하게 검출할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 검출하고자 하는 구강 질환 관련 세균의 유전자에 상보적인 염기 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 적어도 2 쌍 이상, 예를 들어, 3 쌍 또는 4 쌍 이상의 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트로서 사용되어 상기 구강 질환 관련 세균을 동시에 다중 실시간 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 1 및 2의 염기 서열을 포함하는, 프레보텔라 인터미디아 검출용 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4의 염기 서열을 포함하는, 포필로모나스 진지발리스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 염기 서열을 포함하는, 캄필로박터 렉터스 검출용 프라이머쌍; 및 서열번호 7 및 8의 염기 서열을 포함하는, 트레포네마 덴티콜라 검출용 프라이머쌍을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 9 및 10의 염기 서열을 포함하는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 염기 서열을 포함하는, 푸소박테리움 뉴클레아툼 검출용 프라이머쌍 서열번호 13 및 14의 염기 서열을 포함하는, 파비모나스 마이크라 검출용 프라이머쌍; 및 서열번호 15 및 16의 염기 서열을 포함하는, 타네렐라 포시티아 검출용 프라이머쌍을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 1 및 2의 염기 서열을 포함하는, 프레보텔라 인터미디아 검출용 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4의 염기 서열을 포함하는, 포필로모나스 진지발리스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 염기 서열을 포함하는, 캄필로박터 렉터스 검출용 프라이머쌍; 및 서열번호 7 및 8의 염기 서열을 포함하는, 트레포네마 덴티콜라 검출용 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 염기 서열을 포함하는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 염기 서열을 포함하는, 푸소박테리움 뉴클레아툼 검출용 프라이머쌍 서열번호 13 및 14의 염기 서열을 포함하는, 파비모나스 마이크라 검출용 프라이머쌍; 및 서열번호 15 및 16의 염기 서열을 포함하는, 타네렐라 포시티아 검출용 프라이머쌍을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 구강 질환 관련 세균은 치주 질환 등의 원인이 되는 균으로서, 예를 들어, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 타네렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus), 및 파비모나스 마이크라(Parvimonas micra)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세균일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 서열번호 17의 염기서열을 포함하는, 프레보텔라 인터미디아 검출용 프로브; 서열번호 18의 염기서열을 포함하는, 포필로모나스 진지발리스 검출용 프로브; 서열번호 19의 염기서열을 포함하는, 캄필로박터 렉터스 검출용 프로브; 서열번호 20의 염기서열을 포함하는, 트레포네마 덴티콜라 검출용 프로브; 서열번호 21의 염기서열을 포함하는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프로브; 서열번호 22의 염기서열을 포함하는, 푸소박테리움 뉴클레아툼 검출용 프로브; 서열번호 23의 염기 서열을 포함하는, 파비모나스 마이크라 검출용 프로브; 및 서열번호 24의 염기 서열을 포함하는, 타네렐라 포시티아 검출용 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 2 개 이상의 프로브를 포함하는, 구강 질환 관련 세균의 다중 실시간 검출용 프로브 세트를 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트는 16s rDNA보다는 큰 기능성 유전자인 waaA (3-deoxy-D-manno-octulosonic-acid transferase) 유전자를 바탕으로 하여 제조된 것으로서, 민감도 및 특이도가 높으며, 교차 오염을 줄일 수 있어, 구강 내 다양한 세균 중 치주 질환 고위험 원인균을 정확하게 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트는 검출하고자 하는 구강 질환 관련 세균의 유전자에 특이적으로 결합하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트는 적어도 2 개 이상, 예를 들어, 3 개 또는 4 개 이상의 프로브를 포함하는 프로브 세트로서 사용되어 상기 구강 질환 관련 세균을 동시에 다중 실시간 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트는, 서열번호 17의 염기서열을 포함하는, 프레보텔라 인터미디아 검출용 프로브; 서열번호 18의 염기서열을 포함하는, 포필로모나스 진지발리스 검출용 프로브; 서열번호 19의 염기서열을 포함하는, 캄필로박터 렉터스 검출용 프로브; 및 서열번호 20의 염기서열을 포함하는, 트레포네마 덴티콜라 검출용 프로브를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트는 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지 물질로 표지된 2 개 이상의 프로브를 동시에 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지 물질로 표지된 2개 이상의 프로브를 동시에 포함하는 경우 1 개의 검사 튜브에서 2 개 이상의 구강 질환 원인 세균을 한번에 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브는 표지 물질로 표지된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 표지 물질은 당업계에 알려진 다양한 형광 물질, 방사성 물질, 발광성 물질 등과 같은 다양한 표지 물질을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민, 텍사스 레드, SYBR 그린 I(SYBR green I), VIC, FAM(fluorescein), TAMRA(carboxytetramethylrhodamine), HEX(carboxy-2',4,4',5',7,7'-hexachloroflurescein), BHQ3 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 프로브는, 5' 말단, 3' 말단, 또는 5' 말단과 3' 말단 둘 다에 표지 물질로 표지될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트는, 서열번호 21의 염기서열을 포함하는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프로브; 서열번호 22의 염기서열을 포함하는, 푸소박테리움 뉴클레아툼 검출용 프로브; 서열번호 23의 염기 서열을 포함하는, 파비모나스 마이크라 검출용 프로브; 및 서열번호 24의 염기 서열을 포함하는, 타네렐라 포시티아 검출용 프로브를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트는, 서열번호 17의 염기서열을 포함하는, 프레보텔라 인터미디아 검출용 프로브; 서열번호 18의 염기서열을 포함하는, 포필로모나스 진지발리스 검출용 프로브; 서열번호 19의 염기서열을 포함하는, 캄필로박터 렉터스 검출용 프로브; 서열번호 20의 염기서열을 포함하는, 트레포네마 덴티콜라 검출용 프로브; 서열번호 21의 염기서열을 포함하는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프로브; 서열번호 22의 염기서열을 포함하는, 푸소박테리움 뉴클레아툼 검출용 프로브; 서열번호 23의 염기 서열을 포함하는, 파비모나스 마이크라 검출용 프로브; 및 서열번호 24의 염기 서열을 포함하는, 타네렐라 포시티아 검출용 프로브를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트에서, 상기 프로브는 한쪽 말단, 예를 들어, 5' 말단을 470 nm에서 검출할 수 있는 표지 물질로 표지하고, 또 다른 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어, 5' 말단을 530 nm에서 검출할 수 있는 표지 물질로 표지함으로써, 다양한 검출 파장에서 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 470 nm에서 검출할 수 있는 상기 표지 물질은 FAM일 수 있고, 530 nm에서 검출할 수 있는 상기 표지 물질은 VIC일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 프라이머 세트 및 제 2 측면에 따른 프로브 세트를 포함하는, 구강 질환 관련 세균 검출용 리얼타임 PCR 조성물을 제공한다.
본원의 제 3 측면에 따른 구강 질환 관련 세균 검출용 리얼타임 PCR 조성물에 대하여, 본원의 제 1 측면 및 본원의 제 2 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면 및 본원의 제 2 측면에 기재된 내용은 본원의 제 3 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 1 및 2의 염기 서열을 포함하는, 프레보텔라 인터미디아 검출용 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4의 염기 서열을 포함하는, 포필로모나스 진지발리스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 염기 서열을 포함하는, 캄필로박터 렉터스 검출용 프라이머쌍; 및 서열번호 7 및 8의 염기 서열을 포함하는, 트레포네마 덴티콜라 검출용 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 염기 서열을 포함하는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 염기 서열을 포함하는, 푸소박테리움 뉴클레아툼 검출용 프라이머쌍 서열번호 13 및 14의 염기 서열을 포함하는, 파비모나스 마이크라 검출용 프라이머쌍; 및 서열번호 15 및 16의 염기 서열을 포함하는, 타네렐라 포시티아 검출용 프라이머쌍을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트는, 서열번호 17의 염기서열을 포함하는, 프레보텔라 인터미디아 검출용 프로브; 서열번호 18의 염기서열을 포함하는, 포필로모나스 진지발리스 검출용 프로브; 서열번호 19의 염기서열을 포함하는, 캄필로박터 렉터스 검출용 프로브; 서열번호 20의 염기서열을 포함하는, 트레포네마 덴티콜라 검출용 프로브; 서열번호 21의 염기서열을 포함하는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프로브; 서열번호 22의 염기서열을 포함하는, 푸소박테리움 뉴클레아툼 검출용 프로브; 서열번호 23의 염기 서열을 포함하는, 파비모나스 마이크라 검출용 프로브; 및 서열번호 24의 염기 서열을 포함하는, 타네렐라 포시티아 검출용 프로브를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 종래의 리얼타임 PCR 방법에서는, 주로 16S rDNA의 염기서열을 바탕으로 프라이머를 제작하여 정성분석을 하였다. 그러나 16S rDNA 염기서열은 수많은 연구가 진행된 위치이며 변이가 적어 양성률이 높은 장점이 있으나, 여러 미생물 종들과 유사한 염기서열 구조를 가지고 있어 PCR 조건 및 반응용액 조건의 최적화가 필요하며, 실험상의 작은 변화가 일어나면 유사한 미생물에 대한 비특이적 증폭반응이 일어날 가능성이 높다. 이에 반하여, 본원의 프라이머 세트는 다른 균주와 구별될 수 있는 16S rDNA와 각 균주가 가지고 있는 기능적 유전자를 바탕으로 하여 제조된 것으로서, 민감도 및 특이도가 높으며, 교차 오염을 줄일 수 있어, 구강 내 다양한 세균 중 치주 질환 고위험 원인균을 정확하게 검출할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 검출하고자 하는 구강 질환 관련 세균의 유전자에 상보적인 염기 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 적어도 2 쌍 이상, 예를 들어, 3 쌍 또는 4 쌍 이상의 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트로서 사용되어 상기 구강 질환 관련 세균을 동시에 다중 실시간 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트는 16s rDNA보다는 큰 기능성 유전자인 waaA (3-deoxy-D-manno-octulosonic-acid transferase) 유전자를 바탕으로 하여 제조된 것으로서, 민감도 및 특이도가 높으며, 교차 오염을 줄일 수 있어, 구강 내 다양한 세균 중 치주 질환 고위험 원인균을 정확하게 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트는 검출하고자 하는 구강 질환 관련 세균의 유전자에 특이적으로 결합하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트는 적어도 2 개 이상, 예를 들어, 3 개 또는 4 개 이상의 프로브를 포함하는 프로브 세트로서 사용되어 상기 구강 질환 관련 세균을 동시에 다중 실시간 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트는 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지 물질로 표지된 2 개 이상의 프로브를 동시에 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지 물질로 표지된 2개 이상의 프로브를 동시에 포함하는 경우 1 개의 검사 튜브에서 2 개 이상의 구강 질환 원인 세균을 한번에 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브는 표지 물질로 표지된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 표지 물질은 당업계에 알려진 다양한 형광 물질, 방사성 물질, 발광성 물질 등과 같은 다양한 표지 물질을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민, 텍사스 레드, SYBR 그린 I(SYBR green I), VIC, FAM(fluorescein), TAMRA(carboxytetramethylrhodamine), HEX(carboxy-2',4,4',5',7,7'-hexachloroflurescein), BHQ3 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 프로브는, 5' 말단, 3' 말단, 또는 5' 말단과 3' 말단 둘 다에 표지 물질로 표지될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트에서, 상기 프로브는 한쪽 말단, 예를 들어, 5' 말단을 470 nm에서 검출할 수 있는 표지 물질로 표지하고, 또 다른 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어, 5' 말단을 530 nm에서 검출할 수 있는 표지 물질로 표지함으로써, 다양한 검출 파장에서 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 470 nm에서 검출할 수 있는 상기 표지 물질은 FAM일 수 있고, 530 nm에서 검출할 수 있는 상기 표지 물질은 VIC일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 4 측면은, 본원의 제 3 측면에 따른 리얼타임 PCR 조성물을 이용하여 환자의 구강으로부터 수득한 시료에서 구강 질환 관련 세균을 다중 검출하기 위한, 리얼타임 PCR 방법을 제공한다.
본원의 제 4 측면에 따른 리얼타임 PCR 방법에 대하여, 본원의 제 1 측면 내지 제 3 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면 내지 제 3 측면에 기재된 내용은 본원의 제 4 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 리얼타임 PCR 방법은, 환자의 구강으로부터 수득한 시료, 하나 이상의 프라이머쌍 및 표지 물질로 표지된 이상의 상기 프로브를 이용하여 리얼타임 PCR로 증폭하는 단계; 및 상기 표지 물질로부터의 실시간 방출(emission)의 실시간 증가를 검출하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 표지 물질로부터의 실시간 방출 정도를 측정하여 상기 구강 질환 관련 세균에 특이적인 유전자 증폭량을 산출할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 환자의 구강으로부터 수득한 시료는 환자의 구강으로부터 가글액을 통해서 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 시료는 검출하고자 하는 구강 질환 관련 세균의 유전자 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 구강 질환 관련 세균은 치주 질환 등의 원인이 되는 균으로서, 예를 들어, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포필로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 푸소박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아 (Prevotella intermedia), 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola), 타네렐라 포시티아 (Tannerella forsythia), 캄필로박터 렉터스 (Campylobacter rectus), 및 파비모나스 마이크라 (Parvimonas micra)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세균일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 가글액은 플루오르화나트륨, 스페아민트 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 리얼타임 PCR 방법은, 상기 증폭하는 단계 전에, 상기 구강 질환 관련 세균에 특이적인 유전자의 카피수를 알고 있는 양성 표준자를 둘 이상의 상기 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트 및 표지 물질로 표지된 둘 이상의 상기 프로브를 포함하는 프로브 세트를 이용하여 리얼타임 PCR로 증폭하는 단계를 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 표지 물질로부터의 실시간 방출(emission)의 실시간 증가를 검출하는 단계는, 상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지 물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp 값 또는 Ct 값)를 분석하는 단계; 상기 표지 물질의 형광세기의 변화를 측정하여 얻어진 표준곡선으로부터 상기 유전자 서열의 카피수와, Cp 값 또는 Ct값을 대응시키는 단계; 상기 환자의 구강으로부터의 수득한 시료 내에 존재하는 상기 구강 질환 관련 세균에 특이적인 유전자 서열의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지 물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp 값 또는 Ct 값)를 분석하는 단계; 및 상기 환자의 구강으로부터의 수득한 시료 내에 존재하는 상기 구강 질환 관련 세균에 특이적인 유전자를 PCR 증폭하여 얻은 Cp 값 또는 Ct 값을 상기 양성 표준자의 카피수에 대응시켜, 상기 검체 내에 존재하는 구강 질환 관련 세균의 감염 정도를 정량적으로 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 둘 이상의 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트 및 둘 이상의 프로브를 포함하는 프로브 세트를 사용하여, 둘 이상의 구강 질환 관련 세균을 동시에 실시간 다중 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 프라이머와 상기 프로브는 검출하고자 하는 세균에 대하여 종 특이적이면서도 서로 상호저해를 하지 않아, 그로 인한 교차 오염을 줄일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머쌍은 검출하고자 하는 구강 질환 관련 세균의 유전자에 상보적인 염기 서열을 포함하는 것으로서, 한 쌍의 프라이머쌍 단독으로 사용되거나, 둘 이상의 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 1 및 2의 염기 서열을 포함하는, 프레보텔라 인터미디아 검출용 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4의 염기 서열을 포함하는, 포필로모나스 진지발리스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 염기 서열을 포함하는, 캄필로박터 렉터스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8의 염기 서열을 포함하는, 트레포네마 덴티콜라 검출용 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 염기 서열을 포함하는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 염기 서열을 포함하는, 푸소박테리움 뉴클레아툼 검출용 프라이머쌍 서열번호 13 및 14의 염기 서열을 포함하는, 파비모나스 마이크라 검출용 프라이머쌍; 및 서열번호 15 및 16의 염기 서열을 포함하는, 타네렐라 포시티아 검출용 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 2 쌍 이상의 프라이머쌍을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브는 상기 검출하고자 하는 구강 질환 관련 세균의 유전자에 특이적으로 결합하는 염기 서열을 포함하는 것으로서, 하나의 프로브 단독으로 사용되거나, 둘 이상의 프로브 세트의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브 세트는, 서열번호 17의 염기서열을 포함하는, 프레보텔라 인터미디아 검출용 프로브; 서열번호 18의 염기서열을 포함하는, 포필로모나스 진지발리스 검출용 프로브; 서열번호 19의 염기서열을 포함하는, 캄필로박터 렉터스 검출용 프로브; 서열번호 20의 염기서열을 포함하는, 트레포네마 덴티콜라 검출용 프로브; 서열번호 21의 염기서열을 포함하는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프로브; 서열번호 22의 염기서열을 포함하는, 푸소박테리움 뉴클레아툼 검출용 프로브; 서열번호 23의 염기 서열을 포함하는, 파비모나스 마이크라 검출용 프로브; 및 서열번호 24의 염기 서열을 포함하는, 타네렐라 포시티아 검출용 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 2 개 이상의 프로브를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브는 표지 물질로 표지된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 표지 물질은 당업계에 알려진 다양한 형광 물질, 방사성 물질, 발광성 물질 등과 같은 다양한 표지 물질을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민, 텍사스 레드, SYBR 그린 I(SYBR green I), VIC, FAM(fluorescein), TAMRA(carboxytetramethylrhodamine), HEX(carboxy-2',4,4',5',7,7'-hexachloroflurescein), BHQ3 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 표지 물질은 형광 물질일 수 있으며, 형광의 세기를 측정하여 상기 구강 질환 관련 세균에 특이적인 유전자의 증폭량을 산출할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이하, 본원에 대하여 실시예를 이용하여 좀더 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 표준 균주의 선택 및 DNA 추출
표준 균주의 선택 및 배양
본원 실시예에서 사용된 치주 질환의 주요한 원인균종은 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포필로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 타네렐라 포시티아 (Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 푸소박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 파비모나스 마이크라 (Parvimonas micra), 캄필로박터 렉터스 (Campylobacter rectus)를 선택하여 사용하였다 (표 1: 표준 균주 8 종).
Figure pat00001
본원 실시예에서 제작한 프라이머가 구강 내에 다른 균주와 반응을 일으키는 교차오염을 확인하기 위한 음성대조군으로, 악티노마이세스 오돈토리티쿠스 (Actinomyces odontolyticus), 캄필로박터 콘시수스 (Campylobacter concisus), 캡노시토파가 오차라세아 (Capnocytophaga ochracea), 에셔리키아 콜라이 (Escherichia coli), 익케넬라 코로덴스 (Eikenella corrodens), 사핑고모나스 파우씨모빌리스 (Sphingomonas paucimobilis), 스트렙토코쿠스 고도니 (Streptococcus gordonii), 스트렙토코쿠스 미티스 (Streptococcus mitis), 베일로넬라 파불라 (Veillonella parvula) 등의 균주를 사용하였다 (표 2: 음성대조군 9 종).
Figure pat00002
상기 균주들은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)와 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, Biological Resource Center, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
A. 악티노마이세템코미탄스는 0.6% 효모 추출물, 5% 말 혈청 (horse serum), 75 ㎍/ml 바시트라신 (bacitracin) 및 5 ㎍/ml 반코마이신 (vancomycin) (Sigma, USA) 이 첨가된 TSB (tryptic soy broth, Difco Laboratories, USA) 배지에서 배양하였다. 그 외 균주들은 TSB (trypticase soy broth)에 0.5% 효모 추출물, 0.05% 시스테인 HCl-H2O (cysteine HCl-H2O), 0.5 ㎎/㎖ 헤민 (hemin) 및 2 ㎍/㎖ 비타민 K1이 첨가된 배지에 배양하였다.
DNA 추출
균주 검출을 위한 PCR 반응의 주형으로 사용할 모든 균주의 게놈 DNA들은 ExgeneTMClinic SV product: ExgeneTM Clinic SV Mini (GeneAll CO., Seoul, Korea)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 추출하였다. 각각의 배양액에서 배양된 균주들은 1 ㎖를 10,000 x g의 원심력을 이용하여 세균을 수확한 다음, 1X PBS에 용해시킨 후 프로테이나아제 (proteinase) K 용액 (20 mg/ml) 20 ㎕을 첨가하고, BL 버퍼(세포 용해 버퍼) 200 ㎕를 넣고 볼텍싱(vortex)하였다. 그런 다음, 56℃에서 10 분간 반응시키고 스핀다운 하였다. 이후, 상기 용액을 SV 컬럼에 조심스럽게 옮긴 후, 8,000 rpm에서 1 분간 원심분리 하였다. 그런 다음, BW 버퍼(세척 버퍼) 600 ㎕를 첨가한 후 8,000 rpm에서 1 분간 원심분리하고, TW 버퍼(Washing buffer 2) 700 ㎕를 넣고, 또다시 8000 rpm에서 1 분간 원심분리 하였다. 최종 용출 버퍼를 사용하여 회수한 DNA를 이후 각각의 PCR에 사용하였다. 컬럼을 새로운 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에 결합시킨 후 AE 버퍼(용출 버퍼) 50 ㎕을 첨가하고 5 분간 상온에서 반응 시킨 다음 12,000 rpm에서 1 분간 원심분리하여 DNA를 회수하였다.
회수한 균종별 DNA는 목적에 맞게 NanoDrop2000 (Thermo SCIENTIFIC., USA) 으로 정량한 이후 PCR 주형으로 사용하였다.
실시예 2: 표준 균주 DNA를 이용한 리얼타임 PCR (Real-time PCR )
표준화된 PCR 조건을 위해 상기 실시예 1의 표 1에서와 같은 8 종의 분양 받은 표준 균주에서 DNA를 추출하고 NanoDrop2000 (Thermo SCIENTIFIC., USA)을 이용하여 정량한 이후 TE 버퍼를 사용하여 10 ng부터 10 fg 까지 10 배씩 연속적으로 희석하여 리얼타임 PCR 정량에 필요한 표준곡선을 작성하였다. 현재 진단용으로 분류되어 있는 리얼-타임 PCR 장비들은 각 프로브의 형광물질들이 파장대별로 겹치는 한계가 있으므로 표준 염료(reference dye)를 제외한 4 종의 프라이머쌍 및 프로브의 A 및 B 두 개의 세트로 구분하여 다중분석하였다 (표 3 및 표 4).
각 균주에 대한 단일 카피 유전자로부터 보존된 영역 (conserved region)을 바탕으로 하여 소프트웨어 PRIMER3 (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/eprimer3.html)를 이용하여 프라이머 및 프로브를 설계 및 제작하였다. 보존된 영역은 다중 서열 정렬 소프트웨어 (multiple sequence alignment software) (T-Coffee v.1.41)를 사용하여 확인하였으며, 선택된 프라이머 및 프로브는 Basis Local Alignment Search Tool (BLAST) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 사용하여 비관련 서열과의 상동성을 비교하였다. 프라이머 및 프로브는 기능성 유전자에 근거한 것으로, RealTime Design Software를 사용하여 특이성에 대해 설계하였다. 이차 구조의 존재는 mFOLD (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)를 사용하여 분석하였다. 이와 같이 제조된 프라이머와 프로브는 종 특이적이면서 상호저해를 하지 않는 것을 확인하였다 (표 3: 본원에서 사용된 구강질환 원인균주 검출용 프라이머, 및 표 4: 본원에서 사용된 구강 질환 원인 균주 검출용 프로브).
Figure pat00003
Figure pat00004
10 pmol의, 각 4 종씩 2 세트의 8 종의 균주의 센스 프라이머와 안티센스 프라이머 (Macrogen, korea) (표 3의 A 세트 및 B 세트); 각각 2 ㎕의 DNA 주형; 1 ㎕의 균주별 이중 표지된 프로브 (Macrogen, korea) (표 4의 A 세트 및 B 세트) 10 pmol; 12.5 ㎕의 2X Master Mix (Applied biosystems, singapore); 3 차 멸균수를 포함하여, 최종 용량 25 ㎕가 되게 하였다. 그런 다음, 이를 96 웰 플레이트에 분주하고, Rea-time PCR Thermal Cycler (Applied biosystems 7500 Fast system, singapore)을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 이때 사용한 리얼타임 PCR 조건은 사전 변성을 위해 95℃에서 10 분간, 이후 40 번의 중합효소연쇄반응 사이클은 95℃ 20 초, 60℃에서 30 초간 시행하였다. 데이터 분석은 Life technologies 7500 software V 2.0.6을 이용하였다. Cycle threshold(Ct)는 알려진 숫자의 DNA 농도의 대수증폭기로 시작하여 균주에 대한 표준곡선에 의해서 시료당 세균수를 측정하였다.
제작한 프라이머와 프로브를 기반으로 하여 최적화된 PCR 조건으로 치주 질환 원인균 8 종의 민감도와 특이도 분석을 시행하였다. 멀티플렉스 (Multiplex)의 민감도와 특이도를 확인하기 이전에, 각 균주 종별 싱글플렉스 (Singleplex)의 민감도를 확인하기 위하여 상기 8 종의 표준 균주를 각각 단독으로 리얼타임 PCR을 시행하여 확인하였고 균주별 게놈 DNA를 1 ng부터 10 fg까지 10 배씩 희석하여 표준곡선과 최소검출한도를 측정하였다 (도 1 내지 도 8 및 표 5). 그런 다음, 세트별 멀티플렉스 상황에서 원인균을 0.1 ng씩 혼합하여 상호 간섭 없이 검출되는지를 확인하였고, 싱글플렉스의 결과값과 비슷하게 검출되는 것을 확인하였다 (도 9).
도 1 내지 도 8 및 하기 표 5(각 균주별 최소 검출한도)는 상기 8 종의 표준 균주의 종별 싱글플렉스의 민감도를 확인하기 위해 각각 단독으로 리얼타임 PCR을 실시한 결과를 나타낸 것으로, 상기 8 종의 구강 질환 관련 세균의 유전자가 상보적으로 결합을 하는지를 확인하고 [도 1 내지 도 8의 (a)], 표준곡선 [도 1 내지 도 8의 (b)]와 최소검출한도, 즉 민감도 (표 5)를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 이미 농도를 알고 있는 샘플들의 리얼타임 PCR의 증폭곡선은 일정한 간격을 주고 S자 형태를 나타내며, 이러한 결과의 곡선을 log로 변환하여 직선 그래프를 생성하는데, 이를 표준 곡선 (standard curve)이라고 한다 (상기 실시예 2에서와 같이 각각의 표준 균주의 gDNA를 10 배씩 희석해서 표준 곡선 작성). 이 표준 곡선을 동일한 시료의 리얼타임 PCR을 진행하여 나온 Ct 값으로부터 검출하고자 하는 DNA의 양이 얼마인지 알 수 있도록 하는 식으로서 사용하여 리얼타임 PCR 정량분석을 실시하였다. 상기 식에서 R2 값은 상기 직선 그래프로부터 나온 식의 값이 얼마나 잘 만들어졌는가를 나타내는 것으로, 1에 가까울수록 신뢰도가 높은 것이다. 도 1 내지 도 8의 (b)에서 R2 값은 모두 약 0.99 정도로서, 1에 매우 근접한 값으로서 그 신뢰도가 매우 높음을 알 수 있다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 하기 표 3 및 표 4의 A 세트 및 B 세트의 프라이머쌍 세트, 프로브 세트 및 8종의 원인균을 이용한 멀티플렉스 리얼타임 PCR에서, 목표하는 각 세트별 4 종의 원인균은 다른 원인균의 간섭을 받지않고 세균의 유전자가 증폭되는 것을 확인하였고, 싱글플렉스의 결과값과 비슷한 결과값을 나타내는 것을 확인하였다.
도 10 내지 도 17은 구강 내 일반 세균 17종 (표 1의 표준 균주 8 종 및 표 2의 음성대조군 9 종)에 대한 특이도를 확인한 것으로, 상기 8 종의 구강질환 원인균에 대한 프라이머 및 프로브가 상기 음성대조균 9 종과 리얼타임 PCR 반응을 일으키지 않음을 확인할 수 있다.
Figure pat00005
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수도 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 2의 염기 서열을 포함하는, 프레보텔라 인터미디아 검출용 프라이머쌍;
    서열번호 3 및 4의 염기 서열을 포함하는, 포필로모나스 진지발리스 검출용 프라이머쌍;
    서열번호 5 및 6의 염기 서열을 포함하는, 캄필로박터 렉터스 검출용 프라이머쌍;
    서열번호 7 및 8의 염기 서열을 포함하는, 트레포네마 덴티콜라 검출용 프라이머쌍;
    서열번호 9 및 10의 염기 서열을 포함하는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프라이머쌍;
    서열번호 11 및 12의 염기 서열을 포함하는, 푸소박테리움 뉴클레아툼 검출용 프라이머쌍
    서열번호 13 및 14의 염기 서열을 포함하는, 파비모나스 마이크라 검출용 프라이머쌍; 및
    서열번호 15 및 16의 염기 서열을 포함하는, 타네렐라 포시티아 검출용 프라이머쌍
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 2 쌍 이상의 프라이머쌍을 포함하는, 구강 질환 관련 세균의 다중 실시간 검출용 프라이머 세트.
  2. 서열번호 17의 염기서열을 포함하는, 프레보텔라 인터미디아 검출용 프로브;
    서열번호 18의 염기서열을 포함하는, 포필로모나스 진지발리스 검출용 프로브;
    서열번호 19의 염기서열을 포함하는, 캄필로박터 렉터스 검출용 프로브;
    서열번호 20의 염기서열을 포함하는, 트레포네마 덴티콜라 검출용 프로브;
    서열번호 21의 염기서열을 포함하는, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프로브;
    서열번호 22의 염기서열을 포함하는, 푸소박테리움 뉴클레아툼 검출용 프로브;
    서열번호 23의 염기 서열을 포함하는, 파비모나스 마이크라 검출용 프로브; 및
    서열번호 24의 염기 서열을 포함하는, 타네렐라 포시티아 검출용 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 2 개 이상의 프로브를 포함하는, 구강 질환 관련 세균의 다중 실시간 검출용 프로브 세트.
  3. 제 1 항의 프라이머 세트 및 제 2 항의 프로브 세트를 포함하는, 구강 질환 관련 세균의 다중 검출용 리얼타임 PCR 조성물.
  4. 제 3 항의 리얼타임 PCR 조성물을 이용하여 환자의 구강으로부터 수득한 시료에서 구강 질환 관련 세균을 다중 검출하기 위한, 리얼타임 PCR 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 리얼타임 PCR 방법은, 환자의 구강으로부터 수득한 시료 및 제 3 항의 리얼타임 PCR 조성물을 이용하여 리얼타임 PCR로 증폭하는 단계; 및
    상기 리얼타임 PCR 조성물의 프로브에 표지된 표지 물질로부터의 실시간 방출(emission)의 실시간 증가를 검출하는 단계
    를 포함하는 것인, 리얼타임 PCR 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 증폭하는 단계 전에, 상기 구강 질환 관련 세균에 특이적인 유전자의 카피수를 알고 있는 양성 표준자를 제 3 항의 리얼타임 PCR 조성물을 이용하여 증폭하는 단계를 추가 포함하는 것인, 리얼타임 PCR 방법.
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