KR20150080106A - 다중 리얼타임 pcr을 이용한 구강질환 유발 미생물 검출 방법 - Google Patents

다중 리얼타임 pcr을 이용한 구강질환 유발 미생물 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다중 리얼타임 PCR을 이용한 구강질환 유발 미생물 검출 방법에 관한 것으로, 구체적으로 포르피로모나스 진지발리스, 타네렐라 포르시서스, 트레포네마 덴티콜라, 엑티노바실러스 엑티노마이세템코미탄스, 캄필로박터 렉터스, 프레보텔라 인터미디아 각각의 유전체 DNA에 대한 프라이머와 이 프라이머로 증폭되는 DNA에 대한 탐침을 사용하여 리얼타임 PCR을 수행하고, 탐침의 표지물질을 이용하여 각 프라이머 쌍에 의한 증폭량을 산출함으로써 구강질환 유발 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 구강질환 유발에 매우 중요한 6종의 미생물을 샘플로부터 매우 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 정량적인 분석도 가능하기 때문에 구강의 미생물 환경을 정확하게 판단할 수 있다. 따라서 구강의 미생물 환경 정보를 바탕으로 일반인의 경우 치주 질환 발병 가능성의 예측 및 관리가 가능하며 환자의 경우 치료 과정에서 치료 계획의 수립의 지침으로 활용 될 수 있으며 치료 이후 예후 관찰의 지표로 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

다중 리얼타임 PCR을 이용한 구강질환 유발 미생물 검출 방법{Detection method for periodontal pathogenic microbes using Multiplex real time PCR}
본 발명은 다중 리얼타임 PCR을 이용한 구강질환 유발 미생물 검출 방법에 관한 것으로, 구체적으로 포르피로모나스 진지발리스, 타네렐라 포르시서스, 트레포네마 덴티콜라, 엑티노바실러스 엑티노마이세템코미탄스, 캄필로박터 렉터스, 프레보텔라 인터미디아 각각의 유전체 DNA에 대한 프라이머와 이 프라이머로 증폭되는 DNA에 대한 탐침을 사용하여 리얼타임 PCR을 수행하고, 탐침의 표지물질을 이용하여 각 프라이머 쌍에 의한 증폭량을 산출함으로써 구강질환 유발 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
치주염은 치아를 지탱하는 치아주위 조직과 치조골 등의 부위에 염증이 발생하여 치아 연결 조직과 치조골이 손실되고 종국에는 치아가 상실되는 감염성 질환이다(Zambon, J. J. 1996.). 치주염은 구강 내에 서식하는 다양한 구강질환 유발미생물들이 복합적으로 군집을 형성함으로써 이루어지는 것으로 추정되고 있다(Haffajee and Socransky, 1994; Takamatsu et al., 1999; Wolff et al., 1993). 이러한 박테리아들이 구강질환 환부에서 동시에 서식하는 것이 확인되었으며 다양한 균종들이 동시에 서식하는 상황이 치주염 등의 질환을 더욱 증대시키는 것으로 추정되고 있다(Takamatsu et al., 1999;, Thomas et al., 1995). 이와 같은 이유로 구강에 서식하고 있는 미생물의 분포의 다양성과 농도의 증가를 확인하는 것은 치주 질환의 진단과 치료에 매우 중요한 의미를 지닌다.
구강 질환 유발 미생물의 신속한 동정을 위한 기술의 개발이 지속적으로 이루어져 왔으나 낮은 민감도, 과정의 복잡성으로 인하여 일반화되지 못하였다. 이와 같은 문제를 극복하기 위하여 다종의 미생물을 동시에 분석하기 위한 다양한 기술 개발이 시도 되고 있다(Garcia et al., 1998; Takamatsu et al., 1999; Tran and Rudney, 1996; Wahlfors et al., 1995).
이에 본 발명자는 연구결과 구강 질환 유발과 밀접한 관련이 있는 것으로 보이는 포르피로모나스 진지발리스, 타네렐라 포르시서스, 트레포네마 덴티콜라, 엑티노바실러스 엑티노마이세템코미탄스, 캄필로박터 렉터스, 프레보텔라 인터미디아의 6종 미생물(Thomas et al., 1995; Xiang et al., 2005; Yasuyuki et al., 2002)을 동시에 신속 정확하게 분석할 수 있는 기법을 개발하고자 노력하였다.
이의 결과, 서열번호 1 ~ 12의 각 프라이머와 표지물질로 표지된 서열번호 13 ~ 18의 탐침을 사용하여 리얼타임 PCR을 수행할 경우, 프라이머들 사이의 간섭없이 각 목표로 하는 부위를 정확하게 증폭할 수 있으며, 이러한 증폭 정도를 표지물질을 이용하여 정확하게 판단할 수 있어, 샘플로부터 구강질환 유발 미생물을 매우 신속하고 정확하게 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
Zambon, J. J. 1996. Periodontal diseases: microbial factors. Ann. Periodontol. 1:879-925. Haffajee, A. D., and S. S. Socransky. 1994. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontology 2000 5:78-111. Takamatsu, N., K. Yano, T. He, M. Umeda, and I. Ishikawa. 1999. Effect of initial periodontal therapy on the frequency of detecting Bacteroides forsythus, Porphyromonas gingivalis, and Actinobacillus actinomycetemcomitans. J. Periodontol. 70:574-580. Wolff, L. F., D. M. Aeppli, B. L. Pihlstrom, L. Anderson, J. L. Stoltenberg, J. B. Osborn, N. A. Hardie, C. E. Shelburne, and G. E. Fisher. 1993. Natural distribution of 5 bacteria associated with periodontal disease. J. Clin. Periodontol. 20:699-706. Thomas F. Flemmig, Stefan Rudiger, Ulrich Hofmann, Herbert Schmidt, Barbara Plaschke, Anja Stratz, Bernd Klaiber, Andhelge Karch. 1995. Identification of Actinobacillus actinomycetemcomitansin Subgingival Plaque by PCR. J. Clin. Microbiol. 33:3102-3105. Garcia, L., J. C. Tercero, B. Legido, J. A. Ramos, J. Alemany, and M. Sanz. 1998. Rapid detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia, and Porphyromona gingivalis by multiplex PCR. J. Periodont. Res. 33:59-64. Tran, S. D., and J. D. Rudney. 1996. Multiplex PCR using conserved and species-specific 16S rRNA gene primers for simultaneous detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis. J. Clin. Microbiol. 34:2674-2678. Wahlfors, J., J. H. Meurman, P. Vaisanen, P. Alakuijala, A. Korhonen, H. Torkko, and J. Janne. 1995. Simultaneous detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis by a rapid PCR method. J. Dent. Res. 74:1796-1801. Xiang Y. Han, Jeffrey J. Tarrand, and David C. Rice. 2005. Oral Campylobacter Species Involved in Extraoral Abscess: a Report of Three Cases. J. Clin. Microbiol. 43:2513-2515. Yasuyuki Asai, Takayoshi Jinno, Hajime Igarashi, Yoshinori Ohyama, and Tomohiko Ogawa. 2002. Detection and Quantification of Oral Treponemes in Subgingival Plaque by Real-Time PCR. J. Clin. Microbiol. 40:3334-3340.
본 발명의 주된 목적은 생물학적 샘플로부터 구강질환 유발 미생물을 신속하고 정확하게 검출하기 위한 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 구강질환 유발 미생물 검출을 용이하게 실시할 수 있도록 구성된 검출용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 구강에서 채취한 생물학적 샘플로부터 얻어진 DNA를 대상으로 하여, 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 특이적인 DNA에 대한 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제1프라이머 쌍, 타네렐라 포르시서스(Tannerella forsythus)에 특이적인 DNA에 대한 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제2프라이머 쌍, 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)에 특이적인 DNA에 대한 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제3프라이머 쌍, 엑티노바실러스 엑티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)에 특이적인 DNA에 대한 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제4프라이머 쌍, 캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus)에 특이적인 DNA에 대한 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제5프라이머 쌍, 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia)에 특이적인 DNA에 대한 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제6프라이머 쌍, 상기 제1프라이머 쌍에 의해 증폭되는 DNA에 반응하는 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드가 증폭된 DNA의 농도를 확인할 수 있는 표지물질로 표지된 제1탐침, 상기 제2프라이머 쌍에 의해 증폭되는 DNA에 반응하는 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드가 증폭된 DNA의 농도를 확인할 수 있는 표지물질로 표지된 제2탐침, 상기 제3프라이머 쌍에 의해 증폭되는 DNA에 반응하는 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드가 증폭된 DNA의 농도를 확인할 수 있는 표지물질로 표지된 제3탐침, 상기 제4프라이머 쌍에 의해 증폭되는 DNA에 반응하는 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드가 증폭된 DNA의 농도를 확인할 수 있는 표지물질로 표지된 제4탐침, 상기 제5프라이머 쌍에 의해 증폭되는 DNA에 반응하는 서열번호 17의 올리고뉴클레오티드가 증폭된 DNA의 농도를 확인할 수 있는 표지물질로 표지된 제5탐침 및 상기 제6프라이머 쌍에 의해 증폭되는 DNA에 반응하는 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드가 증폭된 DNA의 농도를 확인할 수 있는 표지물질로 표지된 제6탐침을 이용한 리얼타임 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 표지물질을 이용하여 각 프라이머 쌍에 의한 증폭량을 산출하는 단계;를 포함하는 구강질환 유발 미생물 검출 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 생물학적 샘플로는 검사 대상의 구강으로부터 스왑이나 페이퍼 포인트 등을 이용하여 채취한 조직, 입을 헹군 용액, 타액 등을 사용할 수 있으나, 구강 내부의 전체적인 미생물 환경을 보다 효과적으로 확인하기 위해서는 물, 식염수, 가글액 등의 용액으로 입을 헹군 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 구강질환 유발 미생물 검출 방법에 있어서, 상기 표지물질은 올리고뉴클레오타이드 탐침에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물 등을 의미하며, 본 발명에서는 이 표지물질로 형광물질을 사용하고 형광의 세기를 측정하여 증폭량을 산출하는 것이 바람직하다. 리얼타임 PCR과 같은 DNA 분석을 위해 사용되는 다양한 표지물질이 알려져 있다. 본 발명에서는 이러한 표지물질 중 비교적 쉽게 입수할 수 있고, 관련 분석 장비 또한 많이 보급되어 있는 형광물질을 사용하는 것이 바람직하다. FAM, TAMRA, HEX, CY3, CY5, BHQ, ROX, JOE, ALEXA와 같은 다양한 형광물질이 알려져 있으며, 여러 회사를 통해 상기 각 형광물질들이 표지된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 탐침을 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 각 프라이머 쌍 및 각 탐침이 포함되는 구강질환 유발 미생물 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 구강질환 유발 미생물 검출용 키트는 상기 각 프라이머와 탐침 이외에도 선택적으로, 리얼타임 PCR에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소[Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소], DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명에 따르면 구강질환 유발에 매우 중요한 6종의 미생물을 샘플로부터 매우 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 정량적인 분석도 가능하기 때문에 구강의 미생물 환경을 정확하게 판단할 수 있다. 따라서 구강의 미생물 환경 정보를 바탕으로 일반인의 경우 치주 질환 발병 가능성의 예측 및 관리가 가능하며 환자의 경우 치료 과정에서 치료 계획의 수립의 지침으로 활용 될 수 있으며 치료 이후 예후 관찰의 지표로 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 Porphyromonas gingivalis DNA의 PCR 산물을 클로닝한 플라스미드를 주형으로 하여 희석 농도별로 다중 리얼타임 PCR한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1.
프라이머 및 탐침
본 실시예에 사용된 프라이머(표 1 참조)와 탐침(표 2 참조)들은 NCBI 데이터베이스에 등록된 6종 균주들[Porphyromonas gingivalis(이하 'Pg'로 약기한다), Tannerella forsythia(이하 'Tf'로 약기한다), Treponema denticola(이하 'Td'로 약기한다), Actinobacillus actinomycetemcomitans(이하 'Aa'로 약기한다), Campylobacter rectus(이하 'Cr'로 약기한다), Prevotella intermedia(이하 'Pi'로 약기한다)]의 16S rRNA gene을 INRA multiple sequence alignment program으로 분석하여 상호 저해하지 않으면서 특이도와 민감도를 확보할 수 있도록 디자인 및 제조하였다. 또한 다중 리얼타임 PCR 반응의 적정성을 확인하기 위하여 각 반응에 옥수수의 Adh1 gene 서열에 대하여 디자인된 내부대조군(internal control, IC) 프라이머와 탐침도 제작하였다.
다중 리얼타임 PCR에 사용된 탐침들은 Taq man probe형으로 디자인하였으며, 각 탐침에 부착된 형광 dye들은 서로간의 간섭 등을 고려하여 파장이 겹치거나 간섭하지 않는 4종으로 선정하였다. 이와 같은 형광 dye의 제한으로 인해 하나의 튜브에서 동시에 분석할 수 있는 형광 파장은 4개를 초과할 수 없었기 때문에, 각 반응에 대조군과 검출대상 균종들 중 3종을 함께 분석하는 세트로 구성하였다. 6종을 검출하기 위하여 P set와 A set로 나누었다. P set는 Pg, Tf, Td의 3종을 검출대상으로 하며 A set는 Aa, Cr, Pi의 3종을 검출대상으로 구성하였다(표 1 및 2 참조). 파장이 겹치지 않는 다른 종류의 형광 dye 또는 다른 표지물질을 사용하면 동시에 6종의 균주를 함께 분석할 수 있다.
검출대상 균종 프라이머명 염기서열(5'→3') 서열번호 증폭크기


P set		 Pg PGF catgatcttagcttgctaaggttgat 1 146bp
PGR tatttccttgtaatatcatgcaataataca 2
Tf TFF actggtactgagacacggacca 3 103bp
TFR gcagtcatccttcacgcgact 4
Td TDF cctgaagatggggatagctagtaga 5 178bp
TDR ttcaccctctcaggccgga 6


A set		 Aa AAF attggggtttagccctggtg 7 188bp
AAR aacccatctctgagttcttcttcg 8
Cr CRF tgcaagtcgaacggagattaagtag 9 197bp
CRR accaactagctgatacgatatagcct 10
Pi PIF agtcgaggggaaacggcat 11 160bp
PIR ctttggtccacgtcagatgc 12
IC MADFa ctcttcctcctttagagctaccact 132bp
ADHR4 ccaaatcaatccactccgaga
검출대상 균종 탐침명 염기서열(5'→3') 서열번호 5' 표지 3' 표지

P Set		 Pg PGP tcgagatgaaagggacgatgtacttca 13 FAM TAMRA
Tf TFP tgagatacgtgtattttattgcatgtacct 14 HEX TAMRA
Td TDP tggtgagtaacgcgtgggtgacct 15 CY5 BHQ-3

A Set		 Aa AAP tcgggagacgaaagtgcggga 16 FAM TAMRA
Cr CRP gcaaacaggattagataccctggtagtcca 17 HEX TAMRA
Pi PIP agacggcctaatacccgatgttgt 18 CY5 BHQ-3
IC ICP tcagggctcattttctcgctcctca ROX BHQ-2
분석 시료
상기 프라이머 및 탐침의 유효성을 평가하기 위하여 다양한 균주 DNA를 분석 시료로 사용하였다.
우선, 분석 대상 균주로 본래 검출하고자 하는 대상균주인 Aa(KCCM 41632), Cr(KCTC 5636), Pg(KCTC 5500), Tf(KCTC 5666), Td(KCTC 15104), Pi(KCTC 3692)의 6종(실험군)을 선정하였다. 또한 제작한 프라이머의 특이성을 확인하기 위하여 구강 내에 존재하는 미생물인 Fusobacterium nucleatum(KCTC 2640), Eikenella corrodens(KCTC 15198), Actinomyces viscosus(KCCM 41596), Veillonella parvula(KCTC 5019), Capnocytophaga ochracea(KCTC 3693)를 선정하였고, 이 외에도 Streptococcus sanguinis(KCTC 3284), Streptococcus mitis(KCTC 5638), Streptococcus gordonii(KCTC 3286), Campylobacter concisus(KCTC 5326), Prevotella nigrescens(KCTC 5407), Actinomyces odontolyticus(KCTC 5804), Elizabethkingia meningoseptica(KCTC 2906), Sphingomonas paucimobilis(KCTC 2346), Pseudomonas aeruginosa(KCTC 1636), Escherichia coli(KCTC 1041)를 선정하여 음성 대조군으로 사용하였다. 상기의 균주들은 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC) 및 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)로부터 동결건조 되어있는 상태로 분양받았다. 동결건조 되어있는 균주는 멸균된 증류수로 현탁하여 DNA 추출에 사용하였다. Genomic DNA의 추출은 Genomic DNA Extraction Kit(Intron, Korea)를 사용하였다.
또한, 옥수수의 Adh1 gene을 클로닝하여 플라스미드로 제작한 다음 이를 내부대조군 DNA로 사용하였다.
다중 리얼타임 PCR
PCR 반응을 위한 혼합물의 총 부피를 30㎕로 하였으며, 2유닛(unit)의 HS Prime Taq Premix(Genet Bio, 한국)를 사용하였다. 각 프라이머는 0.5μM의 농도로 사용하였으며, 사용된 모든 탐침은 각각 0.06μM의 농도로 사용하였다. 내부대조군 프라이머는 Ct값이 22 ~ 24로 형성될 수 있을 정도의 농도로 사용하였다. 각 다중 리얼타임 PCR에서 대조군의 Ct값(PCR cycle마다 형광을 측정하여 발생된 형광이 base line을 돌파한 cycle 수)이 적정한 값을 산출시키지 못할 경우 반응액 제조과정 혹은 시료와 DNA 추출 과정에서의 오류를 확인 할 수 있다. Tris-HCl, KCl, MgCl2의 농도가 각각 10.3mM, 51.3mM, 2.9mM이 되도록 첨가하였고, 오염을 방지하기 위하여 UDG(uracil-DNA glycosylase, ElpisBio, 한국)를 1유닛 첨가하였으며, dNTP 중 dATP, dCTP, dGTP는 200mM 그리고 dUTP는 600mM(Solgent, 한국)의 농도가 되도록 첨가하였다.
리얼타임 PCR 반응을 수행하기 위한 장치로는 Mx3005P(Agilent Technologies, USA)를 사용하였으며, 오염방지 단계와 PCR 증폭단계로 나누어 수행하였다. 오염방지 단계의 UDG 반응을 위해 50℃에서 10분간 유지하였으며, 이후 UDG의 불활성화를 위해 95℃에서 10분간 유지하였다. PCR 증폭 단계는 94℃에서 40초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초의 주기로 40회 반복하여 수행하였고, PCR 증폭 반응 이후 72℃에서 5분간 유지하여 post elongation 반응을 수행하였다.
실시간 핵산 증폭 결과인 Ct값에 따른 핵산의 농도를 결정하기 위하여 각 균종들의 PCR 산물을 클로닝하고 Nucleic acid spectrophotometer(ACTgene Inc, USA)를 사용하여 260nm에서 흡광도를 측정하여 플라스미드 copy number를 계산하였다. 109 copy로 확인된 플라스미드를 10배 계단 희석하고 본 실시예의 다중 리얼타임 PCR 방법으로 분석하여 Ct값에 따른 플라스미드 DNA copy number의 표준곡선을 확인하고 각 시료들의 정량에 적용하였다(도 1 및 표 3 참조).
희석 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 Blank
Ct값 10.34 13.59 17.16 19.96 23.37 26.97 30.34 33.61 36.21 38.71 - -
본 발명의 6종 구강 미생물 동시 분석용 다중 리얼타임 PCR의 유효성 분석을 위하여 PCR 반응의 특이도 분석을 시행하였다. 이를 위하여 분양받아 핵산이 추출된 6종의 구강 미생물의 DNA를 각각 단독으로 PCR 주형(template)으로 사용하여 비 특이 반응 결과물의 생성을 확인하였다. 이와 함께 다른 종의 구강 미생물 5종 그리고 일반 미생물 10종의 DNA를 섞어서 DNA 주형으로 사용하여 비 특이 PCR 반응 발생 여부를 확인하였다(표 4 참조).
미생물 Pg Tf Td Aa Pi Cr IC



대상 미생물		 Porphyromonas gingivalis + - - - - - +
Tannerella forsythia - + - - - - +
Treponema denticola - - + - - - +
Actinobacillus actinomycetemcomitans - - - + - - +
Prevotella intermedia - - - - + - +
Campylobacter rectus - - - - - + +







음성대조군 균주		 Escherichia coli - - - - - - +
Pseudomonas Aeroginosa - - - - - - +
Fusobacterium nucleatum - - - - - - +
Eikenella corrodens - - - - - - +
Actinomyces viscosus - - - - - - +
Veillonella parvula - - - - - - +
Capnocytophaga ochracea - - - - - - +
Streptococcus sanguinis - - - - - - +
Streptococcus mitis - - - - - - +
Streptococcus gordonii - - - - - - +
Campylobacter concisus - - - - - - +
Prevotella nigrescens - - - - - - +
Actinomyces odontolyticus - - - - - - +
Elizabethkingia meningoseptica - - - - - - +
Sphingomonas paucimobilis - - - - - - +
이의 결과 6종의 각 병원성 구강 미생물들의 DNA에 대하여서 매우 특이적인 PCR 결과를 나타내었으며 비 특이적인 반응을 양산시키지 않음을 확인할 수 있었다. 아울러 다른 6종의 구강미생물들과 일반 미생물들의 DNA들에 대하여서도 비 특이 반응을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.
환자 시료를 대상으로 한 구강미생물 검출
본 발명의 방법으로 일반인과 환자의 시료를 분석하여 실제 임상에서의 활용 가능성을 확인하는 실험을 시행하였다. 환자 시료의 경우 아산병원 치과에 내원한 치주염 환자 10명을 대상으로 시료(시료 No. 1 ~ No. 10)를 채취하였으며 일반인 시료는 건강한 20세 이상 성인 20명의 시료(시료 No. 11 ~ No. 30)를 채취하여 분석을 시행하였다. 구강 플라그(plaque)는 치간솔과 페이퍼 포인트(paper point)를 사용하여 채취하였으며 타액의 경우 가글액을 사용하여 10초간 입을 행군 뒤 용기에 받아서 시료로 사용하였다.
치과 병원에 내원한 환자와 건강한 비교 시료들에 대한 분석 결과 환자들의 경우 분석 대상 균종 모두를 보균하고 있어 100%의 환자들이 전체 균종 동시 감염을 나타내었으며 Ct값이 30 이하로 매우 높은 농도로 보균하고 있음을 확인할 수 있었다(표 5 참조). 이에 반하여 건강한 대조군 시료들의 분석 결과는 거의 대부분 30 이상의 Ct값을 나타내어 분석 대상 미생물들을 낮은 농도로 보균하고 있음을 나타내었고 이와 함께 대상 균종의 한종 이상을 아직 보균하고 있지 않는 특징을 보이는 경우가 다수 발견되었으며 20%의 환자들의 경우에만 전체 균종 동시 감염이 확인되었다(표 6 참조).
대상 미생물 Pg Tf Td Aa Pi Cr
평균 Ct값
(표준편차)		 26.83
(±1.71)		 27.79
(±1.72)		 28.04
(±1.89)		 33.18
(±4.12)		 28.29
(±1.44)		 28.65
(±1.73)
평균 copy number 1.0×105 7.8×104 7.1×104 1.1×103 6.4×104 5.5×104
시료번호 Pg Tf Td Aa Pi Cr
11 0 1.0 × 104 37.29 32.39 33.82 31.77
12 7.8 × 103 6.6 × 104 38.97 32.85 32.28 31.24
13 9.5 × 103 9.7 × 103 32.37 35.62 0 31.37
14 0 9.1 × 102 0 36.90 38.51 36.85
15 5.5 × 103 4.3 × 103 37.76 29.70 32.94 32.21
16 0 1.0 × 104 0 28.26 0 31.89
17 4.6 × 103 0.5 × 10 34.28 38.49 33.34 32.46
18 1.9 × 104 8.4 × 103 34.20 0 32.87 32.25
19 1.5 × 104 8.1 × 103 37.27 0 33.88 33.31
20 0 5.4 × 104 30.95 33.85 0 31.28
21 6.1 × 10 1.1 × 103 0 37.00 0 35.57
22 3.8 × 10 1.0 × 104 39.21 36.56 31.07 31.25
23 2.3 × 104 7.2 × 103 35.72 39.85 30.80 31.55
24 0 8.7 × 102 37.13 37.60 34.58 36.56
25 6.6 × 103 8.1 × 103 32.00 37.57 0 31.73
26 2.8 × 103 9.7 × 102 37.83 39.12 0 33.79
27 2.3 × 10 9.4 × 103 0 31.18 0 30.15
28 0 5.4 × 103 33.98 38.01 32.67 32.55
29 9.6 × 103 8.7 × 103 1.0 × 103 36.28 34.53 31.50
30 2.2 × 103 6.6 × 103 1.7 × 10 29.33 34.60 0
이와 같은 결과는 치주 질환이 진행됨에 따라 치주 질환 유발 미생물들의 농도와 균종의 다양성이 증가한다는 기존의 다른 논문들과 높은 유사성을 보이고 있다.(Simon and Joel, 1999; Simonson et al., 1992; Wolff et al., 1993). 이는 건강한 구강 미생물 환경이 다양한 요인으로 인하여 치주염 유발 미생물들이 우점하고 농도가 증가하여 치주 질환 상태로 변화하는 것을 나타내고 있다.
<110> Diaprobe Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Detection method for periodontal pathogenic microbes using Multiplex real time PCR <130> PA130912-C01 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Porphyromonas gingivalis(PGF) <400> 1 catgatctta gcttgctaag gttgat 26 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Porphyromonas gingivalis(PGR) <400> 2 tatttccttg taatatcatg caataataca 30 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Tannerella forsythia(TFF) <400> 3 actggtactg agacacggac ca 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Tannerella forsythia(TFR) <400> 4 gcagtcatcc ttcacgcgac t 21 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Treponema denticola(TDF) <400> 5 cctgaagatg gggatagcta gtaga 25 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Treponema denticola(TDR) <400> 6 ttcaccctct caggccgga 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Actinobacillus actinomycetemcomitans(AAF) <400> 7 attggggttt agccctggtg 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Actinobacillus actinomycetemcomitans(AAR) <400> 8 aacccatctc tgagttcttc ttcg 24 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Campylobacter rectus(CRF) <400> 9 tgcaagtcga acggagatta agtag 25 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Campylobacter rectus(CRR) <400> 10 accaactagc tgatacgata tagcct 26 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Prevotella intermedia(PIF) <400> 11 agtcgagggg aaacggcat 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Prevotella intermedia(PIR) <400> 12 ctttggtcca cgtcagatgc 20 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Porphyromonas gingivalis(PGP) <400> 13 tcgagatgaa agggacgatg tacttca 27 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Tannerella forsythia(TFP) <400> 14 tgagatacgt gtattttatt gcatgtacct 30 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Treponema denticola(TDP) <400> 15 tggtgagtaa cgcgtgggtg acct 24 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Actinobacillus actinomycetemcomitans(AAP) <400> 16 tcgggagacg aaagtgcggg a 21 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Campylobacter rectus(CRP) <400> 17 gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 30 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Prevotella intermedia(PIP) <400> 18 agacggccta atacccgatg ttgt 24

Claims (3)

  1. 구강에서 채취한 생물학적 샘플로부터 얻어진 DNA를 대상으로 하여,
    포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 특이적인 DNA에 대한 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제1프라이머 쌍,
    타네렐라 포르시서스(Tannerella forsythus)에 특이적인 DNA에 대한 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제2프라이머 쌍,
    트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)에 특이적인 DNA에 대한 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제3프라이머 쌍,
    엑티노바실러스 엑티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)에 특이적인 DNA에 대한 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제4프라이머 쌍,
    캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus)에 특이적인 DNA에 대한 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제5프라이머 쌍,
    프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia)에 특이적인 DNA에 대한 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제6프라이머 쌍,
    상기 제1프라이머 쌍에 의해 증폭되는 DNA에 반응하는 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드가 증폭된 DNA의 농도를 확인할 수 있는 표지물질로 표지된 제1탐침,
    상기 제2프라이머 쌍에 의해 증폭되는 DNA에 반응하는 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드가 증폭된 DNA의 농도를 확인할 수 있는 표지물질로 표지된 제2탐침,
    상기 제3프라이머 쌍에 의해 증폭되는 DNA에 반응하는 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드가 증폭된 DNA의 농도를 확인할 수 있는 표지물질로 표지된 제3탐침,
    상기 제4프라이머 쌍에 의해 증폭되는 DNA에 반응하는 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드가 증폭된 DNA의 농도를 확인할 수 있는 표지물질로 표지된 제4탐침,
    상기 제5프라이머 쌍에 의해 증폭되는 DNA에 반응하는 서열번호 17의 올리고뉴클레오티드가 증폭된 DNA의 농도를 확인할 수 있는 표지물질로 표지된 제5탐침 및
    상기 제6프라이머 쌍에 의해 증폭되는 DNA에 반응하는 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드가 증폭된 DNA의 농도를 확인할 수 있는 표지물질로 표지된 제6탐침을 이용한 리얼타임 PCR을 수행하는 단계; 및
    상기 표지물질을 이용하여 각 프라이머 쌍에 의한 증폭량을 산출하는 단계;를 포함하는 구강질환 유발 미생물 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 표지물질은 형광물질이고, 형광의 세기를 측정하여 증폭량을 산출하는 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 미생물 검출 방법.
  3. 제 1항의 각 프라이머 쌍 및 각 탐침이 포함되는 구강질환 유발 미생물 검출용 키트.
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